JPH07505770A

JPH07505770A - 新規ケトエステル‐還元酵素，その製造方法及びこれを酵素酸化還元反応に使用する方法

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Publication number: JPH07505770A
Application number: JP5515239A
Authority: JP
Inventors: クーラ・マリア‐レジナ; ペータース・イエルク
Original assignee: フォルシュングスツェントルム・ユーリッヒ・ゲゼルシャフト・ミト・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1992-03-13
Filing date: 1993-03-05
Publication date: 1995-06-29
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: CA2117482C; EP0630402A1; EP0630402B1; JP3672307B2; DK0630402T3; CA2117482A1; US5523223A; DE59306681D1; WO1993018138A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】新規ケトエステル−還元酵素、その製造方法及びこれを酵素酸化還元反応に使用する方法本発明の対象は、β−１γ−及びδ−ケトエステルをＮＡＤＨ−依存酵素反応して対応する光学的に活性なβ−１γ−及びδ−ヒドロキシ酸エステルにすることができる、新規ケトエステル−還元酵素であり、これはカンジダ　パラブシロシス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、ヤローヴイニア　セロビオサ（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｓａ　）、ロードコツカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｊｓ）又はシュードモナス　アシトポランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）の菌株から単離することができる。

光学的に活性なβ−１γ−及びδ−ヒドロキシカルボン酸エステルは、価値あるキラル合成構成成分であり、これは薬剤、芳香物質、フェロモン、農業用化学物質、酵素阻害剤中に広く使用される。これは通常の化学方法で極めて入手が困難である。というのは化学的還元によって生じる対掌体混合物の分離が複雑であり、かつ費用がかかるからである。

微生物を用いるβ−１γ−及びδ−ヒドロキシカルボン酸の発酵製造処理は、公知である。その際、微生物細胞を常に過剰に使用し、収量及び過剰の対掌体は細胞の起源に応して広い範囲にわたって変化する。その際パン焼き用酵母サツカロマイセス　セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がもっとも頻繁に使用される。

サツカロマイセス　セレビジアエから単離される酸化還元酵素もすてに知られている。この酵素は、対応するケトエステルのβ−１γ−及びδ−ケト基の酵素還元に触媒作用を呈し、対応する光学的に活性なヒドロキシ化合物とする（ハイトラス（Ｈｅｉｄｌａｓ）等、（１９８８）、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７２：　６３３−６３９）。この公知の酸化還元酵素は共触媒としてＮＡＤＰＨを必要とし、その再生が困難であり、それ故にこの公知の酵素による合成法は工業的に採算が合わない。

したがって本発明の目的は、ＮＡＤＨによって共触媒反応を生じる、β−１γ− 及びδ−ケトエステルの酵素反応及びこれに適する酵素である。

これは驚くへきことに特定の酵母及び細菌中に、すなわちカンジダ　パラブシロシス及びヤローヴイニア　セロビオサ中に並びにロードコツカス　エリスロポリス及びシュードモナス　アシトポランス中に見い出され、これらはｎ−アルカン又はｎ−アルカン酸を利用することができる。カンジダ　パラブシロシス及びロードコツカス　エリスロポリスから単離されたケトエステル−還元酵素は広範囲にわたって研究されている。

長鎖アルカン酸又はアルカン、すなわち特にドデカン酸及びテトラデカンを炭素源として含有する栄養培地上でカンジダ　パラブシロシス又はロードコツカスエリスロポリスを増殖した場合、新規ケトエステル−還元酵素（ＫＥＲｅｄ）の特に高い活性が得られる。

カンジダ　パラブシロシスＤＭＳ　７０１２５によるＫＥＲｅｄの形成及びこの菌株から酵素の単離及び精製が特に著しく研究されている。

精製されたＫＥＲｅｄは次のパラメーターの点で優れているニーｐＨ−最適条件は、ケトエステル−還元に関してｐＨ７，８ないし８．０及び逆反応に関して約１１Ｈ９，５である。

−ケトエステル−還元に最適な温度は、３６ないし４０℃及び逆反応に最適な温度は５０°Ｃないし５６°Ｃである。

８ｇ”−、Ｐｂ”−、Ａｇ”　、Ｃｕ”−１Ｎｉｔｌ−１５ｎｔｏ−及びＣｏ” −イオンによる急速な脱活性化。ｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀ベンゾアート、５．５°〜ジチオビス（２−ニトロベンゾアート）及びヨードアセトアミドによる並びにキレート化された２、２−ビピリジル及びＯ−フェナントロリンによる著しい阻害。ＳＨ−保護試薬、たとえばジチオトレイトールによる安定化。

−脂肪族、脂環式及び芳香族ケトン、ジケトン、ケタール及びアルデヒドの還元だめの並びに第−及び第二アルコールの酸化のための更なる能力。

β−１γ−及びδ−ケトエステルを、酵素還元反応に付して対応する光学的活性ヒ　ドロキシカルボン酸エステルとすることは、次の反応式に従って行われＮＡＤＨＮＡＤ” 式中Ｒ及びＲ゛は幅広い意味を有することができ、それはたとえば表４から明らかである。口は１〜３の値をとることができる。更に基質結合部位のモデル（図５、表５、例３．Ｇ）で基質受容の範囲を図示する。

