KR101354546B1 - 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한 산화환원효소 - Google Patents

케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한 산화환원효소 Download PDF

Info

Publication number
KR101354546B1
KR101354546B1 KR1020137022212A KR20137022212A KR101354546B1 KR 101354546 B1 KR101354546 B1 KR 101354546B1 KR 1020137022212 A KR1020137022212 A KR 1020137022212A KR 20137022212 A KR20137022212 A KR 20137022212A KR 101354546 B1 KR101354546 B1 KR 101354546B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
oxidoreductase
alkyl
alkynyl
alkenyl
Prior art date
Application number
KR1020137022212A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130110223A (ko
Inventor
앙케 첸체르
안트예 구프타
마리아 보브코바
Original Assignee
이에페 게엠베하
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이에페 게엠베하 filed Critical 이에페 게엠베하
Publication of KR20130110223A publication Critical patent/KR20130110223A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101354546B1 publication Critical patent/KR101354546B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 보조인자의 존재하에 산화환원효소를 이용하여 키랄 화합물을 환원시키며, (a) 아미노산의 적어도 70% 이상은 서열번호 1, 서열번호 6, 및 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산과 동일하거나, 또는 (b) 아미노산의 적어도 55% 이상은 서열번호 2의 아미노산과 동일하거나, 또는 (c) 아미노산의 적어도 65% 이상은 서열번호 3의 아미노산과 동일하거나, 또는 (d) 아미노산의 적어도 75% 이상은 서열번호 4의 아미노산과 동일하거나, 또는 (e) 아미노산의 적어도 65% 이상은 서열번호 5의 아미노산과 동일하거나, 또는 (f) 아미노산의 적어도 50% 이상은 서열번호 7의 아미노산과 동일하거나, 또는 (g) 아미노산의 적어도 72% 이상은 서열번호 129의 아미노산과 동일한 아미노산 서열을 갖는 산화환원효소를 사용하는 것을 특징으로 하는, 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법에 관한 것이다.

