JPS58165789A - α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 - Google Patents
α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法Info
- Publication number
- JPS58165789A JPS58165789A JP57048641A JP4864182A JPS58165789A JP S58165789 A JPS58165789 A JP S58165789A JP 57048641 A JP57048641 A JP 57048641A JP 4864182 A JP4864182 A JP 4864182A JP S58165789 A JPS58165789 A JP S58165789A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- alpha
- glycerophosphate oxidase
- gpo
- enzyme
- ascorbic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 101710143182 Alpha-glycerophosphate oxidase Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 13
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 claims abstract description 13
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 11
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 claims abstract description 10
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 claims abstract description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 abstract description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 abstract description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 238000013019 agitation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 abstract 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 4
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940012969 lactobacillus fermentum Drugs 0.000 description 4
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241001147746 Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis Species 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 2
- GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone phosphate Chemical compound OCC(=O)COP(O)(O)=O GNGACRATGGDKBX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 2
- AWUCVROLDVIAJX-VKHMYHEASA-N sn-glycerol 1-phosphate Chemical compound OC[C@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 2-aminophenol Chemical compound NC1=CC=CC=C1O CDAWCLOXVUBKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000057621 Glycerol kinases Human genes 0.000 description 1
- 108700016170 Glycerol kinases Proteins 0.000 description 1