ケトエステルの他にＫＥＲｅｄによって他のすキソ化合物が基質として挙げられる。

たとえば特に１，１−ジクロルアセトン、クロルアセトン、３−クロル−２−ブタノン、２−オクタノン、２−ブタノン、２−ペンタノン、２−メチル−３−ペンタノン、メトキン−２−プロパノン、アセトフェノン、３−クロルアセトフェノン、４−フルオルアセトフェノン、４−ブロムアセトフェノン、プロピオフェノン、２．４−ヘキサンジオン、２．４−ペンタジオン並びにアセトアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びプロピオンアルデヒドである。アセトフェノンを（Ｓ）−フェニルエタノールへ、３−オキソ酪酸エチルエステルを（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸エチルエステルを、そして５−オキソヘキサン酸エチルエステルを（Ｓ）−５−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステルへ変換する。

このことに関連して、特にＮＡＤＨ−共触媒中でアセトフェノン、４−ブロムアセトフェノン、３−クロルアセトフェノン及び４−フルオルアセトフェノンの対応する（Ｓ）−フェニルエタノールへの変換が重要である。というのは従来（Ｒ）−特異変換し起こらないからである。

逆反応（ヒドロキシ基の酸化）を、同様に酵素によって実施することができ、特にこれを利用して、Ｒ−及びＳ−ヒドロキシ化合物のラセミ体の対掌体を変換することによって場合により所望されたＲ一対掌体を得ることができる。

下記に、個々に記載されたケトエステル−還元酵素は上述の様にケトエステルの β−１γ−１δ−ケト基の還元を可能にするばかりでなく、更に広範囲のカルボニル化合物の還元に使用することができる。したがってこの酵素をカルボニル− 還元酵素として表示することもできる。

新規酵素を、ＥＣ−分類内で番号（ＥＣ１，２，＋３に分類することができる。

ＥＣ一番号の正確な指定は勿論まだ決着がづいていない。説明を簡略化するために、新規酵素を下記の説明でケトエステル−還元酵素（ＫＥＲｅｄ）と表示する。

ＫＥＲｅｄが公知方法で上記微生物の培養（通常の栄養培地中で、場合によりアルカン及び（又は）アルカン酸の存在下）によって得られ、その粗抽出物から使用可能な酵素調製物をＰＥＧ−分別沈殿によって得ることができる。この際、先ず比較的低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて随伴たん白質の沈殿を行い、一方ＫＥＲｅｄはまだ溶液中に残存し、次いで液体からこれをより一層高い分子量を有するＰＥＧによって沈殿させ、沈殿物から緩衝溶液を再び“抽出”する。

あるいは種々のＰＥＧ−濃度と共にしかも１．０００ないし１０．０００の範囲、特に約５、０００の一定の分子量を処理することができる。クロマトグラフィー分離法による他の精製は、下記例で示される様により高い比活性を有する、好ましい単離物を生しる。

次に、本発明を例によって詳述する。その際、ここでの説明は添付の図面を参照して述べられている。図面は下記の通りである：図」及び２　グリセリン（１）又はドデカン酸（２）上で培養した場合、Ｃ，パラブシロシスによるＫＥＲｅｄの形成。

図３　Ｃ，バラブシロシスからのＫＥＲｅｄの活性を調節。

ａ）５．４％グルコース、ｂ）０．８％グルコース、ｃ）　２％グリセリン、ｄ）２％グリセリン＋０．１％誘導物質、ｅ）　１％ドデカン酸、Ｆ）　１％ドデカン酸＋０．１％誘導物質；誘導物質＝　３−オキソヘキサン酸エチルエステル。

図４　酸化及び還元の際のＫＥＲｅｄ−活性のｐＨ−依存性。

図５　Ｃ，パラブシロシスからのＫＥＲｅｄの基質結合部位モデル。

図６（ａ）ラセミ混合物に対する及び（ｂ）本発明によるＫＥＲｅｄ−反応生成物に対する（Ｒ）−及び（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルのクロマトグラフィー分離。

図７　本発明によるＫＥＲｅｄ−反応生成物に対する（Ｒ）−及び（Ｓ）−３− ヒドロキシ酪酸エチルエステルのクロマトグラフィー分離。

例１．酵素の回収ｌ、スクリーニングＤＭＳ（トイチェ　ザシムルング　ジオン　マイクロオルガニスメン　ラント　ツエカルチャー（Ｄｕｔｓｃｈｅ　Ｓａ＋ｎｎｍ１ｕｎ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）Ｇｍｂg１ブランシュバイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ））の寄託菌株をＤＭＳによって推挙された培地中て培養し、菌体を遠心分離して集め、湿潤粉砕によって上澄みを酵素源（粗抽出物）として使用し、ケトエステル−還元酵素−活性を試験する。テストを光度測定によって実施する。この際、次の成分を含有する・−０，２ｍＭ　ＭＡＤ（Ｐ）Ｈ −８ｍＭ　ケトエステル −０，１Ｍトリエタノールアミン（ＴＥＡ）−ＮａＯ）１−緩衝液、ｐＨ７−粗抽出物の限定量ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−減少は３３４ｎｍで１分間にわたって進行する。活性度を算出するために、６、１８Ｍ　”Ｃｍ−’の吸収係数を使用する。表１に６５種のテストされる微生物のグループから有効であると実証された、個々の微生物に対する得られた比活性をまとめて示す。

