JP2007523617A - ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
a)配列番号8,配列番号5,配列番号6或いは配列番号7に記載のヌクレオチド配列或いはその相補鎖を有するDNA配列,
b)a)に記載のDNA配列の一種以上或いはその相補鎖に対し,ストリンジェントな条件下で行うハイブリダイゼーションによってハイブリダイズするDNA配列,及び
c)遺伝コードの変性によって,a)或いはb)に記載のDNA配列の一種以上でコードされるたんぱく質をコードするDNA配列
から成る群から選択される単離DNA配列に関する。
a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する
ことを特徴とする方法に関する。
R1−C(O)−R2 (I)
で表される化合物を意味する。
1)直鎖或いは分岐鎖の−(C1−C20)−アルキル,
2)直鎖或いは分岐鎖であり,鎖長に応じて1個,2個,3個或いは4個の二重結合を含む−(C2−C20)−アルケニル,
3)直鎖或いは分岐鎖であり,任意的に1個,2個,3個或いは4個の三重結合を含む−(C2−C20)−アルキニル,
4)−(C6−C14)−アリール,
5)−(C1−C8)−アルキル−(C6−C14)−アリール,
6)非置換であるか,或いはハロゲン,ヒドロキシル,アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−(C5−C14)−複素環,或いは
7)−(C3−C7)−シクロアルキルであって,
1)〜7)で記載した各基は非置換であるか,或いは互いに独立して,
a)−OH,
b)フッ素や塩素,臭素,ヨウ素等のハロゲン,
c)−NO2,或いは
d)−NH2
で一置換,二置換或いは三置換されている。
1)直鎖或いは分岐鎖の−(C1−C6)−アルキル,
2)直鎖或いは分岐鎖であり,鎖長に応じて1個,2個或いは3個の二重結合を含む−(C2−C6)−アルケニル,
3)直鎖或いは分岐鎖であり,任意的に1個或いは2個の三重結合を含む−(C2−C6)−アルキニル,或いは
4)アルキル部分が直鎖或いは分岐鎖であり,非置換であるか,或いはハロゲン,ヒドロキシル,アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−(C0−C10)−アルキル−C(O)−O−(C1−C6)−アルキルであって,
1)〜4)で記載した各基は非置換であるか,或いは互いに独立して,
a)−OH,
b)フッ素や塩素,臭素,ヨウ素等のハロゲン,
c)−NO2,或いは
d)−NH2
で一置換,二置換或いは三置換されている。
R1−C(OH)−R2 (II)
で表される化合物を意味し,式中,OH基は通常,それが結合している炭素原子に対して(S)配置であり,R1及びR2は式Iの場合と同様の意味を有する。
a)本発明に係る酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADを補基質を用いてNADHに還元し,
c)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)本発明に係る酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADを脱水素酵素及び補基質を用いてNADHに還元し,
c)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)本発明の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)本発明の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)該酸化還元酵素によって生成したNADを補基質を用いてNADHに還元し,
d)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)本発明の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADを脱水素酵素及び補基質を用いてNADHへ同時に(simultaneously)還元し,
c)有機溶媒の存在下で反応を行い,
d)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
R1−C(OH)−R2 (II)
で表され,R1基及びR2が上述と同様であるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を回収するための方法に関する。前記方法においては,
a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,本発明に係る酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離する。
a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,本発明に係る酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADHを補基質を用いてNADに酸化し,
