JPS58165789A - α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はα−グリセロリン酸オキシダーゼを効率良く製
造する方法に関する。

従来、α−グリセロリン酸オキシダーゼ（以下α−ＧＰ
Ｏと略する）はストレプトコッカス（５ｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ　）属細菌（アーカイブス　オプ　バイオケ
ミストリー　アンド　バイオフィジクス、８８巻、２５
０頁、１９６０年）、ラクトバシラ秦（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　）属細菌（ジャーナルオブバイオロジカ
ルケミストリ−２３４看、２７９４頁、１９５９年）、
ロイコノス０ｅｒｅｖｉｓｉａｅ　）　（特開昭５３−
７２８９２号公報）及びアエロコツカス（Ａｅｒｏｏｏ
ｃｃｕＢ）属細菌（特開昭５５−１５７４６号公報）が
生産することが知られている。

α−ＧＰＯは血清またはその他の試料中のＬ−α−グリ
セロリン酸の定量、グリセロールキナーゼとの併用でグ
リセロールの定量１リボプロテインリパーゼ及びグリセ
ロールキナーゼとの共役によるトリグリセライドの定量
に利用出来ることが知られており１研究用試薬、臨床診
断用試薬として注目を集めている。

本発明者等はかかる要望に応えるべく工業的に安価にα
−ＧＰＯを製造する方法について鋭意研究を重ねた結果
、ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属、ラクト
バシルス属またはロイコノストック属に属するα−ａｐ
ｏ生産性細菌をアスコルビン酸またはその塩を含有せし
めた栄養培地に培養することにより、著しくａ　−（）
　Ｐ　Ｏの生産性が増大する−ことを見出し、本発明を
完成するに到った。すなわち、本発明はペディオコッカ
ス属、ストレプトコツカス属、ラクトバシルス属または
ロイフッストック属に属するα−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ生産菌をアスコルビン酸またはその塩を含有する
栄養培地に培養し、該培養物からα−グリセロリン酸オ
キシダーゼを採取することを特徴とするα−グリセロリ
ン酸オキシダーゼの製造法である。

本発明では栄養培地に上記アスコルビン酸またはその塩
を添加することにより、α−ＧＰＯの生産性を無添加に
比べて著しく増大せしめることができる。

本発明において１使用可能な菌株としては１ペデイオコ
ツカス・アシディラフティシイ（Ｐｅｄｉｏｏｏｃｃｕ
ｓａａｉｍｌａｃｌｉａｉ　）ｓペディオコッカス・セ
リヴイジイエ（Ｐｅｄｉｏｏｏｃａｕｓ　０ｓｒｅｖｉ
ｓｉａｅ　）、ペディオコッカス・ホマリ（Ｐｅｄｉｏ
ａｏａｃｕｓ　ｈｏｍａｒｉ　）、ペディオコッカス鴫
パルヴアコツカス属に属するα−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ生産性細菌が挙げられる。

またストレプトコッカス　ファエ力リス（Ｓｔ、　ｆａ
ｅｃａｌｉｓｋストレブトコッ力スサリヴアリアス（ｓ
　ｔ、　５ａｌｖａｒｉｕｅ　）、ストレプトコツ力ス
クリモリス（Ｓ　ｔ、　ａｒｅｍｏｒｉ８　）Ｎストレ
プトコツカスファエシウム（Ｓｔ、　ｆａｅｏｉｕｍ　
）などのストレプトコツカス属に属するα−グリセロリ
ン酸オキシダーゼ生産性細菌、ラクトバシルス　ブラン
テルム（Ｌ、　ｐＨＬηｔｅｒｕｍ）、ラクトバシルス
デルブ　。

リュツキイ　（Ｌ、　ａｅ４ｂｒｕθｃｋｉｉ）、ラク
トバシルスフアーメンタム（Ｌ、　ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ
　）、ラクトバシルスベントアテイカス（ｈ　ｐｅｎｔ
ｏａｅｔｉｃｕｓ　）％ラクトバシルスラクチス（Ｌ、
　１ａｏｔｉｓ　）、ラクトバシルスブユクネリ（Ｌ、
　１ｘｏｈ、ｎｅｒｉ　）、ラクトパシルスＬ／イクマ
ニイ（Ｌ、　ｌｅｉｅｈｍａｎｎｉ）などのラクトバシ
ルス属に属するα−グリセロリン酸オキシダーゼ生産性
細“′ｊ′″ｒ、＝　′ｔ　Ｏ（°″“”：／１１４ｔ
＞ｆａ４　　　　、・デス（Ｌｅｕｏｏｎｏｓｔｏｃ　
ｍｅａｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ　）などのロイフッストッ
ク属に属するα−グリセロリン酸オキシダーゼ生産性細
菌も使用される。