- 150000000996 L-ascorbic acids Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101150094640 Siae gene Proteins 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- SWXVUIWOUIDPGS-UHFFFAOYSA-N diacetone alcohol Natural products CC(=O)CC(C)(C)O SWXVUIWOUIDPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- XLSMFKSTNGKWQX-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetone Chemical compound CC(=O)CO XLSMFKSTNGKWQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- BITYAPCSNKJESK-UHFFFAOYSA-N potassiosodium Chemical class [Na].[K] BITYAPCSNKJESK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M potassium benzoate Chemical compound [K+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAEFZNCEHLXOMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N sn-glycerol 3-phosphate Chemical compound OC[C@@H](O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001665 trituration Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はα−グリセロリン酸オキシダーゼを効率良く製
造する方法に関する。
造する方法に関する。
従来、α−グリセロリン酸オキシダーゼ(以下α−GP
Oと略する)はストレプトコッカス(5treptoc
occus )属細菌(アーカイブス オプ バイオケ
ミストリー アンド バイオフィジクス、88巻、25
0頁、1960年)、ラクトバシラ秦(Lactoba
cillus )属細菌(ジャーナルオブバイオロジカ
ルケミストリ−234看、2794頁、1959年)、
ロイコノス0erevisiae ) (特開昭53−
72892号公報)及びアエロコツカス(Aerooo
ccuB)属細菌(特開昭55−15746号公報)が
生産することが知られている。
Oと略する)はストレプトコッカス(5treptoc
occus )属細菌(アーカイブス オプ バイオケ
ミストリー アンド バイオフィジクス、88巻、25
0頁、1960年)、ラクトバシラ秦(Lactoba
cillus )属細菌(ジャーナルオブバイオロジカ
ルケミストリ−234看、2794頁、1959年)、
ロイコノス0erevisiae ) (特開昭53−
72892号公報)及びアエロコツカス(Aerooo
ccuB)属細菌(特開昭55−15746号公報)が
生産することが知られている。
α−GPOは血清またはその他の試料中のL−α−グリ
セロリン酸の定量、グリセロールキナーゼとの併用でグ
リセロールの定量1リボプロテインリパーゼ及びグリセ
ロールキナーゼとの共役によるトリグリセライドの定量
に利用出来ることが知られており1研究用試薬、臨床診
断用試薬として注目を集めている。
セロリン酸の定量、グリセロールキナーゼとの併用でグ
リセロールの定量1リボプロテインリパーゼ及びグリセ
ロールキナーゼとの共役によるトリグリセライドの定量
に利用出来ることが知られており1研究用試薬、臨床診
断用試薬として注目を集めている。
本発明者等はかかる要望に応えるべく工業的に安価にα
−GPOを製造する方法について鋭意研究を重ねた結果
、ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属、ラクト
バシルス属またはロイコノストック属に属するα−ap
o生産性細菌をアスコルビン酸またはその塩を含有せし
めた栄養培地に培養することにより、著しくa −()
P Oの生産性が増大する−ことを見出し、本発明を
完成するに到った。すなわち、本発明はペディオコッカ
ス属、ストレプトコツカス属、ラクトバシルス属または
ロイフッストック属に属するα−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ生産菌をアスコルビン酸またはその塩を含有する
栄養培地に培養し、該培養物からα−グリセロリン酸オ
キシダーゼを採取することを特徴とするα−グリセロリ
ン酸オキシダーゼの製造法である。
−GPOを製造する方法について鋭意研究を重ねた結果
、ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属、ラクト
バシルス属またはロイコノストック属に属するα−ap
