JP2002247987A - 新規なエノン還元酵素、その製造方法、およびこれを利用したα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ケトンの製造に有用な新規エノン還元酵素の
提供。 【解決手段】 Kluyveromyces属に由来する新規エノン
還元酵素が提供された。また本発明は、該酵素をコード
する遺伝子、該酵素を含むベクター、形質転換体をも提
供する。更に本発明は、酵母に由来するエノン還元酵素
を提供する。これらのエノン還元酵素により、α，β−
不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する
方法が提供される。 【効果】医薬品原料などとして有用なケトンを、酵素的
な反応によって製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α，β不飽和ケト
ン（エノン、enone）のα，β−不飽和結合の還元に有
用な、新規なエノン還元酵素、該酵素をコードするDN
A、該酵素の製造方法、該酵素ならびに該酵素に相同性
を有する蛋白質を用いたα，β−不飽和ケトンの炭素−
炭素２重結合を選択的に還元する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ケトンは、有機合成における原料として
極めて汎用性の高い化合物である。また、ケトンは、医
薬品合成において重要な光学活性中間体である光学活性
アルコール、光学活性アミンの原料としても重要な化合
物である。これらのケトンの前駆体として、例えば、ア
ルデヒドとケトンの縮合反応により得られるα，β−不
飽和ケトンが有用である。

【０００３】例えば、アセトアルデヒドと２−ブタノン
を縮合することにより３−メチル−３−ペンテン−２−
オン（3-methyl-3-penten-2-one; J. Amer. Chem. So
c., 81, 1117-1119 (1959)）を容易に調製することがで
きる。

【０００４】種々のケトンは、α，β−不飽和カルボニ
ル化合物の、α，β−不飽和結合を選択的に還元するこ
とにより得ることができる。カルボニル基の還元反応を
伴わずに、α，β−不飽和結合のみを選択的に還元する
方法としては、Ni触媒やPd-C触媒を用いた水素添加反応
などが知られている（「接触水素化反応」p135、東京化
学同人 (1987)）。これらの方法は、反応を継続するこ
とによりカルボニル基も還元される、環境に対して負荷
の大きい金属を触媒として利用する、高圧の水素を利用
するなどの問題がある。カルボニル基の還元は、ケトン
の収率の低下を意味している。

【０００５】一方、生物学的な反応によってα，β−不
飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方
法としては、次のような生物を用いた方法が報告されて
いる。 ・植物細胞（J. Nat. Prod. 56, 1406-1409 (1993)） ・パン酵母（Tetrahedron Lett. 52, 5197-5200 (1978)
, Bull. Chem. Soc. Jpn. 64, 3473-3475 (1991) , Te
trahedron Asym. 6, 2143-2144 (1995)他） ・カビ（J. Org. Chem. 47, 792-798 (1982)） しかしこれらの方法では、カルボニル基の還元反応を伴
う、反応性が低い、細胞の大量調製が困難など問題があ
る。また、これらの生物より各種のエノン還元酵素が報
告されているが、それをコードする遺伝子をクローニン
グした報告はなく、これらの酵素を容易に、かつ、大量
に調製することは困難であった。

【０００６】この他にα，β−不飽和カルボニル化合物
の還元酵素としては、以下のような酵素が報告されてい
る。これらの酵素は、いずれも基質特異性が明らかにさ
れていない、あるいはα，β−不飽和結合に対する選択
的が低いといった理由により、工業的な利用には不向き
である。 クロストリジウム・チオブチリカム（Clostridium tyro
butyricum）由来の２−エノエート還元酵素 (2-enoate
reductase, E.C.1.3.1.31) （J. Biotechnol. 6, 13-29
(1987)） クロストリジウム・クライベリ (Clostridium kluyver
i) 由来のアクリロイル−CoA還元酵素 (acryloyl-CoA r
eductase) （Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366, 953-961
(1985) ） パン酵母より精製されたエノン還元酵素ＹＥＲ−２（京
都大学・河合ら、第4回生体触媒シンポジウム講演要旨
集p58 (2001) ） パン酵母より精製されたエノン還元酵素ＥＩ及びＥＩＩ
（Eur. J. Biochem. 255, 271-278 (1998)） タバコ（Nicotiana tabacum）細胞由来のエノン還元酵
素（ベルベノン還元酵素（verberone reductaee, 別名
ｐ９０）（J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1993,1426-1
427、Chem. Lett. 2000, 850-851） タバコ（Nicotiana tabacum）細胞由来のエノン還元酵
素であるカルボン還元酵素（別名、エノン還元酵素−
Ｉ）（Phytochemistry 31, 2599-2603 (1992)） タバコ（Nicotiana tabacum）細胞由来のエノン還元酵
素であるエノン還元酵素−ＩＩ、ｐ４４、ｐ７４植物の
１種ユーグレナ・グラシリス（Euglena gracilis）やア
スタシア・ロンガ（Astasia longa）から精製されたエ
ノン還元酵素（Phytochemistry 49, 49-53(1998)） ラット肝臓より精製されたエノン還元酵素（Arch. Bioc
hem. Biophys. 282, 183-187 (1990)）

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、α，β−不
飽和ケトンのα，β−不飽和結合を選択的に還元し、
α，β−飽和ケトンを生成する酵素活性を有する新規な
エノン還元酵素、該酵素をコードする遺伝子を提供する
ことを課題とする。さらに、本発明は、該酵素並びに該
酵素を生産する生物を利用してα，β−不飽和ケトンの
炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法の提供を課
題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、メチルビ
ニルケトンから２−ブタノンを生成する酵素をスクリー
ニングした結果、クライベロマイセス・ラクティス (Kl
uyveromyces lactis)が目的とする活性を有することを
見出した。次に、クライベロマイセス・ラクティスの菌
体より目的とする活性を有する酵素を精製し、その性質
を明らかにした。この酵素は、α，β−不飽和ケトンの
α，β−不飽和結合をβ−ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドリン酸依存的に選択的に還元すること、ケト
ンの還元活性を実質的に持たないことを確認した。更に
本発明者らは、該酵素をコードする遺伝子をクローニン
グし、その構造を明らかにして、この遺伝子が新規な遺
伝子であることを確認した。また、この遺伝子を異種の
生物で高発現させて、α，β−不飽和ケトンのα，β−
不飽和結合をNADPH依存的に還元する高い選択性と高い
活性を併せ持つ形質転換株を得た。そしてこの酵素やそ
のホモログ、あるいはこれらを産生する細胞等によっ
て、α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合の選択
的な還元が可能となることを見出し本発明を完成した。
以下、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
酸はNADP、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
はNAD、そしてこれらの還元型をNADPHあるいはNADHと記
載する。

【０００９】すなわち本発明は、次のエノン還元酵素、
該酵素をコードするDNA、該酵素の製造方法、該酵素な
らびに該酵素に相同性を有する蛋白質を用いたα，β−
不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する
方法に関する。 〔１〕次の（Ａ）から（Ｃ）に示す理化学的性質を有す
るエノン還元酵素。 （Ａ）作用 NADPHを電子供与体として、α，β−不飽和ケトンの炭
素−炭素２重結合を還元し、対応する飽和炭化水素を生
成する。 （Ｂ）基質特異性 (1)α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元
するが、実質的にケトンの還元活性は無い。 (2)電子供与体としては、NADHよりもNADPHに対して、有
意に高い活性を有する。 (3)ケトンからβ位炭素の２つの置換基がともに水素で
ない基質に対しては実質的に作用しない。 (4)炭素−炭素２重結合が環状構造中に存在する基質に
対しては実質的に作用しない。 （Ｃ）至適pH pH ６．５−７．０ 〔２〕更に次に示す理化学的性質（Ｄ）−（Ｅ）を有す
る〔１〕に記載のエノン還元酵素。 （Ｄ）至適温度 ３７−４５℃ （Ｅ）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により約４３，０００。ゲル濾過により約４２，
０００。 〔３〕クライベロマイセス（Kluyveromyces）属に由来
する〔１〕に記載の新規エノン還元酵素。 〔４〕クライベロマイセス属に属し、〔１〕に記載のエ
ノン還元酵素生産能を有する微生物を培養することを特
徴とする〔１〕に記載のエノン還元酵素を取得する方
法。 〔５〕クライベロマイセス属に属する微生物が、クライ
ベロマイセス・ラクティス（Kluyveromayces lactis）
である、〔４〕に記載の方法。 〔６〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のエノン
還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチ
ド。 （ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレ
オチド、（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコ
ードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号：２に記載
のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が
置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配
列をコードするポリヌクレオチド、（ｄ）配列番号：１
に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン
ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
ド、（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と６０%
以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチド、 〔７〕〔６〕に記載のポリヌクレオチドによってコード
される蛋白質。 〔８〕〔６〕に記載のポリヌクレオチドが挿入された組
換えベクター。

〔９〕更にNADPを補酵素とする酸化還元反応を触媒する
ことができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド
が挿入された、〔８〕に記載の組換えベクター。 〔１０〕〔６〕に記載のポリヌクレオチド、または
〔８〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換
体。 〔１１〕〔１０〕に記載の形質転換体を培養する工程を
含む〔７〕に記載の蛋白質の製造方法。 〔１２〕下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の、エ
ノン還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
チド。 （ａ）配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：
７からなる群から選択されたいずれかに記載の塩基配列
を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号：４、配列番
号：６、および配列番号：８からなる群から選択された
いずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコード
するポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号：４、配列番
号：６、および配列番号：８からなる群から選択された
いずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複
数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加
したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：
７からなる群から選択されたいずれかに記載の塩基配列
からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下
でハイブリダイズするポリヌクレオチド、（ｅ）配列番
号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群
から選択されたいずれかに記載のアミノ酸配列と６０%
以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌ
クレオチド、 〔１３〕〔１２〕に記載のポリヌクレオチドによってコ
ードされる蛋白質。 〔１４〕〔１２〕に記載のポリヌクレオチドが挿入され
た組換えベクター。 〔１５〕更にNADPを補酵素とする酸化還元反応を触媒す
ることができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチ
ドが挿入された、〔１４〕に記載の組換えベクター。 〔１６〕〔１２〕に記載のポリヌクレオチド、または
〔１４〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転
換体。 〔１７〕〔１６〕に記載の形質転換体を培養する工程を
含む〔１３〕に記載の蛋白質の製造方法。 〔１８〕〔１〕に記載のエノン還元酵素、〔７〕に記載
の蛋白質、〔１３〕に記載の蛋白質、該酵素または蛋白
質を産生する微生物、および該微生物の処理物、からな
る群から選択されるいずれかの酵素活性物質をα，β不
飽和ケトンに作用させる工程を含む、α，β−不飽和ケ
トンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元する方法。 〔１９〕該酵素または蛋白質を産生する微生物が、〔１
１〕および／または〔１６〕に記載の形質転換体である
〔１８〕に記載の方法。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明は、次の（Ａ）−（Ｃ）に
示す理化学的性質を有する酵素を提供する。 （Ａ）作用 NADPHを電子供与体として、α，β−不飽和ケトンの炭
素−炭素２重結合を還元し、対応する飽和炭化水素を生
成する。 （Ｂ）基質特異性 (1)α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元
するが、実質的にケトンの還元活性は無い。 (2)電子供与体としては、NADHよりもNADPHに対して、有
意に高い活性を有する。 (3)ケトンからβ位炭素の２つの置換基がともに水素で
ない基質に対しては実質的に作用しない。 (4)炭素−炭素２重結合が環状構造中に存在する基質に
対しては実質的に作用しない。 （Ｃ）至適pH pH ６．５−７．０

【００１１】本発明のエノン還元酵素は、望ましくは更
に次の理化学的的性質（Ｄ）−（Ｅ）を備える。 （Ｄ）至適温度 ３７−４５℃ （Ｅ）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（以下、SDS-PAGEと略す）により約４３，０００。
ゲル濾過により約４２，０００。

【００１２】本発明の酵素のNADPHに対する反応性がNAD
Hに対する反応性に比較して有意に高いとは、少なくと
も２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍
以上高い活性を言う。NADPHとNADHに対する反応性は、
実施例に示すような方法によって比較することができ
る。すなわち、同一のα，β−不飽和ケトンを基質と
し、両者を用いてケトンを生成させる。このときに消費
されるNADPH、あるいはNADHの量を比較すれば、反応性
を比較することができる。

【００１３】また本発明において、エノン還元酵素が実
質的にケトンの還元活性が無いこと、あるいは、エノン
還元酵素が基質に対して実質的に作用しないこととは、
具体的には、メチルビニルケトンにおけるオレフィンに
対する還元活性の１％以下であることを言う。

【００１４】本発明の酵素は、該酵素を産生する微生物
から通常の蛋白質の精製方法により、精製することがで
きる。例えば、菌体を破砕後、プロタミン硫酸沈澱を行
い、その遠心分離上清を硫酸アンモニウムを用いて塩析
し、更に、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ゲルろ過などを組み合わせることにより、精製すること
ができる。

【００１５】本発明において、エノンに対する還元活性
は、次のようにして確認することができる。本発明にお
いてエノンとは、α，β不飽和ケトンを意味する。 エノンに対する還元活性測定法:５０mM リン酸カリウム
緩衝液（pH ６．５）、０．２mM NADPH、２０mM メチル
ビニルケトン及び酵素を合む反応液中３０℃で反応さ
せ、NADPHの減少にともなう３４０ nmの吸光度の減少を
測定する。１Uは、１分間に１μmolのNADPHの減少を触
媒する酵素量とした。また、蛋白質の定量は、バイオラ
ッド製蛋白質アッセイキットを用いた色素結合法により
行った。

【００１６】上記のような理化学的性状を持つエノン還
元酵素は、たとえばクライベロマイセス属酵母の培養物
より精製することができる。クライベロマイセス属酵母
としては、クライベロマイセス・ラクティス（Kluyvero
myces lactis）が特に本発明によるエノン還元酵素の産
生能に優れる。本発明のエノン還元酵素を得るために利
用することができるクライベロマイセス・ラクティス
は、たとえば、ＩＦＯ０４３３、ＩＦＯ １０１２、Ｉ
ＦＯ １２６７、ＩＦＯ １６７３、ＩＦＯ １９０３と
して財団法人発酵研究所より入手することができる。