微生物１種につき、第１行にＮＡＤＨ−依存性比活性、第２行にＮＡＤＰＨ−依存比活性をｍｕ／ｍｇで示す。Ｕ（ユニット）は、１分あたり１μｍｏｌ還元された補酵素の変換率に相当する。

表１にＥＲｅｄ：　ＡＥＥＥ”　ＢＥＥＥ　ＡＢＳ　ＡＢＥＥ　ＬＳ　ＬＳＥＥｍｕ／ｍｇＰ、アシトポランス　４９．０　１１．６　９．１　１５．９−′４．１１５．６　３．５　−　− Ｒ，エリスロポリス　＋５３．０　３．Ｏｎ、ｂ、”　９７．Ｏｎ、ｂ、　８７．１ｎ、ｂ、　ｎ、ｂ、　− Ｃ，パラブシロシス　９１．０　４９．０　１６．４　９６．１　２．７　８５．１１４．１　２５．０　２５．０　４．５　２．４　１．３Ｙ、セロビオサ　＋０３．１　２０．３　ｎ、ｂ、　５５．４　ｎ、ｂ、　４１．１５．０　−　ｎ、ｂ、　−ｎ、ｂ、　４．０”　ＡＥＥＥ・アセト酢酸エチルエステル、　ＢＥＥＥ・ブチリル酢酸エチルエステル；ＡＢＳアセチル酪酸；　ＡＢＥＥニアセチル酪酸エチルエステル：シＳニラエバリン酸：ＬＳＥＥニラエバリン酸エチルエステル；２１二検出限界以下の活性、　３１０．１．、、測定されない。

２、カンジダ　バラブシロシスの増殖酵素を調製するために、カンジダ　パラブシロシスを次の培地中で増殖する。

（Ｉｆにつき）：酵母抽出物　１０ｇリン酸カリウム　Ｉｇ硫酸アンモニウム　１．２ｇグリセリン　２０ｇ　（抑制しない）又はグルコース　５４ｇ　（抑制する）又はグルコース　８ｇ　（脱抑制する）又はドデカン酸　１０ｇ場合により３−オキソヘキサン酸エチルエステルの０．１％添加（誘導物質）この溶液の両値を、４．５に調製し、次いで１５分間１２１°Ｃで（２バール）滅菌する。菌体を好気性培養する。１０？規模で３０℃の培養温度に達した後に、この培地に２０時間たっている培養液を植菌する。この様な１０トバツチ中で時間に対する酵素活性の経過を例示的に測定する。この際試料を種々の時間で取り出し、ケトエステル−還元酵素の活性を細胞の砕解後に測定する。図１中にこの経過を示し、ケトエステル−還元酵素の活性は２０時間後最大値に達し、次いで再び減少する。細胞を２０時間後遠心分離によって集める。この１ｌＩｉ８ｆ培地から湿性物１７５ｇが得られる。細胞物質を一２０°Ｃで凍結して保存する。

この際、数週間にわたって活性損失は認められない。

３、酵素単離（粗抽出物）完全な細胞からの酵素遊離は、公知方法（超音波、高圧−均一化、湿潤粉砕等々）によって行うことができる。この際細胞をガラス球で湿潤粉砕して砕解する。

更に細胞物質（１７５ｇ）を緩衝液（２００ｍＭ　ＴＥＡ−ＮａＯＨ−緩衝液（ｐ１４７．５））中に５−ジチオトレイトール及び１ｍＭプロテアーゼ−阻害物質（Ｐｅｆａｂｌｏｃ、メルク社、ダルムシュタット）の添加下に懸濁する。その際、細胞湿性物質の濃度は２５％である（最終容量７００ｍ１）。

細胞内容物を、冷却された懸濁液（４°Ｃ）からガラスパールミル（ＤｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒＳ、　ＩＭＡ社、フチンクアルト）を用いる機械的砕解によって遊離する。粉砕容器をガラス球（０，５ｍｍ：　０．３ｍｍ＝２：ｌ−割合、９０ｍ１）で満たし、２５％細胞懸濁液６０ｍ１で満たす。砕解を４０００ＵｐＭの撹拌波動回転数で実施する。冷却マントルを、操作の間冷却する。９分の砕解時間が最適であると分り、細胞砕解に使用する。細胞砕開後、上澄みをデカンテーションし、ガラス球を２回砕解緩衝液で洗滌する。