o生産性細菌をアスコルビン酸またはその塩を含有せし
めた栄養培地に培養することにより、著しくa −()
P Oの生産性が増大する−ことを見出し、本発明を
完成するに到った。すなわち、本発明はペディオコッカ
ス属、ストレプトコツカス属、ラクトバシルス属または
ロイフッストック属に属するα−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ生産菌をアスコルビン酸またはその塩を含有する
栄養培地に培養し、該培養物からα−グリセロリン酸オ
キシダーゼを採取することを特徴とするα−グリセロリ
ン酸オキシダーゼの製造法である。
本発明では栄養培地に上記アスコルビン酸またはその塩
を添加することにより、α−GPOの生産性を無添加に
比べて著しく増大せしめることができる。
を添加することにより、α−GPOの生産性を無添加に
比べて著しく増大せしめることができる。
本発明において1使用可能な菌株としては1ペデイオコ
ツカス・アシディラフティシイ(Pedioooccu
saaimlacliai )sペディオコッカス・セ
リヴイジイエ(Pediooocaus 0srevi
siae )、ペディオコッカス・ホマリ(Pedio
aoacus homari )、ペディオコッカス鴫
パルヴアコツカス属に属するα−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ生産性細菌が挙げられる。
ツカス・アシディラフティシイ(Pedioooccu
saaimlacliai )sペディオコッカス・セ
リヴイジイエ(Pediooocaus 0srevi
siae )、ペディオコッカス・ホマリ(Pedio
aoacus homari )、ペディオコッカス鴫
パルヴアコツカス属に属するα−グリセロリン酸オキシ
ダーゼ生産性細菌が挙げられる。
またストレプトコッカス ファエ力リス(St、 fa
ecaliskストレブトコッ力スサリヴアリアス(s
t、 5alvariue )、ストレプトコツ力ス
クリモリス(S t、 aremori8 )Nストレ
プトコツカスファエシウム(St、 faeoium
)などのストレプトコツカス属に属するα−グリセロリ
ン酸オキシダーゼ生産性細菌、ラクトバシルス ブラン
テルム(L、 pHLηterum)、ラクトバシルス
デルブ 。
ecaliskストレブトコッ力スサリヴアリアス(s
t、 5alvariue )、ストレプトコツ力ス
クリモリス(S t、 aremori8 )Nストレ
プトコツカスファエシウム(St、 faeoium
)などのストレプトコツカス属に属するα−グリセロリ
ン酸オキシダーゼ生産性細菌、ラクトバシルス ブラン
テルム(L、 pHLηterum)、ラクトバシルス
デルブ 。
リュツキイ (L、 ae4bruθckii)、ラク
トバシルスフアーメンタム(L、 fermentum
)、ラクトバシルスベントアテイカス(h pent
oaeticus )%ラクトバシルスラクチス(L、
1aotis )、ラクトバシルスブユクネリ(L、
1xoh、neri )、ラクトパシルスL/イクマ
ニイ(L、 leiehmanni)などのラクトバシ
ルス属に属するα−グリセロリン酸オキシダーゼ生産性
細“′j′″r、= ′t O(°″“”:/114t
>fa4 、・デス(Leuoonostoc
meaenteroides )などのロイフッストッ
ク属に属するα−グリセロリン酸オキシダーゼ生産性細
菌も使用される。
トバシルスフアーメンタム(L、 fermentum
)、ラクトバシルスベントアテイカス(h pent
oaeticus )%ラクトバシルスラクチス(L、
1aotis )、ラクトバシルスブユクネリ(L、
1xoh、neri )、ラクトパシルスL/イクマ
ニイ(L、 leiehmanni)などのラクトバシ
ルス属に属するα−グリセロリン酸オキシダーゼ生産性
細“′j′″r、= ′t O(°″“”:/114t
>fa4 、・デス(Leuoonostoc
meaenteroides )などのロイフッストッ
ク属に属するα−グリセロリン酸オキシダーゼ生産性細
菌も使用される。
本発明方法は前記細菌を適当な炭素源、窒素源、無機塩
類、有機促進物質を含む培地に酵素生産性を増大せしめ
るために、アスコルビン酸またはその塩を共存せしめて
培養し、α−GPOを菌体中に生成蓄積せしめるもので
ある。ここで炭素源にはグリセロール、グルコース、フ
ラクト「ス、ラクトース、シ世−クロース、あるいは廃
糖蜜などが使用出来る0窒素源としてはペプトン、酵母
エキス、肉エキス、コーンステイープリカーなどのなど
の金属塩類や硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などの塩類が使
用出来る。有機促進物質としては特に酵母エキス、コー
ンステイープリカーが有効である。アスコルビン酸の塩
としてはナトリウム−カリウム塩等が有効である。
類、有機促進物質を含む培地に酵素生産性を増大せしめ
るために、アスコルビン酸またはその塩を共存せしめて