【００１７】上記微生物は、YM培地等の真菌の培養に用
いられる一般的な培地で培養される。十分に増殖させた
後に菌体を回収し、２−メルカプトエタノールやフェニ
ルメタンフルホニルフルオリド等の還元剤やプロテアー
ゼ阻害剤を加えた緩衝液中で破砕して無細胞抽出液とす
る。無細胞抽出液から、蛋白質の溶解度による分画（有
機溶媒による沈澱や硫安などによる塩析など）や、陽イ
オン交換、陰イオン交換、ゲルろ過、疎水性クロマトグ
ラフィーや、キレート、色素、抗体などを用いたアフィ
ニティークロマトグラフィーなどを適宜組み合わせるこ
とにより精製することができる。たとえば、フェニル−
セファロースを用いた疎水クロマトグラフィー、MonoQ
を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー、フェニル−
スーパーロースを用いた疎水クロマトグラフィー等を経
て電気泳動的にほぼ単一バンドにまで精製することがで
きる。

【００１８】クライベロマイセス・ラクティスから精製
することができる本発明によるエノン還元酵素は、上記
理化学的性質（Ａ）−（Ｃ）、および（Ｄ）−（Ｅ）を
有する。クライベロマイセス・ラクティスから精製する
ことができる本発明によるエノン還元酵素は、公知の
α，β−不飽和カルボニル化合物の還元酵素に対して、
明らかに新規な酵素である。

【００１９】たとえば、α，β−不飽和カルボニル化合
物の還元酵素としては、クロストリジウム・チオブチリ
カム（Clostridium tyrobutyricum）由来の２−エノエ
ート還元酵素 (2-enoate reductase, E.C.1.3.1.31) が
知られている。本酵素は、NADH依存的に（Ｅ）−２−メ
チル−２−ブテン酸を還元し、（Ｒ）−２−メチル酪酸
を生成する（J. Biotechnol. 6, 13-29 (1987)）。また
本酵素は、カルボニル残基がカルボン酸、アルデヒド、
あるいはケト酸の場合に基質とするが、ケトン体に対す
る活性は報告されていない。更に、分子量は、ゲル濾過
において８０万−９４万であり、本発明の酵素（SDS-PA
GEで43,000、ゲル濾過で42,000）とは明確に異なる。

【００２０】また、クロストリジウム・クライベリ (Cl
ostridium kluyveri) 由来のアクリロイル−CoA還元酵
素 (acryloyl-CoA reductase) がエチルビニルケトン還
元活性を有することが報告されている（Biol. Chem. Ho
ppe-Seyler 366, 953-961 (1985) ）が、本酵素は補酵
素として還元型メチルビオローゲンを利用し、分子量は
ゲル濾過で28,400、SDS-PAGEで14,200であり本発明の酵
素とは異なる。

【００２１】また、パン酵母より複数のエノン還元酵素
が精製され報告されている。京都大学の河合らは、パン
酵母よりエノン還元酵素（ＹＥＲ−２）を精製し、酵素
化学的性質を報告している（第4回生体触媒シンポジウ
ム講演要旨集p58 (2001) ）。ＹＥＲ−２は、反応の至
適pHが７．５であり本発明の酵素（至適pH６．５−７．
０）とは明らかに異なる。Wannerらは、同じパン酵母よ
り2種類のエノン還元酵素（ＥＩ及びＥＩＩ）の精製と
性質を報告している（Eur. J. Biochem. 255, 271-278
(1998)）。ＥＩＩは補酵素としてNADHを利用し、ＥＩは
SDS-PAGEにより34,000と37,000のサブニットからなる分
子量75,000のヘテロダイマーであり、本発明の酵素とは
異なる。

【００２２】植物では、タバコ（Nicotiana tabacum）
の細胞より多数のエノン還元酵素（ベルベノン還元酵素
（別名ｐ９０）、カルボン還元酵素（別名、エノン還元
酵素−Ｉ）、エノン還元酵素−ＩＩ、ｐ４４、ｐ７４）
が精製され、その性質が報告されている。ベルベノン還
元酵素 (verberone reductaee, ｐ９０) 、ｐ４４は環
状のα，β−不飽和ケトンに対する活性を有すること
（J. Chem. Soc., Chem.Commun. 1993, 1426-1427、Che
m. Lett. 2000, 850-851）から本発明の酵素とは異な
る。カルボン (carbone) 還元酵素は補酵素としてNADH
を利用すること（Phytochemistry 31, 2599-2603 (199
2)）、エノン還元酵素−ＩＩは、α，β−不飽和ケトン
のβ位炭素に水素を有さない化合物（ (R) -pulegone）
も基質になること（Phytochemistry 31, 2599-2603 (19
92)）、ｐ７４は分子量が74,000であることから、これ
らの酵素は明らかに本発明の酵素とは異なる。

【００２３】また、植物の１種ユーグレナ・グラシリス
（Euglena gracilis）やアスタシア・ロンガ（Astasia
longa）からもエノン還元酵素が精製されている（Phyto
chemistry 49, 49-53 (1998)）が、これらの酵素はいず
れも補酵素としてNADHを利用するため、本発明の酵素と
は異なる。

【００２４】また、動物ではラット肝臓よりエノン還元
酵素が精製されている（Arch. Biochem. Biophys. 282,
183-187 (1990)）。この酵素は、分子量39,500のモノ
マー酵素だが、環状基質への反応性、β位２置換基質へ
の反応性、至適pHなどが報告されていない。

【００２５】本発明は、エノン還元酵素およびそのホモ
ログをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明に
おいて、ポリヌクレオチドは、DNAやRNAのような天然に
存在するポリヌクレオチドであることもできるし、人工
的に合成されたヌクレオチド誘導体を含むポリヌクレオ
チドであっても良い。

【００２６】本発明のエノン還元酵素をコードするポリ
ヌクレオチドは、たとえば配列番号：１に示す塩基配列
を含む。配列番号：１に示す塩基配列は、配列番号：２
に示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードしており、こ
のアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明によるエノン還
元酵素の好ましい態様を構成する。なお本発明のポリヌ
クレオチドは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコ
ードすることができるあらゆる塩基配列を含む。１つの
アミノ酸に対応するコドンは、1〜6存在することから、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコ
ードするDNAは、配列番号：１のみとは限らず、配列番
号：１に記載されるDNAと等価とみなすことができるDNA
は複数存在する。

【００２７】本発明のポリヌクレオチドは、配列番号：
２に記載のアミノ酸配列において、１もしくは複数のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたア
ミノ酸配列を含み、かつ、エノン還元酵素活性を有する
蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者で
あれば、配列番号：１に記載のDNAに部位特異的変異導
入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Method
s in Enzymol. 100, pp.448 (1983), Molecular Clonin
g 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (19
89) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1
991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および
／または付加変異を導入することが可能である。

【００２８】また、本発明のポリヌクレオチドは、配列
番号：１に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェ
ントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドで
あって、かつ、エノン還元酵素活性を有する蛋白質をコ
ードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな
条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配
列番号：１に記載中の任意の少なくとも２０個、好まし
くは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１０
０個の連続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプ
ローブDNAとし、たとえばECL direct nucleic acid lab
eling and detection system (Amersham Pharmaica Bio
tech社製)を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：4
2℃、0.5x SSCを含むprimary wash buffer）において、
ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。

【００２９】ストリンジェントな条件下で配列番号：１
に記載の塩基配列からなるDNAとハイブリダイズするこ
とができるポリヌクレオチドには、配列番号：１と類似
する塩基配列を含むものが含まれる。このようなポリヌ
クレオチドは、配列番号：２のアミノ酸配列からなる蛋
白質と機能的に同等な蛋白質をコードしている可能性が
高い。したがって当業者は、このようなポリヌクレオチ
ドの中から、本明細書の記載に基づいて、エノン還元酵
素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドを
選択することができる。

【００３０】さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配
列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０
%、好ましくは少なくとも７０%または８０%、より好ま
しくは９０%以上のホモロジーを有する蛋白質をコード
するポリヌクレオチドを含む。蛋白質のホモロジー検索
は、たとえばSWISS-PROT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸
配列に関するデータベースやDNA Databank of JAPAN(DD
BJ)、EMBL、Gene-BankなどのDNAに関するデータベー
ス、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデー
タベースなどを対象に、FASTA programやBLAST program
などを用いて、たとえば、インターネット上で行うこと
ができる。配列番号：２に記載のアミノ酸配列を用いて
SWISS-PROTを対象にBLAST programを用いてホモロジー
検索を行った結果、既知の蛋白質の中でもっとも高いホ
モロジーを示したのは、Cochliobolus carbonum toxD p
roteinの36%(Identity)、54%(Positives)であった。本
発明の60%以上のホモロジーとは、たとえば、BLAST pro
gramを用いたPositiveの相同性の値を示す。

【００３１】このBLAST検索において、本発明のエノン
還元酵素にホモロジーを有する機能未知の予想オープン
リーディングフレーム（ORF）が見いだされた。具体的
には、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces
cerevisiae）のゲノム解析の結果より得られた3種類の
予想ORFであり、それぞれYNN4、YL60、およびYCZ2と命
名されている。これらの予想アミノ酸配列の本発明のエ
ノン還元酵素に対するホモロジーは、54%, 51%, 53% (i
dentity) , 69%, 68%, 69% (Positive) であった。これ
らの予想蛋白質が本発明のエノン還元酵素活性を有する
か否かを明らかにするために、DDBJに登録されているDN
A配列を基にプライマーを合成し、サッカロマイセス・
セレビジエのゲノムDNAより予想ORF部分をPCRクローニ
ングした。各ORFを発現ベクターに導入し、大腸菌を形
質転換して得られた形質転換株を培養して、それぞれの
蛋白質を発現させた結果、YNN4、YL60、およびYCZ2がい
ずれもエノン還元活性を有することを確認した。これら
の結果は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列に対して
６０％以上のホモロジーを有する蛋白質が、本発明のエ
ノン還元活性を有すると推測するに十分な蓋然性がある
ことを示している。YNN4、YL60、およびYCZ2の塩基配
列、およびアミノ酸配列を、以下の配列番号に示した。
これらのORFによってエノン還元酵素活性を有する蛋白
質がもたらされることは知られていない。 配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：７に記
載の塩基配列からなるポリヌクレオチドは、本発明のポ
リヌクレオチドに含まれる。またこれらのポリヌクレオ
チドによってコードされるアミノ酸配列、配列番号：
４、配列番号：６、および配列番号：８に記載されたア
ミノ酸配列をコードする全ての塩基配列からなるポリヌ
クレオチドは、本発明に含まれる。更に、配列番号：
４、配列番号：６、および配列番号：８に記載されたア
ミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な蛋白質をコ
ードするポリヌクレオチドは、本発明に含まれる。

【００３２】すなわち本発明のポリヌクレオチドは、配
列番号：４、配列番号：６、および配列番号：８に記載
のアミノ酸配列のいずれかにおいて、１もしくは複数の
アミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加された
アミノ酸配列を含み、かつ、エノン還元酵素活性を有す
る蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含む。このよ
うなポリヌクレオチドは、先に述べたような方法に基づ
いて取得することができる。また、本発明のポリヌクレ
オチドは、配列番号：３、配列番号：５、および配列番
号：７に記載の塩基配列のいずれかからなるDNAとスト
リンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレ
オチドであって、かつ、エノン還元酵素活性を有する蛋
白質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチド
とは、配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：
７に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少な
くとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連
続した配列を一つまたは複数選択したDNAをプローブDNA
とし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and
detection system (Amersham Pharmaica Biotech社製)
を用いて、マニュアルに記載の条件（wash：42℃、0.5x
SSCを含むprimary wash buffer）において、ハイブリ
ダイズするポリヌクレオチドを指す。

【００３３】ストリンジェントな条件下で配列番号：
３、配列番号：５、あるいは配列番号：７に記載の塩基
配列からなるDNAとハイブリダイズすることができるポ
リヌクレオチドには、これらの塩基配列と類似する塩基
配列を含むものが含まれる。このようなポリヌクレオチ
ドは、配列番号：４、配列番号：６、あるいは配列番
号：８のアミノ酸配列からなる蛋白質と機能的に同等な
蛋白質をコードしている可能性が高い。

【００３４】さらに、本発明のポリヌクレオチドは、配
列番号：４、配列番号：６、あるいは配列番号：８に示
されるアミノ酸配列と少なくとも６０%、好ましくは少
なくとも７０%または８０%、より好ましくは９０%以上
のホモロジーを有する蛋白質をコードするポリヌクレオ
チドを含む。蛋白質のホモロジー検索は、既に述べたよ
うな方法によって行うことができる。

【００３５】本発明のポリヌクレオチドは、本発明のエ
ノン還元酵素の遺伝子工学的な製造に有用である。ある
いは本発明のポリヌクレオチドによって、α，β−不飽
和ケトンからのα，β―飽和ケトンの製造に有用なエノ
ン還元酵素活性を有する微生物を遺伝子工学的に作り出
すことができる。

【００３６】本発明は、配列番号：２に記載のアミノ酸
配列を有し、かつエノン還元酵素活性を有する蛋白質、
及びそのホモログを含む。配列番号：２に示すアミノ酸
配列を含む蛋白質は、本発明によるエノン還元酵素の好
ましい態様を構成する。

【００３７】本発明のエノン還元酵素のホモログとは、
配列番号：２に記載のアミノ酸配列において、１もしく
は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付
加されたアミノ酸配列を含む。当業者であれば、配列番
号：１に記載のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic A
cid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.10
0,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold S
pring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Pract
ical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用い
て、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を
導入することによりエノン還元酵素のホモログをコード
するDNAを得ることができる。そのエノン還元酵素のホ
モログをコードするDNAを宿主に導入して発現させるこ
とにより、配列番号：２に記載のエノン還元酵素のホモ
ログを得ることが可能である。