c)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,本発明に係る酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADHを脱水素酵素及び補基質を用いてNADに酸化し,
c)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,本発明に係る酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離する,方法に関する。
a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,本発明に係る酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)該酸化還元酵素によって生成したNADHを脱水素酵素及び補基質を用いてNADに酸化し,
d)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする。
スクリーニングのために,多数の様々な酵母菌株を次の培地:酵母エキス(3),麦芽エキス(3),ペプトン(5)及びグルコース(10)で培養した(データは全てg/L)。培地を121℃で殺菌し,更なるpH調整を行わずに振盪機にて25℃,160回転/分(rpm)で酵母を培養した。次いで,125mgの細胞を800μLの消化バッファー(100mM トリエタノールアミン(TEA),pH=7.0)で再懸濁させ,1gのガラスビーズと混合し,グローブミル(Retsch)にて4℃で10分間(min)消化させた。12,000rpmで2分間遠沈した後に得た上清(ライセート)を次の活性スクリーニング及びエナンチオマー過剰率(ee値)の測定に用いた。エチル−4−クロロアセトアセテート及び2−クロロ−1−(3−クロロフェニル)エタン−1−オンを基質として用いた。
860μL 0.1M KH2PO4/K2PO4,pH=7.0,1mM MgCl2
20μL NADPH或いはNADH(10mM)
20μL ライセート
100μL 各基質(100mM)
20μL ライセート
100μL NADH或いはNADPH(50mM)
60μL 基質(エチル−4−クロロアセトアセテート 100mM)
ee(%)=((R−アルコール − S−アルコール)/(R−アルコール + S−アルコール))×100
酵素単位の定義:1Uは,1分当たり基質1μmolを反応させるのに必要な酵素量に相当する。
ピキア・カプスラータ(P.カプスラータ)からNADH依存性酸化還元酵素を単離するため,実施例1に記載したように微生物を培養した。定常期に達した時点で,細胞を採取し,遠沈によって培地から分離した。ガラスビーズを用いた湿式粉砕によって酵素の遊離を行ったが,酵素遊離は他の消化方法によって行うこともできる。この目的のために,100gのP.カプスラータを400mLの消化バッファー(100mM トリエタノールアミン,1mM MgCl2,pH=7.0)で懸濁させ,フレンチプレスによってホモジナイズした。
ゲル浸透後,実施例2に記載の酵素調製物を10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ゲルに分画し,ポリビニリデンジフルオライド膜(PVDF膜)上に移した。約35〜45kDaにおける明確なバンドをエドマン分解(Procise 492(PE−バイオシステム))によるN末端配列決定に付した。次のN末端配列が得られた。
配列番号10
KTQAGYIFKKGA
真核微生物ピキア・カプスラータは,サッカロマイセタセア(Saccaromycetacea)のファミリーに属する。該微生物のゲノム構造は,エキソン−イントロン配列を示す。従って,エナンチオ選択的酸化還元酵素をコードする遺伝子配列を同定するため,ピキア・カプスラータの活性細胞からcDNAライブラリーを調製した。
ピキア・カプスラータ由来の新鮮細胞(600mg)を2.5mLの氷冷LETS(10mM tris−HCl,pH=7.4,10mM EDTA,100mM LiCl,0.2%SDS)バッファーに再懸濁させた。得られた細胞浮遊液に,硝酸で洗浄し3mLのフェノール(pH 7.0)で平衡化した5mL(約20g)のガラスビーズを添加した。その直後,バッチ全体に対して,1回30秒間(sec)の振盪(Vortex Genie 2,Scientific Industries社,米国,ニューヨーク)と30秒間の氷上冷却とを交互に行い,この処理を合計10分間行った。次いで,更に氷冷LETSバッファー(5mL)を添加した。得られた細胞浮遊液を11,000g,4℃で5分間遠沈した。水相を除去し,抽出を2回,同体積のフェノール:クロロホルム:3−メチル−1−ブタノール(24:24:1)で行った。その後,クロロホルムで抽出を行った。最終抽出を行った後,1/10vol.の5M LiClを添加して,得られた全RNAを−20℃で4時間沈殿させた。