Description

케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한 산화환원효소 {OXIDOREDUCTASES FOR THE STEREOSELECTIVE REDUCTION OF KETO COMPOUNDS}
본 발명은, 산화환원효소(oxidoreductase)에 의한 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상이성질체 선택적인(enantioselective) 효소적 환원 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 케토 화합물의 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상이성질체 선택적인 효소 환원 반응에 이용되는 새로운 산화환원효소에 관한 것이다.
광학적으로 활성을 가진 하이드록시 화합물은 약학적 활성 화합물, 방향 물질, 페르몬, 농업 화합물 및 효소저해제의 합성에 널리 적용할 수 있는 가치있는 카이런(chiron)이다. 그로 인하여, 미래에는 라세믹 화합물은 약학 조제에 거의 이용되기 어렵기 때문에, 키랄 화합물에 대한 수요는 증가하고 있으며, 특히 약학 분야에서 키랄 합성 기술이 주목될 수 있다.
프로키랄 케토 화합물의 비대칭적인 환원은 입체구조선택적(stereoselective) 촉매작용의 섹터이며, 여기서 생촉매작용(biocatalysis)은 화학적 촉매작용에 대비해 강력하고 경쟁적인 기술이다. 화학적 비대칭적인 수소화(hydrogenation)는 높은 독성을 지니고 환경적으로 유해한 중금속 촉매의 이용 및 많은 양의 유기적 용매는 물론이고, 극도의 따라서 에너지 집중적인 반응 조건을 요한다. 또한, 이들 방법은 부작용과 불량한 광학 순도(enantiomeric excess)가 특징이다.
자연에서 프로키랄 케토 화합물의 키랄 하이드록시 화합물로의 환원과 그 반대 반응은 모든 생물체에 존재하는 일차적 물질대사와 이차적 물질대사과정을 포함하는 다양한 생화학적 경로에서 발견되고 있으며, 다른 종류의 이차 알코올 탈수소화효소(dehydrogenase)와 산화환원효소에 의하여 반응이 촉매된다. 보통 이러한 효소들은 보조인자 의존적이다.
종래에, 프로키랄 케토 화합물의 키랄 하이드록시 화합물로의 환원에서 생촉매제의 사용 가능성은, 분리된 산화환원효소와 다양한 세포 전체를 이용한 생물전환 시스템을 기초로 한 모델 시스템을 기반으로 반복적으로 입증되어져 왔다. 그 때문에 생촉매를 이용한 접근 방법은 완화된 반응조건(mild reaction condition)과 부산물의 미생성 및 종종 달성가능한 광학 순도에 상당히 유리하다는 점에서 아주 유용한 것으로 입증되었다. 분리된 효소의 사용은 생성물의 분리뿐만 아니라, 달성가능한 광학 순도, 분해 산물의 형성 그리고 부산물 생성 뿐만 아니라 산물 분리 측면에서도 전체 세포를 이용하는 방법보다 더 유용하다. 또한, 전체 세포를 이용하는 과정은 특별한 장비와 축적된 경험이 있어야 하기 때문에 모든 화학회사에서 이용할 수 없다.
최근 유기용매를 이용한 수상/유기상 2상(two phase) 시스템에서 분리된 산화환원효소의 사용은 매우 효과적이고 경제적이며, 높은 농도(>5%)도 역시 이용 가능한 것으로 알려지고 있다. 설명된 시스템에서 일반적으로 환원될 케토 화합물은 물에 잘 녹지 않아 유기용매와 함께 유기상을 형성하게 된다. 물론 유기용매 자체는 부분적으로 분리될 수 있다. 그러한 경우 환원될 케토 화합물로부터 유기상이 형성된다(DE 10119274, DE 10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5). 조효소의 재생은 대부분의 경우 물과 혼합될 수 있는 값싼 2-프로판올을 사용하는 2차 알코올의 동시 산화에 의하여 이루어진다.
높은 거울상이성질체 선택성을 가진 적합한 R-과 S-특이적 산화환원효소와 탈수소화효소의 예로는, 하기와 같다: 칸디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis (CPCR) (US 5,523,223 and US 5,763,236, (Enzyme Microb Technol. 1993 Nov;15(11):950-8) )) 및 피키아 캡슐라타(Pichia caps ㎕ ata (DE10327454.4))로부터 유래된 카르보닐 환원효소, 로도코커스 에리스로폴리스( Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5,523,223)), 노르카르디아 푸스카(Norcardia fusca(Biosci. Biotechnol. Biochem., 63(10) (1999), pp.1721-1729; Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;62(4):380-6. Epub 2003 Apr 26)), 및 로도코커스 루버(Rhodococcus ruber(J Org Chem. 2003 Jan 24;68(2):402-6))로부터 유래된 카르보닐 환원효소.
락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주(락토바실러스 케피르(Lactobacillus kefir, US 5200335), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis, DE 19610984 A1)(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 2000 Dec;56 Pt 12:1696-8), 락토바실러스 마이너(Lactobacillus minor, DE10119274)) 또는 슈도모나스(Pseudomonas (US 05385833)(Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Aug;59(4-5):483-7. Epub 2002 Jun 26.,J. Org. Chem. 1992, 57, 1532)) 유래의 R-특이적 이차알코올 탈수소화효소.
그러나 오늘날 알려진 효소는 잠재적인 케토 화합물의 입체구조선택적 환원의 전체 시장을 개척하기에는 충분하지 못하다. 한편으로, 이 같은 사실은 개별적인 효소가 종종 서로 보충하기도 하는, 온도와 용매의 안정성뿐만 아니라, 기질 선택범위, 적정 pH 등, 연관된 다양한 특성을 나타내는 사실로 설명될 수 있다. 따라서, 비교적 유사한 상동 효소도 어떤 특정한 기질에 대하여 완전히 다른 변환특성을 보이기도 하는 한다. 또 한편으로는, 기술된 모든 효소들이 클로닝되지 않았으며 산업적으로 사용될 만큼 충분한 정도의 발현되지 않았다. 가능한 광범위한 효소적 비대칭적 수소화의 합성 가능성을 조사하기 위해서는 가능한 넓은 범위에서 산업적으로 접근할 수 있는 다양한 종류의 산화환원효소가 필요하며, 더욱이 이 산화환원효소는 유기용매를 포함한 수상/유기상 2상 시스템에 사용하기 적합하여야 한다.
본 발명은 수상/유기상 2상 시스템에서 안정성이 우수할 뿐만 아니라 E. coli에서 발현성이 우수한(>500 units/g E. Coli wet biomass) 다수의 신규한 거울상이성질체 선택적인 R- 및 S- 특이적 새로운 산화환원효소와, 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 반응으로 키랄 하이드록시 화합물을 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 대상은 수상/유기상 2상 시스템에서 안정성이 우수할 뿐만 아니라 E. coli에서 발현성이 우수한(>500 units/g E. Coli wet biomass) 다수의 신규한 거울상이성질체 선택적인 R- 및 S- 특이적 새로운 산화환원효소와, 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 반응으로 키랄 하이드록시 화합물을 생성하는 방법이다.
본 발명의 산화환원효소는
(a) 아미노산의 적어도 70% 이상은 서열번호 1, 서열번호 6, 및 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산과 동일하거나, 또는
(b) 아미노산의 적어도 55% 이상은 서열번호 2의 아미노산과 동일하거나, 또는
(c) 아미노산의 적어도 65% 이상은 서열번호 3의 아미노산과 동일하거나, 또는
(d) 아미노산의 적어도 75% 이상은 서열번호 4의 아미노산과 동일하거나, 또는
(e) 아미노산의 적어도 65% 이상은 서열번호 5의 아미노산과 동일하거나, 또는
(f) 아미노산의 적어도 50% 이상은 서열번호 7의 아미노산과 동일하거나, 또는
(g) 아미노산의 적어도 72% 이상은 서열번호 129의 아미노산과 동일한, 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
서열번호 1에 해당하는 폴리펩티드는 효모, 특히 그 중에서도 로도토룰라(Rhodotorula) 속 균주, 특히 그 중에서도 로도토룰라 뮤실라지노사(Rhodotorula mucilaginosa)에서 수득할 수 있다.
본 발명의 또다른 대상은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 서열번호 9의 핵산 서열이다.
로도토룰라 뮤실라지노사로부터 수득된 산화환원효소는 예를 들면, 2-옥탄온을 S-2-옥탄올로 환원시키며, 바람직하기로는 2-옥탄올의 두가지 거울상이성질체 중 S-2-옥탄올을 산화시킨다. 로도토룰라 뮤실라지노사로부터 수득된 산화환원효소는 SDS 겔에서 측정된 30 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 7.0 내지 8.0이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 8.5 내지 10.0이다. 로도토룰라 뮤실라노사로부터 수득된 산화환원효소는 온도 pH에 대한 양호한 안정성을 보이며, pH 범위 5.5 내지 10.0 및 35 ℃ 이상에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다. 또한, 로도토룰라 뮤실라지노사로부터 수득된 산화환원효소는 유기용매에서도 높은 안전성을 보인다.
서열번호 2 또는 8에 따른 폴리펩티드는 효모, 특히 그 중에서도 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 파키솔렌(Pachysolen), 데바로마이세스(Debaromyces) 또는 이삿첸키아(Issatschenkia) 속 균주, 특히 그 중에서도 피키아 파리노사(Pichia farinosa) DSMZ 3316 또는 칸디다 네모덴드라(Candida nemodendra) DSMZ 70647로부터 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 대상은 서열번호 2와 8의 아미노산 서열을 각각 코딩하는 서열번호 10과 16의 핵산 서열이다. 산화환원효소는 바람직하기로는 2-부탄온을 R-2-부탄올로 환원시키며, 바람직하기로는 2-부탄올의 두 가지 거울상이성질체 중 R-2-부탄올을 산화시킨다.
피키아 파리노사로부터 수득된 산화환원효소는 R-2-옥탄올보다 R-2-부탄올과 2-프로판올에 대하여 매우 높은 활성을 보이며, 뿐만 아니라 2-옥탄온 보다는 아세톤과 2-부탄온에 대하여 매우 높은 활성을 보인다.
그러나, 칸디다 네모덴드라(Candida nemodendra)로부터 수득된 산화환원효소는 R-2-부탄올, 2-프로판올 그리고 R-2-옥탄올에 대하여 유사한 활성을 나타낼 뿐만 아니라 2-옥탄온에 대하여서도 거의 유사한 활성을 보인다.
피키아 파리노사로부터 수득된 산화환원효소는 SDS 겔에서 측정된 27 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 5.0 내지 6.0이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 7.5 내지 10.0이다. 피키아 파리노사로부터 수득된 산화환원효소는 우수한 pH 및 용매 안정성을 보이며, pH 범위 5.5 내지 10.0에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다.
칸디다 네모덴드라로부터 수득된 산화환원효소는 SDS 겔에서 측정된 바에 따라 27 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH는 6.0이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 10.0 내지 11.0이다. 칸디다 네모덴드라로부터 수득된 산화환원효소는 우수한 pH 및 용매 안정성을 보이며 pH 범위 6.5 내지 9.5에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다.
서열번호 3 또는 7에 해당하는 폴리펩티드는 효모, 특히 그 중에서도 피키아 속 및 칸디다 속의 효소, 특히 그 중에서도 피키아 스티피디스(Pichia stipidis) DSMZ 3651과 피키아 트레할로필라(Pichia trehalophila) DSMZ 70391로부터 수득할 수 있다. 본 발명의 또 다른 대상은 서열번호 3과 7의 폴리펩티드를 각각 코딩하는 서열번호 11과 15의 핵산 서열이다.
아미노산 서열번호 3과 적어도 65%의 동일성을 가지거나 서열번호 7과 적어도 50% 이상의 동일성을 가지는 피키아 속 및 칸디다 속의 효소로부터 유래된 카르보닐 환원효소는, 바람직하기로는 2-옥탄온을 S-2-옥탄올로 환원시키며, 바람직하기로는 2-옥탄올의 두 가지 거울상이성질체 중 S-2-옥탄올을 산화시킨다. 이 카르보닐 환원효소는 4-할로아세토아세테이트 에스테르의 4-R-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로의 환원에 특히 적합하다.
피키아 스티피디스로부터 수득된 산화환원효소는 SDS-겔에서 측정된 바 36 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 5.5 내지 6.5이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 6.5 내지 8.0이다. 피키아 스티피디스로부터 수득된 산화환원효소는 우수한 pH 및 용매 안정성을 보이며, pH 범위 5.5 내지 10.0에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다.
피키아 트레할로필라로부터 수득된 산화환원효소는 SDS-겔에서 측정된 바 36 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 7.0 내지 7.5이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 7 내지 8이다.
서열번호 4에 해당하는 폴리펩티드는 루코노스톡 강의 박테리아, 특히 그 중에서도 루코노스톡 카르노섬(Leuconostoc carnosum) DSMZ 5576에서 수득할 수 있다. 본 발명의 또 다른 대상은 서열번호 4 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 서열번호 12의 핵산 서열이다. 이 폴리펩티드는 2-옥탄온을 R-2-옥탄올로의 환원과 R-2-옥탄올의 산화에 특히 적합하다. 그리고 4-할로아세토아세테이트 에스테르의 4-R-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로의 환원에도 매우 적합하다.
루코노스톡 카르노섬으로부터 수득된 산화환원효소는 SDS-겔에서 측정된 바에 따라 27 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 5.0 내지 6.0이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 6.0 내지 9.0이다. 루코노스톡 카르노섬으로부터 수득된 산화환원효소는 우수한 온도, pH 및 용매 안정성을 보이며, pH 범위 4.5 내지 10.0 및 35 ℃ 이상에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다.
서열번호 5에 해당하는 폴리펩티드는 액티노박테리아(Actinobacteria) 강의 박테리아, 특히 그 중에서도 마이크로박테리움(Microbacterium) 강의 박테리아, 특히 그 중에서도 마이크로박테리움 spec DSMZ 20028에서 수득할 수 있다. 본 발명의 대상은 서열번호 5 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 서열번호 13의 핵산 서열이다. 이 폴리펩티드는 2-옥탄온의 S-2-옥탄올로의 환원에 매우 적합하며, 바람직하기로는 2-옥탄올의 두개의 거울상이성질체중 S-2-옥탄올을 우선적으로 산화시킨다. 그리고 4-할로아세토아세테이트 에스테르의 4-R-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로의 환원에도 매우 적합하다.
마이크로박테리움 spec DSMZ 20028에서 수득된 산화환원효소는 SDS-겔에서 측정된 바에 따라 35 ± 2 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 6.0 내지 7.5이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 7.5 내지 9.5이다. 마이크로박테리움 spec에서 수득된 산화환원효소는 우수한 온도, pH 및 용매 안정성을 보이며, pH 범위 4.5 - 10.0 및 50 ℃ 이상에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다.
서열번호 6에 해당하는 폴리펩티드는 액티노박테리아 강의 박테리아, 특히 그 중에서도 고르도니아(Gordonia) 강의 박테리아, 특히 그 중에서도 고르도니아 루비르페르틴크타(Gordonia rubripertincta) DSMZ 43570에서 수득할 수 있다. 본 발명의 또다른 대상은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 서열번호 14의 핵산 서열이다. 이 폴리펩티드는 2-옥탄온을 S-2-옥탄올로의 환원에 매우 적합하며, 바람직하기로는 2-옥탄올의 두개의 거울상이성질체중 S-2-옥탄올을 산화시킨다. 그리고 4-할로아세토아세테이트 에스테르의 4-R-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로의 환원에도 매우 적합하다.
고르도니아 루비르페르틴크타 DSMZ 43570에서 수득된 산화환원효소는 SDS-겔에서 측정된 바에 따라 41 ± 3 kDa의 분자량을 가지는 동형이량체이다. 상기 산화환원효소의 환원 반응을 위한 최적 pH 범위는 4.5 내지 5.5이고, 산화 반응을 위한 최적 pH 범위는 7.5 내지 9.5이다. 고르도니아 루비르페르틴크타 DSMZ 43570에서 수득된 산화환원효소는 우수한 온도, pH 및 용매 안정성을 보이며, pH 범위 4.5 내지 10.0 및 55 ℃ 이상에서 수 시간 동안 두어도 단지 약간의 활성 소실만을 보인다.
서열번호 129에 해당하는 폴리펩티드는 효모, 특히 그 중에서도 로더로마이세스(Lodderomyces) 속의 박테리아, 특히 그 중에서도, 로더로마이세스 일롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus) DSMZ 70320에서 수득할 수 있다. 본 발명의 또다른 대상은 서열번호 129 아미노산 서열을 가지는 단백질을 코딩하는 서열번호 130의 핵산 서열이다. 이 폴리펩티드는 2-옥탄온을 S-2-옥탄올로의 환원에 매우 적합하고, 바람직하게는 2-옥탄올의 두개의 거울상이성질체중 S-2-옥탄올을 산화시킨다. 그리고 4-할로아세토아세테이트 에스테르의 4-R-할로-3-하이드록시부티르산 에스테르로의 환원에도 매우 적합하다.