【００３８】さらに、本発明のエノン還元酵素のホモロ
グとは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と少なく
とも６０%、好ましくは少なくとも７０%または８０%、
より好ましくは９０%以上のホモロジーを有する蛋白質
をいう。蛋白質のホモロジー検索は、たとえばSWISS-PR
OT、PIRなどの蛋白質のアミノ酸配列に関するデータベ
ースやDNA Databank of JAPAN(DDBJ)、EMBL、Gene-Bank
などのDNAに関するデータベース、DNA配列を元にした予
想したアミノ酸配列に関するデータベースなどを対象
に、FASTA programやBLAST programなどを用いて、たと
えば、インターネット上で行うことができる。配列番
号：２に記載のアミノ酸配列を用いてDDBJを対象にBLAS
T programを用いてホモロジー検索を行った結果、既知
の蛋白質の中でもっとも高いホモロジーを示したのは、
Cochliobolus carbonum toxD proteinの36%(Identit
y)、54%(Positives)であった。。本発明の６０％以上の
ホモロジーとは、たとえば、BLAST programを用いたPos
itiveの相同性の値を示す。

【００３９】このBLAST検索において、本発明のエノン
還元酵素にホモロジーを有する機能未知の予想オープン
リーディングフレーム（ORF）が見いだされた。具体的
には、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces
cerevisiae）のゲノム解析の結果より得られた3種類の
予想ORFであり、それぞれYNN4、YL60、およびYCZ2と命
名されている。これらの予想アミノ酸配列の本発明のエ
ノン還元酵素に対するホモロジーは、54%, 51%, 53% (i
dentity) , 69%, 68%, 69% (Positive) であった。これ
らの予想蛋白質が本発明のエノン還元酵素活性を有する
か否かを明らかにするために、DDBJに登録されているDN
A配列を基にプライマーを合成し、サッカロマイセス・
セレビジエのゲノムDNAより予想ORF部分をPCRクローニ
ングした。各ORFを発現ベクターに導入し、大腸菌を形
質転換して得られた形質転換株を培養して、それぞれの
蛋白質を発現させた結果、YNN4、YL60、およびYCZ2がい
ずれもエノン還元活性を有することを確認した。これら
の結果は、配列番号：２に６０％以上のホモロジーを有
する蛋白質が、本発明のエノン還元活性を有すると推測
するに十分な蓋然性があることを示している。

【００４０】すなわち、配列番号：４、配列番号：６、
および配列番号：８に記載のアミノ酸配列のいずれかか
らなるアミノ酸配列を含む蛋白質は、本発明のエノン還
元酵素のホモログの好ましい態様を構成する。

【００４１】本発明のエノン還元酵素をコードするポリ
ヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって
単離することができる。本発明のポリヌクレオチドは、
配列番号：１に記載された塩基配列に基づいて他の生物
からPCRクローニングやハイブリダイズによって単離す
ることもできる。配列番号：１に記載の塩基配列は、ク
ライベロマイセス・ラクティスより単離された遺伝子の
ものである。配列番号：１に記載の塩基配列を利用して
ＰＣＲ用プライマーをデザインし、クライベロマイセス
属酵母やサッカロマイセス属酵母等の微生物から、エノ
ン還元酵素活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレ
オチドを得ることができる。たとえば、サッカロマイセ
ス・セレビジエよりＰＣＲによって単離することができ
る配列番号：３、配列番号：５、並びに配列番号：７に
記載された塩基配列を有するポリヌクレオチドが、本発
明のエノン還元酵素活性を有する蛋白質をコードしてい
ることは、既に述べたとおりである。あるいは、これら
の塩基配列が明らかにされたポリヌクレオチドをプロー
ブとして、この他の種に由来し、同様の酵素活性を有す
る蛋白質をコードするポリヌクレオチドを単離すること
もできる。

【００４２】また前記理化学的性質（Ａ）−（Ｃ）を有
するエノン還元酵素を単離し、その構造的特徴をもと
に、本発明のポリヌクレオチドを得ることもできる。本
発明の酵素を精製後、Ｎ末端アミノ酸配列を解析し、さ
らに、リジルエンドペプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼな
どの酵素により切断後、逆相液体クロマトグラフィーな
どによりペプチド断片を精製後プロテインシーケンサー
によりアミノ酸配列を解析することにより複数のアミノ
酸配列を決めることができる。

【００４３】部分的なアミノ酸配列が明らかになれば、
それをコードする塩基配列を推定することができる。推
定された塩基配列、あるいは配列番号：１に示す塩基配
列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染
色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型として、PCR
を行うことにより本発明のDNAの一部を得ることができ
る。

【００４４】さらに、得られたDNA断片をプローブとし
て、酵素生産株の染色体DNAの制限酵素消化物をファー
ジ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得
られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用して、コ
ロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイ
ゼーションなどにより、本発明のDNAを得ることができ
る。

【００４５】また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配
列を解析し、得られた配列から、既知のDNAの外側に伸
長させるためのPCRプライマーを設計し、酵素生産株の
染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応に
よりDNAを鋳型として逆PCRを行うことにより（Genetics
120, 621-623 (1988)）、また、RACE法（Rapid Amplif
ication of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33,
HBJ出版局）などにより本発明のDNAを得ることも可能で
ある。なお本発明のDNAは、以上のような方法によって
クローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合
成によって得ることもできる。

【００４６】このようにして単離された、本発明による
エノン還元酵素をコードするDNAを公知の発現ベクター
に挿入することにより、エノン還元酵素発現ベクターが
提供される。また、この発現ベクターで形質転換した形
質転換体を培養することにより、本発明のエノン還元酵
素を組換え体から得ることができる。

【００４７】本発明の組換えベクターは、本発明のエノ
ン還元酵素をコードするDNAとともにNADPを補酵素とす
る酸化反応を触媒する脱水素酵素をコードするポリヌク
レオチドが挿入された組換えベクターも含む。これらの
脱水素酵素として、グルコース脱水素酵素、グルタミン
酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、
グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホグルコン酸
脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グリセロール脱水
素酵素などが挙げられる。これらの酵素は、本発明のエ
ノン還元酵素の補酵素であるNADPHを、NADP⁺ から再生
する際に利用することができる。

【００４８】本発明においてNADPHを補酵素とするエノ
ン還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる
微生物は、NADPHを補酵素とするエノン還元酵素活性を
有するポリペプチドをコードするDNAを含む組み換えベ
クターにより形質転換され、NADPHを補酵素とするエノ
ン還元酵素活性を発現することができる生物であれば特
に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以
下のような微生物を示すことができる。 エシェリヒア(Escherichia)属 バチルス(Bacillus)属 シュードモナス(Pseudomonas)属 セラチア(Serratia)属 ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属 コリネバクテリイウム(Corynebacterium)属 ストレプトコッカス(Streptococcus)属 ラクトバチルス(Lactobacillus)属など宿主ベクター系
の開発されている細菌 ロドコッカス(Rhodococcus)属 ストレプトマイセス(Streptomyces)属など宿主ベクター
系の開発されている放線菌 サッカロマイセス(Saccharomyces)属 クライベロマイセス(Kluyveromyces)属 シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyces)属 チゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)属 ヤロウイア(Yarrowia)属 トリコスポロン(Trichosporon)属 ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属 ピキア(Pichia)属 キャンディダ(Candida)属などの宿主ベクター系の開発
されている酵母 ノイロスポラ(Neurospora)属 アスペルギルス(Aspergillus)属 セファロスポリウム(Cephalosporium)属 トリコデルマ(Trichoderma)属などの宿主ベクター系の
開発されているカビ

【００４９】形質転換体の作製のための手順および宿主
に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生
物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術
に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレ
キュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laborat
ories）。微生物中などにおいて、本発明のNADP^＋を補
酵素とするエノン還元酵素遺伝子を発現させるために
は、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベ
クターやファージベクター中にこのDNAを導入し、その
遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。そのために
は、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモータ
ーを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはター
ミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。
このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主とし
て利用する微生物中において機能することが知られてい
るプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。
これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモ
ーター、ターミネータ−などに関して「微生物学基礎講
座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Ad
v. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-4
88 (1992)、などに詳細に記述されている。

【００５０】例えばエシェリヒア属、特に大腸菌エシェ
リヒア・コリ(Escherichia coli)においては、プラスミ
ドベクターとして、pBR、pUC系プラスミドを利用でき、
lac(β−ガラクトシダーゼ)、trp(トリプトファンオペ
ロン)、tac、trc (lac、trpの融合)、λファージ PL、P
Rなどに由来するプロモーターなどが利用できる。ま
た、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由
来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーターなどを
用いることができる。これらの中で、市販のpSE420（In
vitrogen製）のマルチクローニングサイトを一部改変し
たベクターpSE420D（特開2000-189170に記載）が好適に
利用できる。

【００５１】バチルス属においては、ベクターとしてpU
B110系プラスミド、pC194系プラスミドなどが利用可能
であり、染色体にインテグレートすることもできる。ま
た、プロモーター、ターミネーターとしてapr(アルカリ
プロテアーゼ)、npr(中性プロテアーゼ)、amy(α−アミ
ラーゼ)などが利用できる。

【００５２】シュードモナス属においては、シュードモ
ナス・プチダ(Pseudomonas putida)、シュードモナス・
セパシア(Pseudomonas cepacia)などで宿主ベクター系
が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプ
ラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター
(RSF1010などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含
む)pKT240などが利用可能であり、プロモーター、ター
ミネーターとして、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子
などが利用できる。

【００５３】ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactof
ermentum)においては、pAJ43(Gene 39, 281 (1985))な
どのプラスミドベクターが利用可能である。プロモータ
ー、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されている
プロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能であ
る。

【００５４】コリネバクテリウム属、特にコリネバクテ
リウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)に
おいては、pCS11(特開昭57-183799)、pCB101(Mol. Gen.
Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが
利用可能である。

【００５５】ストレプトコッカス(Streptococcus)属に
おいては、pHV1301(FEMS Microbiol.Lett. 26, 239 (19
85)、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (198
5)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。

【００５６】ラクトバチルス(Lactobacillus)属におい
ては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J.
Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であ
り、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが
利用可能である。

【００５７】ロドコッカス(Rhodococcus)属において
は、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodoch
rous)から単離されたプラスミドベクターが使用可能で
ある (J.Gen. Microbiol. 138,1003 (1992) )。

【００５８】ストレプトマイセス(Streptomyces)属にお
いては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Strepto
myces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Labo
ratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを
構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リ
ビダンス(Streptomyces lividans)においては、pIJ486
(Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986)、pKC1064(Gen
e 103,97-99 (1991) )、pUWL-KS (Gene 165,149-150 (1
995) )が使用できる。また、ストレプトマイセス・バー
ジニア(Streptomyces virginiae)においても、同様のプ
ラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11,
46-53 (1997) ）。

【００５９】サッカロマイセス(Saccharomyces)属、特
にサッカロマイセス・セレビジアエ(Saccharomyces cer
evisiae) においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プ
ラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在す
るリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグ
レーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで
遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため
極めて有用である。また、ADH(アルコール脱水素酵
素)、GAPDH(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵
素)、PHO(酸性フォスファターゼ)、GAL(β−ガラクトシ
ダーゼ)、PGK(ホスホグリセレートキナーゼ)、ENO(エノ
ラーゼ)などのプロモーター、ターミネーターが利用可
能である。

【００６０】クライベロマイセス属、特にクライベロマ
イセス・ラクティス(Kluyveromyceslactis)において
は、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラス
ミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390
(1981)）、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミ
ド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS
系プラスミド、リボソームDNAなどとの相同組み換えに
より染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミ
ド（EP 537456など）などが利用可能である。また、AD
H、PGKなどに由来するプロモーター、ターミネーターが
利用可能である。

【００６１】シゾサッカロマイセス(Schizosaccharomyc
es)属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来
のARS (自律複製に関与する遺伝子)及びサッカロマイセ
ス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マー
カーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol.
Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマ
イセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用でき
る（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、pAUR224は、宝酒
造から市販されており容易に利用できる。

【００６２】チゴサッカロマイセス属(Zygosaccharomyc
es)においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zyg
osaccharomyces rouxii)由来の pSB3（Nucleic Acids R
es.13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクタ
ーが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ
由来 PHO5 プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロ
ウキシ由来 GAP-Zr(グリセルアルデヒド−３−リン酸脱
水素酵素)のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 252
1 (1990)）などが利用可能である。

【００６３】ピキア(Pichia)属においては、ピキア・パ
ストリス(Pichia pastoris)などにピキア由来自律複製
に関与する遺伝子 (PARS1、PARS2)などを利用した宿主
ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 33
76 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能な AO
X など強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids
Res. 15, 3859 (1987)）。また、ピキア・アンガスタ(P
ichia angusta、旧名ハンゼヌラ・ポリモルファ Hansen
ula polymorpha)において宿主ベクター系が開発されて
いる。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律
複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であ
るが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーイ
ンテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (19
91)）。また、メタノールなどで誘導される AOX（アル
コールオキシダーゼ）、FDH(ギ酸脱水素酵素)のプロモ
ーターなどが利用可能である。

【００６４】キャンディダ(Candida)属においては、キ
ャンディダ・マルトーサ(Candida maltosa)、キャンデ
ィダ・アルビカンス(Candida albicans)、キャンディダ
・トロピカリス(Candida tropicalis)、キャンディダ・
ウチルス (Candida utilis) などにおいて宿主ベクター
系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおい
てはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニング
され（Agri. Biol. Chem.51, 51, 1587 (1987)）、これ
を利用したベクターが開発されている。また、キャンデ
ィダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイ
プのベクターは強力なプロモーターが開発されている
（特開平 08-173170）。

【００６５】アスペルギルス(Aspergillus)属において
は、アスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)、ア
スペルギルス・オリジー (Aspergillus oryzae) などが
カビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色
体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プ
ロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能
である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (198
9)）。

【００６６】トリコデルマ(Trichoderma)属において
は、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)を利
用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ
遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnol
ogy 7, 596-603 (1989)）。

【００６７】また、微生物以外でも、植物、動物におい
て様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を
用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、ト
ウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種蛋白
質を発現させる系が開発されており、好適に利用でき
る。

【００６８】また、上記の方法で得られる本発明のエノ
ン還元酵素を発現する形質転換体は、本発明の酵素の製
造や、以下に述べるα，β−不飽和ケトンの炭素−炭素
２重結合の選択的還元によるα，β−飽和ケトンの製造
に用いることができる。