配列番号1に基づき,特定のプライマーを構築した後,全長転写物を適切な発現系にクローニングした。その際,NdeI(或いはSphI)の認識配列を有する5’−プライマーとHindIIIの認識配列を有する3’−プライマーとを修飾した(配列番号5,配列番号6,配列番号7)。
オリゴ1−NdeI:5’−GGAATTCCATATGTCTGCTCTCTCCAAAAC−3’
オリゴ2−SphI:5’−CACTGCATGCTGATGTCTGCTCTCTCCAAAAC−3’
オリゴ3−HindIII:5’−CCCAAGCTTTCATGGAAGCATAACCAATCTT−3’
サイクル1: 94℃,2分間
サイクル2×30: 94℃,15秒間
58℃,30秒間
68℃,75秒間
サイクル3: 68℃,7分間
4℃,∞
コンピテント大腸菌StarBL21(De3)細胞(インビトロジェン)を本発明に係る酸化還元酵素をコードする発現構築物pET21−PC#10で形質転換した。500nmで測定される光学密度が0.5となるまで,形質転換菌株の培養をアンピシリン(50ig/mL)を含有するLB培地(1%トリプトン,0.5%酵母エキス,1%NaCl)にて行った。組換え酸化還元酵素タンパク質の産生は,イソプロピルチオガラクトシド(IPTG)の添加(最終濃度1mM)によって開始した。誘導バッチを25℃,220rpmで更に15時間インキュベートした。得られた酵素活性は約6000U/g湿細胞質量となった。
コンピテント大腸菌RB791細胞を本発明に係る酸化還元酵素をコードする発現構築物pQE30−PC#12で形質転換した。500nmで測定される光学密度が0.5となるまで,形質転換菌株の培養をアンピシリン(50ig/mL)含有LB培地(1%トリプトン,0.5%酵母エキス,1%NaCl)にて行った。組換え酸化還元酵素タンパク質の産生は,IPTGの添加(最終濃度0.1mM)によって開始した。誘導バッチを25℃,220rpmで更に15時間インキュベートした。得られた酵素活性は約1000U/g湿細胞質量となった。
5.1 最適pH値
表3に示すバッファーを調製した。各バッファーにおいて各バッファー成分の濃度は50mMとなった。
870μL 表3に記載の各バッファー系
20μL NADH 10mM(8.6mg/mL水)
10μL 希釈酵素
組換え酸化還元酵素の活性については,表3に記載のバッファー系へ中における保存性によって確認した。この目的のために,各種バッファー(50mM)をpH領域4〜11で調製し,実施例4で産生した酸化還元酵素を該バッファーで希釈した。インキュベーションを30分間,60分間及び300分間行った後,各バッチから10μLを採取し,実施例1に記載の活性試験に用いた。
最適試験温度を求めるため,標準的な測定用バッチにて温度範囲15℃〜70℃で酵素活性を測定した。表4から分かるように,45℃で酵素活性は最大となり,その後,活性は急速に低下する。
温度安定性については,実施例5.2で記載した方法と同様に15℃〜70℃の範囲で確認した。この目的のために,精製酸化還元酵素の1:20希釈物を各温度で60分間及び180分間インキュベートした後,上述の試験用バッチを用いて30℃で測定を行った。本例においても,精製酸化還元酵素をリン酸カリウムバッファー50mM(pH=7.0)に希釈した直後に得られた測定値を初期値として用いた。本例においても,前記初期値を100%値として設定した。
本発明に係る酸化還元酵素の基質スペクトルについては,多数のケトンやオキソ酸及びそのエステルを用いて酵素活性を測定することによって確認した。この目的のために,実施例5.1に記載の標準的な測定用バッチを様々な基質と共に用いた。エチル−4−クロロアセトアセテートの場合の活性を100%とし,これに対して他の基質全ての場合の活性を求めた。ee値を測定するため,選択した基質に対して次の反応バッチを用いた。
60μL 基質(100mM)
+1〜2Uの本発明に係る酸化還元酵素
P.カプスラータ由来酸化還元酵素の酵素安定性については有機溶媒の存在下で検討した。この目的のために,該酸化還元酵素を後述の各溶媒混合物(水混和性有機溶媒の場合)で1:20希釈し,室温(20℃〜24℃;RT)でインキュベートした。次いで,10μLの酵素溶液を標準的な試験バッチに用いた。本例においても,バッファー(リン酸カリウムバッファー(KPP)100mM,pH=7.0)で希釈後の初期値を100%とし,他の値全てを前記初期値に対して求めた。
5.7.1 エチル−4−クロロアセトアセテートからエチル−(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブタン酸への還元
調製用バッチとして,34Lのバッファー(100mM TEA,pH=7,1mM ZnCl2,10%グリセロール),4Lのイソプロパノール,4Lの4−クロロアセトアセテート,4gのNAD及び360万Uのピキア・カプスラータ由来組換え酸化還元酵素の混合物を絶えず混合しながら,室温で24時間インキュベートした。24時間後,用いた4−クロロアセトアセテートの99%が還元された。次いで,得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し,溶媒をロータリーエバポレータによって除去し,粗生成物を蒸留した。このようにして,エナンチオマー過剰率が99%のエチル−(R)−4−クロロ−3−ヒドロキシブタン酸を2.8L(3.4kg)回収した。この場合,用いた抽出物量に対する収率は70%となる。