本発明方法は前記細菌を適当な炭素源、窒素源、無機塩
類、有機促進物質を含む培地に酵素生産性を増大せしめ
るために、アスコルビン酸またはその塩を共存せしめて
培養し、α−ＧＰＯを菌体中に生成蓄積せしめるもので
ある。ここで炭素源にはグリセロール、グルコース、フ
ラクト「ス、ラクトース、シ世−クロース、あるいは廃
糖蜜などが使用出来る０窒素源としてはペプトン、酵母
エキス、肉エキス、コーンステイープリカーなどのなど
の金属塩類や硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などの塩類が使
用出来る。有機促進物質としては特に酵母エキス、コー
ンステイープリカーが有効である。アスコルビン酸の塩
としてはナトリウム−カリウム塩等が有効である。

本発明において使用されるアスコルビン酸またはその塩
の添装置としては、１ｇ〜１０９７ｅ−、好ましくは２
ｇ〜５ｆｌ／ｌの割合で培地に添加すれば良好な結果が
得られる０培地の田は中性付近とし、通気攪拌などの好
気的培養を２５〜３２℃で１０〜３０時間行ない、α−
ＧＰＯを菌体中に生産蓄積せしめる。α−ＧＰＯの菌体
からの抽出には、菌体磨砕、超音波処理、自己消化、リ
ゾチーム処理などの公知の方法の単独使用または１適当
な組合わせによって無細胞酵素液とした後、硫酸アンモ
ニウム塩析、あるいはアセトン島アルコール等を用いる
溶媒沈殿などの公知の方法で酵素標品を得る。更に高度
に精製された酵素標品を得るには、イオン交換クロマト
グラフィーや分子篩を用いれば良い。

次に本発明のα−ＧＰＯの力価測定法および酵素の性質
をペディオコッカス・ベントサセウスエＦＯ１２３１Ｂ
起源のもの（後記の実施例２で得られた３２．６単位／
岬の精製酵素）を代表例として示す。

Ａ、酵素力価測定法 α−（）ＰＯヲＤ、Ｉ、−α−グリセロリン酸に作用せ
しめ１生成した過酸化水素を測定することにより、酵素
力価を求めることが出来る。

即ち、生成する過酸化水素を０−アミノフェノールの存
在下でペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）で分解し、同時に０
−アミノフェノールを定置的に酸化せしめ、生成する色
素量を４８０闘で比色定置することにより、α−Ｇｐｏ
の酵素力価を求める。酵素反応液の組成および反応条件
は以下の通りである。

（１）反応液の組成 ０．４５Ｍ　　Ｄ、Ｌ−α−グリセロリン酸（ｐｌ（ｖ
、ｏ）１．０− 〇、４５Ｍ　　Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７，０）（０，
１２５％（Ｗ／Ｖ））リドンＸ−１００を含む）１．０
ｖＬｔＰＯＤ水溶液（１５ブルブロガリン単位／ｓｄ）
　　　　１．ＭＯ，ＯＯＩＭ　　　Ｑ−アミノフェノ−
Ａ現１１句ｔホ浦谷良　　　　　１．〇−酵素液（０，
００４〜０．０１５単位／ｇＬｔ）　　　　　　０，５
ｓ（（２）　　反応条件 ３７℃で１０分間反応する０反応停止は４Ｎ−塩酸０、
５　ｇＬｔ添加で行ない１生成した色素を４８０略で比
色定量する０ （８）　　酵素力価 酵素力価の表示は上記反応条件下において１分間に１Ｈ
モルの過酸化水素を生成する酵素量を１単位とする。

Ｂ。作用 本酵素はＬ型のα−グｙセロリン酸を特異的に酸化し、
ジヒドロキ側アセトンリン酸と過酸化水素を生成する反
応を触媒する。

０、酵素化学的性質 （１）至適用および安定ｐｌ（範囲 トリス塩酸緩衝液（ｐｉ（７，０〜９．５　）　、　Ｋ
、　００．−ＮａＨｏｏ、緩衝液（ｐ）１９．０〜１０
．５）を用いて至適■を求めた結果一本酵素の至適用は
ａ、Ｏ〜８．５に認められる０ 本酵素の安定用或は２５℃、２０時間処理（ｐＨ５，０
，−、？、０．Ｏ，１Ｍジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ
緩衝液；ｐｌ−＋’ｙ、ｏ〜Ｂ、８，０゜ＬＭ−に−リ
ン酸緩衝液喜田８．８〜１０．０”’。