【００６９】すなわち本発明は、前記エノン還元酵素、
該酵素または蛋白質を産生する微生物、および該微生物
の処理物、からなる群から選択されるいずれかの酵素活
性物質をα，β不飽和ケトンに作用させる工程を含む、
α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に
還元する方法に関する。本発明の酵素、酵素を含む培養
物、その処理物が反応溶液と接触させることにより、目
的とする酵素反応を行わせることができる。

【００７０】本発明の方法において、エノン還元酵素と
しては、配列番号：２に記載されたアミノ酸配列からな
る蛋白質、そのホモログ、あるいは前記理化学的性質
（Ａ）−（Ｃ）を有するエノン還元酵素を用いることが
できる。エノン還元酵素は、精製されたものの他、粗精
製酵素として用いることもできる。更に本発明において
は、エノン還元酵素として、エノン還元酵素の産生能を
有する細胞を用いることもできる。本発明において使用
するエノン還元酵素生産能を有する細胞は、NADPH依存
性エノン還元酵素生産能を有するクライベロマイセス属
に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作
技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得
した形質転換体を含む。

【００７１】なお、酵素と反応溶液の接触形態はこれら
の具体例に限定されるものではない。反応溶液は、基質
や酵素反応に必要な補酵素であるNADPHを酵素活性の発
現に望ましい環境を与える適当な溶媒に溶解したもので
ある。本発明におけるエノン還元酵素を含む微生物の処
理物には、具体的には界面活性剤やトルエンなどの有機
溶媒処理によって細胞膜の透過性を変化させた微生物、
あるいはガラスビーズや酵素処理によって菌体を破砕し
た無細胞抽出液やそれを部分精製したものなどが含まれ
る。

【００７２】本発明におけるα，β−不飽和ケトンは限
定されない。たとえば、次の一般式Ｉで表される化合物
を、α，β−不飽和ケトンとして示すことができる。

【化１】 （式中、R1は、置換または無置換のアルキル基、置換ま
たは無置換のアルケニル基、置換または無置換のアラル
キル基、置換または無置換のアルコキシ基を示す。R2は
水素もしくは、置換又は無置換の短鎖アルキル基を示，
R3は、置換又は無置換の短鎖アルキル基を示す。） より具体的には、メチルビニルケトン、エチルビニルケ
トン、３−ペンテン−２−オン、３−メチル−３−ペン
テン−２−オン等が好適に用いられる。

【００７３】更に、本発明の酵素、または、該酵素を産
生する微生物もしくはその処理物をα−置換を有する
α,β−不飽和ケトンに作用させることにより、光学活
性な飽和ケトンの合成にも利用できる。

【００７４】前記本発明によるケトン製造方法において
は、NADPHの再生系を組み合わせることができる。エノ
ン還元酵素による還元反応に付随して、NADPHからNADP⁺
が生成する。NADP⁺からNADPHへの再生は、微生物の含有
するNADP⁺からNADPHを再生する酵素（系）によって行う
ことができる。これらNADP^＋還元能は、反応系にグルコ
ースまたはエタノールを添加することにより、増強する
ことが可能である。また、NADP⁺からNADPHを生成する能
力を有する酵素、例えば、グルコース脱水素酵素、グル
タミン酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素
酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ホスホグル
コン酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、グリセロー
ル脱水素酵素などを含む微生物、その処理物、ならびに
部分精製もしくは精製酵素を用いてNADPHの再生を行う
ことができる。例えば、上記グルコース脱水素酵素の場
合には、グルコースからδ−グルコノラクトンへの変換
を利用することにより、NADPHの再生が行われる。

【００７５】これらのNADPH再生に必要な反応を構成す
る成分は、本発明によるケトンの製造のための反応系に
添加、もしくは固定化したものを添加することができ
る。あるいはNADPHの交換が可能な膜を介して接触させ
ることができる。

【００７６】また、本発明のDNAを含む組換えベクター
で形質転換した微生物を、生存した状態で前記ケトンの
製造方法に利用する場合には、NADPH再生のための付加
的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、NADP
H再生活性の高い微生物を宿主として用いることによ
り、形質転換体を用いた還元反応において、NADPH再生
用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さ
らに、NADPH再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、
ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水
素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）
などの遺伝子を、本発明のNADPH依存性エノン還元酵素
をコードするDNAと同時に宿主に導入することによっ
て、より効率的なNADPH再生酵素とNADPH依存性エノン還
元酵素の発現、還元反応を行うことも可能である。これ
らの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入に
は、大腸菌においては不和合性をさけるために複製起源
のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組
み換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一
のベクターに両遺伝子を導入する方法、片方、もしく
は、両方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用
することができる。

【００７７】本発明におけるNADPH再生に利用可能なグ
ルコース脱水素酵素として、バシラス・サブチルス（Ba
cillus subtilis）に由来するグルコース脱水素酵素を
示すことができる。この酵素をコードする遺伝子は既に
単離されている。あるいは既に明らかにされているその
塩基配列に基づいて、PCRやハイブリダイズスクリーニ
ングによって、当該微生物から取得することもできる。

【００７８】単一のベクター中に複数の遺伝子を導入す
る場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制
御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラ
クトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペ
ロンとして発現させることも可能である。

【００７９】本発明の酵素を用いた還元反応は、水中
で、あるいは水に溶解しにくい有機溶媒と水との２相中
で実施することができる。水に溶解しにくい有機溶媒と
しては、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、
クロロホルム、n-ヘキサン、イソオクタンなどを用いる
ことができる。あるいは、エタノール、アセトン、ジメ
チルスルホキシド、アセトニトリル等の有機溶媒と水性
媒体との混合系中で行うこともできる。

【００８０】本発明の反応は、固定化酵素、膜リアクタ
ー等を利用して行うことも可能である。特に、本反応の
基質となるα,β−不飽和ケトンは水に対して難溶性の
物が多いために、ポリプロピレンなどの疎水性の膜を介
して本発明の酵素、本発明の酵素を含む微生物、その処
理物を含む水相と基質α,β−不飽和ケトンを含む有機
溶媒相を接触させ、反応させることにより基質及び生成
物による阻害作用を低減させることができる。

【００８１】本発明のエノン還元酵素による酵素反応
は、以下の条件で行うことができる。 ・反応温度：4-55℃、好ましくは10-45℃ ・pH：4-9、好ましくは5.5-8、さらに好ましくはpH6.5-
7.0 ・基質濃度：0.01-90%、好ましくは0.1-20%

【００８２】反応系には必要に応じて補酵素NADP^＋また
はNADPHを0.001 mM-100 mM、好ましくは、0.01-10 mM添
加することができる。また、基質は反応開始時に一括し
て添加することも可能であるが、反応液中の基質濃度が
高くなりすぎないように連続的、もしくは非連続的に添
加することが望ましい。

【００８３】NADPH再生のために反応系に添加される化
合物、例えばグルコース脱水素酵素を利用する場合のグ
ルコース、ギ酸脱水素酵素を利用する場合のギ酸、アル
コール脱水素酵素を利用する場合のエタノールもしくは
2-プロパノール、グルタミン酸脱水素酵素を利用する場
合のＬ−グルタミン酸、リンゴ酸脱水素酵素を利用する
場合のＬ−リンゴ酸、等は、基質α，β−不飽和ケトン
に対してモル比で0.1-20、好ましくは0.5-5倍過剰に添
加することができる。NADPH再生用の酵素、例えばグル
コース脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、アルコール脱水素
酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ
酸脱水素酵素など）等は、本発明のNADPH依存性エノン
還元酵素に比較して酵素活性で0.1-100倍、好ましくは
0.5-20倍程度添加することができる。

【００８４】本発明のα，β−不飽和ケトンの還元によ
り生成するケトンの精製は、菌体、蛋白質の遠心分離、
膜処理等による分離、溶媒抽出、蒸留、クロマトグラフ
ィー等を適当に組み合わせることにより行うことができ
る。

【００８５】これら各種合成反応に利用する本発明の酵
素は、精製酵素に限定されず、部分精製酵素、本酵素を
含む微生物菌体、その処理物も含まれる。なお本発明に
おける処理物とは、菌体、精製酵素、あるいは部分精製
酵素などを様々な方法で固定化処理したものを総称して
示す用語である。以下、実施例により本発明を更に詳し
く説明するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。

【００８６】

【実施例】［実施例１］（エノン還元酵素の精製） クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を
１．２LのYM培地（グルコース２０g/L、酵母エキス３g/
L、麦芽エキス３g/L、ペプトン５g/L、pH ６．０）で培
養し、遠心分離により菌体を調製した。得られた湿菌体
を５０mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）、０．０２
％２−メルカプトエタノール及び２mMフェニルメタンス
ルホニルフルオリド（PMSF）で澱懸し、ビードビーター
（Biospec社製）により破砕後、遠心分離により菌体残
渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液に
プロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上
清を得た。その上清に硫安を３０％飽和になるまで添加
し、３０％硫安を含む標準緩衝液（１０mMトリス−塩酸
緩衝液（pH８．５）、０．０１％ ２−メルカプトエタ
ノール、１０％ グリセロール）で平衡化したフェニル
−セファロースHP（２．６cm×１０cm）に添加し、硫安
濃度を３０％−０％の勾配溶出を行った。

【００８７】NADPH依存性のメチルビニルケトン還元活
性は、勾配溶出部分に２つのピークがみられた。これら
のピークのうち後方に溶出したピーク部分を回収し、限
外濾過により濃縮した。濃縮した酵素液を標準緩衝液に
対して透析した後、同緩衝液で平衡化したMonoQ（０．
５ cm× ５cm）に添加した。標準緩衝液でカラムを洗浄
した後、０−０．５M塩化ナトリウムの勾配溶出を行っ
た。溶出した活性画分を回収し、限外濾過により濃縮し
た。濃縮酵素液に硫安を３０％飽和添加し、３０％飽和
硫安を含む標準緩衝液で平衡化したフェニル−スーパー
ロース（０．５cm×５cm）に添加した。同緩衝液で洗浄
後、３０％−０％飽和硫安で勾配溶出を行った。溶出し
た活性画分を回収した。

【００８８】フェニル−スーパーロースにより得られた
活性画分を、SDS-PAGEにより解析した結果、単一バンド
であった（図１）。精製酵素の比活性は約３１．７ U/m
gであった。精製の要約を表１に示す。

【００８９】

【表１】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ ステップ 蛋白質 酵素活性 比活性 (mg) (U) (U/mg) ─────────────────────────── 無細胞抽出液 3390 1360 0.401 プロタミン硫酸沈殿 1480 1220 0.851 フェニル-セファロース 156 222 1.42 MonoQ 2.70 117 43.4 フェニル-スーパーロース 0.162 5.14 31.7 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００９０】［実施例２］（エノン還元酵素の分子量測
定） 実施例１で得られた酵素のサブユニットの分子量をSDS-
PAGEにより求めた結果、４．３万であった。また、スー
パーデックスG200のゲルろ過カラムを用いて分子量を測
定したところ、約４．２万であった。これらの結果よ
り、本発明のエノン還元酵素はモノマー酵素と予想され
た。

【００９１】［実施例３］（エノン還元酵素の至適pH
） リン酸カリウム緩衝液、ブリットン・ロビンソンの広域
緩衝液を用いてpHを変化させて、実施例１で得られた酵
素のメチルビニルケトンの還元活性を調べ、最大活性を
１００とした相対活性で表し、図２に示した。反応の至
適pHは６．５−７．０であった。

【００９２】［実施例４］（エノン還元酵素の至適温
度） 実施例１で得られた酵素を標準反応条件のうち温度だけ
を変化させて、メチルビニルケトンの還元活性を測定
し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３に示
した。反応の至適温度は３７−４５℃であった。

【００９３】［実施例５］（エノン還元酵素の基質特異
性） 実施例１で得られた酵素を種々のエノン、ケトン、およ
びアルデヒドと反応させ、その還元反応の活性をメチル
ビニルケトンの還元を１００とした相対活性で表し、表
２に示した。

【表２】 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━ 基質 補酵素 相対活性 ──────────────────────── メチルビニルケトン NADPH 100 エチルビニルケトン NADPH 537 3-ペンテン-2-オン NADPH 16 4-メチル-3-ペンテン-2-オン NADPH 1 3-メチル-3-ペンテン-2-オン NADPH 48 2-メチル-2-シクロペンテン-1-オン NADPH 0 3-メチル-2-シクロペンテン-1-オン NADPH 0 2-ブタノン NADPH 0 クロトン酸 NADPH 0 メチルグリコキサール NADPH 1 2, 3-ブタンジオン NADPH 1 アセトフェノン NADPH 0 メチルビニルケトン NADH 14 エチルビニルケトン NADH 52 ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━

【００９４】［実施例６］（エノン還元酵素を用いた３
−ペンタノンの合成） ２００mMリン酸カリウム緩衝液（pH ６．５）、４４mg
NADH、エノン還元酵素１Ｕ、０．２％エチルビニルケト
ンを含む反応液中で、２５℃で終夜反応させた。生成し
た３−ペンタノンをガスクロマトグラフィーで定量し、
出発原料であるエチルビニルケトンに対する収率を求め
た。ガスクロマトグラフィーの条件は以下のとおりであ
る。すなわち、Porapak PS（Waters、mesh 50-80、3.2
mmｘ210cm）を用い、カラム温度を１３０℃とし、水素
炎イオン化検出器（FID）を利用して分析した。その結
果、反応の収率は１００％であった。

【００９５】［実施例７］（エノン還元酵素の部分アミ
ノ酸配列） 実施例１で得られた酵素を用いて、SDS−PAGEのゲルよ
り、エノン還元酵素を含むゲル断片を切り出し、2回洗
浄後、リジルエンドペプチダーゼを用いて、35℃で終夜
イン・ゲル・ダイジェションを行った。消化したペプチ
ドを逆相HPLC (東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、２.０mm
× ２５０mm) を用い、0.1% トリフルオロ酢酸 (TFA)
中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチド
を分離し、分取した。

【００９６】分取したペプチドピーク２種を lep_64、l
ep_65とし、それぞれプロテインシーケンサー（Hewlett
Packard G1005A Protein Sequencer System）によりア
ミノ酸配列の解析を行った。lep_64、lep_65のアミノ酸
配列をそれぞれ配列番号：９，１０で示した。