또한, 본 발명은 아미노산 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129 또는 이들의 상동 서열을 가진 산화환원효소를 나타내는 것을 특징으로 하고, 아미노 말단과 카르복시 말단에 추가의 폴리펩티드가 연결된 융합 단백질에 관한 것이다. 이 융합 단백질은 예를 들면, 다른 단백질들로부터 쉽게 분리할 수 있거나, 또는 다량 재조합으로 발현시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 아미노산 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129 또는 이들의 상동 서열에 따른 산화환원효소에 특이하게 부착하는 항체에 관한 것이다. 이들 항체는 널리 알려진, 적당한 포유류의 면역화와 그에 따른 항체의 회수에 의한 방법으로 생산된다. 항체들은 단일 클론 항체(monoclonal) 또는 다중 클론 항체(polyclonal)일 수 있다.
아미노산 서열의 비교는 예를 들면, 인터넷에서, SWISS-PROT, PIR과 같은 단백질 데이터베이스 뿐만 아니라 EMBL, GenBank 등과 같은 DNA 데이터베이스를 FASTA-프로그램 또는 BLAST-프로그램을 이용하여 수행할 수 있다.
이때, 최적의 정렬을 BLAST 알고리즘으로 결정한다(Basic Local Alignement Search Tool)(Altsch ㎕ et al . 1990, Proc . Natl . Acd . Sci . USA . 87: 2264-2268). 서열의 유사성을 평가하기 위한 스코어고리 매트릭스로 PAM30 매트릭스를 사용한다(Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt, B.C. 1978., A model of evolutionary change in Proteins "in Atlas of Protein Sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoff(ed) 345-352, National Biomedical Research foundation).
또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편 당 아미노산 26개 이상을 가진, 아미노산 서열번호 1의 단편인 것을 특징으로 하는 단백질 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 대상은, N-말단에 아미노산 서열 MPATLRLDK(서열번호 17) 및/또는 C-말단에 아미노산 서열 QALAAPSNLAPKA(서열번호 18) 및/또는 VEIIKTQVQD(서열번호 19), KVAIITGGASGIGL(서열번호 20), SCYVTPEG(서열번호 21), TDFKVDGG(서열번호 22), VMFNNAGIMH(서열번호 23) 또는 VHAREGIRIN(서열번호 24) 중 내부 부분 서열들 중 하나를 포함하는, 미생물의 카르보닐 탈수소화효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편 당 15개 이상의 아미노산을 가진, 아미노산 서열번호 2의 단편이 특징인 단백질 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 아미노산 서열 MAYNFTNKVA(서열번호 25) 아미노 말단 및/또는 아미노산 서열 TTLLVDGGYTAQ(서열번호 26) 카르복시 말단 및/또는 EYKEAAFTN(서열번호 27), NKVAIITGGISGIGLA(서열번호 28), DVNLNGVFS(서열번호 29), HYCASKGGV(서열번호 30), NCINPGYI(서열번호 31) 또는 LHPMGRLGE(서열번호 32) 내부의 부분 서열 중 하나를 포함하는, 미생물의 카르보닐 탈수소화효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편 당 15개 이상의 아미노산을 가진, 아미노산 서열번호 3의 단편이 특징인 단백질 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 아미노산 서열 MSIPATQYGFV(서열번호 33) 아미노 말단 및/또는 아미노산 서열 SAYEGRVVFKP(서열번호 34) 카르복시 말단 및/또는 CHSDLHAIY(서열번호 35), GYQQYLLVE(서열번호 36), TFDTCQKYV(서열번호 37), LLTPYHAM(서열번호 38), LVSKGKVKP(서열번호 39), GAGGLGVNG(서열번호 40), IQIAKAFGAT(서열번호 41) 또는 LGSFWGTS(서열번호 42) 내부의 부분 서열 중 하나를 포함하는, 미생물의 카르보닐 탈수소화효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편 당 18개 이상의 아미노산을 가진, 아미노산 서열번호 4의 단편이 특징인 단백질 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 아미노산 서열 MTDRLKNKVA(서열번호 43) 아미노 말단 및/또는 아미노산 서열 AEFVVDGGYLAQ(서열번호 44) 카르복시 말단 및/또는 VVITGRRAN(서열번호 45), GGASIINMS(서열번호 46), TQTPMGHI(서열번호 47), 또는 GYIKTPLVDG(서열번호 48) 내부의 부분 서열 중 하나를 포함하는 미생물의 카르보닐 탈수소화효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편 당 18개 이상의 아미노산을 가진, 아미노산 서열번호 5의 단편이 특징인 단백질 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 대상은 아미노산 서열 MKALQYTKIGS(서열번호 49) 아미노 말단 및/또는 아미노산 서열 LAAGTVRGRAVIVP(서열번호 50) 카르복시 말단 및/또는 CHSDEFVMSLSE(서열번호 51), VYGPWGCGRC(서열번호 52), VSLTDAGLTPYHA(서열번호 53), LRAVSAATVIAL(서열번호 54), 또는 DFVGADPTI(서열번호 55) 내부의 부분 서열 중 하나를 포함하는, 미생물의 카르보닐 탈수소화효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 폴리펩티드 단편 당 26개 이상의 아미노산을 가진, 아미노산 서열번호 6의 단편이 특징인 단백질 단편에 관한 것이다.
본 발명의 대상은 아미노산 서열 MKAIQIIQ(서열번호 56) 아미노 말단 및/또는 아미노산 서열 DLRGRAVVVP(서열번호 57) 카르복시 말단 및/또는 내부의 부분 서열 중 하나인 TAAGACHSD(서열번호 58), TPYHAIKPSLP(서열번호 59), DFVGLQPT(서열번호 60), VYGAWGCG(서열번호 61), DDARHLVP(서열번호 62), MTLGHEGA(서열번호 63), 또는 GGLGHVGIQLLRHL(서열번호 64)를 포함하는, 미생물의 카르보닐 탈수소화효소에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129 또는 이들의 상동 서열에 따른 카르보닐 환원효소를 코딩하는 하나 또는 수개의 핵산 서열을 포함하는, 클로닝 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 카로보닐 환원효소 뿐만 아니라 NAD(P)의 재생에 적합한 효소, 예를 들면 포르메이트 탈수소화효소, 알코올 탈수소화효소 또는 포도당 탈수소화효소를 포함한 클로닝 벡터도 포함한다.
또한, 본 발명은 박테리아, 곤충, 식물 또는 포유류 세포에 위치되어 있으며, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129 또는 이들의 상동 서열에 따른 카르보닐환원효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 적절한 방법으로 발현 조절 서열에 연결된, 발현 벡터에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 박테리아, 효모, 곤충, 식물 또는 포유류 세포이며 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염할 수 있는 재조합 숙주 세포에 관한 것일 뿐만 아니라 이러한 재조합 숙주 세포의 배양을 기본으로 하여 카르보닐 환원효소를 수득하는 생산 방법에 관한 것이다.
적합한 클로닝 벡터로는, 예를 들면, ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript(Stratagene), pDrive 클로닝 벡터(Quiagen, Hilden, Germany), pS Blue, pET Blue, pET LIC-벡터(Novagen, Madison, USA) 및 TA-PCR 클로닝 벡터(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)가 있다.
적합한 발현 벡터의 예로는 pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL 또는 pTrx가 있다.
적합한 발현 조절 서열은, 예를 들면, trp-lac(tac)-프로모터, trp-lac(trc)- 프로모터, lac- 프로모터, T7- 프로모터 또는 λpL- 프로모터 등이다.
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129 또는 이들의 상동 서열을 가진 산화환원효소는, 상기 재조합 E. coli(E.coli) 세포를 배양한 다음 각각의 산화환원효소의 발현을 유도하고 10 내지 18시간 배양 후, 초음파처리하거나 글로브 밀(globe mill, Retsch, GmbH, Haan Germany 10 min, 24 Hz)의 유리 비드로 습성 분쇄하거나 또는 고압력 호모게나이저로 세포를 분해하는 방식으로, 수득할 수 있다. 수득되는 세포 추출물은 직접 사용하거나 추가적으로 분리 정제한 후 사용할 수 있다. 이를 위해, 세포 추출물은 예컨대 원심분리하고, 수득되는 상층액을 이온 교환수지 크로마토그래피, 예를 들면 Q-세파로스 패스트 플로우®(Pharmacia)에서의 이온 교환수지 크로마토그래피를 수행한다.
또한, 본 발명은 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물으로의 거울상이성질체 선택적인 효소 환원 방법에 관한 것이며, 케토 화합물은 보조인자의 존재 하에서 산화환원효소를 이용하여 환원되며, 이 환원 반응에 사용되는 산화환원효소는,
(a) 아미노산의 적어도 70% 이상은 서열번호 1, 서열번호 6, 및 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산과 동일하거나, 또는
(b) 아미노산의 적어도 55% 이상은 서열번호 2의 아미노산과 동일하거나, 또는
(c) 아미노산의 적어도 65% 이상은 서열번호 3의 아미노산과 동일하거나, 또는
(d) 아미노산의 적어도 75% 이상은 서열번호 4의 아미노산과 동일하거나, 또는
(e) 아미노산의 적어도 65% 이상은 서열번호 5의 아미노산과 동일하거나, 또는
(f) 아미노산의 적어도 50% 이상은 서열번호 7의 아미노산과 동일하거나, 또는
(g) 아미노산의 적어도 72% 이상은 서열번호 129의 아미노산과 동일한, 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법의 바람직한 예는 일반적인 일반식 I의 케토 화합물로 구성된다.
R1-C(O)-R2 (I)
상기 일반식 I에서,
R1은 하기 모이어티들 중 하나이고:
1) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인, -(C1-C20)-알킬,
2) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이고 선택적으로 최대 4개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알케닐,
3) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이고 선택적으로 최대 4개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2-C20)-알키닐,
4) -(C6-C14)-아릴,
5) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
6) 비치환되거나 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2으로 1, 2, 3번 치환된, -(C5-C14)-헤테로사이클, 또는
7) -(C3-C7)-사이클로알킬이며,
상기 1) 내지 7)의 모이어티는 독립적으로 각각 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2으로 1, 2 또는 3번 치환되거나, 또는 비치환되며;
R2는 하기 모이어티들 중 하나이다:
8) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C6)-알킬,
9) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄이고 선택적으로 최대 3개의 이중 결합을 포함하는, -(C2-C6)-알케닐,
10) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄이고 선택적으로 2개의 삼중 결합을 포함하는, -(C2 -C6)-알키닐, 또는
11) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄이고, -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2에 의해 1, 2 또는 3번 치환되거나 비치환된, -(C1 -C10)-알킬-C(O)-O-(C1 -C6)-알킬이며,
상기 8) 내지 11)에서 언급된 모이어티는 각각 서로 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 및/또는 -NH2에 의해 1, 2 또는 3번 치환되거나 비치환된다.
또한, 본 발명은 케토 화합물의 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상이성질체 선택적인 효소 환원 방법에 관한 것으로, 상기 케토 화합물은 보조인자의 존재하에 산화환원효소를 이용하여 환원되며, 상기 방법에서 사용되는 산화환원효소는 하기한 특징을 가진다:
(a) 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 130 중에서 선택된 핵산 서열에 의해 코딩되거나, 또는,
(b) 매우 엄격한 조건하에서 상기 (a)에 언급된 핵산 서열들 중 하나와 혼성화하는 상보적인 가닥의 핵산 서열에 의해 코딩된다.
용어 "아릴"은 고리에 6 내지 14의 탄소 원자를 포함하는 방향족 탄소 모이어티이다. -(C6-C14)-아릴 모이어티는 예를 들면, 페닐, 나프틸, 예컨대, 1-나프틸, 2-나프틸, 바이페닐릴, 예컨대 2-바이페닐릴, 3-바이페닐 및 4-바이페닐릴, 안트릴 또는 플루오레닐이다. 바이페닐릴 모이어티, 나프틸 모이어티 및 특히 페닐 모이어티가 바람직한 아릴 모이어티이다. 용어 "할로겐"은 F, Cl, Br 또는 I이다. 용어 "-(C1-C20)-알킬"은, 직쇄 또는 분지쇄이고, 1-20개의 탄소 원자를 포함하는 탄소쇄인 탄화수소 모이어티이며, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노네닐 또는 데카닐이다. 용어 "-C0-알킬"은 공유결합이다.
"-(C3-C7)-사이클로알킬"은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 또는 사이클로헵틸 등의 사이클형의 탄화수소 모이어티이다.
"-(C5-C14)-헤테로사이클"은 일부 또는 완전하게 포화된(saturated) 모노사이클형 또는 바이사이클형의 5원 내지 14원의 헤테로사이클 고리이다. N, O 및 S는 헤테로원자의 예이다. 피롤, 푸란, 티오펜, 이미다졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 티아졸, 이소티아졸, 테트라졸, 1,2,3,5-옥사티아디아졸-2-옥사이드, 트리아졸론, 옥사디아졸론, 이속사졸론, 옥사디아졸리딘디온, F, -CN, -CF3 또는 -C(O)-O-(C1-C4)-알킬에 의해 치환된 트리아졸, 3-하이드록시피로-2,4-디온, 5-옥소-1,2,4-티아디아졸, 피리딘, 피라진, 피리미딘, 인돌, 이소인돌, 인다졸, 프탈라진, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 퀴녹살린, 퀴나졸린, 신놀린, 카르볼린 및 벤즈-아닐레이트화된, 사이클로펜타-, 사이클로헥사- 또는 사이클로헵타-아닐레이트화된 상기 헤테로사이클의 유도체로부터 유래된 모이어티는 "-(C5-C14)-헤테로사이클"의 예이다. 특히 바람직한 것은, 모이어티 2- 또는 3-피롤릴, 4- 또는 5-페닐-2-피롤릴과 같은 페닐피롤릴, 2-푸릴, 2-티에닐, 4-이미다졸릴, 메틸이미다졸릴, 예를 들면 1-메틸-2, -4- 또는 -5-이미다졸릴, 1,3-티아졸-2-일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-, 3- 또는 4-피리딜-N-옥사이드, 2-피라지닐, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 2-, 3- 또는 5-인돌릴, 치환된 2-인돌릴, 예를 들면 1-메틸, 5-메틸, 5-메톡시-, 5-벤질옥시-, 5-클로로- 또는 4,5-디메틸-2-인돌릴, 1-벤질-2- 또는 -3-인돌릴, 4,5,6,7-테트라하이드로-2-인돌릴, 클로로헵타[b]-5-피롤릴, 2-, 3- 또는 4-퀴놀릴, 1-,3- 또는 4-이소퀴놀릴, 1-옥소-1,2-디하이드로-3-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살리닐, 2-벤조푸라닐, 2-벤조티에닐, 2-벤족사졸릴 또는 벤조티아졸) 또는 디하이드로피리디닐, 피롤리디닐, 예를 들면 2- 또는 3-(N-메틸피롤리디닐), 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 테트라하이드로티에닐 또는 벤조디옥솔라닐이다.
일반식 I의 바람직한 화합물은, 예를 들면 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 메틸아세토아세테이트, 에틸-8-클로로-6-옥소옥타노익산, 에틸-3-옥소발레리에이트, 4-하이드록시-2-부탄온, 에틸-2-옥소발레리에이트, 에틸-2-옥소-4-페닐부티르산, 에틸피루베이트, 에틸 페닐 글리옥실레이트, 1-페닐-2-프로파논, 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온, 아세토페논, 2-옥탄온, 3-옥탄온, 2-부탄온, 1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-온, 2,5-헥산디온, 1,4-디클로로-2-부ㅌ타논, 아세토옥시아세톤, 페나크릴 클로라이드, 에틸-4-브로모아세토아세테이트, 1,1-디클로로아세톤, 1,1,3-트리클로로아세톤 또는 1-클로로아세톤이다.