培養し、α−GPOを菌体中に生成蓄積せしめるもので
ある。ここで炭素源にはグリセロール、グルコース、フ
ラクト「ス、ラクトース、シ世−クロース、あるいは廃
糖蜜などが使用出来る0窒素源としてはペプトン、酵母
エキス、肉エキス、コーンステイープリカーなどのなど
の金属塩類や硫酸、リン酸、塩酸、硝酸などの塩類が使
用出来る。有機促進物質としては特に酵母エキス、コー
ンステイープリカーが有効である。アスコルビン酸の塩
としてはナトリウム−カリウム塩等が有効である。
本発明において使用されるアスコルビン酸またはその塩
の添装置としては、1g〜1097e−、好ましくは2
g〜5fl/lの割合で培地に添加すれば良好な結果が
得られる0培地の田は中性付近とし、通気攪拌などの好
気的培養を25〜32℃で10〜30時間行ない、α−
GPOを菌体中に生産蓄積せしめる。α−GPOの菌体
からの抽出には、菌体磨砕、超音波処理、自己消化、リ
ゾチーム処理などの公知の方法の単独使用または1適当
な組合わせによって無細胞酵素液とした後、硫酸アンモ
ニウム塩析、あるいはアセトン島アルコール等を用いる
溶媒沈殿などの公知の方法で酵素標品を得る。更に高度
に精製された酵素標品を得るには、イオン交換クロマト
グラフィーや分子篩を用いれば良い。
の添装置としては、1g〜1097e−、好ましくは2
g〜5fl/lの割合で培地に添加すれば良好な結果が
得られる0培地の田は中性付近とし、通気攪拌などの好
気的培養を25〜32℃で10〜30時間行ない、α−
GPOを菌体中に生産蓄積せしめる。α−GPOの菌体
からの抽出には、菌体磨砕、超音波処理、自己消化、リ
ゾチーム処理などの公知の方法の単独使用または1適当
な組合わせによって無細胞酵素液とした後、硫酸アンモ
ニウム塩析、あるいはアセトン島アルコール等を用いる
溶媒沈殿などの公知の方法で酵素標品を得る。更に高度
に精製された酵素標品を得るには、イオン交換クロマト
グラフィーや分子篩を用いれば良い。
次に本発明のα−GPOの力価測定法および酵素の性質
をペディオコッカス・ベントサセウスエFO1231B
起源のもの(後記の実施例2で得られた32.6単位/
岬の精製酵素)を代表例として示す。
をペディオコッカス・ベントサセウスエFO1231B
起源のもの(後記の実施例2で得られた32.6単位/
岬の精製酵素)を代表例として示す。
A、酵素力価測定法
α−()POヲD、I、−α−グリセロリン酸に作用せ
しめ1生成した過酸化水素を測定することにより、酵素
力価を求めることが出来る。
しめ1生成した過酸化水素を測定することにより、酵素
力価を求めることが出来る。
即ち、生成する過酸化水素を0−アミノフェノールの存
在下でペルオキシダーゼ(POD)で分解し、同時に0
−アミノフェノールを定置的に酸化せしめ、生成する色
素量を480闘で比色定置することにより、α−Gpo
の酵素力価を求める。酵素反応液の組成および反応条件
は以下の通りである。
在下でペルオキシダーゼ(POD)で分解し、同時に0
−アミノフェノールを定置的に酸化せしめ、生成する色
素量を480闘で比色定置することにより、α−Gpo
の酵素力価を求める。酵素反応液の組成および反応条件
は以下の通りである。
(1)反応液の組成
0.45M D、L−α−グリセロリン酸(pl(v
、o)1.0− 〇、45M K−リン酸緩衝液(pH7,0)(0,
125%(W/V))リドンX−100を含む)1.0
vLtPOD水溶液(15ブルブロガリン単位/sd)
1.MO,OOIM Q−アミノフェノ−
A現11句tホ浦谷良 1.〇−酵素液(0,
004〜0.015単位/gLt) 0,5
s((2) 反応条件 37℃で10分間反応する0反応停止は4N−塩酸0、
5 gLt添加で行ない1生成した色素を480略で比
色定量する0 (8) 酵素力価 酵素力価の表示は上記反応条件下において1分間に1H
モルの過酸化水素を生成する酵素量を1単位とする。
、o)1.0− 〇、45M K−リン酸緩衝液(pH7,0)(0,
125%(W/V))リドンX−100を含む)1.0
vLtPOD水溶液(15ブルブロガリン単位/sd)
1.MO,OOIM Q−アミノフェノ−
A現11句tホ浦谷良 1.〇−酵素液(0,
004〜0.015単位/gLt) 0,5
s((2) 反応条件 37℃で10分間反応する0反応停止は4N−塩酸0、
5 gLt添加で行ない1生成した色素を480略で比
色定量する0 (8) 酵素力価 酵素力価の表示は上記反応条件下において1分間に1H
モルの過酸化水素を生成する酵素量を1単位とする。
B。作用
本酵素はL型のα−グyセロリン酸を特異的に酸化し、
ジヒドロキ側アセトンリン酸と過酸化水素を生成する反
応を触媒する。
ジヒドロキ側アセトンリン酸と過酸化水素を生成する反
応を触媒する。
0、酵素化学的性質
(1)至適用および安定pl(範囲
トリス塩酸緩衝液(pi(7,0〜9.5 ) 、 K
、 00.−NaHoo、緩衝液(p)19.0〜10
.5)を用いて至適■を求めた結果一本酵素の至適用は
a、O〜8.5に認められる0 本酵素の安定用或は25℃、20時間処理(pH5,0