【００９７】配列番号：９：lep_64 Ser-Tyr-Gly-Ala-Asp-Asp-Val-Phe-Asp-Tyr-His-Asp 配列番号：１０：lep_65 Ile-Gly-Pro-Glu-Gly-Ser-Ile-Leu-Gly-Cys-Asp-Ile

【００９８】［実施例８］（クライベロマイセス・ラク
ティスからの染色体DNAの精製） クライベロマイセス・ラクティス ＩＦＯ １２６７株を
YM培地で培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体DN
Aの精製は、Meth. Cell Biol. 29, 39-44 (1975) に記
載の方法により行った。

【００９９】［実施例９］（エノン還元酵素遺伝子のコ
ア領域のクローニング） lep_64、lep_65のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプ
ライマー、アンチセンスプライマーを計３種類合成し
た。それぞれの塩基配列を配列番号：１１(KR2-64U)、
１２(KR2-65D)、１３(KR2-65E)に示した。

【０１００】配列番号：１１：KR2-64U TGRTARTCRAANACRTCRTC 配列番号：１２：KR2-65D ATWGGHCCWGARGGHTCNAT 配列番号：１３：KR2-65E ATWGGHCCNGARGGHAGYAT

【０１０１】３種類のうち2種類の組み合わせでプライ
マーを選び、プライマーを各５０pmol、dNTP１０nmol、
クライベロマイセス・ラクティス由来染色体DNA５０n
g、AmpliTaq用緩衝液 (宝酒造製)、AmpliTaq２Ｕ (宝酒
造製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（94℃、30
秒)、アニール（45℃、30秒）、伸長（70℃、1分）を30
サイクル、GeneAmp PCR System 2400 (パーキンエルマ
ー製)を用いて行った。

【０１０２】PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳
動により解析した結果、KR2-64UとKR2-65Dの組み合わせ
において特異的と思われるバンドが検出できた。得られ
たDNA断片を、フェノール／クロロホルム抽出後、エタ
ノール沈殿として回収した。得られたDNA断片を、pT7Bl
ue(R) Tベクター（Novagen社）とTakara Ligation Kit
を用いて、ライゲーションし、大腸菌JM109株を形質転
換した。

【０１０３】形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）
を含むＬＢ培地（１％バクト−トリプトン、０．５％バ
クト−酵母エキス、１％塩化ナトリウム、以下、LB培地
と略す）プレート上で生育させ、Blue/Whiteセレクショ
ン法により選別されたいくつかの白色のコロニーより市
販のM13-21（TGTAAAACGACGGCCAGT（配列番号：２
８））、M13-RP（CAGGAAACAGCTATGACC（配列番号：２
９））プライマーを用いてコロニーダイレクトPCRを行
い、挿入断片のサイズを確認した。目的とするDNA断片
が挿入されていると考えられるコロニーをアンピシリン
を含む液体ＬＢ培地で培養し、Flexi-Prep (ファルマシ
ア製) によりプラスミドを精製し、pKLR2とした。

【０１０４】精製したプラスミドを用いて、挿入DNAの
塩基配列を解析した。DNA塩基配列の解析には、BigDye
Terminator Cycle Sequencing FS ready Reaction Kit
(パーキンエルマー製)を用いてPCRを行い、DNAシーケン
サーABI PRISM^TM 310(パーキンエルマー製)により行っ
た。決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：１４と
して示した。

【０１０５】［実施例１０］（エノン還元酵素遺伝子の
コア領域周辺の塩基配列の解析） クライベロマイセス・ラクティス由来染色体DNAを制限
酵素HaeII、またはPstIで消化し、T4リガーゼを用いて1
6℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片
を環化させた。次に、プライマーKL2-5U（配列番号：１
５）およびKL2-3D（配列番号：１６）を各１００pmol、
環化DNAを２５ng、Ex-Taq用緩衝液 (宝酒造製)、Ex-Taq
2U (宝酒造製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（9
4℃、30秒） 、アニール（55℃、30秒）、伸長（72℃、
7分）を30サイクル、GeneAmp PCRSystem 2400 (パーキ
ンエルマー製)を用いて行った。PCR反応液の一部をアガ
ロースゲル電気泳動により解析した結果、５０００ｂｐ
あたりに特異的と思われるバンドが検出できた。このDN
A断片をSephaglas BandPrep Kit(ファルマシア製)によ
り精製し、塩基配列をプライマーウォーキング法により
解析した。用いたプライマーは、KL2-5U、KL2-3D、KL2-
Sq1（配列番号：１７）、KL2-Sq2（配列番号：１８）、
KL2-Sq3（配列番号：１９）の5種類。DNA塩基配列の解
析には、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS read
y Reaction Kit (パーキンエルマー製)を用いてPCRを行
い、DNAシーケンサーABI PRISM^TM 310 (パーキンエルマ
ー製)により行った。その結果、エノン還元酵素のORF配
列を決定することができた。決定したDNA配列は配列番
号：１に、コードする蛋白質の配列は配列番号：２に示
す。DNA配列からのORF検索、予想アミノ酸配列への翻訳
などは、Genetyx-WIN（ソフトウェア開発株式会社製）
を用いて行った。 配列番号：１５：KL2-5U TCCGGTACCGACAACTGTACCAGCAATGTC 配列番号：１６：KL2-3D ATCGGTACCTATACTAAGATTGTAACTGTTGC 配列番号：１７：KL2-Sq1 CCGGGTACCCTTTTAGGGTGA 配列番号：１８：KL2-Sq2 TCATGAAGCCACAGTTAAATTCG 配列番号：１９：KL2-Sq3 ATATTCATATGATGGATATCACCG

【０１０６】［実施例１１］（エノン還元酵素遺伝子の
クローニング） エノン還元酵素の構造遺伝子配列を元にORFクローニン
グ用のプライマーKLCR2-N（配列番号：２０）、KLCR2-C
（配列番号：２１）を合成した。プライマーを各５０pm
ol、dNTP１０nmol、クライベロマイセス・ラクティス由
来染色体DNA５０ng、Pfu Turbo-DNA polymerase用緩衝
液 (STRATAGENE製)、Pfu Turbo-DNA polymerase 2.5 U
(STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用い、変性（9
5℃、2分30秒）、アニール（55℃、１分）、伸長（75
℃、1分30秒）を30サイクル、GeneAmp PCR System 2400
(パーキンエルマー製)を用いて行った。 配列番号：２０：KLCR2-N CTGGAATTCTACCATGGCTTCAGTTCCAACCACTCAAAAAG 配列番号：２１：KLCR2-C GACAAGCTTCTAGATTATAACCTGGCAACATACTTAACA

【０１０７】PCR反応液の一部をアガロースゲル電気泳
動により解析した結果、特異的と思われるバンドが検出
できた。得られたDNA断片を、フェノール／クロロホル
ム抽出後、エタノール沈殿として回収した。DNA断片を
制限酵素NcoI、XbaIで2重消化し、アガロースゲル電気
泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、Sepa
glas BandPrep Kit(ファルマシア製)により精製した。
得られたDNA断片を、NcoI、XbaIで2重消化したpSE420D
とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、
大腸菌JM109株を形質転換した。

【０１０８】形質転換株をアンピシリン（５０μg/mL）
を含むLB培地プレート上で生育させ、いくつかのコロニ
ーよりKLCR2-N、KLCR2-Cプライマーを用いてコロニーダ
イレクトPCRを行い、挿入断片のサイズを確認した。目
的のサイズである事が確認できたコロニーよりプラスミ
ドを精製し、挿入断片の塩基配列を解析した。目的とす
るエノン還元酵素遺伝子を持つプラスミドをpSE-KLR1
(図４) とした。

【０１０９】［実施例１２］（組換えエノン還元酵素の
大腸菌による生産） エノン還元酵素を発現するプラスミドpSE-KLR1で形質転
換された大腸菌HB101株をアンピシリンを含む液体LB培
地で終夜30℃培養し、0.1mM IPTGを加え、さらに4時間
培養を行った。菌体を遠心分離により集菌した後、0.02
% 2-メルカプトエタノール、2mM PMSF、10%グリセリン
を含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH８．０）に懸濁
し、密閉式超音波破砕装置UCD-200TM（コスモバイオ
製）を用いて3分間処理することで、菌体を破砕した。
菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液中とし
て回収し、種々の基質に対する活性を測定した。また該
プラスミドを含まない大腸菌HB101株をLB培地で終夜培
養し、0.1mM IPTG添加後さらに4時間培養した菌体を、
同様に破砕して種々の基質に対する活性を測定した。結
果を表３に示す。

【表３】

【０１１０】［実施例１３］（サッカロマイセス・セレ
ビジエからの染色体DNAの精製） サッカロマイセス・セレビジエ X2180-1B (Yeast Genet
ic Stock Center) をYM培地で培養し、菌体を調製し
た。菌体からの染色体DNAの精製は、Meth. Cell Biol.
29, 39-44 (1975) に記載の方法により行った。

【０１１１】［実施例１４］（エノン還元酵素のホモロ
グ YNN4 のクローニング） DDBJに登録されている予想蛋白質YNN4 (SWISS-PROT Acc
ession No., P53912)に対応するDNA配列 (DDBJ Accessi
on No. Z46843) を基にPCR用プライマーYNN4-ATG1（配
列番号：２２）、YNN-TAA1（配列番号：２３）を合成し
た。

【０１１２】プライマーを各２５pmol、dNTP１０nmol、
サッカロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ng、P
fu DNA polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA
polymerase 2Ｕ (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液
を用い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、
１分）、伸長（７５℃、６分）を30サイクル、GeneAmp
PCR System 2400 (パーキンエルマー製)をPCRを行った
結果、特異的な増幅産物が得られた。増幅産物をフェノ
ール処理後、制限酵素AflIII, XbaIで2重消化し、制限
酵素NcoI, XbaIで2重消化したベクターpSE420DとTAKARA
Ligation Kit によりライゲーションした。ライゲーシ
ョンしたDNAにより大腸菌JM109株を形質転換し、アンピ
シリン（５０mg/L）を含むＬＢ培地で生育し、得られた
形質転換株よりプラスミドをFlexiPrepにより精製し
た。得られたプラスミドをpSE-YNN4とした。

【０１１３】プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解
析し、その結果を配列番号：３に示した。得られた塩基
配列は、DDBJに登録されたいる塩基配列と完全に一致し
た。配列番号：３の塩基配列から予想されるアミノ酸配
列を配列番号：４に示した。 配列番号：２２：YNN4-ATG1 CAAACATGTCTGCCTCGATTCCAGA 配列番号：２３：YNN4-TAA1 CAGTCTAGATTATTTCAAGACGGCAACCAAC

【０１１４】［実施例１５］（エノン還元酵素のホモロ
グ YL60 のクローニング） DDBJに登録されている予想蛋白質YL60 (SWISS-PROT Acc
ession No., P54007)に対応するDNA配列 (DDBJ Accessi
on No. U22383) を基にPCR用プライマーYL60-ATG2（配
列番号：２４）、YL60-TAA1（配列番号：２５）を合成
した。プライマーを各２５pmol、dNTP１０nmol、サッカ
ロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ng、Pfu DNA
polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polyme
rase 2U (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用
い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、１
分）、伸長（７５℃、６分）を30サイクル、GeneAmp PC
R System 2400 (パーキンエルマー製)をPCRを行った結
果、特異的な増幅産物が得られた。

【０１１５】増幅産物をフェノール処理後、制限酵素Nc
oI, XbaIで2重消化し、制限酵素NcoI, XbaIで2重消化し
たベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりライ
ゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸菌J
M109株を形質転換し、アンピシリン（５０mg/L）を含む
ＬＢ培地で生育し、得られた形質転換株よりプラスミド
をFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミドをpSE
-YL60とした。プラスミドの挿入DNA部分の塩基配列を解
析し、その結果を配列番号：５に示した。得られた塩基
配列は、DDBJに登録されている塩基配列と完全に一致し
た。配列番号：５の塩基配列から予想されるアミノ酸配
列を配列番号：６に示した。

【０１１６】配列番号：２４：YL60-ATG2 CAACCATGGCTCAAGTTGCAATTCCAGAAACC 配列番号：２５：YL60-TAA1 GACTCTAGATTAGTTTAATACGGCAACGAGTTTTTCAC

【０１１７】［実施例１６］（エノン還元酵素のホモロ
グ YCZ2 のクローニング） DDBJに登録されている予想蛋白質YCZ2 (SWISS-PROT Acc
ession No., P25608)に対応するDNA配列 (DDBJ Accessi
on No. X59720) を基にPCR用プライマーYCZ2-ATG1（配
列番号：２６）、YCZ2-TAA1（配列番号：２７）を合成
した。プライマーを各２５pmol、dNTP１０nmol、サッカ
ロマイセス・セレビジエ由来染色体DNA５０ng、Pfu DNA
polymerase用緩衝液 (STRATAGENE製)、Pfu DNA polyme
rase 2 U (STRATAGENE製)を含む５０μLの反応液を用
い、変性（９５℃、４５秒）、アニール（５０℃、１
分）、伸長（７５℃、６分）を30サイクル、GeneAmp PC
R System 2400 (パーキンエルマー製)をPCRを行った結
果、特異的な増幅産物が得られた。

【０１１８】増幅産物をフェノール処理後、制限酵素Bs
pHI, XbaIで2重消化し、制限酵素NcoI, XbaIで2重消化
したベクターpSE420DとTAKARA Ligation Kit によりラ
イゲーションした。ライゲーションしたDNAにより大腸
菌JM109株を形質転換し、アンピシリン（５０mg/L）を
含むＬＢ培地で生育し、得られた形質転換株よりプラス
ミドをFlexiPrepにより精製した。得られたプラスミド
をpSE-YCZ2とした。プラスミドの挿入DNA部分の塩基配
列を解析し、その結果を配列番号：７に示した。得られ
た塩基配列は、1089位のAがCに置換していたが、アミノ
酸は同じであった。塩基配列から予想されるアミノ酸配
列を配列番号：８に示した。 配列番号：２６：YCZ2-ATG1 GAAATCATGAAAGCTGTCGTCATTGAA 配列番号：２７：YCZ2-TAA1 GTTTCTAGATTAGTTTAATACGGCAACKAGTTTTTCA