ｘ２００３−　ＮａＨＯＯ３緩衝液）で、ｐＨ６，５〜
８．５の範囲にある０ （２）作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の力価測定条件において、
３５〜４０℃付近にある。

（８）ｐＨ，温度などによる失活条件 本酵素はＯ，ｌ　Ｍ−ジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩
衝液（Ｖ１７・０）中で１５分間処理の場合、４０℃ま
で安定で、５０℃でも３０％の活性が残存するが、５５
℃処理では完全に失活する０次に本発明を実施例により
説明する。

実施例中、単に％とあるのは重量％を示す。

以下余白 実践例　Ｌ ポリペプトン０．８％、酵母エキス０．６％、グリセロ
ール１．０％、Ｋ、ＨＰＯ４１，５％、ＫＨ，ＰＯ４０
，５％、ＪＳｏ、　、　７　Ｈ，ＯＯ，０５％、？ｅＳ
Ｏ４−７Ｈ，ＯＯ，００５％、Ｍｎ０１．４Ｈ，ＯＯ，
００３％、Ｎａ１ｌ　ｏ、ｏｏｇ％、０ａＯ１，，２Ｈ
，，００，０００２％、ＺｎＳＯ４−’；Ｈ，ＯＯ，０
００１％の基本培地に、アスコルビン酸、そのナトリウ
ム塩またはカリウム塩を各々０．３％に添加し、田を７
．２に調整後、該培地を７−宛３５−容試験管に分注し
、１２０℃、１５分間滅菌した。冷却後、乳酸菌保存用
培地（日永製薬製）で予め３０℃で２４時間穿刺培養Ｉ
／ した第１表に示されるペデイオーコＦカス属に属する細
菌を１白金耳接種し、３０℃で２０時間振盪培養（３ａ
　ＯＳ、Ｐ、Ｍ　）　した。培養後、それぞれの試験管
からサンプル５．０−を採取し、１０，０ＯＯｒ、ｐ、
ｍで１０分間遠心分離して集菌した。得られた菌体は０
．００５　Ｍ　ＦｔＤＴＡ　　を含む０．１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＩ（７，０）の１０−で再懸濁後、超
音波処理を行なって菌体を破砕し、酵素を可溶化した後
、遠心分離によって菌体破砕物を除去し１得られた上澄
液について酵素活性の測定を行なった。この際のα−Ｇ
ＰＯの活性は第１表に示す。第１表がら明らかな如く、
アスコルビン酸の添加で著しくα−ＧＰＯの生産性が増
大されることが認められた。

実施例　２ 実施例１に示した基本培地に、アスコルビン酸ナトリウ
ム塩０．３％及び消泡剤、アデカノールＬＧ−１２ｅ（
旭電化製）０．０４％を添加し１田を７．２に調整した
。かくして得られた栄養培地１５ｇを３０１容のジャー
ファメンターに仕込み、１２１’ｔｌで１５分間オート
クレーブ滅菌した。他方同組成培地を用い２ｅ容坂ロコ
ルペンで３０℃。

１５時間予め振盪培養しておいたペディオコッカス・ベ
ントサセウスエ１ＦＯ１２３１８の培１ｉ［１５０１を
前記培地に無菌的に植菌し、３６℃で１５時間通気（１
４１７分）攪拌（ｌ　ａ　ｏ　ｒ、ｐ、ｍ、　）培養し
た０培養終了後、培養液１４　Ｊ　（９，３００単位）
を連続遠心分離機にて処理して菌体を集め１この菌体を
０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ４７．０）にて１
ｅに懸濁した。この懸濁液をダイノミルにかけ菌体を磨
砕した。磨砕後）磨砕液を０・０５ＭＫ−リン酸緩衝液
（ｐｌ（７，０）で２ｅとし、不溶物を遠心分離で除去
した◇得られた上澄液にまず４０％飽和になるように硫
酸アンモニウムを加え、不溶物を遠心分離で沈殿として
除去した後１その上澄液に終末６１５％飽和になる様に
更に硫酸アンモニウムを加え、α−ＧＰＯを沈殿として
回収した。　　　□この沈殿としての活性回収率は約８
３％で、比活性は約８倍に上昇していた。