본 발명의 방법에서, 산화환원효소는 완전히 정제되거나 또는 부분적으로 정제된 상태에서도 사용될 수 있으며, 또는 산화환원효소가 포함된 세포를 이용하여 수행할 수 있다. 그 과정에서, 세포는 원래 상태 그대로, 투과화된 상태 또는 용해된 상태로 제공될 수 있다. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129에 따른 클로닝된 산화환원효소 또는 각각의 그 상동체가 바람직하게 사용된다.
일반식 I의 화합물이 변환되는데 kg 당 산화환원효소 5.000에서 10 Mio U이 사용된다(상한 없음). 효소 단위 1U은 1분 동안 일반식 I의 화합물 1 μmol을 변환시키는데 필요한 효소의 양이다.
효소적 환원 그 자체는 생산된 알코올이 더 이상 반응하지 않게 되는 완화된 조건에서 진행된다. 본 발명에 따른 방법은 체류(residence) 시간이 길고, 생산되는 키랄 알코올의 거울상이성질체 순도는 보통 95% 이상이며, 케토 화합물의 사용량 대비, 수율이 높다.
본 발명에 따른 방법에서, 카보닐 화합물은 총 부피 기준으로 3% 내지 50%로 사용되며, 바람직하게는 5% 내지 40%이고, 보다 바람직하게는 10% 내지 30%이다.
또한, 본 발명의 바람직한 실시예는, 환원 중에 형성된 NAD 또는 NADP가 보조기질과 함께 각각 NADH 또는 NADPH로 연속적으로 환원되는 것을 특징으로 한다.
이러한 과정에서, 에탄올, 2-프로판올, 2-부탄올, 2-펜탄올, 3-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-헵탄올, 2-옥탄올 또는 사이클로헥산올과 같은 1차 및 2차 알코올은 바람직한 보조기질(cosubstrate)로서 이용된다.
상기 보조기질은 산화환원효소 및 각각 NAD 또는 NADP의 보조 작용하에서 해당 알데히드 또는 케톤 및 NADH 또는 NADPH로 각각 반응된다. 그 결과, 각각 NADH 또는 NADP가 재생된다. 이러한 재생 과정에서 보조기질의 비율은 총 부피를 기준으로 5 내지 95 부피%이다.
보조인자의 재생에서는 부가적인 알코올 탈수소화효소가 첨가될 수 있다. 적절한 NADH-의존적인 알코올 탈수소화효소는 예를 들면, 제빵 효모, 칸디다 보이디니, 칸디다 파랍실로시스 또는 피키아 캡슐라타로부터 수득할 수 있다. 또한, 적절한 NADPH-의존적인 알코올 탈수소화효소는 락토바실러스 브레비스(DE 196 10 984 A1), 락토바실러스 마이너(DE 101 19 274), 슈도모나스(US 5,385,833), 또는 써모언에어로비움 브로키(Themoanaerobium brockii)에 존재하고 있다. 이들 알코올 탈수소화효소의 적절한 보조기질은 이미 언급한 에탄올, 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올, 4-메틸-2-펜탄올, 2-옥탄올 또는 사이클로헥산올과 같은 2차 알코올이다.
또한, 보조인자의 재생은 예를 들면, NAD- 또는 NADP-의존적인 포르메이트 탈수소화효소를 이용하여 수행할 수 있다(Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase). 포르메이트 탈수소화효소의 적절한 보조기질은, 예를 들면, 암모늄 포르메이트, 소듐 포르메이트 또는 칼슘 포르메이트와 같은 포름산의 염이다. 그러나, 본 발명에 따른 방법은 그러한 추가적인 탈수소화효소 없이 수행되는 것이 바람직하며, 즉, 기질-커플링된 보조효소 재생이 이루어진다.
반응 혼합물의 효소 환원이 이루어지는 수상 부분은, pH 값이 5 내지 10, 바람직하게는 6 내지 9의, 예를 들면 포타슘 포스페이트, 트리스/HCl 또는 트리에탄올아민 완충액 등의 완을액를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 완충액은 효소를 안정화시키거나 활성화시키기 위한 이온, 예를 들면, 아연 이온이나, 마그네슘 이온을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법을 수행하는 온도는 10 ℃ 내지 70 ℃가 적합하며, 바람직하게는 20 ℃ 내지 40 ℃이다.
본 발명에 따른 방법의 보다 바람직한 예는, 물과 섞이지 않거나, 단지 제한적인 수준으로 혼화가능한 유기 용매 존재하에 효소적 변화이 실행된다. 상기 용매는 예를 들면, 대칭 또는 비대칭성 디(C1-C6)알킬 에테르, 직쇄 또는 분지쇄 알칸 또는 사이클로 알칸, 또는 동시에 대표적인 보조기질이기도 한 비수용성 2차 알코올이다. 바람직한 유기용매는 예를 들면, 디에틸 에테르, 3차 부틸 메틸 에테르, 디이소프로필 에테르, 디부틸 에테르, 부틸 아세테이트, 헵탄, 헥산, 2-옥탄올, 2-헵탄올, 4-메틸-2-펜탄올 또는 사이클로 헥산이다. 이 용매는 동시에 보조인자 재생의 보조기질로도 사용할 수 있다.
만약, 비수용성 용매와 보조 기질이 각각 사용된다면, 반응 배치는 수상(aqueous)과 유기상(organic phase)으로 구성된다. 기질은 그 용해도에 따라 유기상과 수상에 분산된다. 유기상의 비율은 일반적으로 총 반응 부피를 기준으로 5 내지 95%, 바람직하게는 10 내지 90%이다. 2 개의 용액 상은, 바람직하게는 이들 사이에 표면적을 넓게 하도록 기계적으로 혼합한다. 또한, 상기 예에서, 효소 환원 중에 형성되는 NAD 또는 NADP는 상기에서 설명한 바와 같이 보조기질을 이용하여 각각 NADH 또는 NADPH로 다시 환원할 수 있다.
수상중의 보조인자 NADH 또는 NADPH 각각의 농도는 일반적으로 0.001 mM 내지 1 mM, 특히 0.01 mM 내지 0.1 mM의 범위이다.
본 발명에 따른 방법에서, 산화환원효소/탈수소화효소의 안정화제도 사용할 수 있다. 적절한 안정화제는 예를 들면, 글리세롤, 소르비톨, 1,4-DL-디티오트레이톨(DTT) 또는 디메틸 설폭사이드(DMSO)이다.
본 발명에 따른 방법은, 예를 들면, 유리나 금속으로 만들어진 밀폐된 반응 용기에서 수행된다. 이를 위하여, 성분을 각각 반응 용기에 이동시키고, 질소 또는 공기 대기 중에서 교반한다. 반응 시간은 1 내지 48시간이고, 특히 2 내지 24시간이다.
이어, 반응 혼합물을 가공 처리한다. 이를 위해, 수상을 분리하고 유기상은 여과한다. 경우에 따라 수상을 한번 더 추출할 수 있고, 유기상과 같이 더욱 처리할 수 있다. 이어서, 경우에 따라, 여과된 유기상으로부터 용매를 증발시킨다.
또한, 본 발명은 일반식 II의 키랄 하이드록시 화합물을 수득하는 방법에 관한 것이다.
R1-C(OH)-R2 (II)
R1과 R2는 상기에서 정의된 바와 동일하며,
a) 일반식 II의 라세믹 화합물을 포함하는 혼합물은, 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 129 또는 그 상동체에 따른 본 발명의 산화환원효소들 중 하나, NAD(P) 및 물의 존재하에 인큐베이션하여, 일반식 II의 하이드록시 화합물의 거울상이성질체가 해당 케토 화합물과 NAD(P)H로 변환에 따라 변환되며,
b) 일반식 II의 하이드록시 화합물의 나머지 거울상이성질체가 분리되는 것을 특징으로 한다.
만약 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 129에 따른 카보닐 환원효소를 사용하면, 바람직하기로는 해당 키랄 R-하이드록시 화합물이 수득된다. 만약 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 8에 따른 카보닐 환원효소를 사용하면, 바람직하기로는 해당 키랄 S-하이드록시 화합물이 수득된다.
반응 조건은 기분적으로 기본적으로 상기에서 언급한 일반식 I의 케토 화합물의 거울상이성질체 특이적 환원 과정과 동일하다. 그러나, 일반식 II의 라세믹 혼합물로부터의 일반식 I의 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 환원 대신에, 일반식 II의 하이드록시 화합물의 단지 하나의 거울상이성질체만 거울상이성질체 선택적인으로 해당 케토 화합물로 산화된다. 따라서, 일반식 II의 하이드록시 화합물의 반대 거울상이성질체는 잔류되어, 분리할 수 있다. 또한, 에탄올, 2-프로판올(이소프로판올), 2-부탄올, 2-펜탄올 또는 2-옥탄올과 같은 보조 기질로 사용되는 알코올 대신, 아세톤과 같은 해당 케톤이 NAD의 재생 과정에 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 산화환원효소 또는 추가적 탈수소화효소에 의해 아세톤과 NAD(P)H는 NAD와 이소프로판올로 변환된다.
본 발명은 수상/유기상 2상 시스템에서 안정성이 우수할 뿐만 아니라 E. coli에서 발현성이 우수한(>500 units/g E. Coli wet biomass) 다수의 신규한 거울상이성질체 선택적인 R- 및 S- 특이적 새로운 산화환원효소와, 케토 화합물의 거울상이성질체 선택적인 효소적 반응으로 키랄 하이드록시 화합물을 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 예는 하기의 실시예를 들어 보다 구체적으로 예시된다.
실시예 1: 유기체 배양 및 카보닐 환원효소의 활성 스크리닝
스크리닝을 하기 위해, 로도토룰라 뮤실라지노사 DSMZ 70825, 피키아 파리노사 DSMZ 3316, 칸디다 네모덴드라 DSMZ 70647, 피키아 스티피디스 DSMZ 3651 및 피키아 트레할로필라 DSMZ 70391, 로더로마이세스 일롱기스포러스 DSMZ 70320 등의 효모 균주를 다음과 같은 배지에서 배양하였다: 효모 추출물(3), 말트 추출물(3), 펩톤(5) 그리고 포도당(10)(괄호 안의 숫자는 g/l). 배지는 121℃에서 멸균하고 더 이상의 pH 조정 없이 25 ℃에서 160rpm의 속도로 교반기에서 배양하였다.
루코노스톡 카르노섬 DSMZ 5576 균주는 다음의 배지에서 배양하였다: 포도당(20), 효모 추출물(5), 미트 추출물(10), 디암모니움 하이드로겐 시트레이트(2), 소듐아세테이트(5), 마그네슘 설페이트(0.2), 망간 설페이트(0.05), 디포타슘 하이드로겐 포스페이트(2). 배지는 121℃에서 멸균한 다음 더 이상의 pH 조정이나 산소 공급 없이 30 ℃에서 배양하였다.
마이크로박테리움 spec DSMZ 20028 균주는 효소 추출물(3), 트립티카제 소이 플로우어(crypticase soy flour)(30) 배지에서, 30 ℃에서 160rpm으로 배양하였다.
고르도니아 루브리페르틴크타 DSMZ 43570 균주는 효소 추출물(4), 포도당(4), 말트 추출물(10), CaCO3(2) 배지에서, 37℃에서 160rpm으로 배양하였다.
그 후, 125mg의 세포를 800 ㎕의 분해 완충액(100 mM 트리에탄올아민(TEA), pH=7.0)에 재현탁하고, 1g의 유리 비드로 혼합한 다음 글로브 밀(Retsch) 중에서 4℃에서 10분간 분해하였다. 12,000rpm으로 2분간 원심분리하여 수득한 상등액(세포 용혈물)을 하기 활성 스크리닝과 광학 순도(ee-value)를 결정하는데 사용하였다. 2-부탄온, 2-옥탄온, 에틸-4-클로로아세토아세테이트, 아세토페논 또는 에틸-2-옥소-4-페닐부티르산 같은 여러가지 케톤을 기질로서 사용하였다.
활성 스크리닝용 배치(batch)
860 ㎕의 0.1M KH2PO4/K2PO4 pH = 7.0 1 mM MgCl2
20 ㎕의 NADPH 또는 NADH(10 mM)
20 ㎕의 세포 용혈물
100 ㎕의 기질(100 mM)
반응은 340 nm에서 1분간 관찰하였다.
ee-value를 결정하기 위한 배치(batch)
20 ㎕의 세포 용혈물
100 ㎕의 NADH 또는 NADPH(50 mM)
60 ㎕의 기질(100 mM)
24시간 후, ee-결정을 위한 배치를 예컨대 클로로포름으로 추출하고, 가스크로마토그래피(GC)로 광학 순도를 결정하였다. 광학 순도(ee)는 다음과 같이 계산하였다:
ee(%) = ((R-알코올 - S-알코올)/(R-알코올 + S-알코올)) x 100.
DSMZ 번호 미생물 U/g 세포 숙주 유기체에서의 활성
2-부탄온 2-옥탄온
NADH NADPH NADH NADPH
70825 로도토룰라 뮤실라지노사 <1 ----- <1 ------
3316 피키아 파리노사 12 ----- <1 -----
70647 칸디다 네모덴드라 45 ----- 12 -----
3651 피키아 스티피디스 10 ----- 6.4 -----
70391 피키아 트레할로필리아 85 ----- 45 -----
5576 루코노스톡 카르노섬 ------- 77 ------- 77
20028 마이크로박테리움 spec 9 ----- 26 -----
43570 고르도니아 루브리페르틴크타 7.7 ----- 13 -----
70320 로더로마이세스 일롱기스포러스 40 ----- 34 ----
DSMZ는 Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkuluren, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig이다. 효소 단위의 정의: 1U은 1분 동안 기질 1 μmol를 변환시키는데 필요한 효소량이다
실시예 2: NAD(P)H-의존적인 미생물 산화환원효소의 분리와 정제
NAD(P)H-의존적인 미생물 산화환원효소를 분리하기 위하여, 실시예 1에 따라 미생물을 배양하였다. 정체기(Stationary phase)에 도달했을 때 원심분리하여 배지에서 세포들을 모아 분리하였다. 유리비드를 이용한 습식 분쇄나 다른 분해방법으로 효소를 세포로부터 유리시킬 수 있다. 이를 위하여, 예를 들면 100 g의 세포를 400 ml의 분해 완충액(100 mM 트리에탄올아민(TEA), pH=7.0)에 현탁하고, 프렌치 프레스로 동질화하였다.
이후, 원심분리(7,000rpm)로 수득한 조 추출물을 FPLC(fast protein liquid chromatography)로 정제하였다.
본 발명에 따른 모든 산화환원효소는 Q-세파로스 패스트 플로우(Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)) 또는 Uno Q(Biorad, Munich, Germany) 등의 이온 교환수지 크로마토그래피, 옥틸-세파로스 패스트 플로우(Octyl-Sepharose Fast Flow) 또는 부틸-세파로스 패스트 플로우(Pharmacia) 등의 소수성 상호작용 크로마토그래피, 세라믹 하이드록실아파티트 크로마토그래피 및 겔 여과(gel permeation)와 같은 여러가지 크로마토그래피를 조합하여 정제할 수 있다.
실시예 2a: 피키아 파리노사 DSMZ 3316로부터 NAD (P)H-의존적인 미생물 산화환원효소의 분리 및 정제
단백질을 분리하기 위하여, 원심 분리한 후 수득된 피키아 파리노사 DSMZ 3316의 세포 용혈물을 100 mM 트리에탄올아민 완충액 pH 7.0 및 1M 암모니움 설페이트로 평형화시킨 부틸-세파로스 FF-컬럼에 직접 주입하고, 선형 농도 구배로 염 농도를 감소시키며서 용리시켰다. 산화환원효소를 포함하는 분획을 모아 한외여과(ultrafilteration)법으로 적정 부피로 농축하였다(배제 한계 10kDa).
그 후, 산화환원효소 농출 분획을 Uno Q로 더욱 정제하였다. 이를 위해, 50 mM 인산완충액 pH 7.0으로 평형화한 Uno Q-컬럼(Biorad)에 산화환원효소를 직접 주입하고, 염 농도를 증가시키는 선형 농도 구배로 용리시켰고, 그에 따라 산화환원효소는 0 M NaCl에서 컬럼에 부착되지 않고 용리되었으며 대부분의 불순물은 결합되어 보다 높은 염 농도에서 용리되었다.
세번째 정제 단계는 세라믹 하이드록시아파티트 컬럼(Pharmacia)으로 진행하였으며, 1 mM MgCl2을 포함한 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 6.8로 평형화된 컬럼에 산화환원효소를 주입하고, 완충액 농도(1 mM MgCl2을 포함하는 400 mM 포타슘 포스페이트 완충액)를 증가시켜 용리시켰다. 산화환원효소는 80-100 mM의 포타슘 포스페이트 완충액에서 용리시켰다.
그 후, 겔 여과(슈퍼덱스 200 HR; Phamarcia, 100 mM 트리에탄올아민, pH 7.0, 0.15 M NaCl)를 통해 정제된 산화환원효소의 분자량을 결정하였다. 분자량 표준 물질로서 카탈라제(232kDa), 알돌라제(158kDa), 알부민(68.9kDa) 및 오발부민(49.4kDa)을 사용하였다.
하기 표 2에 실험 결과를 요약 정리하였다.
정제단계 부피[ml] 활성 [U/ml]
2-부탄온		 총활성[U]
2-부탄온		 특이 활성[U/mg]
2-부탄온		 수율
조 추출물 70 1.3 80 0.1 100%
부틸-세파로스 10 4.4 44 1.7 55%
Uno Q 1.4 17 24 5 30%
하이드록실아파타이트 0.7 13.5 9.5 16 12%
산화환원효소의 효소 활성은 실시예 1(배치 활성스크리닝)에 따른 실험 시스템으로 결정하였다. 단백질 정량은 라우리법(Lowry et al. Journal of Biological Chemistry, 193 (1951): 265-275; Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979): 201-220))에 따라 실시하였다. 단백질 양 대비 효소활성 비인 특이 활성을 구하였으며, 1 unit은 1분 동안 1 μmol의 기질을 변환시킬 있는 활성이다.
실시예 2b: 마이크로박테리움 spec DSMZ 20028로부터 NAD (P)H-의존적인 미생물 산화환원효소의 분리 및 정제
단백질을 분리하기 위하여, 원심 분리 후 얻어진 마이크로박테리움 spec DSMZ 20028의 용해물을 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0으로 평형화한 Q-세파로스 FF-컬럼에 적용하고, 염 농도를 증가시키는 선형 농도 구배로 용리시켰다. 산화환원효소의 용리는 NaCl 농도 0.6 내지 0.8 M에서 이루어졌다. 산화환원효소를 포함한 분획을 모아 한외여과법으로 적정 부피로 농축하였다(배제 한계 10 kDa).
이어서, 농축된 산화환원효소 분획을 Uno Q로 더욱 정제하였다. 이를 위하여, 50 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 7.0으로 평형화한 Uno Q-컬럼(Biorad)에 산화환원효소를 직접 주입하고, 염 농도를 증가시키는 선형 농도 구배로 용리시켰으며, 이에 산화환원효소의 용리는 NaCl 농도 0.2 내지 0.25 M에서 이루어졌다.
세번째 정제 단계는 세라믹 하이드록시아파티트 컬럼(Pharmacia)으로 진행하였다. 1 mM MgCl2을 포함하는 10 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 6.8로 평형화한 컬럼에 마이크로박테리움 spec DSMZ 20028에서 분리한 산화환원효소를 주입하고, 완충액 농도(1 mM MgCl2을 포함하는 400 mM 포타슘 포스페이트 완충액 pH 6.8)를 증가시켜 효소를 용리시켰다. 산화환원효소는 80 내지 100 mM의 포타슘 포스페이트 완충액에서 용리되었다. 이후, 실시예 2a에 따른 방법으로 정제된 산화환원효소의 분자량을 결정하였다.
하기 표 3은 실험 결과를 요약 정리한 것이다.
정제단계
 부피 [ml] 활성 [U/ml]
2-옥탄온		 총 활성[U]
2-옥탄온		 특이 활성 [U/mg]
2-옥탄온		 수율
조 추출물 55 3.8 212 0.4 100%
Q-세파로스 FF 34 4.1 139 0.56 65%
Uno Q 0.8 9.3 7.5 3.8 3.5%