【０１１９】［実施例１７］（エノン還元酵素のホモロ
グ YNN4、YL60、およびYCZ2 の活性確認） pSE-YNN4, pSE-YL60, pSE-YCZ2をそれぞれ含有する大腸
菌JM109株をアンピシリンを含むLB培地で培養し、0.1 m
M IPTGにより誘導を4時間行い、遠心分離により集菌菌
体を得た。それぞれの菌体を菌体破砕液（50mM KPB pH
8.0、1mM EDTA、0.02% 2-ME、2mM PMSF、10% Glycero
l）に懸濁し、超音波により菌体を破砕後、遠心分離に
より得られた上清を無細胞抽出液とした。各無細胞抽出
液を用いてエノン還元活性を測定した結果、0.268 U/mg
-protein, 0.198 U/mg-protein, 0.133 U/mg-proteinの
活性が得られ、本発明の酵素の3種類のホモログがいず
れもエノン還元酵素活性を有することが確認された。

【０１２０】

【発明の効果】α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重
結合を選択的に還元することができる新規なエノン還元
酵素が提供された。この酵素によって、医薬品の原料な
どに有用なケトンを酵素的に、製造することが可能とな
った。本発明のエノン還元酵素は、α，β−不飽和ケト
ンの炭素−炭素２重結合に対する選択性に優れる。した
がって、目的とするケトンを高い収率で得ることができ
る。