,−、?、0.O,1Mジメチルグルタル酸−NaOH
緩衝液;pl−+’y、o〜B、8,0゜LM−に−リ
ン酸緩衝液喜田8.8〜10.0”’。
、 00.−NaHoo、緩衝液(p)19.0〜10
.5)を用いて至適■を求めた結果一本酵素の至適用は
a、O〜8.5に認められる0 本酵素の安定用或は25℃、20時間処理(pH5,0
,−、?、0.O,1Mジメチルグルタル酸−NaOH
緩衝液;pl−+’y、o〜B、8,0゜LM−に−リ
ン酸緩衝液喜田8.8〜10.0”’。
x2003− NaHOO3緩衝液)で、pH6,5〜
8.5の範囲にある0 (2)作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の力価測定条件において、
35〜40℃付近にある。
8.5の範囲にある0 (2)作用適温の範囲 本酵素の作用最適温度は前記の力価測定条件において、
35〜40℃付近にある。
(8)pH,温度などによる失活条件
本酵素はO,l M−ジメチルグルタル酸−NaOH緩
衝液(V17・0)中で15分間処理の場合、40℃ま
で安定で、50℃でも30%の活性が残存するが、55
℃処理では完全に失活する0次に本発明を実施例により
説明する。
衝液(V17・0)中で15分間処理の場合、40℃ま
で安定で、50℃でも30%の活性が残存するが、55
℃処理では完全に失活する0次に本発明を実施例により
説明する。
実施例中、単に%とあるのは重量%を示す。
以下余白
実践例 L
ポリペプトン0.8%、酵母エキス0.6%、グリセロ
ール1.0%、K、HPO41,5%、KH,PO40
,5%、JSo、 、 7 H,OO,05%、?eS
O4−7H,OO,005%、Mn01.4H,OO,
003%、Na1l o、oog%、0aO1,,2H
,,00,0002%、ZnSO4−’;H,OO,0
001%の基本培地に、アスコルビン酸、そのナトリウ
ム塩またはカリウム塩を各々0.3%に添加し、田を7
.2に調整後、該培地を7−宛35−容試験管に分注し
、120℃、15分間滅菌した。冷却後、乳酸菌保存用
培地(日永製薬製)で予め30℃で24時間穿刺培養I
/ した第1表に示されるペデイオーコFカス属に属する細
菌を1白金耳接種し、30℃で20時間振盪培養(3a
OS、P、M ) した。培養後、それぞれの試験管
からサンプル5.0−を採取し、10,0OOr、p、
mで10分間遠心分離して集菌した。得られた菌体は0
.005 M FtDTA を含む0.1Mリン酸カ
リウム緩衝液(pI(7,0)の10−で再懸濁後、超
音波処理を行なって菌体を破砕し、酵素を可溶化した後
、遠心分離によって菌体破砕物を除去し1得られた上澄
液について酵素活性の測定を行なった。この際のα−G
POの活性は第1表に示す。第1表がら明らかな如く、
アスコルビン酸の添加で著しくα−GPOの生産性が増
大されることが認められた。
ール1.0%、K、HPO41,5%、KH,PO40
,5%、JSo、 、 7 H,OO,05%、?eS
O4−7H,OO,005%、Mn01.4H,OO,
003%、Na1l o、oog%、0aO1,,2H
,,00,0002%、ZnSO4−’;H,OO,0
001%の基本培地に、アスコルビン酸、そのナトリウ
ム塩またはカリウム塩を各々0.3%に添加し、田を7
.2に調整後、該培地を7−宛35−容試験管に分注し
、120℃、15分間滅菌した。冷却後、乳酸菌保存用
培地(日永製薬製)で予め30℃で24時間穿刺培養I
/ した第1表に示されるペデイオーコFカス属に属する細
菌を1白金耳接種し、30℃で20時間振盪培養(3a
OS、P、M ) した。培養後、それぞれの試験管
からサンプル5.0−を採取し、10,0OOr、p、
mで10分間遠心分離して集菌した。得られた菌体は0
.005 M FtDTA を含む0.1Mリン酸カ
リウム緩衝液(pI(7,0)の10−で再懸濁後、超
音波処理を行なって菌体を破砕し、酵素を可溶化した後
、遠心分離によって菌体破砕物を除去し1得られた上澄
液について酵素活性の測定を行なった。この際のα−G
POの活性は第1表に示す。第1表がら明らかな如く、
アスコルビン酸の添加で著しくα−GPOの生産性が増
大されることが認められた。
実施例 2
実施例1に示した基本培地に、アスコルビン酸ナトリウ
ム塩0.3%及び消泡剤、アデカノールLG−12e(
旭電化製)0.04%を添加し1田を7.2に調整した
。かくして得られた栄養培地15gを301容のジャー
ファメンターに仕込み、121’tlで15分間オート
クレーブ滅菌した。他方同組成培地を用い2e容坂ロコ
ルペンで30℃。
ム塩0.3%及び消泡剤、アデカノールLG−12e(
旭電化製)0.04%を添加し1田を7.2に調整した
。かくして得られた栄養培地15gを301容のジャー
ファメンターに仕込み、121’tlで15分間オート
クレーブ滅菌した。他方同組成培地を用い2e容坂ロコ
ルペンで30℃。
15時間予め振盪培養しておいたペディオコッカス・ベ
ントサセウスエ1FO12318の培1i[1501を
前記培地に無菌的に植菌し、36℃で15時間通気(1