酵母湿性物質１７５ｇは、体積活性６．６０／ｍｌ及びたん白質含有量１０．７ｍｇ／ｍｌを有する粗抽出物２８５ｍ１を生じる。これから発酵混合物１００１からケトエステル−還元酵素約２３０００単位が得られつる（ｌ酵素単位とは１分あたり１μｍａｔアセチル酪酸エチルエステルが反応する酵素量である。）ことが算出される。

４、酵素の濃縮酵素をたん白質精製の公知方法、たとえば二段階のポリエチレングリコール分別沈殿、イオン交換−クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーによって濃縮し、精製する。

４　ｌ　ポリエチレングリコール−分別沈殿氷冷された粗抽出物（４°Ｃ）を、撹拌及びｐＨ−コントロール（ｐＨ７−７，５）下でポリエチレングリコール（分子量：　５０００）を加えて、濃度４％（Ｗ／Ｖ）とする。１０分間１１００００ＵＰで遠心分離後に得られた沈降物は、ケトエステル−還元酵素−活性を含存し、トリエタノールアミン−ＮａＯＨ−緩衝液、２０ｍ！ｉｆ、　ｐＨ７，５中に取り、凍結乾燥する。酵素は、この条件下で数ケ月間活性損失することなく維持される。

４．２　イオン交換クロマトグラフィー３０％ＰＥＧ−沈殿物から得られた再懸濁された沈降物１ｍｌ　（例１：４．１に対応）を、Ｑ−セファロース−ファーストフロー（Ｆａｓｔｆ　ｌｏｗ）−カラム（アニオン−交換体、高負荷、高処理、＋６／１０　、容量２０ｍ１）に装填する（ＦＰＬＣ−クロマトグラフィーシステム、ファルマシア社、フライグルタ）。カラムを緩衝液で平衡化する（２０−トリエタノールアミン−ＮａＯＨ−緩衝液；　ｐＨ７，５）。カラムを緩衝液Ａで十分に洗滌した後、ケトエステル−還元酵素を線状ＮａＣ１−勾配（０− ２００ｍＭ）で溶離し、その際酵素が約１００ｍＭ　ＮａＣ１で溶離する。クロマトグラフィー分離を、流出割合１ｍ／分で実施する。得られた濃縮物を表２中にまとめて示す。

４．３　アフィニティークロマトグラフィー最も高い活性を有するＱ−セファロース−クロマトグラフィーの分画を集め、限外濾過セル（アミコン、ヴイッテン／ルール）を用いて濃縮し、更に寒天−ＮＡＤ（シグマ社、ダイセンホーフェン）でクロマトグラフィー分離して精製する。ファルマシア社の低圧−クロマトグラフィーシステムを使用する。ゲル床は５ｍｌである。クロマトグラフィーを流出割合０．５ｍｌ／分で実施する。濃縮を表２中にまとめて示す。

表２：　ケトエステル−還元酵素の濃縮精製工程　比活性　全収率　濃縮（Ｕ／ｍｇ）　（％）　（倍）粗抽出物　０．６　１００　１．０４％ＰＥＧ−沈殿　０．７　７５　１．２３０％ＰＥＧ−沈殿　２．５　７５　４．２Ｑ−セファロースＦＦ　４０．３　７１　６７．０限外濾過　４０．３　６７　６７．０寒天−ＮＡＤ＋１８５５．０　６７　３０９１．０ケトエステル還元酵素の見かけの天然分子量１３ＫＤａ（±１ＩＫＤａ）を、セファデックスＧ−２００でゲルパーミテーションークロマトグラフィーによって測定する。その際チログロブリン、フェリチン、カタラーゼ、アルドラーゼ、子牛血清アルブミン、オバルブミン　キモトリプシノーゲンＡ及びリボヌクレアーゼ八を標準たん白質として使用する。２つの同一の大きい構成単位は見かけ分子量６７ＫＤａを有し、たとえばこれは５ＯＳ−ゲル電気泳動によって測定される。分子量標準として、Ｃ２− マクログロブリン、ホスホリラーゼｂ１子牛血清アルブミン、グルタマートープヒドロゲナーゼ、レフタート−デヒドロゲナーゼ及びトリプシン阻害物質から成る混合物を使用する。

ＫＥＲｅｄの種々の起源に応じて、分子量中での一定の差異が一定作用（β−１ γ−及びδ−ケトエステルのＮＡＤＨ−依存還元）で予想される。

例２　ケトエステル−還元酵素の制御ケトエステル−還元酵素の制御を調べる。細胞を異なるＣ−源（例１：２参照）上に２００ｍ１−規模で塗布する。ケトエステル酸−還元酵素の活性が最大である時点を決め、回収時点として確定する（図１参照）。

３−オキソヘキサン酸チルエステルに対するケトエステル−還元酵素の比活性は、種々のＣ−源上での増殖に関係なく図３中に示す。カンジダ　パラブシロシスのケトエステル−還元酵素はカタボライト（Ｋａｔａｂｏｌｉ　ｔ）−抑制を受ける。脱抑制化条件（培地中で０．８％グルコース）下で酵素の比活性は、抑制条件（培地中５．４％グルコース）下よりも約３６％高い。非−抑制条件（培地中で２％グリセリン）は抑制条件下よりも約３００％高い。ドデカン酸での増殖の場合、カンジダ　パラブシロシスのケトエステル−還元酵素の活性は７００％以上に上昇する。培地にケトエステルの添加（０，１％）は、Ｃ−源としてグリセリンの場合比活性の上昇を３５０％に上昇させる。