調製用バッチとして,164mLのバッファー(100mM TEA,pH=7,1mM ZnCl2,20%グリセロール),16mLのイソプロパノール,メチルtert−ブチルエーテル(MTBE)(20mL)に溶解した20gの2−クロロ−1−(3−クロロフェニル)エタン−1−オン,10mgのNAD及び20,000Uのピキア・カプスラータ由来組換え酸化還元酵素の混合物を絶えず混合しながら,室温で24時間インキュベートした。24時間後,用いた2−クロロ−1−(3−クロロフェニル)エタン−1−オンの96%が還元された。次いで,得られた反応混合物を酢酸エチルで抽出し,溶媒をロータリーエバポレータによって除去した。このようにして,エナンチオマー過剰率が100%の(R)−2−クロロ−1−(3−クロロフェニル)エタン−1−オールを15g回収した。この場合,用いた抽出物量に対する収率は77%となる。
Claims (40)
- NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元することを特徴とする,酸化還元酵素。
- ピキア属或いはカンジダ属の酵母,特にピキア・カプスラータから得ることができることを特徴とする,請求項1に記載の酸化還元酵素。
- 配列番号8に記載のDNA配列及び配列番号9に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とする,請求項1又は2に記載の酸化還元酵素。
- アミノ酸の70%超が配列番号9のアミノ酸配列と同一であり,エチル−4−クロロ−3−オキソブタン酸から(R)−エチル−4−クロロ−3−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性が1μmol/mgタンパク質を超えることを特徴とする,請求項1〜3のいずれか一項に記載の酸化還元酵素。
- アミノ酸の80%〜99.5%,特に90%〜99.5%,更に特に99%〜99.5%が配列番号9のアミノ酸配列と同一であることを特徴とする,請求項4に記載の酸化還元酵素。
- 配列番号9のアミノ酸配列を有する酸化還元酵素よりもアミノ酸が1〜40個多いか或いは1〜40個少なく,エチル−4−クロロ−3−オキソブタン酸から(R)−エチル−4−クロロ−3−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性が1μmol/mgタンパク質を超えることを特徴とする,請求項1〜5のいずれか一項に記載の酸化還元酵素。
- 配列番号9のアミノ酸配列よりもアミノ酸が1〜25個,特に2〜20個,或いは3〜10個多く或いは少なく存在することを特徴とする,請求項4に記載の酸化還元酵素。
- 配列番号9のアミノ酸配列を有し,水溶性ポリマーで1回,2回,3回,4回或いは5回修飾されており,エチル−4−クロロ−3−オキソブタン酸から(R)−エチル−4−クロロ−3−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性量が1μmol/mgタンパク質を超えることを特徴とする,請求項1〜6のいずれか一項に記載の酸化還元酵素。
- 前記水溶性ポリマーはポリエチレングリコールであることを特徴とする,請求項8に記載の酸化還元酵素。
- 配列番号9のアミノ酸配列の複数の断片に相当し,一断片当たりのアミノ酸数が5〜30であることを特徴とするタンパク質断片。
- 前記複数の断片は,6〜25アミノ酸鎖長,特に8〜20アミノ酸鎖長或いは10〜18アミノ酸鎖長,特に配列番号10のアミノ酸配列の鎖長を有する配列番号9の複数の断片であることを特徴とする,請求項10に記載のタンパク質断片。
- 配列番号9のアミノ酸配列或いは配列番号9のアミノ酸配列の複数の断片を有する酸化還元酵素を含み,他のポリペプチドに対してN末端或いはカルボキシ末端でペプチド結合により結合しているアミノ酸の数が5〜30であることを特徴とする融合タンパク質。
- 配列番号9或いは配列番号10に記載の酸化還元酵素に特異的に結合することを特徴とする抗体。
- 配列番号9及び配列番号10に記載の酸化還元酵素をコードする単離核酸配列。
- NADH及び水の存在下でカルボニル化合物の対応する(S)−ヒドロキシ化合物への還元を触媒する酸化還元酵素の単離DNA配列であって,
a)配列番号8,配列番号5,配列番号6或いは配列番号7に記載のヌクレオチド配列或いはその相補鎖を有するDNA配列,
b)a)に記載のDNA配列の一種以上或いはその相補鎖に対し,ストリンジェントな条件下で行うハイブリダイゼーションによってハイブリダイズするDNA配列,及び
c)遺伝コードの変性によって,a)或いはb)に記載のDNA配列の一種以上でコードされるたんぱく質をコードするDNA配列
から成る群から選択される単離DNA配列。 - 核酸塩基の70%超が配列番号8に記載のDNA配列或いはその相補鎖と同一であり,エチル−4−クロロ−3−オキソブタン酸から(R)−エチル−4−クロロ−3−ヒドロキシブタン酸への反応に基づく比活性が1μmol/mgタンパク質を超える酸化還元酵素をコードすることを特徴とする単離DNA配列。