417分)攪拌(l a o r、p、m、 )培養し
た0培養終了後、培養液14 J (9,300単位)
を連続遠心分離機にて処理して菌体を集め1この菌体を
0.05Mリン酸カリウム緩衝液(p47.0)にて1
eに懸濁した。この懸濁液をダイノミルにかけ菌体を磨
砕した。磨砕後)磨砕液を0・05MK−リン酸緩衝液
(pl(7,0)で2eとし、不溶物を遠心分離で除去
した◇得られた上澄液にまず40%飽和になるように硫
酸アンモニウムを加え、不溶物を遠心分離で沈殿として
除去した後1その上澄液に終末615%飽和になる様に
更に硫酸アンモニウムを加え、α−GPOを沈殿として
回収した。 □この沈殿としての活性回収率は約8
3%で、比活性は約8倍に上昇していた。
ントサセウスエ1FO12318の培1i[1501を
前記培地に無菌的に植菌し、36℃で15時間通気(1
417分)攪拌(l a o r、p、m、 )培養し
た0培養終了後、培養液14 J (9,300単位)
を連続遠心分離機にて処理して菌体を集め1この菌体を
0.05Mリン酸カリウム緩衝液(p47.0)にて1
eに懸濁した。この懸濁液をダイノミルにかけ菌体を磨
砕した。磨砕後)磨砕液を0・05MK−リン酸緩衝液
(pl(7,0)で2eとし、不溶物を遠心分離で除去
した◇得られた上澄液にまず40%飽和になるように硫
酸アンモニウムを加え、不溶物を遠心分離で沈殿として
除去した後1その上澄液に終末615%飽和になる様に
更に硫酸アンモニウムを加え、α−GPOを沈殿として
回収した。 □この沈殿としての活性回収率は約8
3%で、比活性は約8倍に上昇していた。
得られた沈殿を200−の0.05Mリン酸カリウム緩
衝液(pH7,0)に溶解し、予め0.05Mリン酸カ
リウム緩衝液で平衡化したセファデックスG−25を充
填したカラム(1,56容)に通じ脱塩を行い)活性画
分を集めた。かくして得られた脱塩酵素液を次いて予め
0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7,0)で緩衝
化したDBAI−セファロースカラム(100@を容)
に通してα−GPOを吸着させ、同緩衝液で洗浄後、同
緩衝液とQ、5Mの塩化ナトリウムの溶解した同緩衝液
の各々600−で塩化ナトリウムの濃度勾配をつくり、
徐々に塩化ナトリウム濃度を上げなからα−GPOを溶
出させた0溶出されたα−GPO活性画分を集め、70
%飽和硫酸アンモニウムによる塩析濃縮後、0.02M
リン酸カリウム緩衝液(pH’7゜5)で平衡化したセ
ファデックス(k−150を通して分子篩を行い1最終
的に得られるセファデックスG −150の分子篩液は
1次いで凍結乾燥して109.89のα−GPO標品を
得た。このものの比活性は32.6単位/呼であり1抽
出液がらの収率は38.5%であった。
衝液(pH7,0)に溶解し、予め0.05Mリン酸カ
リウム緩衝液で平衡化したセファデックスG−25を充
填したカラム(1,56容)に通じ脱塩を行い)活性画
分を集めた。かくして得られた脱塩酵素液を次いて予め
0.05Mリン酸カリウム緩衝液(pH7,0)で緩衝
化したDBAI−セファロースカラム(100@を容)
に通してα−GPOを吸着させ、同緩衝液で洗浄後、同
緩衝液とQ、5Mの塩化ナトリウムの溶解した同緩衝液
の各々600−で塩化ナトリウムの濃度勾配をつくり、
徐々に塩化ナトリウム濃度を上げなからα−GPOを溶
出させた0溶出されたα−GPO活性画分を集め、70
%飽和硫酸アンモニウムによる塩析濃縮後、0.02M
リン酸カリウム緩衝液(pH’7゜5)で平衡化したセ
ファデックス(k−150を通して分子篩を行い1最終
的に得られるセファデックスG −150の分子篩液は
1次いで凍結乾燥して109.89のα−GPO標品を
得た。このものの比活性は32.6単位/呼であり1抽
出液がらの収率は38.5%であった。
実施例 3゜
使用菌株としてペディオコッカス・アシディラクティシ
イエ’F03885.ペディオコッカス。
イエ’F03885.ペディオコッカス。
セリヴイジイエエFO12230,ペディオコッカス・
パルヴアラスエFO12235,ペディオコッカス・ホ
マリエIFO12217,ペディオコッカスφウリナエ
ーエクィエFO12173,を用い、実施例と同様に培
養精製を行い1第2表のような比活性の凍結乾燥α−G
POを得た。
パルヴアラスエFO12235,ペディオコッカス・ホ
マリエIFO12217,ペディオコッカスφウリナエ
ーエクィエFO12173,を用い、実施例と同様に培
養精製を行い1第2表のような比活性の凍結乾燥α−G
POを得た。
実施例 本
実施例1における菌体を第3表に示される菌体を使用す
る以外は実施例1と同様にして培養し、得られた菌体か
ら実施例1と同様にして抽出を行ない酵素活性の測定を
行なった。その結果を第3表に示す。
る以外は実施例1と同様にして培養し、得られた菌体か
ら実施例1と同様にして抽出を行ない酵素活性の測定を
行なった。その結果を第3表に示す。
手 続 補 正 書(自発)
昭和57年11月24日
1、 事件の表示
昭和57年特許願第48641号