例３：ケトエステルー還元酵素の特性次の試験に関して、部分的に精製された酵素（Ｑ−セファロース−クロマトグラフィー後、６７倍濃縮）を使用する。

Ａ１反応のｐＨ−依存性活性のｐＨ−値依存性を測定する。その際５−オキソヘキサン酸エチルエステル（３５ｍＭ）をＮＡＤＨ（０，２ｍＭ）及び１Ｏｕｌ酵素溶液と種々のｐＨ−値（０，２Ｍ緩衝溶液）で混合し、活性を３４０ｎｍ（３０°Ｃ）で光度測定によって追跡する。図４はｐＨ−値に左右される得られた活性値を示し、５−オキソヘキサン酸エチルエステルー還元の最適条件は、ｐＨ７，９である。

同様な方法で、逆反応、すなわち５−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル−酸化に対するｐｌ−最適条件を測定する。（Ｒ／５）−５−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル（３５ｍλ１）を４〜１０のｐＨ−値を有する０、２Ｍ緩衝液中に溶解し、０．２ｍＭ　ＮＡＤＨ及びｌＯμ！酵素溶液を加え、ＮＡＤ−形成率を３４０ｎｍて光度測定によって追跡する。図４は得られた値を示す、酸化のｐＨ−最適条件はｐ）１９．５である。

Ｂ、還元の温度依存性還元の最適温度を決めるために、酵素活性を３０〜６０℃で測定する。テスト混合物は次の物質を含有する：５−オキソヘキサン酸エチルエステル　３５　ｍＭＮＡＤＨ０，２ｍＭ酵素溶液　ｌＯμ１ＴＥＡ−ＮａＯＨ−緩衝液、０．１　Ｍ；　ｐＨ７，９Ｃ，バラブシロシスからのＫＥＲｅｄｅは、３６〜４０°Ｃの還元最適温度を有する。

Ｃ３酸化の最適温度酸化の最適温度を決定するために、酵素活性を３０〜６０°Ｃで測定する。テスト混合物は次の物質を含有する：５−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル　３５ｍＭＮＡＤ　Ｏ，５＋ｎＭ酵素溶液　１０μ１ＴＲＩＳ−ＨＣＩ−緩衝液、０．ｔ　Ｍ、　Ｉ）Ｈ９Ｃ，バラブシロシスからのＫＥＲｅｄは、５０〜６０°Ｃの酸化最適温度を有する。

Ｄ、　ＫＥＲｅｄに対する種々の試薬の影響酵素活性への種々の金属カチオン及び試薬の影響を調べる。この隔測３．　８に記載したテスト混合物を使用する。

阻害試験の結果を表３中にまとめて示す。注目すべきことは、酵素がキレート化剤、０−フェナントロリンによって比較的強く阻害されるが、これに反してＥＤＴＡによって実質上阻害されないことである。ケトエステル−還元酵素は、０− フェナントロリンによって除去される必須金属イオンを有することが明らかである。このことは更に活性損失を導く。チオール−試剤、たとえばＮ−エチルマレイミド、ヨードアセトアミド、２．２−ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾアート）及びｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀によるケトエステル−還元酵素の増加する著しい阻害は、酵素が少なくとも１個の必須ＳＨ−基を含有することを示す。

表３：Ｃ，バラブシロシスからのＫＥＲｅｄの阻害試験化合物　残存活性〔％〕０．１ｍＭ　１．０ｍＭ金属イオンＮｉ”　１０　０Ｚｎ”　２４　０Ｓｎ”　７３　０Ｃｏ’　３８　１２Ｃａ”　７８　６８Ｍｎ”　８４　８０Ｍｇ友　９１８２Ｆｅ”　＋００　ｎ、ｂ、” ＫＣＮ　１００　１００キレート化剤ＥＤＴＡ（＋＋ｎＭ、　ｌｏｍＭ）　１００　８０２、２’−、ビピリジル（０，０５ｍＭ＋　０．５ｍＭ）　５２　２３０−フェナントロリン　２６　ｎ、ｂ。

スルホヒドリル−試薬ｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀　００５、５−、ジチオ−ビス（２−ニトロベンゾアート）５３０ヨードアセトアミド　７７　１７．５Ｎ−エチルマレイミド　７０４７メチルグリオキザール　１００　３４スルホヒドリル−保護試薬１．４−ジチオトレイトール　＋００　１００グルタチオン（還元された）’　＋００　１００ヒスチジン−特異試薬ジエチルピロカポナート　＋００　１００他の試薬エタノール（５％）　３０トリトンＸ−１００（０，１％）　−１００フエフアブロク（ＰｅｆａｂｌｏｃＸプロテアーゼ阻害剤）　ｎ、ｂ、　１００１１０、ｂｌ、測定されずＥ、　ＫＥＲｅｄの活性に対する緩衝液濃度の影響ケトエステル−還元酵素の活性への緩衝液濃度の影響をテストする。更に例３゜Ｂに記載したテスト混合物を緩衝液濃度の変化によって使用する。