【０１２１】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> DAICEL CHEMICAL INDUSTRIES, LTD. <120> A novel enone reductase, manufacturing of same, and method for red ucing a carbon-carbon double bond of alfa, beta-unsaturated ketone. <130> D1-A0103 <140> <141> <160> 29 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1113 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <220> <221> CDS <222> (1)..(1113) <400> 1 atg tca gtt cca acc act caa aaa gcc gtc atc att gaa ggt gac aaa 48 Met Ser Val Pro Thr Thr Gln Lys Ala Val Ile Ile Glu Gly Asp Lys 1 5 10 15 gct gtt gtt aaa aca gat gtc tca gtt cca gaa tta aag gag ggt aca 96 Ala Val Val Lys Thr Asp Val Ser Val Pro Glu Leu Lys Glu Gly Thr 20 25 30 gcc ttg gtg aag gtt gag gct gtt gct ggt aac cca act gat tgg aag 144 Ala Leu Val Lys Val Glu Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr Asp Trp Lys 35 40 45 cat att gct tat aag att ggt cca gaa ggt tca att cta gga tgt gac 192 His Ile Ala Tyr Lys Ile Gly Pro Glu Gly Ser Ile Leu Gly Cys Asp 50 55 60 att gct ggt aca gtt gtc aaa ctt gga cca aat gct agt act gac ttg 240 Ile Ala Gly Thr Val Val Lys Leu Gly Pro Asn Ala Ser Thr Asp Leu 65 70 75 80 aag gtt gga gat acc ggt ttc ggt ttt gtt cac ggt gct tcc caa aca 288 Lys Val Gly Asp Thr Gly Phe Gly Phe Val His Gly Ala Ser Gln Thr 85 90 95 gat cct aaa aat ggt gca ttt gct gaa tat gcc agg gtt tat cca cct 336 Asp Pro Lys Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Val Tyr Pro Pro 100 105 110 ttg ttt tac aag agt aac tta act cac tca act gct gat gaa att tct 384 Leu Phe Tyr Lys Ser Asn Leu Thr His Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ser 115 120 125 gaa ggc cct gtg aag aac ttc gaa tct gct gca tca ttg cca gtt tcg 432 Glu Gly Pro Val Lys Asn Phe Glu Ser Ala Ala Ser Leu Pro Val Ser 130 135 140 ttg aca act gct ggt gtt agt ttg tgt cat cac ttg ggc tca aaa atg 480 Leu Thr Thr Ala Gly Val Ser Leu Cys His His Leu Gly Ser Lys Met 145 150 155 160 gaa tgg cac cca tct acc ccg caa cat act cat cca tta ttg att tgg 528 Glu Trp His Pro Ser Thr Pro Gln His Thr His Pro Leu Leu Ile Trp 165 170 175 ggt ggt gct aca gca gtg ggt caa caa cta atc caa gtt gcc aaa cat 576 Gly Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Gln Leu Ile Gln Val Ala Lys His 180 185 190 atc aat gct tat act aag att gta act gtt gct tct aaa aag cat gaa 624 Ile Asn Ala Tyr Thr Lys Ile Val Thr Val Ala Ser Lys Lys His Glu 195 200 205 aag ctt tta aag tct tat ggt gct gat gat gtc ttt gac tat cat gat 672 Lys Leu Leu Lys Ser Tyr Gly Ala Asp Asp Val Phe Asp Tyr His Asp 210 215 220 gca ggc gtt att gag cag atc aaa tcg aag tat cca aac ctg caa cat 720 Ala Gly Val Ile Glu Gln Ile Lys Ser Lys Tyr Pro Asn Leu Gln His 225 230 235 240 gtt att gac gct gtg gga agc gaa gat agt atc ccc gag gcc tat aaa 768 Val Ile Asp Ala Val Gly Ser Glu Asp Ser Ile Pro Glu Ala Tyr Lys 245 250 255 gtc aca gca gat agt cta cct gcc aca tta tta gaa gtg gtt cca atg 816 Val Thr Ala Asp Ser Leu Pro Ala Thr Leu Leu Glu Val Val Pro Met 260 265 270 acc att gaa agc att cct gaa gaa atc aga aaa gat aat gtt aaa att 864 Thr Ile Glu Ser Ile Pro Glu Glu Ile Arg Lys Asp Asn Val Lys Ile 275 280 285 gat att act ttg ttg tat cgt gca tct ggt caa gaa att cta ttg ggt 912 Asp Ile Thr Leu Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Gln Glu Ile Leu Leu Gly 290 295 300 gca aca aga ttt cct gct agt cca gaa tat cat gaa gcc aca gtt aaa 960 Ala Thr Arg Phe Pro Ala Ser Pro Glu Tyr His Glu Ala Thr Val Lys 305 310 315 320 ttc gtt aag ttt ata aat cca cac ctt aac aac ggt gat atc cat cat 1008 Phe Val Lys Phe Ile Asn Pro His Leu Asn Asn Gly Asp Ile His His 325 330 335 atg aat att aaa gtt ttc agc aac ggc tta gat gat gtc cca gct ctc 1056 Met Asn Ile Lys Val Phe Ser Asn Gly Leu Asp Asp Val Pro Ala Leu 340 345 350 act gaa ggt ata aaa gaa ggt aaa aac aaa aat gtt aag tat gtt gcc 1104 Thr Glu Gly Ile Lys Glu Gly Lys Asn Lys Asn Val Lys Tyr Val Ala 355 360 365 agg tta taa 1113 Arg Leu 370 <210> 2 <211> 370 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 2 Met Ser Val Pro Thr Thr Gln Lys Ala Val Ile Ile Glu Gly Asp Lys 1 5 10 15 Ala Val Val Lys Thr Asp Val Ser Val Pro Glu Leu Lys Glu Gly Thr 20 25 30 Ala Leu Val Lys Val Glu Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr Asp Trp Lys 35 40 45 His Ile Ala Tyr Lys Ile Gly Pro Glu Gly Ser Ile Leu Gly Cys Asp 50 55 60 Ile Ala Gly Thr Val Val Lys Leu Gly Pro Asn Ala Ser Thr Asp Leu 65 70 75 80 Lys Val Gly Asp Thr Gly Phe Gly Phe Val His Gly Ala Ser Gln Thr 85 90 95 Asp Pro Lys Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Val Tyr Pro Pro 100 105 110 Leu Phe Tyr Lys Ser Asn Leu Thr His Ser Thr Ala Asp Glu Ile Ser 115 120 125 Glu Gly Pro Val Lys Asn Phe Glu Ser Ala Ala Ser Leu Pro Val Ser 130 135 140 Leu Thr Thr Ala Gly Val Ser Leu Cys His His Leu Gly Ser Lys Met 145 150 155 160 Glu Trp His Pro Ser Thr Pro Gln His Thr His Pro Leu Leu Ile Trp 165 170 175 Gly Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Gln Leu Ile Gln Val Ala Lys His 180 185 190 Ile Asn Ala Tyr Thr Lys Ile Val Thr Val Ala Ser Lys Lys His Glu 195 200 205 Lys Leu Leu Lys Ser Tyr Gly Ala Asp Asp Val Phe Asp Tyr His Asp 210 215 220 Ala Gly Val Ile Glu Gln Ile Lys Ser Lys Tyr Pro Asn Leu Gln His 225 230 235 240 Val Ile Asp Ala Val Gly Ser Glu Asp Ser Ile Pro Glu Ala Tyr Lys 245 250 255 Val Thr Ala Asp Ser Leu Pro Ala Thr Leu Leu Glu Val Val Pro Met 260 265 270 Thr Ile Glu Ser Ile Pro Glu Glu Ile Arg Lys Asp Asn Val Lys Ile 275 280 285 Asp Ile Thr Leu Leu Tyr Arg Ala Ser Gly Gln Glu Ile Leu Leu Gly 290 295 300 Ala Thr Arg Phe Pro Ala Ser Pro Glu Tyr His Glu Ala Thr Val Lys 305 310 315 320 Phe Val Lys Phe Ile Asn Pro His Leu Asn Asn Gly Asp Ile His His 325 330 335 Met Asn Ile Lys Val Phe Ser Asn Gly Leu Asp Asp Val Pro Ala Leu 340 345 350 Thr Glu Gly Ile Lys Glu Gly Lys Asn Lys Asn Val Lys Tyr Val Ala 355 360 365 Arg Leu 370 <210> 3 <211> 1145 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (6)..(1136) <400> 3 caaac atg tct gcc tcg att cca gaa acc atg aaa gcc gtt gtc att gaa 50 Met Ser Ala Ser Ile Pro Glu Thr Met Lys Ala Val Val Ile Glu 1 5 10 15 aat ggc aag gct gta gtc aaa cag gac att cca att cct gaa tta gaa 98 Asn Gly Lys Ala Val Val Lys Gln Asp Ile Pro Ile Pro Glu Leu Glu 20 25 30 gaa gga ttt gtt cta att aag act gtc gcc gtt gcc ggt aac cct acc 146 Glu Gly Phe Val Leu Ile Lys Thr Val Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr 35 40 45 gat tgg aaa cat att gat ttc aag att ggt cct caa ggt gcc ctc tta 194 Asp Trp Lys His Ile Asp Phe Lys Ile Gly Pro Gln Gly Ala Leu Leu 50 55 60 ggc tgt gat gca gcc ggc caa atc gta aag ttg ggc cca aat gtt gat 242 Gly Cys Asp Ala Ala Gly Gln Ile Val Lys Leu Gly Pro Asn Val Asp 65 70 75 gct gca cgc ttt gcc att ggt gat tac att tat ggg gtt att cac ggt 290 Ala Ala Arg Phe Ala Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Gly Val Ile His Gly 80 85 90 95 gct tca gtg agg ttc ccc tca aac ggt gcc ttt gct gag tac tct gcc 338 Ala Ser Val Arg Phe Pro Ser Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ser Ala 100 105 110 att tca tcc gag act gct tat aaa cca gcc aga gag ttt aga ttg tgc 386 Ile Ser Ser Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Ala Arg Glu Phe Arg Leu Cys 115 120 125 ggt aaa gac aag cta cca gaa ggc ccc gta aaa tct tta gaa ggg gca 434 Gly Lys Asp Lys Leu Pro Glu Gly Pro Val Lys Ser Leu Glu Gly Ala 130 135 140 gta tcc ctc cca gtc tca ttg acc acg gct ggt atg atc ctt aca cat 482 Val Ser Leu Pro Val Ser Leu Thr Thr Ala Gly Met Ile Leu Thr His 145 150 155 agt ttt ggc ttg gac atg aca tgg aag ccc tcc aaa gcg caa aga gat 530 Ser Phe Gly Leu Asp Met Thr Trp Lys Pro Ser Lys Ala Gln Arg Asp 160 165 170 175 caa ccc atc tta ttt tgg ggt ggt gcc act gct gtt ggc cag atg ctt 578 Gln Pro Ile Leu Phe Trp Gly Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Met Leu 180 185 190 att caa ttg gca aaa aaa cta aac ggt ttc agc aag atc atc gtc gtt 626 Ile Gln Leu Ala Lys Lys Leu Asn Gly Phe Ser Lys Ile Ile Val Val 195 200 205 gct tct cgt aaa cat gaa aaa ttg ttg aaa gag tac ggt gca gat gaa 674 Ala Ser Arg Lys His Glu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Glu 210 215 220 ctt ttt gac tac cac gat gct gac gtt atc gaa cag ata aaa aag aag 722 Leu Phe Asp Tyr His Asp Ala Asp Val Ile Glu Gln Ile Lys Lys Lys 225 230 235 tac aac aac att cct tac ttg gtg gac tgt gtc tcc aac aca gaa act 770 Tyr Asn Asn Ile Pro Tyr Leu Val Asp Cys Val Ser Asn Thr Glu Thr 240 245 250 255 att caa cag gtg tac aaa tgt gcc gct gat gac tta gac gct acg gtc 818 Ile Gln Gln Val Tyr Lys Cys Ala Ala Asp Asp Leu Asp Ala Thr Val 260 265 270 gtt caa ttg acc gtt tta acc gaa aaa gat atc aag gag gaa gac agg 866 Val Gln Leu Thr Val Leu Thr Glu Lys Asp Ile Lys Glu Glu Asp Arg 275 280 285 agg caa aac gtc agt att gaa gga acc ctt cta tat ttg ata gga ggt 914 Arg Gln Asn Val Ser Ile Glu Gly Thr Leu Leu Tyr Leu Ile Gly Gly 290 295 300 aac gac gtc cca ttt ggc acg ttt act ttg cca gca gac cct gaa tac 962 Asn Asp Val Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Pro Ala Asp Pro Glu Tyr 305 310 315 aag gaa gcc gcc ata aaa ttt att aag ttc atc aat cca aaa atc aat 1010 Lys Glu Ala Ala Ile Lys Phe Ile Lys Phe Ile Asn Pro Lys Ile Asn 320 325 330 335 gat ggt gaa atc cac cac atc cca gtg aaa gtt tac aag aac ggg tta 1058 Asp Gly Glu Ile His His Ile Pro Val Lys Val Tyr Lys Asn Gly Leu 340 345 350 gat gat atc cca cag tta ctt gat gat att aag cac ggg agg aat tct 1106 Asp Asp Ile Pro Gln Leu Leu Asp Asp Ile Lys His Gly Arg Asn Ser 355 360 365 ggc gaa aag ttg gtt gcc gtc ttg aaa taa tctagactg 1145 Gly Glu Lys Leu Val Ala Val Leu Lys 370 375 <210> 4 <211> 376 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 Met Ser Ala Ser Ile Pro Glu Thr Met Lys Ala Val Val Ile Glu Asn 1 5 10 15 Gly Lys Ala Val Val Lys Gln Asp Ile Pro Ile Pro Glu Leu Glu Glu 20 25 30 Gly Phe Val Leu Ile Lys Thr Val Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr Asp 35 40 45 Trp Lys His Ile Asp Phe Lys Ile Gly Pro Gln Gly Ala Leu Leu Gly 50 55 60 Cys Asp Ala Ala Gly Gln Ile Val Lys Leu Gly Pro Asn Val Asp Ala 65 70 75 80 Ala Arg Phe Ala Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Gly Val Ile His Gly Ala 85 90 95 Ser Val Arg Phe Pro Ser Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ser Ala Ile 100 105 110 Ser Ser Glu Thr Ala Tyr Lys Pro Ala Arg Glu Phe Arg Leu Cys Gly 115 120 125 Lys Asp Lys Leu Pro Glu Gly Pro Val Lys Ser Leu Glu Gly Ala Val 130 135 140 Ser Leu Pro Val Ser Leu Thr Thr Ala Gly Met Ile Leu Thr His Ser 145 150 155 160 Phe Gly Leu Asp Met Thr Trp Lys Pro Ser Lys Ala Gln Arg Asp Gln 165 170 175 Pro Ile Leu Phe Trp Gly Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Met Leu Ile 180 185 190 Gln Leu Ala Lys Lys Leu Asn Gly Phe Ser Lys Ile Ile Val Val Ala 195 200 205 Ser Arg Lys His Glu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Glu Leu 210 215 220 Phe Asp Tyr His Asp Ala Asp Val Ile Glu Gln Ile Lys Lys Lys Tyr 225 230 235 240 Asn Asn Ile Pro Tyr Leu Val Asp Cys Val Ser Asn Thr Glu Thr Ile 245 250 255 Gln Gln Val Tyr Lys Cys Ala Ala Asp Asp Leu Asp Ala Thr Val Val 260 265 270 Gln Leu Thr Val Leu Thr Glu Lys Asp Ile Lys Glu Glu Asp Arg Arg 275 280 285 Gln Asn Val Ser Ile Glu Gly Thr Leu Leu Tyr Leu Ile Gly Gly Asn 290 295 300 Asp Val Pro Phe Gly Thr Phe Thr Leu Pro Ala Asp Pro Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Glu Ala Ala Ile Lys Phe Ile Lys Phe Ile Asn Pro Lys Ile Asn Asp 325 330 335 Gly Glu Ile His His Ile Pro Val Lys Val Tyr Lys Asn Gly Leu Asp 340 345 350 Asp Ile Pro Gln Leu Leu Asp Asp Ile Lys His Gly Arg Asn Ser Gly 355 360 365 Glu Lys Leu Val Ala Val Leu Lys 370 375 <210> 5 <211> 1134 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(1134) <400> 5 atg gct caa gtt gca att cca gaa acc atg aag gct gtc gtc att gaa 48 Met Ala Gln Val Ala Ile Pro Glu Thr Met Lys Ala Val Val Ile Glu 1 5 10 15 gac ggt aaa gcg gtt gtt aaa gag ggc att ccc att cct gaa ttg gaa 96 Asp Gly Lys Ala Val Val Lys Glu Gly Ile Pro Ile Pro Glu Leu Glu 20 25 30 gaa gga ttc gta ttg att aag aca ctc gct gtt gct ggt aac ccc act 144 Glu Gly Phe Val Leu Ile Lys Thr Leu Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr 35 40 45 gat tgg gca cac att gac tac aag atc ggg cct caa gga tct att ctg 192 Asp Trp Ala His Ile Asp Tyr Lys Ile Gly Pro Gln Gly Ser Ile Leu 50 55 60 gga tgt gat gct gct ggc caa att gtc aaa ttg ggc cca gct gtc aat 240 Gly Cys Asp Ala Ala Gly Gln Ile Val Lys Leu Gly Pro Ala Val Asn 65 70 75 80 cct aaa gac ttt tct atc ggt gat tat att tat ggg ttc att cac gga 288 Pro Lys Asp Phe Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Gly Phe Ile His Gly 85 90 95 tct tcc gta agg ttt cct tcc aat ggt gct ttt gct gaa tat tct gct 336 Ser Ser Val Arg Phe Pro Ser Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ser Ala 100 105 110 att tca act gtg gtt gcc tac aaa tca ccc aat gaa ctc aaa ttt ttg 384 Ile Ser Thr Val Val Ala Tyr Lys Ser Pro Asn Glu Leu Lys Phe Leu 115 120 125 ggt gag gat gtt cta cct gcc ggc cct gtc agg tct ttg gaa ggt gta 432 Gly Glu Asp Val Leu Pro Ala Gly Pro Val Arg Ser Leu Glu Gly Val 130 135 140 gcc act atc cca gtg tca ctg acc aca gcc ggc ttg gtg ttg acc tat 480 Ala Thr Ile Pro Val Ser Leu Thr Thr Ala Gly Leu Val Leu Thr Tyr 145 150 155 160 aac ttg ggc ttg gac ctg aag tgg gag cca tca acc cca caa aga aaa 528 Asn Leu Gly Leu Asp Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr Pro Gln Arg Lys 165 170 175 ggc ccc atc tta tta tgg ggc ggt gca act gca gta ggt cag tcg ctc 576 Gly Pro Ile Leu Leu Trp Gly Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Ser Leu 180 185 190 atc caa tta gcc aat aaa ttg aat ggc ttc acc aag atc att gtt gtg 624 Ile Gln Leu Ala Asn Lys Leu Asn Gly Phe Thr Lys Ile Ile Val Val 195 200 205 gct tct cgg aag cac gaa aaa ctt ttg aaa gaa tat ggt gct gat gaa 672 Ala Ser Arg Lys His Glu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Glu 210 215 220 tta ttt gat tat cat gat att gac gtg gta gaa caa att aaa cac aag 720 Leu Phe Asp Tyr His Asp Ile Asp Val Val Glu Gln Ile Lys His Lys 225 230 235 240 tac aac aat atc tcg tat tta gtc gac tgt gtc gcg aat caa gat acg 768 Tyr Asn Asn Ile Ser Tyr Leu Val Asp Cys Val Ala Asn Gln Asp Thr 245 250 255 ctt caa caa gtg tac aaa tgt gcg gcc gat aaa cag gat gct aca att 816 Leu Gln Gln Val Tyr Lys Cys Ala Ala Asp Lys Gln Asp Ala Thr Ile 260 265 270 gtt gaa tta aaa aat ttg aca gaa gaa aac gtc aaa aaa gag aac agg 864 Val Glu Leu Lys Asn Leu Thr Glu Glu Asn Val Lys Lys Glu Asn Arg 275 280 285 aga caa aac gtt act att gac ata ata agg cta tat tca ata ggt ggc 912 Arg Gln Asn Val Thr Ile Asp Ile Ile Arg Leu Tyr Ser Ile Gly Gly 290 295 300 cat gaa gta cca ttt gga aac att act tta cca gcc gac tca gaa gct 960 His Glu Val Pro Phe Gly Asn Ile Thr Leu Pro Ala Asp Ser Glu Ala 305 310 315 320 agg aaa gct gca ata aaa ttt atc aaa ttc atc aat cca aag att aat 1008 Arg Lys Ala Ala Ile Lys Phe Ile Lys Phe Ile Asn Pro Lys Ile Asn 325 330 335 gat gga caa att cgc cat att cca gta agg gtc tat aag aac ggg ctt 1056 Asp Gly Gln Ile Arg His Ile Pro Val Arg Val Tyr Lys Asn Gly Leu 340 345 350 tgt gat gtt cct cat atc cta aaa gac atc aaa tat ggt aag aac tct 1104 Cys Asp Val Pro His Ile Leu Lys Asp Ile Lys Tyr Gly Lys Asn Ser 355 360 365 ggt gaa aaa ctc gtt gcc gta tta aac taa 1134 Gly Glu Lys Leu Val Ala Val Leu Asn 370 375 <210> 6 <211> 377 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 Met Ala Gln Val Ala Ile Pro Glu Thr Met Lys Ala Val Val Ile Glu 1 5 10 15 Asp Gly Lys Ala Val Val Lys Glu Gly Ile Pro Ile Pro Glu Leu Glu 20 25 30 Glu Gly Phe Val Leu Ile Lys Thr Leu Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr 35 40 45 Asp Trp Ala His Ile Asp Tyr Lys Ile Gly Pro Gln Gly Ser Ile Leu 50 55 60 Gly Cys Asp Ala Ala Gly Gln Ile Val Lys Leu Gly Pro Ala Val Asn 65 70 75 80 Pro Lys Asp Phe Ser Ile Gly Asp Tyr Ile Tyr Gly Phe Ile His Gly 85 90 95 Ser Ser Val Arg Phe Pro Ser Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ser Ala 100 105 110 Ile Ser Thr Val Val Ala Tyr Lys Ser Pro Asn Glu Leu Lys Phe Leu 115 120 125 Gly Glu Asp Val Leu Pro Ala Gly Pro Val Arg Ser Leu Glu Gly Val 130 135 140 Ala Thr Ile Pro Val Ser Leu Thr Thr Ala Gly Leu Val Leu Thr Tyr 145 150 155 160 Asn Leu Gly Leu Asp Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr Pro Gln Arg Lys 165 170 175 Gly Pro Ile Leu Leu Trp Gly Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Ser Leu 180 185 190 Ile Gln Leu Ala Asn Lys Leu Asn Gly Phe Thr Lys Ile Ile Val Val 195 200 205 Ala Ser Arg Lys His Glu Lys Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Glu 210 215 220 Leu Phe Asp Tyr His Asp Ile Asp Val Val Glu Gln Ile Lys His Lys 225 230 235 240 Tyr Asn Asn Ile Ser Tyr Leu Val Asp Cys Val Ala Asn Gln Asp Thr 245 250 255 Leu Gln Gln Val Tyr Lys Cys Ala Ala Asp Lys Gln Asp Ala Thr Ile 260 265 270 Val Glu Leu Lys Asn Leu Thr Glu Glu Asn Val Lys Lys Glu Asn Arg 275 280 285 Arg Gln Asn Val Thr Ile Asp Ile Ile Arg Leu Tyr Ser Ile Gly Gly 290 295 300 His Glu Val Pro Phe Gly Asn Ile Thr Leu Pro Ala Asp Ser Glu Ala 305 310 315 320 Arg Lys Ala Ala Ile Lys Phe Ile Lys Phe Ile Asn Pro Lys Ile Asn 325 330 335 Asp Gly Gln Ile Arg His Ile Pro Val Arg Val Tyr Lys Asn Gly Leu 340 345 350 Cys Asp Val Pro His Ile Leu Lys Asp Ile Lys Tyr Gly Lys Asn Ser 355 360 365 Gly Glu Lys Leu Val Ala Val Leu Asn 370 375 <210> 7 <211> 1122 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (7)..(1113) <400> 7 gaaatc atg aaa gct gtc gtc att gaa gac ggt aaa gcg gtt gtc aaa 48 Met Lys Ala Val Val Ile Glu Asp Gly Lys Ala Val Val Lys 1 5 10 gag ggc gtt ccc att cct gaa ttg gaa gaa gga ttc gta ttg att aag 96 Glu Gly Val Pro Ile Pro Glu Leu Glu Glu Gly Phe Val Leu Ile Lys 15 20 25 30 aca ctc gct gtt gct ggt aac ccg act gat tgg gca cac att gac tac 144 Thr Leu Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr Asp Trp Ala His Ile Asp Tyr 35 40 45 aag gtc ggg cct caa gga tct att ctg gga tgt gac gct gcc ggc caa 192 Lys Val Gly Pro Gln Gly Ser Ile Leu Gly Cys Asp Ala Ala Gly Gln 50 55 60 att gtc aaa ttg ggc cca gcc gtc gat cct aaa gac ttt tct att ggt 240 Ile Val Lys Leu Gly Pro Ala Val Asp Pro Lys Asp Phe Ser Ile Gly 65 70 75 gat tat att tat ggg ttc att cac gga tct tcc gta agg ttt cct tcc 288 Asp Tyr Ile Tyr Gly Phe Ile His Gly Ser Ser Val Arg Phe Pro Ser 80 85 90 aat ggt gct ttt gct gaa tat tct gct att tca act gtg gtt gcc tac 336 Asn Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Ser Ala Ile Ser Thr Val Val Ala Tyr 95 100 105 110 aaa tca ccc aat gaa ctc aaa ttt ttg ggt gaa gat gtt cta cct gcc 384 Lys Ser Pro Asn Glu Leu Lys Phe Leu Gly Glu Asp Val Leu Pro Ala 115 120 125 ggc cct gtc agg tct ttg gaa ggg gca gcc act atc cca gtg tca ctg 432 Gly Pro Val Arg Ser Leu Glu Gly Ala Ala Thr Ile Pro Val Ser Leu 130 135 140 acc aca gct ggc ttg gtg ttg acc tat aac ttg ggc ttg aac ctg aag 480 Thr Thr Ala Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asn Leu Gly Leu Asn Leu Lys 145 150 155 tgg gag cca tca acc cca caa aga aac ggc ccc atc tta tta tgg ggc 528 Trp Glu Pro Ser Thr Pro Gln Arg Asn Gly Pro Ile Leu Leu Trp Gly 160 165 170 ggt gca act gca gta ggt cag tcg ctc atc caa tta gcc aat aaa ttg 576 Gly Ala Thr Ala Val Gly Gln Ser Leu Ile Gln Leu Ala Asn Lys Leu 175 180 185 190 aat ggc ttc acc aag atc att gtt gtg gct tct cgg aaa cac gaa aaa 624 Asn Gly Phe Thr Lys Ile Ile Val Val Ala Ser Arg Lys His Glu Lys 195 200 205 ctg ttg aaa gaa tat ggt gct gat caa cta ttt gat tac cat gat att 672 Leu Leu Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Gln Leu Phe Asp Tyr His Asp Ile 210 215 220 gac gtg gta gaa caa att aaa cac aag tac aac aat atc tcg tat tta 720 Asp Val Val Glu Gln Ile Lys His Lys Tyr Asn Asn Ile Ser Tyr Leu 225 230 235 gtc gac tgt gtc gcg aat caa aat acg ctt caa caa gtg tac aaa tgt 768 Val Asp Cys Val Ala Asn Gln Asn Thr Leu Gln Gln Val Tyr Lys Cys 240 245 250 gcg gcc gat aaa cag gat gct acc gtt gtc gaa tta act aat ttg aca 816 Ala Ala Asp Lys Gln Asp Ala Thr Val Val Glu Leu Thr Asn Leu Thr 255 260 265 270 gaa gaa aac gtc aaa aag gag aat agg agg caa aat gtc act att gac 864 Glu Glu Asn Val Lys Lys Glu Asn Arg Arg Gln Asn Val Thr Ile Asp 275 280 285 aga aca aga ctg tat tca ata ggc ggc cat gaa gta cca ttt ggt ggc 912 Arg Thr Arg Leu Tyr Ser Ile Gly Gly His Glu Val Pro Phe Gly Gly 290 295 300 att act ttc cct gct gac cca gaa gcc agg aga gct gcc acc gaa ttc 960 Ile Thr Phe Pro Ala Asp Pro Glu Ala Arg Arg Ala Ala Thr Glu Phe 305 310 315 gtc aag ttc atc aat cca aag att agt gat ggg caa att cac cat att 1008 Val Lys Phe Ile Asn Pro Lys Ile Ser Asp Gly Gln Ile His His Ile 320 325 330 cca gca agg gtc tat aag aac ggg ctt tac gat gtt cct cgt atc ctg 1056 Pro Ala Arg Val Tyr Lys Asn Gly Leu Tyr Asp Val Pro Arg Ile Leu 335 340 345 350 gaa gac att aaa atc ggt aag aac tct ggt gaa aaa ctc gtt gcc gta 1104 Glu Asp Ile Lys Ile Gly Lys Asn Ser Gly Glu Lys Leu Val Ala Val 355 360 365 tta aac taa tctagaaac 1122 Leu Asn <210> 8 <211> 368 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 Met Lys Ala Val Val Ile Glu Asp Gly Lys Ala Val Val Lys Glu Gly 1 5 10 15 Val Pro Ile Pro Glu Leu Glu Glu Gly Phe Val Leu Ile Lys Thr Leu 20 25 30 Ala Val Ala Gly Asn Pro Thr Asp Trp Ala His Ile Asp Tyr Lys Val 35 40 45 Gly Pro Gln Gly Ser Ile Leu Gly Cys Asp Ala Ala Gly Gln Ile Val 50 55 60 Lys Leu Gly Pro Ala Val Asp Pro Lys Asp Phe Ser Ile Gly Asp Tyr 65 70 75 80 Ile Tyr Gly Phe Ile His Gly Ser Ser Val Arg Phe Pro Ser Asn Gly 85 90 95 Ala Phe Ala Glu Tyr Ser Ala Ile Ser Thr Val Val Ala Tyr Lys Ser 100 105 110 Pro Asn Glu Leu Lys Phe Leu Gly Glu Asp Val Leu Pro Ala Gly Pro 115 120 125 Val Arg Ser Leu Glu Gly Ala Ala Thr Ile Pro Val Ser Leu Thr Thr 130 135 140 Ala Gly Leu Val Leu Thr Tyr Asn Leu Gly Leu Asn Leu Lys Trp Glu 145 150 155 160 Pro Ser Thr Pro Gln Arg Asn Gly Pro Ile Leu Leu Trp Gly Gly Ala 165 170 175 Thr Ala Val Gly Gln Ser Leu Ile Gln Leu Ala Asn Lys Leu Asn Gly 180 185 190 Phe Thr Lys Ile Ile Val Val Ala Ser Arg Lys His Glu Lys Leu Leu 195 200 205 Lys Glu Tyr Gly Ala Asp Gln Leu Phe Asp Tyr His Asp Ile Asp Val 210 215 220 Val Glu Gln Ile Lys His Lys Tyr Asn Asn Ile Ser Tyr Leu Val Asp 225 230 235 240 Cys Val Ala Asn Gln Asn Thr Leu Gln Gln Val Tyr Lys Cys Ala Ala 245 250 255 Asp Lys Gln Asp Ala Thr Val Val Glu Leu Thr Asn Leu Thr Glu Glu 260 265 270 Asn Val Lys Lys Glu Asn Arg Arg Gln Asn Val Thr Ile Asp Arg Thr 275 280 285 Arg Leu Tyr Ser Ile Gly Gly His Glu Val Pro Phe Gly Gly Ile Thr 290 295 300 Phe Pro Ala Asp Pro Glu Ala Arg Arg Ala Ala Thr Glu Phe Val Lys 305 310 315 320 Phe Ile Asn Pro Lys Ile Ser Asp Gly Gln Ile His His Ile Pro Ala 325 330 335 Arg Val Tyr Lys Asn Gly Leu Tyr Asp Val Pro Arg Ile Leu Glu Asp 340 345 350 Ile Lys Ile Gly Lys Asn Ser Gly Glu Lys Leu Val Ala Val Leu Asn 355 360 365 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 9 Ser Tyr Gly Ala Asp Asp Val Phe Asp Tyr His Asp 1 5 10 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> Kluyveromyces lactis <400> 10 Ile Gly Pro Glu Gly Ser Ile Leu Gly Cys Asp Ile 1 5 10 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n indicates g, a, c or t. <400> 11 tgrtartcra anacrtcrtc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n indicates g, a, c or t. <400> 12 atwgghccwg argghtcnat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n indicates g, a, c or t. <400> 13 atwgghccng argghagyat 20 <210> 14 <211> 509 <212> DNA <213> Kluyveromyces lactis <400> 14 attggtccwg arggytcwat tctaggatgt gacattgctg gtacagttgt caaacttgga 60 ccaaatgcta gtactgactt gaaggttgga gataccggtt tcggttttgt tcacggtgct 120 tcccaaacag atcctaaaaa tggtgcattt gctgaatatg ccagggttta tccacctttg 180 ttttacaaga gtaacttaac tcactcaact gctgatgaaa tttctgaagg ccctgtgaag 240 aacttcgaat ctgctgcatc attgccagtt tcgttgacaa ctgctggtgt tagtttgtgt 300 catcacttgg gctcaaaaat ggaatggcac ccatctaccc cgcaacatac tcatccatta 360 ttgatttggg gtggtgctac agcagtgggt caacaactaa tccaagttgc caaacatatc 420 aatgcttata ctaagattgt aactgttgct tctaaaaagc atgaaaagct tttaaagtct 480 tatggtgctg atgacgtmtt cgactacca 509 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 15 tccggtaccg acaactgtac cagcaatgtc 30 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 16 atcggtacct atactaagat tgtaactgtt gc 32 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 17 ccgggtaccc ttttagggtg a 21 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 18 tcatgaagcc acagttaaat tcg 23 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 19 atattcatat gatggatatc accg 24 <210> 20 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 20 ctggaattct accatggctt cagttccaac cactcaaaaa g 41 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 21 gacaagcttc tagattataa cctggcaaca tacttaaca 39 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 22 caaacatgtc tgcctcgatt ccaga 25 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 23 cagtctagat tatttcaaga cggcaaccaa c 31 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 24 caaccatggc tcaagttgca attccagaaa cc 32 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 25 gactctagat tagtttaata cggcaacgag tttttcac 38 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 26 gaaatcatga aagctgtcgt cattgaa 27 <210> 27 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 27 gtttctagat tagtttaata cggcaackag tttttca 37 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 28 tgtaaaacga cggccagt 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:an artificially synthesized primer sequence <400> 29 caggaaacag ctatgacc 18