2 発明の名称
α−グリ七ロリン酸オキシダーゼの製造法& 補正をす
る者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目2番8号 4、 補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 5 補正の内容 (1) 明細書第2頁第5行目 「0ereviaiaeJを「oereviaiaeJ
に訂正する0(2)同第3頁第19行目 「oerevisiaeJを「cereviaiaeJ
に訂正する。
る者 事件との関係 特許出願人 大阪市北区堂島浜二丁目2番8号 4、 補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 5 補正の内容 (1) 明細書第2頁第5行目 「0ereviaiaeJを「oereviaiaeJ
に訂正する0(2)同第3頁第19行目 「oerevisiaeJを「cereviaiaeJ
に訂正する。
(8)同第4頁第7行目
「クリモリス」を「タレモリス」に訂正する。
(4)同第4頁第11〜12行目
「ラクトバシルスデルブリュツキイ」を「ラクトパシル
ス デルプリュツキイ」に訂正する。
ス デルプリュツキイ」に訂正する。
(5) 同第4頁第12行目
「ラクトバシルスフアーメンタム」を「ラクトバシルス
ファーメンタム」に訂正スる。
ファーメンタム」に訂正スる。
ス」に訂正する。
(7)同第4頁第14行目
「L、 pentoaeticusJを「lL、psn
toacstiousJに訂正する。
toacstiousJに訂正する。
(8)同第4頁第14行目
「ラクトバシルスラクチス」を「ラクトバシルス ラク
チス」に訂正する。
チス」に訂正する。
(9)同第4頁第16行目
[L。1θi%chmanniJを「L、 leioh
manniI Jに訂正するO α0)同第7頁第6行目 rmJをr−Jに訂正する。
manniI Jに訂正するO α0)同第7頁第6行目 rmJをr−Jに訂正する。
(11)同第7頁第19行目
「mm」をrn、Jに訂正する。
(ロ)同第11頁第1表「菌株」の欄
[工F03385Jを「xyo3aaJに訂正する。
(18)同第13頁第7行目
「次いて」を「次いで」に訂正する。
0荀 同第13頁第11行目
「600」を「300」に訂正する。
に)同第14頁第10行目
「実施例」を「実施例2」に訂正する。
06)同第14頁第2表「菌株」の欄
「工F03385Jを「工FO3E185Jに訂正する
。
。
(17) 同第15頁第2行目2箇所「菌体」を「菌
株」に訂正する0 (ホ)同第15頁第3表「菌株」の欄 「工F034門5」を「工FO3073Jに訂正する。
株」に訂正する0 (ホ)同第15頁第3表「菌株」の欄 「工F034門5」を「工FO3073Jに訂正する。
4−
Claims (1)
- ペディオコッカス属、ストレプトコツカス属、ラクトバ
シルス属またはロイコノストック属に属するα−グリセ
ロリン酸オキシダーゼ生産菌をアスコルビン酸またはそ
の塩を含有する栄養培地に培養し、該培養物からα−グ
リセロリン酸オキシダーゼを採取することを特徴とする
α−グリセロリン酸オキシダーゼの製造法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57048641A JPS58165789A (ja) | 1982-03-25 | 1982-03-25 | α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
DE19823244129 DE3244129A1 (de) | 1982-03-25 | 1982-11-29 | Verfahren zur erzeugung von (alpha)-glycerophosphatoxidase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57048641A JPS58165789A (ja) | 1982-03-25 | 1982-03-25 | α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS58165789A true JPS58165789A (ja) | 1983-09-30 |
JPS6121074B2 JPS6121074B2 (ja) | 1986-05-24 |
Family
ID=12808991
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57048641A Granted JPS58165789A (ja) | 1982-03-25 | 1982-03-25 | α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS58165789A (ja) |