酵素活性は、０．１１１の緩衝液モル濃度で最大である。

Ｆ、　ＫＥＲｅｄの基質スペクトル例３．　８に対応して、５−オキソヘキサン酸エチルエステルの代わりに一連の芳香族及び脂肪族ケトエステル、ケト酸、ケトン、ジケトン及びアルデヒドを、これらが酵素触媒による還元されるかどうかを調べる。その際化合物を常に８嘘最終濃度で添加する。結果を、表４中にまとめて示す。酵素は多数の芳香族及び脂肪族オキソ化合物を基質として受け入れることが分かる。

５−オキソヘキサン酸エチルエステルによる活性は、実質上１００％とする。

表４０．パラブシロソスからのＫＥＲｅｄの基質特異性化合物　比活性〔％〕　化合物　比活性〔％〕ケト酸及び−エステル脂環式ケトン芳香族ケトン脂肪族ケトン脂肪族アルデヒド α−ケトカルボン酸及び−エステル及びアリル−ケトンは反応しない。

明らかに、ケトエステル−還元酵素の基質スペクトルは著しい広い。この際β− １γ−及びδ−ケトエステルの他に、１．３−及び１．４−ジケトン、場合により置換された、特にハロゲン化された脂肪族、脂環式及び芳香族ケトン、ケトアセタール及びアルデヒドを受け入れる。

Ｇ、　ＫＥＲｅｄの反応速度特性選ばれた基質に関して、上記光度測定テストによってＣ，バラブシロシスからのＫＥＲｅｄの選ばれた基質を反応速度の点で測定する。反応速度特性の結果は、表５中にまとめて示す。

表５　：　ＫＥＲｅｄの反応速度特性Ｎｏ、　基質　Ｖｍａｘ　Ｋｍ　Ｖｍａｘ／Ｋｍ（％）　（蘭）（−）脂肪族ケトンｌ　アセトン　９７　１．０６０　５．５２　クロルアセトン　６１　０．１２４　２９．５３　１．１−ジクロルアセトン　４５　０．１７６　１５．３４　ビルビアルデヒドージメチルアセクール　２４　０．１８９　７．６５２−ブタノン　１００　１．４８０　４．１６３−クロル−２−ブタノン　５９　０．４４２　６．８７２− ペンタノン　６２　０．１４１　２６．４８２−へキサノン　５３　０．０５４　５８．９９３−ヘキサノン　１０　０．８４０　０．７１０　２−ヘプタノン　５８　０．０９７　３５．９１１　３−へブタノン　１１　５．６　０．１１２４−へブタノン　９５．３０．１１３２−オクタノン　６２　０．３２４　１１．５１４　３−オクタノン　１２　１１．２０　０．１１５　２−ノナノン　４５　０．３１４　８．６１６　２ −デカノン　２０　３．９６０　０．３芳香族ケトン１７　アセトフェノン　２２　０．０４９　２６．９＋８　３−クロル−アセトフェノン　３２　０．０１５　１２８．０１９　４−クロル−アセトフェノン　１９　０．０１０　＋１４．０２０　アセトアルデヒド　１２９　０．０８５　９１．０２１　エチル　３−オキソブタノアート　７９　０．１２２　３８．９２２ｔ、−ブチル　３−オキソブタノアート７１　０．３５６　１２．０２３　エチル４−クロル−３−オキソブタノアート　１０　３．５６　０．２２４　エチル４−トリフルオル−３−オキソブタノアート　Ｉ＋　２．０　０．３２５　エチル３−オキソペンタノアート　１７　６．９　０．１２６　エチル３−オキソペンタノアート　５１．３０．２２７　エチル４−オキソペンタノアート　１２　１．７３　０．４２８　エチル５＝オキソヘキサノアート　１１６　０．８９　７．８第−及び第二アルコール２９　メタノール　反応せず３０　エタノール　４２　３．４　０．７３１　１−プロパツール　４７　３．８　０．７３２　１−ブタノール　４７　２．９　１．０３３２−プロパツール　１８３　２．２１　５．０３４　（Ｓ）−２−ブタノール　２１０　０．６　２１．０補酵素３５　ＮＡＤＨ１０５０，０３８１６５，８３６ＮＡＤＰＨ反応せずすへてのＶｍａｘは、２−ブタノンに対してである（６０／ｍｇ、部分的に精製された酵素）、基質阻害をクロルアセトン（Ｋｉｓ　：　１２１．３ｍＬｌ）　、３−ヘキサノン（Ｋｉｓ　：　６１２ｍＮ１）及び２−ノナノン（にｉｓ　：　２４．９ｍＭ）で観察する。一般に最大反応速度及びミカエリス・メンテン定数の標準誤差は、値の５−１０％である。