히드록실아파타이트 0.5 4.2 2.1 117 1%
실시예 3: 본 발명에 따른 산화환원효소의 아미노 말단의 서열 결정
10% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 겔을 이용한 겔 여과를 수행하여, 실시예 2에 따른 효소 조제물을 분리시키고, 이를 폴리비닐이덴 디플로라이드 멤브레인(PVDF-membrane)에 이동시켰다. 두드러진 밴드는 에드만 분해법(Edman degradation: Procise 492(PE-Biosystems)으로 아미노 말단의 아미노산 서열을 결정하였다.
실시예 4: 효모로부터 분리된 거울상이성질체 선택적인 알코올 탈수소화효소의 일반적인 클로닝 전략
Manniatis 및 Sambrook의 "분자 클로닝"에 기술된 방법으로 염색체 DNA를 추출하였다. 수득되는 핵산은 중축(degenerate) 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 주형으로 이용하였다. 이에, 5'-프라이머는 아미노산 서열(서열번호 66; 72; 80)로부터 유래되며, 3'-프라이머는 아미노산 서열(서열번호 67; 73; 81)로부터 유래되며, 이는 유기체에 특이적인 유전자 코드를 포함한다(서열버호 68; 69; 74; 75; 82; 83).
증폭은 PCR 완충액(67 mM Tris-HCl(pH 8.3), 16 mM (NH4)2SO4, 115 mM MgCl2, 0.01% Tween 20) 0.2 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 믹스(dNTPs), 40 pMol의 각각 프라이머 및 2.5U의 Bio Therm Star 중합효소(Genecraft, Luingshausen, Germany))에서 수행하였다. Bio Therm Star 중합효소를 활성화(8분, 95 ℃)시킨 후, 45 내지 50회의 사이클로 터치-다운 PCR을 수행하고, 반응물을 4 ℃에서 식힌 다음, 반응 분석을 위해 전체 PCR 반응물을 1% 아가로스겔에 로딩하였다.
PCR로 수득되는 특이적인 단편을 TA-클로닝 벡터 pCR2.1(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 연결하고, M13 rev(서열번호 65) 및 M13 uni(서열번호 128) 프라이머를 이용하여 ABI DNA 염기서열 분석기로 염기서열을 분석하였다.
유전자를 코딩하는 염기서열의 5'-와 3'- 말단 부위는 RACE 방법(rapid amplification of cDNA ends)으로 결정하였다. 특이적인 단편의 핵산 서열을 기초로, 3'-RACE, 5'-RACE에 대한 올리고뉴클레오티드를 구축하였다. 세포로부터 준비한 총 RNA를 3'-RACE 시스템(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)의 제1 cDNA 가닥 합성의 주형으로 사용하였다. 이후, 증폭시킨 다음, 3'-RACE 올리고뉴클레오티드(서열번호 76; 77; 84; 85)를 이용하여 특이적인 cDNA를 재증폭시켰다. 이 배치는 분석하기 위해 1% 아가로스 겔에서 전기영동하였다. 3'-측면(franking) 서열에 대한 정보가 없는 특이적인 단편을 분리하여 T-클로닝 벡터 pCR2.1에 연결한 다음 서열 분석하였다.
5'-말단의 코딩 서열 및 비코딩 서열을 5'-RACE 시스템(Invitrogen)을 이용하여 결정하였다. 이를 위해서, 미리 수득한 총 RNA에서 mRNA를 올리고 dT-셀룰로오스(NEB, Beverly, USA)로 농화시키고, 유전자 특이적인 올리고뉴클레오티드 (서열번호 70; 71; 78; 79; 86; 87)를 이용하여 제1 cDNA 가닥 합성에 사용하였다. 이후의 증폭 및 특이적인 cDNA의 재증폭으로 단편을 확보하고, 이를 분석하기 위해 pCR2.1 TA-클로닝 벡터(Invitrogen)에 연결하였다. 상기 단편이 함유된 플라스미드를 ABI DNA 염기서열 분석기를 통하여 분석하였다. 유전자의 5'-말단에 대한 알려지지 않은 서열 정보를 수득하였다.
Figure 112013076361359-pat00001
전장 유전자를 코딩하는 염기서열(서열번호 9; 10; 11)을 기초로, 적절한 발현 시스템에 상기 DNA를 클로닝하기 위한 특이적인 프라이머를 구축하였다. 이를 위해, 예컨대, Nde I, SphI 또는 BamHI 각각의 인지서열을 가지는 5'-프라이머와 HindIII의 인지서열을 가지는 3'-프라이머를 변형 제작하였다(서열번호 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96).
이후 PCR에서, 염색체 DNA를 주형으로 사용하였다. 각각의 산화환원효소를 코딩하는 DNA 섹션을 Platinum pfx 중합효소(Invitrogen)로 증폭하였다. 1% 아가로스 겔상에서 정제한 후, 수득되는 PCR 산물을 적정 DNA 엔도뉴클레아제로 처리하고, 이를 동일한 엔도뉴클레이즈로 처리한 pET21a 벡터(Novagen, Madison, USA) 또는 pQE70(Qiagen, Hilden, Germany) 벡터 벡본에 각각 연결하였다.
염기 서열을 분석한 후, 제조된 발현 구조체를 발현 균주 BL21 Star(Invitrogen) 또는 RB791(E.coli genetic stock, Yale, USA)에 각각 도입하였다.
실시예 4a: 피키아 파리노사 효모로부터 거울상이성질체 선택적인 산화환원효소의 클로닝
피키아 파리노사로부터 산화환원효소를 클로닝하기 위하여, Manniatis와 Sambrook의 "분자 클로닝(Molecular Cloning)"에 기술된 방법에 따라 염색체 DNA를 피키아 파리노사 세포로부터 추출하였다. 수득되는 핵산을 주형으로, 염기서열 74;75의 올리고뉴클레오티드로 터치다운(Touch Down) PCR을 수행하였다. PCR 사이클러(BioRad, Hercules, USA)에서 95 ℃에서 8분간 Bio Therm Star 중합효소를 활성시킨 후, 하기 30회의 사이클을 프로그래밍하여 특이적인 DNA 단편을 확인하였다.
94℃ 45 초
60 ℃-0.5 ℃/사이클 45 초
68℃ 2 분
이후, 20회의 사이클을 추가로 하여 증폭 신호를 증가시켰다.
94℃ 40 초
52℃ 40 초
72℃ 1 분
전체 반응 배치를 1% 아가로스 겔에서 단편화한 후, 550bp의 특이적인 단편을 확인할 수 있었다. 이 단편을 겔에서 용출시켜, pCR2.1 TA-벡터(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 연결하였다. 재조합된 플라스미드 pCR2.1-PF550의 염기서열을 분석하였다.
550 bp의 유전자 단편의 염기서열 분석으로, 아미노 말단과 내부 펩티드의 2개의 서열 단편을 발견할 수 있는, 174개의 아미노산으로 이루어진 오픈 리딩 프레임(open reading frame)이 확인되었다.
521 bp의 유전자 단편의 염기서열을 기초로, 3'-RACE(서열번호 76;77) 및 5'-RACE (서열번호 78;79;88)에 대한 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. cDNA 합성 반응을 위해, 피키아 파리노사 세포로부터 총 RNA를 하기 방법에 따라 준비하였다.
600 mg의 신선한 세포를 2.5 ml의 빙냉한 LETS 완충액에 재현탁하였다. 글라스 비드를 질산으로 세정하고 페놀 3 ml로 평형화한 다음, 5 ml(약 20 g)을 상기 세포 현탁물에 첨가하였다. 전체 배치를 각 30초간 총 10분동안 혼합하고, 30초간 얼음에서 냉각시켰다. 이어서, 5 ml의 빙냉한 LETS 완충액를 첨가하여 다시 충분히 혼합하였다. 상기 세포 현탁액은 4 ℃에서 11,000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 수상을 회수하여 동일 부피의 페놀: 클로로포름: 이소아밀알코올(25　:24　:1)로 2회 추출하였다. 그 후, 클로로포름으로 다시 추출하였다. 마지막 추출한 후, 총 RNA는 1/10 부피배의 5 M LiCl2를 첨가하여, -20 ℃에서 4시간 동안 침전시켰다. 제1 cDNA 가닥은 3'-RACE 시스템(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 이용하여 합성하였다. 그 후, 서열번호 76과 AUAP(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 반응액: 67 mM Tris-HCl(pH 8.3), 16 mM(NH4)2SO4, 115 mM MgCl2, 0.01% Tween 20, 0.2 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs), 10 pMol의 각 프라이머 및 2.5U의 Bio Therm Star 중합효소(Genecraft, Luingshausen, Germany) 중에서, 94℃에서 40초, 55 ℃에서 40초, 72℃에서 1분으로 구성된 30회의 온도 사이클을 이용하여, 특이적인 cDNA를 증폭시켰다.
프라이머(서열번호 77)과 프라이머 UAP(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)를 이용하고, 94℃에서 40초, 55 ℃에서 40초, 72℃에서 50초로 구성된 30회의 온도 사이클을 실시한 네스티드(nested) PCR을 통하여 PCR 신호를 증대시켰다. 그 결과, 약 400 bp의 특이적인 DNA 단편이 확인되었으며, 이를 1% 아가로스 겔로부터 분리한 후 pCR2.1(Invitrogen) 벡터에 연결하였다. 382 bp의 DNA 단편의 염기서열을 분석하여, 피키아 파리노사 유래의 산화환원효소를 코딩하는 cDNA의 종결코돈과 폴리 A 루프까지의 3'-확장 서열에 대한 정보를 얻을 수 있었다.
5'-RACE 반응에서, 피키아 파리노사 세포로부터 준비한 5 ㎍의 총 RNA를 사용하였다. 5'-RACE 시스템(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)과 서열번호 78의 올리고뉴클레오티드를 이용하여 유전자 특이적인 cDNA를 합성하였다. 수득되는 유전자 특이적인 cDNA는 동형중합성 dCTP 첨가 반응에 투입하였다. 이후, PCR [67 mM Tris-HCl(pH 8.3), 16 mM (NH4)2SO4, 115 mM MgCl2, 0.01% Tween 20], 0.2 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트(dNTPs), 20 pMol 프라이머(서열번호 79) 및 프라이머 AAP(Invitrogen), 2.5U의 Bio Therm Star 중합효소(Genecraft, Luingshausen, Germany) 중에서, 94 ℃에서 45초, 54 ℃에서 45초, 72 ℃에서 1분 30초로 이루어진 35회의 온도 사이클을 수행하여 cDNA를 증폭시켰다. PCR 신호는 프라이머 서열번호 88과 프라이머 UAP(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)를 사용하고, 94 ℃에서 40초, 55 ℃에서 40초, 72 ℃에서 1분으로 이루어진 30회의 온도 사이클을 수행하는 네스티드 PCR을 통하여 증대시켰다. 그 결과, 약 350 bp의 특이적인 DNA 단편이 확인되었으며, 이를 1% 아가로스 겔로부터 분리하여 pCR2.1(Invitrogen) 벡터에 연결시켰다. 352 bp DNA 단편의 염기서열을 분석하여, 알코올 탈수소화효소/환원효소를 코딩하는 cDNA의 5'-말단에 대한 정보를 얻을 수 있었다.
단백질을 코딩하는 DNA 단편은 총 765 bp(서열번호 10)이며 245개의 아미노산(서열번호 2)으로 이루어진 ORF이다. 피키아 파리노사의 염색체 DNA를 주형으로 PCR(10 mM Tris-HCl(pH 8.0); 50 mM KCl; 10 mM MgSO4; 0.2 mM dNTP Mix; 20 pMol 프라이머 서열번호 91 또는 각각 20 pMol 프라이머 서열번호 92, 20 pMol 프라이머 서열번호 93, 및 2 U Platinum pfx 중합효소(Invitrogen))을 실시하여 전장 DNA를 제조하였으며, 수행한 온도 사이클은 다음과 같다:
사이클 1 94 ℃, 2 분
사이클 2 x 30 94 ℃, 15 초
56 ℃, 20 초
68 ℃, 1분 15초
1% 아가로스 겔에서 정제한 다음, 수득되는 PCR 산물을 NdeI 및 HindIII, 또는 ShpI 및 HindIII로 각각 처리하여, 벡본을 동일한 엔도뉴클레이즈로 처리한 pET21a(Novagen, Madison, USA) 또는 pQE70(Qiagen, Hilden, Germany)에 연결시켰다. 상기 반응물 2 ㎕을 E.coli Top10F' 세포로 형질전환하고, 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA에서 벡터 연결이 올바르게 되었는지를 체크하고, 엔도뉴클레이즈 NdeI 또는 SphI 및 HindIII 각각으로 제한 효소 분석을 수행하였다. 삽입체에 대해 양성을 보인 벡터의 DNA는 발현 균주인 BL21 Star(Invitrogen) 및 RB791(E.coli genetic Stock, Yale, USA)에 각각 형질전환하였다.
실시예 5: 박테리아로부터 분리된 거울상이성질체 선택적인 산화환원효소의 일반적인 클로닝 전략
Manniatis 및 Sambrook의 "분자 클로닝"에 기술된 방법에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 수득되는 핵산은 중축(degenerate) 프라이머를 이용한 PCR에 주형으로 사용하였다. 5'-프라이머는 서열번호 104; 112의 아미노산 서열로부터 유래된 것이고, 3'-프라이머는 서열번호 105; 113의 아미노산 서열로부터 유래된 것으로, 유기체에 특이적인 유전자 코드를 사용하였다(서열번호 106; 107; 114; 115).
증폭은 PCR 완충액(67 mM Tris-HCl(pH 8.3), 16 mM(NH4)2SO4, 115 mM MgCl2, 0.01% Tween 20), 0.2 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물(dNTPs), 40 pMol의 각 프라이머 및 2.5U의 Bio Therm Star 중합효소(Genecraft, Luingshausen, Germany))에서 수행하였다. 95 ℃에서 8분간 Bio Therm Star 중합효소를 활성시킨 다음, 45-50회의 사이클로 구성된 터치-다운 PCR(Touch-Down PCR)을 수행하고, 반응물은 4 ℃로 냉각한 다음, 전체 PCR 반응물을 1% 아가로스 겔에 로딩하여 분석하였다.
PCR로 수득되는 특이적인 단편을 TA-클로닝 벡터 pCR2.1(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 연결하고, 프라이머 M13 rev(서열번호 65) 및 M13 uni(서열번호 128)를 이용하여 ABI DNA 염기서열 분석기로 염기서열을 분석하였다.
유전자-코딩 서열의 5'- 및 3'- 말단 부위는 인버스 PCR(iPCR)로 결정하였다. 특이적인 내부 단편의 핵산 서열을 기초로, 서열번호 100; 101; 102; 103; 108; 109; 110; 111; 116; 117; 118; 119의 올리고뉴클레오티드를 제작하였다. 게놈 DNA는 제한효소 엔도뉴클레이즈로 절단하고 다시 연결하여, 보다 작은 DNA 단편이 환화되게 하였다. 상기 재연결 혼합물을 iPCR의 주형으로 사용하였고, 프라이머 서열번호 100; 102; 108; 110; 116; 118를 사용하였다. 프라이머 서열번호 101; 103; 109; 111; 117; 119를 이용한 추가적인 네스티드 PCR을 통해, PCR 신호를 증대시켰다. 수득되는 특이적인 단편을 1% 아가로스 겔에서 분리하여 pCR2.1(Invitrogen) 벡터에 연결하였다.
상기 단편을 포함하고 있는 pCR2.1 벡터의 염기서열 분석으로, 알코올 탈수소화효소/환원효소의 3'-와 5'-코딩 부위에 대해 몰랐던 서열 정보를 입수하였다.
Figure 112013076361359-pat00002
전장 유전자(서열번호 12; 13; 14)를 코딩하는 서열을 기초로, 상기 DNA를 적절한 발현 시스템으로 클로닝하기 위한 특이적인 프라이머를 제작하였다. 즉, 5'-프라이머는 NdeI, SphI 또는 BamHI 인지서열을 포함하도록 변형하였고, 3'-프라이머는 HindIII 인지서열을 포함하도록 변형하였다(서열번호 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126;127).
게놈 DNA로부터 단백질을 코딩하는 전장 DNA의 증폭과, 이후의 제한 효소 처리 및 발현 벡터에 연결은 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다. 발현 균주 BL21 Star(Invitrogen) 또는 RB791(E.coli gentic stock, Yale, USA)에 제조한 발현 구조체를 각각 형질전환시켰다.
5a: 미생물 마이크로박테리움 sp .유래의 거울상이성질체 선택적인 알코올 탈수소화효소/환원효소의 클로닝
마이크로박테리움 sp. 유래의 산화환원효소를 클로닝하기 위하여, Manniatis 및 Sambrook의 "분자 클로닝"에 기술된 방법에 따라 신선한 마이크로박테리움 sp. 세포로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 수득되는 핵산을 PCR 주형으로 제공하였고, 각 염기서열 106; 107의 올리고뉴클레오티드 30 pMol을 이용하여 PCR하였다. PCR Cycler(BioRad, Hercules, USA)에서 10분간 Bio Therm Star 중합효소를 활성화시킨 다음, 하기 30회의 온도 사이클을 프로그래밍하여, 특이적인 DNA 단편을 동정하였다:
94℃ 50 초
60 ℃ 1 분
72 ℃ 1 분
전체 반응 배치를 1% 아가로스 겔에 전개시킨 후, 약 1,000 bp의 특이적인 단편을 검출하였다. 상기 단편을 추출하여 pCR2.1 TA-벡터(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 연결하였다. 제조된 pCR2.1-Ms1000 플라스미드의 염기서열을 분석하였다.
1,002 bp의 유전자 단편을 서열 분석한 결과, 이는 아미노 말단과 내부 펩티드의 2개의 서열 단편을 확인할 수 있는, 334개의 아미노산으로 이루어진 ORF였다.
1,002 bp 단편의 뉴클레오티드 서열을 기초로, 역 PCR(iPCR)을 위한 올리고뉴클레오티드(서열번호 108; 109; 110; 111)를 제작하였다.
마이크로박테리움 sp.로부터 분리된 게놈 DNA(2.5 ㎍)을 50 ㎕ 배치중에서 20U의 SacI 제한효소로 25분간 처리하였다. 전체 배치를 페놀: 클로로포름: 이소아말알코올(25: 24: 1)로 추출한 다음, 1/10 부피배의 3M 소듐-아세테이트(pH 5.2) 및 2.5 부피배의 에탄올로 침전시킨 다음, 잘려진 DNA를 25 ㎕의 수중으로 이동시켰다. 그 중 5 ㎕(200 ng)은 총 부피 40 ㎕의 2U의 T4 리가아제(Fermentas)를 사용하는 재연결 반응에 사용하였다. 재연결시킨 게놈 DNA(2 ㎕=20 ng)을 iPCR하였다(67 mM Tris-HCl(pH 8.3), 16 mM(NH4)2SO4, 115 mM MgCl2, 0.01% Tween 20, 0.2 mM 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 혼합물(dNTPs), 30pMol의 각 프라이머(서열번호 108; 110) 및 2.5U의 Bio Therm Star 중합효소(Genecraft, Luingshausen, Germany)). 증폭은 하기 사이클에 따라 수행하였다:
사이클 1 95 ℃, 10 분
사이클 2 x 30 95 ℃, 1 분
56℃, 1 분
72℃, 2 분
서열번호 109와 111의 올리고뉴클레오티드를 이용한 네스티드 PCR로 증폭 신호를 증대시켰다.
이어, 증폭 반응물을 4 ℃로 냉각시키고, 전체를 1% 아가로스 겔에 적용하였다. 그 결과, 약 1,000 bp의 특이적인 단편이 확인되었다. 겔에서 추출한 다음 이를 pCR2.1벡터(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)에 연결시켰다.
단편을 포함하는 플라스미드의 서열분석으로, 5'-과 3'-측면 서열에 대한 정보를 얻을 수 있었다. 따라서, 단백질을 코딩하는 DNA는 종결 코돈(서열번호 13)까지 총 1,044 bp이며, 347개의 아미노산(서열번호 5)으로 이루어진 ORF이다.
마이크로박테리움 sp.의 게놈 DNA를 단백질을 코딩하는 전장 DNA 제조를 위한 주형으로, GC-Rich PCR 시스템(Roche, Mannheim, Germany), 30 pMol의 서열번호 123 또는 124의 올리고뉴클레오티드 각각 및 30 pMol의 서열번호 125 올리고뉴클레오티드를 이용한 PCR 반응에 사용하였고, 온도 사이클은 하기와 같다:
사이클 1 95 ℃, 3 분
사이클 2 x 30 95 ℃, 30 초
59℃, 30 초
72℃, 45 초.
1% 아가로스 겔로 정제한 다음, 수득되는 PCR 산물은 NdeI 및 HindIII, 또는 ShpI 및 HindIII로 각각 처리하고, 벡본을 동일한 엔도뉴클레이즈로 처리한 pET21a(Novagen, Madison, USA) 또는 pQE32(Qiagen, Hilden, Germany)에 각각 연결하였다. 연결 배치 2 ㎕을 E.coli Top10F' 세포에 형질전환시킨 다음, 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA에서 벡터 연결이 올바르게 되었는지를 체크하고, 엔도뉴클레이즈 NdeI 또는 SphI 및 HindIII 각각으로 제한 효소 분석을 수행하였다. 삽입체에 대해 양성을 보인 벡터의 DNA는 발현 균주인 BL21 Star(Invitrogen) 및 RB791(E.coli genetic Stock, Yale, USA)에 각각 형질전환하였다.
실시예 6: E. coli 에서의 재조합 알코올 탈수화효소 /환원효소의 발현
발현 구조체로 형질전환된 E. coli 균주 BL21 Star(Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 및 RB791(E.coli genetic Stock, Yale, USA) 각각을, 암피실린(50 ㎍/ml)과 카베리실린(50 ㎍/ml)이 첨가된 200 ml의 LB-배지(1% 트립톤, 0.5% 효소 추출물, 1% NaCl)에서, 550 nm에서의 흡광도가 0.5가 될 때까지 배양하였다. 재조합 단백질의 발현은, 이소프로필 티오갈락토사이드(IPTG)를 0.1 mM로 첨가하여 유도시켰다. 25 ℃ 및 220rpm의 조건에서 8시간 또는 16시간 배양한 다음, 세포를 회수하여 -20 ℃에서 냉동시켰다. 활성 측정을 위하여, 세포 10 mg을 500 ㎕의 100 mM TEA 완충액 pH7.0과 500 ㎕의 유리 비드와 혼합한 다음, 글로브 밀을 이용하여 10분간 분해시켰다. 수득되는 용혈물은 희석된 상태로 각 측정에 사용하였다. 활성 측정은 하기와 같이 구성된다: 870 ㎕의 100 mM TEA 완충액 pH7.0, 160㎍의 NAD(P)H, 10 ㎕의 희석된 세포 용혈물. 반응은 상기 반응 혼합물에 100 ㎕의 100 mM 기질을 첨가하여 개시하였다.
Figure 112013076361359-pat00003
실시예 7: 재조합 산화환원효소의 특성 파악
7a: pH -최적화
표 4에 나열된 완충액을 제조하였다. 각 경우에서 각 완충액의 농도는 50 mM로 맞추었다.
pH-값 완충액 시스템 pH-값 완충액 시스템
4 Na-아세테이트/아세트산 7.5 KH2PO4/K2PO4
4.5 Na-아세테이트/아세트산 8 KH2PO4/K2PO4
5 Na-아세테이트/아세트산 8.5 KH2PO4/K2PO4
5.5 KH2PO4/K2PO4 9 글리신/NaOH
6 KH2PO4/K2PO4 9.5 글리신/NaOH
6.5 KH2PO4/K2PO4 10 글리신/NaOH
7 KH2PO4/K2PO4 11 글리신/NaOH
배치(30 ℃)-pH 최적 환원을 측정하고:
870 ㎕ 표 4에 언급된 각 완충액 시스템
20 ㎕ NAD(P)H 10 mM
10 ㎕ 효소 희석물
인큐베이션은 약 2-3분 수행한 다음,
100 ㎕의 기질 용액(100 mM)을 첨가하였다.
산화환원효소에 따라, 2-부탄온 또는 2-옥탄온을 기질로 사용하였다. 반응은 340 nm에서 1분간 수행되었다. 최적 pH를 결정하기 위하여, 표 4에 나열된 각 완충액에서의 효소 반응을 분석하였다. 산화 반응의 최적 pH를 결정하기 위해, NAD(P)를 보조 인자로 사용하고, 2-프로판올 또는 2-옥타놀을 기질로 사용하였다.
본 발명의 산화환원효소에 대한 결과는 표 5에 나타낸다.
DSMZ 번호 미생물 환원 반응의 최적 pH 산화 반응의 최적 pH
70825 로도토룰라 뮤실라지노사 7 - 8 8.0 - 9.5
3316 피키아 파리노사 5 - 6 7 - 11
70647 칸디다 네모덴드라 6 10 - 11
3651 피키아 스티피디스 5.5 - 6.5 6.5 - 7.5
70391 피키아 트레할로필리아 7 - 7.5 7 - 8
5576 루코노스톡 카르노섬 5.0 - 6 6.5 - 9.5
20028 마이크로박테리움 spec 6.5 - 7.5 7.5 - 8.5
43570 고르도니아 루브리페르틴크타 5 7.5 - 9.5
7b: pH 안정성
재조합 산화환원효소의 활성은, 표 4의 완충액 시스템에 저장하여, 결정하였다. 이를 위해, pH 4 내지 11의 다양한 완충액(50 mM)을 제조하고, 실시예 4에 따라 제조한 산화환원효소를 상기 완충액으로 희석하였다. 30, 60, 120분간 인큐베이션한 다음, 각 배치에서 10 ㎕를 취하여 실시예 1에 따라 활성도를 측정하였다.
초기 값은, 포타슘 포스페이트 완충액 50 mM(pH 7.0)에 효소를 희석(1:20)한 즉시 측정한 값이다. 주어진 조건하에서, 상기 값은 약 0.70/분의 소멸 변화를 보였으며, 이를 100%로 설정하였고, 이후 모든 측정값은 이 수치를 기준으로 정하였다.
표 6은, 120분 동안의 인큐베이션에서 본 발명의 산화환원효소의 활성이 초기 활성의 50% 이상을 보이는 pH 범위를 나타낸다.
DSMZ 번호 미생물 pH-범위 안정성
70825 로도토룰라 뮤실라지노사 5.5 - 9.5
3316 피키아 파리노사 5.5 - 10.0
70647 칸디다 네모덴드라 6.5 - 9.5
3651 피키아 스티피디스 6.0 - 7.0
70391 피키아 트레할로필리아 6.0 - 8.0
5576 루코노스톡 카르노섬 4.5 - 9.5
20028 마이크로박테리움 spec. 5.0 - 9.5
43570 고르도니아 루브리페르틴크타 4.5 - 10
7c: 최적 온도
최적 온도를 결정하기 위해, 본 발명의 산화환원효소의 효소 활성도를 15 ℃ 내지 70 ℃의 범위에서 표준 측정 배치로 측정하였다.
결정된 최적 온도는 표 7에 나타내었다.
DSMZ 번호 미생물 적정온도
70825 로도토룰라 뮤실라지노사 50 ℃
3316 피키아 파리노사 40 ℃
70647 칸디다 네모덴드라 65 ℃
3651 피키아 스티피디스 40 ℃
70391 피키아 트레할로필리아 n.b.
5576 루코노스톡 카르노섬 60 ℃
20028 마이크로박테리움 spec 60 ℃
43570 고르도니아 루브리페르틴크타 45 - 55 ℃
7d: 온도 안정성
15 ℃ 내지 70 ℃에서의 온도 안정성을, 상기 실시예 5c와 유사한 방식으로 측정하였다. 이를 위해, 본 발명에 따른 산화환원효소의 희석물을 각 경우에서 각 해당 온도로 60분 및 180분간 인큐베이션한 다음, 상기 테스트 배치로 30 ℃에서 측정하였다. 표 8에, 120분 동안의 인큐베이션시 본 발명의 산화환원효소의 활성이 초기 활성의 50% 이상을 보이는 온도 범위를 나타내었다.
DSMZ 번호 미생물 온도 안정성
70825 로도토룰라 뮤실라지노사 15 - 35 ℃
3316 피키아 파리노사 15 - 25 ℃
70647 칸디다 네모덴드라 15 - 35 ℃
3651 피키아 스티피디스 15 - 35 ℃
70391 피키아 트레할로필리아 15 - 35 ℃
5576 루코노스톡 카르노섬 15 - 35 ℃
20028 마이크로박테리움 spec 15 - 60 ℃
43570 고르도니아 루브리페르틴크타 15 - 55 ℃
7e: 기질 스펙트럼
본 발명에 따른 산화환원효소의 기질 스펙트럼을, 다수의 케톤류 및 알코올류를 이용한 산화 및 환원 반응에서의 효소 활성을 측정함으로써, 결정하였다. 이를 위해, 실시예 1의 표준 측정 배치를 여러가지 기질과 함께 사용하였다.
메틸 아세토아세테이트를 이용한 경우의 활성을 모든 효소에서 100%으로 결정하였고, 다른 기질은 상기를 기준으로 정하였다.
환원 반응의 기질 스펙트럼
기질 로도토룰라 뮤시실라지노사
서열번호1		 피키아 파리노사
서열번호2		 피키아 스티피디스
서열번호3		 루코노스톡 카르노섬
서열번호4		 마이크로박테리움 spec
서열번호5		 고르도니아 루브리페르틴크타
서열번호6
1-페닐-2-
프로판온		 66% 10% 30% 13% 80% 82%
펜아실 클로라이드 36% 130% 9% 37% < 2% 7%
아세토페논 12% 195% 32% 28% 52% 23%
아세토-나프톤 n.b. 25% 84% n.b. 125% 68%
부티로-페논 0% 0% 0% 0% 0% 0%
2-옥탄온 71% 20% 27% 28% 227% 75%
3-옥탄온 29% 10% 40% 18% 47% 52%
2-부탄온 190% 65% 49% 36% 4% 14%
에틸-2-옥소발레리에이트 4% 85% 60% 25% < 2% 23%
에틸-2-옥소-4-페닐 부티르산 4% 35% 16% 10% < 2% 18%
에틸 피루베이트 60% 560% 148% 122% 480% 160%
에틸 페닐-글리옥실레이트 8% 35% 3% 4% < 2% 11%
에틸-4-클로로아세토아세테이트 79% 70% 100% 80% 110% 110%
메틸 아세토아세테이트 100% 100% 100% 100% 100% 100%
에틸-3-옥소발레리에이트 60% 45% 73% 30% < 2% 56%
아세톤 82% 55% 100% 28% < 2% 7%
산화 반응의 기질 스펙트럼
기질 로도토룰라 뮤실라지노사
서열번호 1 		피키아 파리노사
서열번호 2		 피키아 스티피디스
서열번호 3		 루코노스톡 카르노섬
서열번호 4		 마이크로박테리움 spec
서열번호 5		 고르도니아 루브리페르틴크타
서열번호 6
S-2-옥탄올 100% 0% 100% 0% 100% 100%
R-2-옥탄올 0% 100% 0% 100% 0% 0%
S-2-부탄올 266% 100% 237% 56% 5% 45%
R-2-부탄올 60% 340% 74% 178% 0% 17%
S-페닐-2-프로판올 200% 0% 26% 0% 10% 0%
R-페닐-2-프로판올l 0% 0% 0% 6% 0% 0%
에틸-(S)-4-클로로-3-하이드록시부틸레이트
0%
0%
0%
0%
0%
0%
에틸-(R)-4-클로로-3-하이드록시부틸레이트
0%
0%
0%
0%
10%
0%
2-프로판올 180% 180% 218% 67% < 1% 27%
사이클로헥산올 26% 120% 0% n.b. n.b. 7%
7f: 수상/유기상 2상 시스템에서의 안정성
수상/유기상 2상 시스템에서의 신규한 산화환원효소의 안정성은, 실시예 6에서 수득한(재조합 발현으로 수득한) 세포 용혈물을 각 산화환원효소에 적합한 수성 완충액(약 10 unit/ml 완충액)에 희석함으로써, 조사하였다. 이후, 물에 혼화되지 않는 유기 용매를 동일 부피비로 상기 완충액에 희석시킨 산화환원효소에 첨가하고, 이 배치는 실온에서 연속 혼합하면서(써모믹서, 170rpm) 인큐베이션하였다. 24시간 인큐베이션한 다음 각 10 ㎕을 수상에서 취하여 표준 테스트 배치(포타슘 포스페이트 완충액(KPP) 100 mM, pH=7.0, 0.2 mM NAD(p)H, 10 mM 기질)에서의 효소 활성 결정에 사용하였다. 또한, 완충액에 희석물을 첨가한 즉시 측정한 초기 값을 100%로 설정하고, 이후의 모든 수치는 이를 기준으로 정하였다.
수상/유기상 2상 시스템에서 24시간 인큐베이션한 이후의 효소 활성
시스템 완충액 부틸아세테이트 디에틸 에테르 MTBE 다이이소프로필 에테르 헵탄 사이클로헥산
로도토룰라 뮤실라지노사
서열번호 1		 100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100%
피키아 파리노사
서열번호 2		 100% 40-60% 60-80% 80-100% 40-60% 40-60% 40-60%
칸디다 네모덴드라
서열번호 8		 100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100%
피키아 스티피디스
서열번호 3		 100% 40-60% n.b. 20-50% 60-80% 80-100% 40-60%
루코노스톡 카르노섬
서열번호 4		 100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100%
마이크로박테리움 spec
서열번호 5		 100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100%
고르도니아 루브리페르틴크타
서열번호 6 		100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100% 80-100%
MTBE = 메틸-tert-부틸 에테르
실시예 8: 예비 변환
8a: 로도토룰라 뮤실라지노사의 산화환원효소를 이용한 메틸 -(3S)-3- 하이드 록시펜타노에이트의 합성
예비 변환 실험으로, 완충액(100 mM TEA, pH=7, 1 mM ZnCl2, 10% 글리세린) 25 ml, 4-메틸-2-펜탄올 375 ml, 메틸-3-옥소펜타노에이트 100ml, NAD 100mg 및 37kU 로도토룰라 뮤실라지노사 DSMZ 70825 유래 재조합 산화환원효소의 혼합물을, 24시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용한 메틸-3-옥소펜타노에이트의 97%가 메틸-(3S)-3-하이드록시펜타노에이트로 환원되었다. 다음으로, 이 산물을 포함하는 4-메틸-2-펜탄올 상을 수상으로부터 분리, 여과 및 증류하여, 산물 메틸-(3S)-3-하이드록시펜타노에이트를 수득하였다.
이러한 방법으로, 메틸-(3S)-3-하이드록시펜타노에이트를 고수율로 수득하였으며, 이의 순도는 >99%이고 거울이성질체 과잉은 >99.5%이었다.
8b: 피키아 파리노사의 산화환원효소를 이용한 (2R)-1- 클로로프로판 -2-올의 합성
예비 변환 실험으로, 80ml의 완충액(100 mM TEA, pH=7, 1 mM MgCl2, 10% 글리세린), 15 ml의 2-프로판올, 5 ml의 클로로아세톤, 10 mg의 NAD 및 2kU의 피키아 파리노사 DSMZ 3316의 재조합 산화환원효소 혼합물을, 24시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용한 클로로아세톤은 모두 (2R)-1-클로로프로판-2-올로 환원되었다. 이후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 용매는 회전 증발기로 제거하여, 조산물을 수득하였다. 이러한 방법으로 제조된 (2R)-1-클로로프로판-2-올의 광학 순도는 >99%이었다.
8c: 피키아 스티피디스의 산화환원효소를 이용한 (R)-2- 클로로 -1-(3- 클로로 페닐)에탄-1-올의 합성
변환으로, 20 ml의 완충액(100 mM 인산칼륨, pH=8.5, 1 mM MgCl2, 10% 글리세린), 80 ml의 4-메틸-2-펜탄올 중의 20 g의 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온, 10 mg의 NAD 및 20,000U의 피키아 스티피디스 DSMZ 3651 유래 재조합 산화환원효소의 혼합물을, 24시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용한 2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-온의 99% 이상이 환원되었다. 이어, 산물을 포함하는 4-메틸-2-펜타놀 상을 수상으로부터 분리, 여과 및 증류하여, (R)-2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-올은 수득하였다.
이러한 방법으로, (R)-2-클로로-1-(3-클로로페닐)에탄-1-올을 고수율로 수득하였으며, 이의 순도는 >98%이고, 광학 순도는 >99.9%이었다.
8d: 루코노스톡 카르노섬의 산화환원효소를 이용한 에틸-(S)-4- 클로로 -3- 하 이드록시부티르산의 합성
변환 실험으로, 8 ml의 완충액(100 mM TEA, pH=7, 1 mM MgCl2), 24 ml의 이소프로판올, 8 ml의 에틸-4-클로로아세테이트, 2 mg의 NADP 및 6.7kU(= 6 ml)의 루코노스톡 카르노섬 DSMZ 5576 유래의 재조합 산화환원효소의 혼합물을, 24시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용한 에틸-4-클로로아세테이트의 99% 이상이 에틸-(S)-4-클로로-3-하이드록시부티르산으로 환원되었다. 반응 혼합물을 회전증발기를 이용하여 2-프로판올을 먼저 제거하여, 재처리하였다. 그 후, 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 용매를 회전증발기를 이용하여 제거하여, 조산물을 수득하였다. 이러한 방법으로 제조된 조산물, 에틸-(S)-4-클로로-3-하이드록시부티르산의 광학 순도는 >99.5%였다.
8e: 마이크로박테리움 spec 의 산화환원효소를 이용한 (1S)-1-[3,5-비스( 트리 플루오로메틸)페닐]에탄-1-올의 합성
변환으로, 1 ml의 완충액(100 mM TEA, pH=7, 10% 글리세린, 1 mM ZnCl2), 3 ml의 4-메틸-2-펜탄올, 1 ml의 1-[3,5-비스(트리플루오로-메틸)페닐]에탄-1-온, 2 mg의 NAD 및 0.7kU(= 6 ml)의 마이크로박테리움 spec DSMZ 20028 유래의 재조합 산화환원효소의 혼합물을, 24시간 동안 일정하게 혼합하면서 실온에서 인큐베이션하였다. 24시간 후, 사용한 1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-온의 90% 이상이 (1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-올로 환원되었다. 이어, 산물이 포함된 4-메틸-2-펜탄올 상을 수상에서 분리, 여과 및 증발시켜, 산물 (1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-올을 수득하였다. 이러한 방법으로 수득되는 조산물, (1S)-1-[3,5-비스(트리플루오로메틸)페닐]에탄-1-올의 광학 순도는 >99.5%이었다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (11)