DE (1) | DE3244129A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2213822B (en) * | 1987-12-15 | 1991-12-18 | Toyo Jozo Kk | Dna having genetic information of l-´-glycerophosphate oxidase and application thereof |
ES2226228T5 (es) | 1999-04-30 | 2009-01-16 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Crecimiento mejorado de las bacterias del acido lactico en la leche. |
-
1982
- 1982-03-25 JP JP57048641A patent/JPS58165789A/ja active Granted
- 1982-11-29 DE DE19823244129 patent/DE3244129A1/de active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE3244129A1 (de) | 1983-11-10 |
DE3244129C2 (ja) | 1989-10-05 |
JPS6121074B2 (ja) | 1986-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Socransky et al. | Capnocytophaga: new genus of gram-negative gliding bacteria. III. Physiological characterization | |
EP0576838A2 (en) | Fructosylamine deglycase, method of producing it, and method of quantitative determination of amadori compounds using the enzyme | |
JP2008035748A (ja) | アスペルギルス属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JPH07505770A (ja) | 新規ケトエステル‐還元酵素,その製造方法及びこれを酵素酸化還元反応に使用する方法 | |
JPH0671425B2 (ja) | ウリカ−ゼおよびその製造法 | |
JPS58165789A (ja) | α−グリセロリン酸オキシダ−ゼの製造法 | |
JP3773283B2 (ja) | D−乳酸脱水素酵素およびその製造法 | |
JPS6243671B2 (ja) | ||
JPS58216686A (ja) | α−グリセロホスフエ−トオキシダ−ゼの製造法 | |
Thompson et al. | Enzymatic removal of diacetyl from beer: III. Enzyme protection and regeneration of cofactor | |
JP2647689B2 (ja) | 新規アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ | |
JP2008035747A (ja) | ペニシリウム属菌由来新規グルコースデヒドロゲナーゼ | |
JPS6143987A (ja) | ペルオキシダ−ゼ及びその製造法 | |
JPS6314692A (ja) | 3α―ヒドロキシステロイドオキシダーゼ組成物及びこれを用いる3α―ヒドロキシステロイドの定量法 | |
Shugart et al. | Occurrence and distribution of proteinase of Streptococcus faecalis var. liquefaciens | |
Prabhakaran | Metabolism of Mycobacterium leprae separated from human leprosy nodules | |
JPS6126356B2 (ja) | ||
JPS6031473B2 (ja) | 微生物によるポリアミンオキシダ−ゼ類の製造法 | |
JPS6121073B2 (ja) | ||
CN114507615A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其生产纤溶酶的应用 | |
JPS61219383A (ja) | クレアチニンデイミナ−ゼの製造法 | |
JPS6020995B2 (ja) | 発酵法によるウリカ−ゼの製造法 | |
Takahashi et al. | Purification and characterization of a β-galactosidase from Treponema phagedenis (Reiter strain) | |
JPH09313174A (ja) | 耐熱性グルコ−ス−6−リン酸デヒドロゲナ−ゼ及びその製造法 | |
JPH0260313B2 (ja) |