これらの結果から、ＫＥＲｅｄの基質結合部位に対するモデルを導くことができる。

このモデルによって、ＫＥＲｅｄの特定の考えられる基質が受け入れられるか、されないか予想することができる。図５中に基質結合部位のモデルを示す。

これによれば基質結合部位は、容量と疎水性の点で異なる２つの領域から成る。

小さい袋はメチル−、エチル−及びプロピル基を取り込む。それは共に置換されたメチル基、たとえばクロルメチル基も受け入れる。大きい袋は、長い及び疎水性残基を結合する。表５から明らかな様にこれはＣ１までの脂肪族残基（２−デカノン）であることができる。大きい袋は立体的要求の多い残基も多く取り込み、酵素の極めて広い基質スペクトルを決定することができる。

Ｈ，バッチ−混合物中で３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルの酵素触媒による製造３−オキソ酪酸メチルエステルの溶液（ｌｏｏｍＭ）を、ケトエステル−還元酵素（＋００）及び補酵素（０，１ｍＭ）と反応させ（１００ｍｌ全容量）、その際補酵素ＮＡＤＨをギ酸ナトリウム（ＩＭ）及びホルマート−還元酵素（４００）とのカップリングによって再生する。一定の間隔て試料を取り出し、薄層クロマトグラフィー（ＤＣ）を用いて形成された３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルを分析する。対掌体純度をＧＣ−分析によって測定する。

ＤＣの分離条件固定相：　シリカゲル６０　Ｆ　２５４移動相：　ジエチルエーテル：石油エーテル６Ｏ−８０＝２　：　１展開距離：　５　ｃｍ浸漬溶液・　４％ＨＣＩを存する無水エタノール９ニ０処理．　飽和シリンダーで傾斜クロマトグラフィー試料容量：　２−１０μｌ展開挙動：ヒドロキシ酸／ーエステルは、ケト酸／ーエステルより小さい幅で展開する３６時間の反応が経過した後、対掌体純度の測定のために、反応混合物をクロロホルムで抽出し、沈殿したたん白質を分離し、有機相をトリフルオル無水酢酸（ＴＦＡＡ）を用いて誘導する。試料をキラルガスクロマトグラフィーで分析する。

ＧＣの分離条件・Ｓカラム：　リボデックス（Ｌｉｐｏｄｅｘ）Ｅ（２５ｍｘ０．２５ｍｍ　ＩＤ）ヘリウム・　０．８バール水素・　０．５バール試料容量　ｌμＩＴカラム：８０°Ｃ又は９０°ＣＴインゼクター＝２６０℃ 保持時間：３−（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸メチルエステル　ｌ００５　分３−（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸メチルエステル　１４．９　分キラルＧＣーカラムての対掌体の溶離順序を、３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルの純粋な対掌体を用いて（Ｓ）の前に（Ｒ）を特定化する。ＧＣ−分析の結果を図６に示す。カンジダパラブンロシスからのケトエステル−還元酵素は、９８％の過剰対掌体及び９５％収率の３−オキソ酪酸メチルエステルを（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルに変換する。

■、バッチー混合物中で５−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステルの酵素触媒による製造例３．　Ｈと同様に、５−オキソヘキサン酸エチルエステルを、実験室規模で酵素によって還元する。試料をキラルクロマトグラフィーによって分析する（Ｔｓ：９０°Ｃ）、保持時間：５−（Ｒ）−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル　２５．０　分５−（Ｓ）− ヒドロキシヘキサン酸エチルエステル　２６．９　分ＧＣ−分析の結果を、図７中に示す。カンジダ　パラブシロシスからのケトエステル−還元酵素は、９５％の過剰対掌体及び９６％収率を有する５−オキソヘキサン酸エチルエステルを（Ｓ）−５−ヒドロキシヘキサン酸エチルエステルに変換する。

Ｊ、酵素の立体特異性の検出酵素の立体特異性及び生成物の対掌体純度の検出のために、２つの方法を使用する。一方で酵素により製造された生成物を、（Ｒ）−及び（Ｓ）−ヒドロキシエステルを相互に分離することができるキラルクロマトグラフィーで調べ、他方で（Ｒ）−及び（Ｓ）−ヒドロキシ酸エステル並びに（Ｒ）−及び（Ｓ）−フェニルエタノールの市販の純粋な異性体を用いて光度測定によって酸化反応を測定する。

１　キラルＧＣ酵素反応の生成物並びに視線の純粋な対掌体を、例３．Ｈと同様にキラル相でガスクロマトグラフィーによって分離する。ピークの配分は、３−ヒドロキシ酪酸メチルエステルの市販の純粋対掌体と比較して行われる。溶離順序：（Ｓ）の前の（Ｒ）は、ヒドロキソエステルの対応する順序にも適用される。図６は、酵素による反応によって純粋な（Ｓ）−ヒドロキシ酪酸メチルエステルに達することを示す。