得られた沈殿を２００−の０．０５Ｍリン酸カリウム緩
衝液（ｐＨ７，０）に溶解し、予め０．０５Ｍリン酸カ
リウム緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−２５を充
填したカラム（１，５６容）に通じ脱塩を行い）活性画
分を集めた。かくして得られた脱塩酵素液を次いて予め
０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で緩衝
化したＤＢＡＩ−セファロースカラム（１００＠を容）
に通してα−ＧＰＯを吸着させ、同緩衝液で洗浄後、同
緩衝液とＱ、５Ｍの塩化ナトリウムの溶解した同緩衝液
の各々６００−で塩化ナトリウムの濃度勾配をつくり、
徐々に塩化ナトリウム濃度を上げなからα−ＧＰＯを溶
出させた０溶出されたα−ＧＰＯ活性画分を集め、７０
％飽和硫酸アンモニウムによる塩析濃縮後、０．０２Ｍ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ’７゜５）で平衡化したセ
ファデックス（ｋ−１５０を通して分子篩を行い１最終
的に得られるセファデックスＧ　−１５０の分子篩液は
１次いで凍結乾燥して１０９．８９のα−ＧＰＯ標品を
得た。このものの比活性は３２．６単位／呼であり１抽
出液がらの収率は３８．５％であった。

実施例　３゜ 使用菌株としてペディオコッカス・アシディラクティシ
イエ’Ｆ０３８８５．ペディオコッカス。

セリヴイジイエエＦＯ１２２３０，ペディオコッカス・
パルヴアラスエＦＯ１２２３５，ペディオコッカス・ホ
マリエＩＦＯ１２２１７，ペディオコッカスφウリナエ
ーエクィエＦＯ１２１７３，を用い、実施例と同様に培
養精製を行い１第２表のような比活性の凍結乾燥α−Ｇ
ＰＯを得た。

実施例　本 実施例１における菌体を第３表に示される菌体を使用す
る以外は実施例１と同様にして培養し、得られた菌体か
ら実施例１と同様にして抽出を行ない酵素活性の測定を
行なった。その結果を第３表に示す。

手　続　補　正　書（自発） 昭和５７年１１月２４日 １、　事件の表示 昭和５７年特許願第４８６４１号 ２　発明の名称 α−グリ七ロリン酸オキシダーゼの製造法＆　補正をす
る者 事件との関係　　特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目２番８号 ４、　補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ５　補正の内容 （１）　　明細書第２頁第５行目 「０ｅｒｅｖｉａｉａｅＪを「ｏｅｒｅｖｉａｉａｅＪ
に訂正する０（２）同第３頁第１９行目 「ｏｅｒｅｖｉｓｉａｅＪを「ｃｅｒｅｖｉａｉａｅＪ
に訂正する。

（８）同第４頁第７行目 「クリモリス」を「タレモリス」に訂正する。

（４）同第４頁第１１〜１２行目 「ラクトバシルスデルブリュツキイ」を「ラクトパシル
ス　デルプリュツキイ」に訂正する。

（５）　　同第４頁第１２行目 「ラクトバシルスフアーメンタム」を「ラクトバシルス
　ファーメンタム」に訂正スる。

ス」に訂正する。

（７）同第４頁第１４行目 「Ｌ、　ｐｅｎｔｏａｅｔｉｃｕｓＪを「ｌＬ、ｐｓｎ
ｔｏａｃｓｔｉｏｕｓＪに訂正する。

（８）同第４頁第１４行目 「ラクトバシルスラクチス」を「ラクトバシルス　ラク
チス」に訂正する。

（９）同第４頁第１６行目 ［Ｌ。１θｉ％ｃｈｍａｎｎｉＪを「Ｌ、　ｌｅｉｏｈ
ｍａｎｎｉＩ　Ｊに訂正するＯ α０）同第７頁第６行目 ｒｍＪをｒ−Ｊに訂正する。

（１１）同第７頁第１９行目 「ｍｍ」をｒｎ、Ｊに訂正する。

（ロ）同第１１頁第１表「菌株」の欄 ［工Ｆ０３３８５Ｊを「ｘｙｏ３ａａＪに訂正する。

（１８）同第１３頁第７行目 「次いて」を「次いで」に訂正する。

０荀　同第１３頁第１１行目 「６００」を「３００」に訂正する。

に）同第１４頁第１０行目 「実施例」を「実施例２」に訂正する。

０６）同第１４頁第２表「菌株」の欄 「工Ｆ０３３８５Ｊを「工ＦＯ３Ｅ１８５Ｊに訂正する
。

（１７）　　同第１５頁第２行目２箇所「菌体」を「菌
株」に訂正する０ （ホ）同第１５頁第３表「菌株」の欄 「工Ｆ０３４門５」を「工ＦＯ３０７３Ｊに訂正する。

　４−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属、ラクトバ
   シルス属またはロイコノストック属に属するα−グリセ
   ロリン酸オキシダーゼ生産菌をアスコルビン酸またはそ
   の塩を含有する栄養培地に培養し、該培養物からα−グ
   リセロリン酸オキシダーゼを採取することを特徴とする
   α−グリセロリン酸オキシダーゼの製造法。