  1. 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상이성질체 선택적인(enantioselective) 효소적 환원 방법으로서,
    상기 케토 화합물은 보조인자의 존재하에 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 코딩되는 산화환원효소를 이용하여 환원되는 것을 특징으로 하는 방법:
  2. 제 1항에 있어서, 상기 케토 화합물은 일반식 I로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:
    R1-C(O)-R2 (I)
    상기 일반식 I에서,
    R1은 하기 모이어티들 중 하나이고:
    1) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인, -(C1-C20)-알킬,
    2) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄인, -(C2-C20)-알케닐,
    3) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C2-C20)-알키닐,
    4) -(C6-C14)-아릴,
    5) -(C1-C8)-알킬-(C6-C14)-아릴,
    6) 비치환되거나 -OH, 할로겐, -NO2 및 -NH2로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 1회, 2회, 또는 3회 치환된, -(C5-C14)-헤테로사이클, 또는
    7) -(C3-C7)-사이클로알킬이며,
    상기 1) 내지 7)의 모이어티는 독립적으로 각각 -OH, 할로겐, -NO2 및 -NH2로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 1, 2 또는 3번 치환되거나, 또는 비치환되며;
    R2는 하기 모이어티들 중 하나이다:
    8) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄인 -(C1-C6)-알킬,
    9) 알케닐이 직쇄 또는 분지쇄인, -(C2-C6)-알케닐,
    10) 알키닐이 직쇄 또는 분지쇄인, -(C2 -C6)-알키닐, 또는
    11) 알킬이 직쇄 또는 분지쇄이고, -OH, 할로겐, -NO2 및 -NH2로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 1, 2 또는 3번 치환되거나 비치환된, -(C1 -C10)-알킬-C(O)-O-(C1-C6)-알킬이며,
    상기 8) 내지 11)에서 언급된 모이어티는 각각 서로 독립적으로 -OH, 할로겐, -NO2 및 -NH2로 구성된 그룹에서 선택된 치환기로 1, 2 또는 3번 치환되거나 비치환된다.
  3. 제 2항에 있어서, R1은 -(C2-C20)-알케닐이며, 여기서 상기 알케닐은 최대 4개의 이중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, R1은 -(C2-C20)-알키닐이며, 상기 알키닐은 최대 4개의 삼중결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2항에 있어서, R2는 -(C2-C6)-알케닐이며, 여기서 상기 알케닐은 최대 3개의 이중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서, R2는 -(C2-C6)-알키닐이며, 상기 알키닐은 2개의 삼중 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 서열번호 2에 따른 산화환원 효소를 코딩하는 하나 또는 수개의 핵산 서열을 포함하는 클로닝 벡터.
  8. 발현 조절 서열에 연결된 서열번호 2에 따른 산화환원 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 박테리아, 곤충, 식물 또는 포유류 세포에 위치된 발현 벡터.
  9. 제 8항에 따른 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된, 박테리아, 곤충, 식물 또는 포유류 세포인 재조합 숙주 세포.
  10. 제 1항 또는 제 6항 중 어느 한 항에 따른 방법에 이용하기 위한 산화환원효소로서, 상기 산화환원효소는 서열번호 10의 핵산 서열에 의해 코딩되는 것인, 산화환원효소.
  11. 케토 화합물의 해당 키랄 하이드록시 화합물로의 거울상이성질체 선택적인 효소적 환원 방법으로서, 상기 케토 화합물은 보조인자의 존재하에 산화환원효소를 이용하여 환원되며, 상기 산화환원효소는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020137022212A 2005-07-27 2006-07-20 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한 산화환원효소 KR101354546B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0126105A AT502395B1 (de) 2005-07-27 2005-07-27 Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen
ATA1261/2005 2005-07-27
PCT/EP2006/007150 WO2007012428A1 (de) 2005-07-27 2006-07-20 Oxidoreduktasen zur stereoselektiven reduktion von ketoverbindungen