２、　（Ｒ）−又は（Ｓ）−ヒドロキシ化合物との逆反応立体特異性の光度測定による検出のために、次のテスト混合物を用いる：Ｉ）　３５ｍＭ　（Ｒ）−ヒドロキシ酪酸メチルエステル０、５＋ｕＭ　ＮＡＤ１０μｌ　酵素溶液ＴＲｌ５−ＨＣＩ−緩衝液、ｐ）Ｉ　９．０．１　ＭＩＩ）　３５ｍＭ　（Ｓ） −ヒドロキシ酪酸メチルエステル０、５ｍＭ　ＮＡＤ１０μＩ　酵素溶液トリス−ＣＩ−緩衝液、ｐＨ９，０，１Ｍ温度＝５６℃ ■）ｓ　１１１１１１　（Ｒ）−フェニルエタノール０．５ｍＭ　ＮＡＤ１０μｌ　酵素溶液ＴＲｌ５−ＨＣＩ−緩衝液、ｐＨ９，０，１ＭＩＶ）　８　ｍＭ　（Ｓ）−フェニルエタノール０、５ｍＭ　ＮＡＤｌＯμｌ　酵素溶液ＴＲｌ５−ＨＣＩ−緩衝液、ｐＦｌ　９．０．１　Ｍ活性測定を３４０ｎｍで光度測定によって行う。

糀！− 混合物Ｉ：　７％　混合物に：　１００％混合物ｍ：　１．１％　混合物■：１００％結果は、酵素が（Ｓ）−３−ヒドロキシ酪酸メチルエステル及び（Ｓ）− フェニルエタノールに対して極めて特異的であることを明らかに示す。

［５ｕｌ／ｎ山］　０［５ＬＬＩ／ｎ山］　０大きい袋補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年９月１２日

Claims

【特許請求の範囲】

１．β−、γ−及びδ−ケトエステルをＮＡＤＨ−依存酵素反応して対応する光学的に活性なβ−、γ−及びδ−ヒドロキシ酸エステルにすることができる、ケトエステル−還元酵素であり、これはカンジダパラプシロシス（ＣａｎｄｉｄａＰａｒａｐｉｌｏｓｉｓ）、ヤローヴィニアセロビオサ（Ｙａｒｒｏｗｉｎｉａ　ｃｅｌｌｏｂｉｏｓａ）、ロードコッカスエリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）又はシュードモナスアシドボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ）の菌株から単離することができる、上記ケトエステル−還元酵素。
２．Ｃ−源として長鎖のアルカン酸又はアルカンを含有する培地で増殖された菌株から単離される、請求の範囲１記載のケトエステル−還元酵素。
３．カンジダパラプシロシス株（ＤＳＭ７０１２５）から単離される、請求の範囲１又は２記載のケトエステル−還元酵素。
４．精製された形で次のパラメーターを有する；−ｐＨ−最適条件は、ケトエステル−還元に関してｐＨ７．８ないし８．０及び逆反応に関して約ｐＨ９．５．である、 −ケトエステル−還元に最適な温度は、３６℃ないし４０℃及び逆反応に最適な温度は５０℃ないし５６℃である、 −Ｈｇ２−、Ｐｂ２−、Ａｇ−、Ｃｕ２−、Ｎｉ２−、Ｓｎ２−及びＣｏ２−イオンによる急速な脱活性化、ｐ−ヒドロキシ安息香酸水銀、５．５′−ジチオビス（２−ニトロベンゾアート）及びヨードアセトアミドによる並びにキレート化された２．２′−ビピリジル及び０−フエナントロリンによる著しい阻害及びＳＨ−保護試薬、たとえばジチオトレイトールによる安定化、−脂肪族、脂環式及び芳香族ケトン、ジケトン、ケタール及びアルデヒドの還元のための並びに第一及び第二アルコールの酸化のための更なる能力、ことを特徴とする、請求の範囲１ないし３のいずれかに記載のケトエステル−還元酵素。
５．オキソ−化合物を酵素還元して光学的に活性なＳ−ヒドロキシ化合物とするにあたり、オキソ−化合物をＮＡＤＨの存在下に請求の範囲１ないし４のいずれかに記載のケトエステル−還元酵素によって変換することを特徴とする、上記酵素還元方法。
６．請求の範囲１ないし４のいずれかに記載のケトエステル−還元酵素を用いて酵素酸化によって光学的に活性なＲ−ヒドロキシ−化合物を製造するにあたり、Ｒ−及びＳ−ヒドロキシ−化合物のラセミ体から出発し、Ｓ−対掌体を酵素によりオキソ−化合物に変え、次いで分離することを特徴とする、上記製造方法。
７．β−、γ−及びδ−ケトエステルをＮＡＤＨ−依存酵素反応して対応する光学的に活性なβ−、γ−及びδ−ヒドロキシ酸エステルにすることができる、ケトエステル−還元酵素を回収するにあたり、カンジダパラプシロシス、ヤローヴィニアセロビオサ、ロードコッカスエリスロポリス又はシュードモナスアシドボランスの菌株を培養し、微生物によって産出される酵素を細胞−粗抽出物からＰＥＧ−分別沈殿によって単離することを特徴とする、上記ケトエステル−還元酵素の回収方法。
８．更に酵素を精製するために、引き続きクロマトグラフィ−分蔵を行う、請求の範囲７記載の方法。