- 核酸塩基の80%〜99.5%,特に90%〜99.5%,特に99%〜99.5%が配列番号8に記載のDNA配列と同一であることを特徴とする,請求項16に記載の単離DNA配列。
- 10〜50個の核酸塩基を有し,配列番号8に記載のDNA配列の一以上の部分或いはその相補鎖に対応する配列を有する核酸配列であることを特徴とする単離DNA配列。
- 15〜45個の核酸塩基,特に20〜40個或いは30〜40個の核酸塩基を有する核酸配列であることを特徴とする,請求項18に記載の単離DNA配列。
- 請求項14〜19に記載の核酸配列或いはDNA配列の一以上を含むことを特徴とするクローニングベクター。
- 請求項14〜19に記載の核酸配列或いはDNA配列の一以上を含み,発現制御配列に対して適切に結合していることを特徴とする発現ベクター。
- 細菌細胞,酵母細胞,昆虫細胞,植物細胞或いは哺乳類細胞であって,請求項21に記載の発現ベクターで形質転換或いはトランスフェクトされた宿主細胞。
- カルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物へエナンチオ選択的に還元するための方法であって,
a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離する
ことを特徴とする方法。 - 式I
R1−C(O)−R2 (I)
で表される化合物をカルボニル化合物として用い,R1基は,
1)直鎖或いは分岐鎖の−(C1−C20)−アルキル,
2)直鎖或いは分岐鎖であり,鎖長に応じて1個,2個,3個或いは4個の二重結合を含む−(C2−C20)−アルケニル,
3)直鎖或いは分岐鎖であり,任意的に1個,2個,3個或いは4個の三重結合を含む−(C2−C20)−アルキニル,
4)−(C6−C14)−アリール,
5)−(C1−C8)−アルキル−(C6−C14)−アリール,
6)非置換であるか,或いはハロゲン,ヒドロキシル,アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−(C5−C14)−複素環,或いは
7)−(C3−C7)−シクロアルキルから選択され,
1)〜7)で記載した各R1基は非置換であるか,或いは互いに独立して,
a)−OH,
b)フッ素や塩素,臭素,ヨウ素等のハロゲン,
c)−NO2,或いは
d)−NH2
で一置換,二置換或いは三置換されており,
また,R2基は,
1)直鎖或いは分岐鎖の−(C1−C6)−アルキル,
2)直鎖或いは分岐鎖であり,鎖長に応じて1個,2個或いは3個の二重結合を含む−(C2−C6)−アルケニル,
3)直鎖或いは分岐鎖であり,任意的に1個或いは2個の三重結合を含む−(C2−C6)−アルキニル,或いは
4)アルキル部分が直鎖或いは分岐鎖であり,非置換であるか,或いはハロゲン,ヒドロキシル,アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−(C0−C10)−アルキル−C(O)−O−(C1−C6)−アルキルから選択され,
1)〜4)で記載した各R2基は非置換であるか,或いは互いに独立して,
a)−OH,
b)フッ素や塩素,臭素,ヨウ素等のハロゲン,
c)−NO2,或いは
d)−NH2
で一置換,二置換或いは三置換されていることを特徴とする,請求項23に記載の方法。 - a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADを補基質を用いてNADHに還元し,
c)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項23又は24に記載の方法。 - a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADを脱水素酵素及び補基質を用いてNADHに還元し,
c)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項23又は24に記載の方法。 - a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項23又は24に記載の方法。 - a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)該酸化還元酵素によって生成したNADを補基質を用いてNADHに還元し,
d)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項23又は24に記載の方法。 - a)請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NADH及び水の存在下でカルボニル化合物を対応する(S)−ヒドロキシ化合物に還元し,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADを脱水素酵素及び補基質を用いてNADHへ同時に還元し,
c)有機溶媒の存在下で反応を行い,