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087004580A Division KR101341392B1 (ko) 2005-07-27 2008-02-26 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한산화환원효소

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130110223A KR20130110223A (ko) 2013-10-08
KR101354546B1 true KR101354546B1 (ko) 2014-01-22

Family

ID=37216025

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020137022212A KR101354546B1 (ko) 2005-07-27 2006-07-20 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한 산화환원효소
KR1020087004580A KR101341392B1 (ko) 2005-07-27 2008-02-26 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한산화환원효소

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087004580A KR101341392B1 (ko) 2005-07-27 2008-02-26 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한산화환원효소

Country Status (16)

Country Link
US (2) US20090311762A1 (ko)
EP (5) EP1907556A1 (ko)
JP (1) JP2009502148A (ko)
KR (2) KR101354546B1 (ko)
CN (1) CN101273137A (ko)
AT (1) AT502395B1 (ko)
AU (1) AU2006274252B2 (ko)
CA (5) CA2869218C (ko)
DK (3) DK2428576T3 (ko)
ES (3) ES2524167T3 (ko)
HU (1) HUE024985T2 (ko)
PL (3) PL2428574T3 (ko)
PT (3) PT2428576E (ko)
SI (3) SI2426209T1 (ko)
WO (1) WO2007012428A1 (ko)
ZA (1) ZA200800732B (ko)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT501928B1 (de) 2004-10-27 2010-09-15 Iep Gmbh Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen
EP2066788B1 (en) 2006-10-02 2014-07-23 Codexis, Inc. Compositions and methods for producing stereoisomerically pure statins and synthetic intermediates therefor
CN101627116B (zh) * 2007-02-08 2013-07-10 科德克希思公司 酮还原酶及其用途
US7977078B2 (en) 2007-08-24 2011-07-12 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of (R)-3-hydroxythiolane
JP5973131B2 (ja) 2007-09-13 2016-08-23 コデクシス， インコーポレイテッド アセトフェノンの還元のためのケトレダクターゼポリペプチド
TWI601825B (zh) * 2007-09-27 2017-10-11 Ｉｅｐ有限公司 對映異構選擇性酶催化還原中間產物之方法
WO2009042984A1 (en) 2007-09-28 2009-04-02 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides and uses thereof
SI2205727T1 (sl) 2007-10-01 2015-09-30 Codexis, Inc. Polipeptidi ketoreduktaze za izdelavo azetidinona
US8426178B2 (en) 2008-08-27 2013-04-23 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of a 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
WO2010025287A2 (en) 2008-08-27 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the production of 3-aryl-3-hydroxypropanamine from a 3-aryl-3-ketopropanamine
WO2010025085A2 (en) 2008-08-29 2010-03-04 Codexis, Inc. Ketoreductase polypeptides for the stereoselective production of (4s)-3[(5s)-5(4-fluorophenyl)-5-hydroxypentanoyl]-4-phenyl-1,3-oxazolidin-2-one
EP2226386A1 (de) 2009-03-05 2010-09-08 IEP GmbH Verfahren zur stereoselektiven enzymatischen Reduktion von Ketoverbindungen
RU2508290C2 (ru) 2009-06-22 2014-02-27 ЭсКей БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ КО., ЛТД. Способ получения (r)-1-арил-2-тетразолилэтилового эфира карбаминовой кислоты
SG10201405022PA (en) 2009-08-19 2014-10-30 Codexis Inc Ketoreductase polypeptides for the preparation of phenylephrine
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
US20120285816A1 (en) * 2009-11-24 2012-11-15 Basf Se Method for isolating an alkanol from an aqueous biotransformation mixture
US9040262B2 (en) 2010-05-04 2015-05-26 Codexis, Inc. Biocatalysts for ezetimibe synthesis
EP2861750B1 (en) 2012-06-18 2016-11-23 Laboratorio Chimico Internazionale S.p.A. Process for producing chiral 1-substituted 3-piperidinols employing oxidoreductases
WO2014086702A2 (de) * 2012-12-03 2014-06-12 Basf Se Enzymatische reduktion von hydroxymethylfurfuralen
DE102013104418B4 (de) 2013-04-30 2018-09-27 Cambrex Iep Gmbh Biokatalytisches Verfahren für die Herstellung von (R)-3-Chinuclidinol
EP3185888B1 (en) * 2014-08-25 2023-06-07 Celularity Inc. Extracellular matrix compositions
CN108441433B (zh) * 2018-03-31 2021-08-20 湖南科技大学 胶红酵母nq1及在制备手性醇中的应用
CN108753851B (zh) * 2018-05-28 2022-05-20 中国科学院成都生物研究所 羰基还原酶生物催化生产手性1,2-二醇类化合物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1179595A1 (en) 2000-02-16 2002-02-13 Daicel Chemical Industries, Ltd. (r)-2-octanol dehydrogenase, process for producing the enzyme, dna encoding the enzyme and process for producing alcohol by using the same

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH03127998A (ja) 1989-10-13 1991-05-31 Taunzu:Kk 尿素の定量法
DE4014573C1 (ko) * 1990-05-07 1991-10-10 Forschungszentrum Juelich Gmbh, 5170 Juelich, De
US5200355A (en) 1990-12-10 1993-04-06 Samsung Electronics Co., Ltd. Method for manufacturing a mask read only memory device
US5385833A (en) 1992-02-26 1995-01-31 The Scripps Research Institute Pseudomonas sp. ATCC No. 49794 alcohol dehydrogenase
WO1993018138A1 (de) 1992-03-13 1993-09-16 Forschungszentrum Jülich GmbH Neue ketoester-reduktase, deren herstellung und verwendung für enzymatische redoxreaktionen
JP3574682B2 (ja) * 1993-09-24 2004-10-06 ダイセル化学工業株式会社 新規な酵素、該酵素を製造する方法、該酵素をコードするｄｎａ、該ｄｎａを含む形質転換体、該酵素による光学活性アルコール等の製造方法
US5523233A (en) * 1995-05-03 1996-06-04 Merck & Co., Inc. Enzymatic hydrolysis of 3,3-diethyl-4-[(4-carboxy)phenoxy]-2-azetidinone esters
DE19610984A1 (de) * 1996-03-21 1997-09-25 Boehringer Mannheim Gmbh Alkohol-Dehydrogenase und deren Verwendung zur enzymatischen Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen
JP4753273B2 (ja) * 1999-07-21 2011-08-24 株式会社カネカ 光学活性ピリジンエタノール誘導体の製造方法
DE10037101A1 (de) * 2000-07-27 2002-02-07 Degussa Rekombinant hergestellte Enzyme mit verbesserter NAD(H)-Akzeptanz
DE10119274A1 (de) 2001-04-20 2002-10-31 Juelich Enzyme Products Gmbh Enzymatisches Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen
EP1485471B1 (en) * 2002-03-18 2007-08-29 BioCatalytics Inc. Alcohol dehydrogenases with high solvent and temperature stability
DE10218689A1 (de) * 2002-04-26 2003-11-20 Degussa ADH aus Rhodococcus erythropolis
DE10300335B4 (de) 2003-01-09 2008-06-26 Iep Gmbh Oxidoreduktase
US20050037946A1 (en) * 2003-01-13 2005-02-17 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating cardiovascular disease using 1722, 10280, 59917, 85553, 10653, 9235, 21668, 17794, 2210, 6169, 10102, 21061, 17662, 1468, 12282, 6350, 9035, 1820, 23652, 7301, 8925, 8701, 3533, 9462, 9123, 12788, 17729, 65552, 1261, 21476, 33770, 9380, 2569654, 33556, 53656, 44143, 32612, 10671, 261, 44570, 41922, 2552, 2417, 19319, 43969, 8921, 8993, 955, 32345, 966, 1920, 17318, 1510, 14180, 26005, 554, 16408, 42028, 112091, 13886, 13942, 1673, 54946 or 2419
DE10327454A1 (de) * 2003-06-18 2005-01-20 Juelich Enzyme Products Gmbh Oxidoreduktase aus Pichia capsulata
JP2007502111A (ja) * 2003-08-11 2007-02-08 コデクシス， インコーポレイテッド ４−置換３−ヒドロキシ酪酸誘導体およびビシナルなシアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルの生成のための酵素的プロセス
WO2005017135A1 (en) * 2003-08-11 2005-02-24 Codexis, Inc. Improved ketoreductase polypeptides and related polynucleotides
JP2005095022A (ja) * 2003-09-22 2005-04-14 Daicel Chem Ind Ltd 光学活性アルコールの製造方法
EP1731618A1 (en) 2005-06-07 2006-12-13 Prodotti Chimici E Alimentari Spa Process for the selective oxydation of colic acid
AT503486B1 (de) * 2006-04-11 2008-05-15 Iep Gmbh Verfahren zur enantioselektiven reduktion von steroiden

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1179595A1 (en) 2000-02-16 2002-02-13 Daicel Chemical Industries, Ltd. (r)-2-octanol dehydrogenase, process for producing the enzyme, dna encoding the enzyme and process for producing alcohol by using the same

Also Published As

Publication number Publication date
HUE024985T2 (hu) 2016-02-29
CA2821719C (en) 2017-06-27
ES2524167T3 (es) 2014-12-04
ES2525549T3 (es) 2014-12-26
CA2821717C (en) 2017-06-27
KR101341392B1 (ko) 2013-12-20
CA2625834A1 (en) 2007-02-01
JP2009502148A (ja) 2009-01-29
EP2426209A1 (de) 2012-03-07
PT2426209E (pt) 2014-12-16
CA2821717A1 (en) 2007-02-01
DK2428576T3 (en) 2015-03-09
EP2428574B1 (de) 2014-09-24
CA2869218A1 (en) 2007-02-01
US9040265B2 (en) 2015-05-26
EP1907556A1 (de) 2008-04-09
AU2006274252B2 (en) 2012-12-13
EP2428575A1 (de) 2012-03-14
WO2007012428A1 (de) 2007-02-01
PL2428576T3 (pl) 2015-07-31
ZA200800732B (en) 2009-05-27
CA2821719A1 (en) 2007-02-01
PT2428576E (pt) 2015-04-30
ES2534657T3 (es) 2015-04-27
AU2006274252A1 (en) 2007-02-01
AT502395B1 (de) 2007-03-15
KR20130110223A (ko) 2013-10-08
CN101273137A (zh) 2008-09-24
SI2428574T1 (sl) 2014-12-31
DK2428574T3 (da) 2014-10-27
AT502395A4 (de) 2007-03-15
KR20080036617A (ko) 2008-04-28
US20140017743A1 (en) 2014-01-16
PT2428574E (pt) 2014-11-26
US20090311762A1 (en) 2009-12-17
DK2426209T3 (da) 2014-11-10
SI2428576T1 (sl) 2015-04-30
SI2426209T1 (sl) 2015-02-27
PL2426209T3 (pl) 2015-04-30
CA2821720C (en) 2015-11-24
EP2428576A1 (de) 2012-03-14
EP2426209B1 (de) 2014-10-15
CA2821720A1 (en) 2007-02-01
CA2869218C (en) 2017-06-27
PL2428574T3 (pl) 2015-03-31
EP2428574A1 (de) 2012-03-14
EP2428576B1 (de) 2015-01-14
CA2625834C (en) 2013-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101354546B1 (ko) 케토 화합물의 입체구조 선택적인 환원을 위한 산화환원효소
US7575909B2 (en) Oxidoreductase from pichia capsulata
JP2007523617A6 (ja) ピキア・カプスラータ由来酸化還元酵素
EP1437401B1 (de) Oxidoreduktase
KR101780510B1 (ko) 케토 화합물의 입체선택적 효소적 환원 방법
EP1685248A2 (de) Oxidoreduktase aus metschnikowia zobellii

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170105

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180104

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200103

Year of fee payment: 7