【図面の簡単な説明】

【図１】 SDS-PAGEにおけるパターンを示す写真であ
る。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例１で
得られた酵素を示す。

【図２】 実施例１で得られた酵素のメチルビニルケト
ン還元活性のpH依存性を示す図である。

【図３】 実施例１で得られた酵素のメチルビニルケト
ン還元活性の温度依存性を示す図である。

【図４】 エノン還元酵素遺伝子を持つプラスミドpSE-
KLR1を模式的に示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｐ 7/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 5/00 Ａ Ｃ１２Ｒ 1:645） Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】次の（Ａ）から（Ｃ）に示す理化学的性質
   を有するエノン還元酵素。 （Ａ）作用 還元型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン
   酸を電子供与体として、α，β−不飽和ケトンの炭素−
   炭素２重結合を還元し、対応する飽和炭化水素を生成す
   る。 （Ｂ）基質特異性 (1)α，β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を還元
   するが、実質的にケトンの還元活性は無い。 (2)電子供与体としては、還元型β−ニコチンアミドア
   デニンジヌクレオチドよりも還元型β−ニコチンアミド
   アデニンジヌクレオチドリン酸に対して、有意に高い活
   性を有する。 (3)ケトンからβ位炭素の２つの置換基がともに水素で
   ない基質に対しては実質的に作用しない。 (4)炭素−炭素２重結合が環状構造中に存在する基質に
   対しては実質的に作用しない。 （Ｃ）至適pH pH ６．５−７．０
2. 【請求項２】更に次に示す理化学的性質（Ｄ）−（Ｅ）
   を有する請求項１に記載のエノン還元酵素。 （Ｄ）至適温度 ３７−４５℃ （Ｅ）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム −ポリアクリルアミドゲル電
   気泳動により約４３，０００。ゲル濾過により約４２，
   ０００。
3. 【請求項３】クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
   に由来する請求項１に記載の新規エノン還元酵素。
4. 【請求項４】クライベロマイセス属に属し、請求項１に
   記載のエノン還元酵素生産能を有する微生物を培養する
   ことを特徴とする請求項１に記載のエノン還元酵素を取
   得する方法。
5. 【請求項５】クライベロマイセス属に属する微生物が、
   クライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromayces lac
   tis）である、請求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載の
   エノン還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレ
   オチド。 （ａ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むポリヌクレ
   オチド、（ｂ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列をコ
   ードするポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号：２に記載
   のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が
   置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配
   列をコードするポリヌクレオチド、（ｄ）配列番号：１
   に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリン
   ジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチ
   ド、（ｅ）配列番号：２に記載のアミノ酸配列と６０%
   以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌ
   クレオチド、
7. 【請求項７】請求項６に記載のポリヌクレオチドによっ
   てコードされる蛋白質。
8. 【請求項８】請求項６に記載のポリヌクレオチドが挿入
   された組換えベクター。
9. 【請求項９】更にβ-ニコチンアミドアデニンジヌクレ
   オチドリン酸を補酵素とする酸化還元反応を触媒するこ
   とができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが
   挿入された、請求項８に記載の組換えベクター。
10. 【請求項１０】請求項６に記載のポリヌクレオチド、ま
    たは請求項８に記載のベクターを発現可能に保持した形
    質転換体。
11. 【請求項１１】請求項１０に記載の形質転換体を培養す
    る工程を含む請求項７に記載の蛋白質の製造方法。
12. 【請求項１２】下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載
    の、エノン還元活性を有する蛋白質をコードするポリヌ
    クレオチド。 （ａ）配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：
    ７からなる群から選択されたいずれかに記載の塩基配列
    を含むポリヌクレオチド、（ｂ）配列番号：４、配列番
    号：６、および配列番号：８からなる群から選択された
    いずれかに記載のアミノ酸配列からなる蛋白質をコード
    するポリヌクレオチド、（ｃ）配列番号：４、配列番
    号：６、および配列番号：８からなる群から選択された
    いずれかに記載のアミノ酸配列において、１若しくは複
    数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加
    したアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号：３、配列番号：５、および配列番号：
    ７からなる群から選択されたいずれかに記載の塩基配列
    からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下
    でハイブリダイズするポリヌクレオチド、（ｅ）配列番
    号：４、配列番号：６、および配列番号：８からなる群
    から選択されたいずれかに記載のアミノ酸配列と６０%
    以上の相同性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌ
    クレオチド、
13. 【請求項１３】請求項１２に記載のポリヌクレオチドに
    よってコードされる蛋白質。
14. 【請求項１４】請求項１２に記載のポリヌクレオチドが
    挿入された組換えベクター。
15. 【請求項１５】更にβ-ニコチンアミドアデニンジヌク
    レオチドリン酸を補酵素とする酸化還元反応を触媒する
    ことができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチド
    が挿入された、請求項１４に記載の組換えベクター。
16. 【請求項１６】請求項１２に記載のポリヌクレオチド、
    または請求項１４に記載のベクターを発現可能に保持し
    た形質転換体。
17. 【請求項１７】請求項１６に記載の形質転換体を培養す
    る工程を含む請求項１３に記載の蛋白質の製造方法。
18. 【請求項１８】請求項１に記載のエノン還元酵素、請求
    項７に記載の蛋白質、請求項１３に記載の蛋白質、該酵
    素または蛋白質を産生する微生物、および該微生物の処
    理物、からなる群から選択されるいずれかの酵素活性物
    質をα，β不飽和ケトンに作用させる工程を含む、α，
    β−不飽和ケトンの炭素−炭素２重結合を選択的に還元
    する方法。
19. 【請求項１９】該酵素または蛋白質を産生する微生物
    が、請求項１１および／または請求項１６に記載の形質
    転換体である請求項１８に記載の方法。