d)生成したキラル(S)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項23又は24に記載の方法。 - 前記補基質として,エタノール,2−プロパノール,2−ブタノール,2−ペンタノール又は2−オクタノールを用いることを特徴とする,請求項25,26,28又は29に記載の方法。
- 前記脱水素酵素として,カンジダ・ボイジニ或いはカンジダ・パラプシローシス由来のパン酵母を用いることを特徴とする,請求項26又は29に記載の方法。
- 前記脱水素酵素としてNADH依存性ギ酸脱水素酵素を用い,前記補基質としてギ酸アンモニウムやギ酸ナトリウム,ギ酸カルシウム等のギ酸塩を用いることを特徴とする,請求項26又は29に記載の方法。
- 有機溶媒として,ジエチルエーテル,第三ブチルメチルエーテル,ジイソプロピルエーテル,ジブチルエーテル,酢酸ブチル,へプタン,ヘキサン又はシクロヘキサンを用いることを特徴とする,請求項27又は29に記載の方法。
- 有機相が総反応物体積の5%〜80%,好ましくは10%〜40%を占めることを特徴とする,請求項27又は29に記載の方法。
- 式II
R1−C(OH)−R2 (II)
で表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を回収するための方法であって,R1基は,
1)直鎖或いは分岐鎖の−(C1−C20)−アルキル,
2)直鎖或いは分岐鎖であり,鎖長に応じて1個,2個,3個或いは4個の二重結合を含む−(C2−C20)−アルケニル,
3)直鎖或いは分岐鎖であり,任意的に1個,2個,3個或いは4個の三重結合を含む−(C2−C20)−アルキニル,
4)−(C6−C14)−アリール,
5)−(C1−C8)−アルキル−(C6−C14)−アリール,
6)非置換であるか,或いはハロゲン,ヒドロキシル,アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−(C5−C14)−複素環,或いは
7)−(C3−C7)−シクロアルキルから選択され,
1)〜7)で記載した各R1基は非置換であるか,或いは互いに独立して,
a)−OH,
b)フッ素や塩素,臭素,ヨウ素等のハロゲン,
c)−NO2,或いは
d)−NH2
で一置換,二置換或いは三置換されており,
また,R2基は,
1)直鎖或いは分岐鎖の−(C1−C6)−アルキル,
2)直鎖或いは分岐鎖であり,鎖長に応じて1個,2個或いは3個の二重結合を含む−(C2−C6)−アルケニル,
3)直鎖或いは分岐鎖であり,任意的に1個或いは2個の三重結合を含む−(C2−C6)−アルキニル,或いは
4)アルキル部分が直鎖或いは分岐鎖であり,非置換であるか,或いはハロゲン,ヒドロキシル,アミノ或いはニトロで一置換〜三置換されている−(C0−C10)−アルキル−C(O)−O−(C1−C6)−アルキルから選択され,
1)〜4)で記載した各R1基は非置換であるか,或いは互いに独立して,
a)−OH,
b)フッ素や塩素,臭素,ヨウ素等のハロゲン,
c)−NO2,或いは
d)−NH2
で一置換,二置換或いは三置換されている方法において,
a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする方法。 - a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADHを補基質を用いてNADに酸化し,
c)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項35に記載の式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を回収するための方法。 - a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)該酸化還元酵素によって生成したNADHを脱水素酵素及び補基質を用いてNADに酸化し,
c)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項35に記載の式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を回収するための方法。 - a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項35に記載の式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を回収するための方法。 - a)式IIで表されるラセミ化合物を含有する混合物を,請求項1〜9のいずれか一項に記載の酸化還元酵素,NAD及び水と共にインキュベートし,
b)有機溶媒の存在下で反応を行い,
c)該酸化還元酵素によって生成したNADHを脱水素酵素及び補基質を用いてNADに酸化し,
d)残存する式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を単離することを特徴とする,請求項35に記載の式IIで表されるキラル(R)−ヒドロキシ化合物を回収するための方法。 - 前記補基質としてアセトンを用いることを特徴とする,請求項36,37又は39に記載の方法。
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