ES2524167T3

ES2524167T3 - Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos

Info

Publication number: ES2524167T3
Application number: ES11189703.9T
Authority: ES
Inventors: Antje Tschentscher; Antje Gupta; Maria Dupont
Original assignee: Cambrex IEP GmbH
Current assignee: Cambrex IEP GmbH
Priority date: 2005-07-27
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2014-12-04
Anticipated expiration: 2026-07-20
Also published as: HUE024985T2; CA2821719C; ES2525549T3; CA2821717C; KR101341392B1; CA2625834A1; JP2009502148A; EP2426209A1; PT2426209E; CA2821717A1; DK2428576T3; EP2428574B1; CA2869218A1; US9040265B2; KR101354546B1; EP1907556A1; AU2006274252B2; EP2428575A1; WO2007012428A1; PL2428576T3

Abstract

Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un cofactor con una oxidorreductasa, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que se selecciona del grupo que está constituido por las oxidorreductasas para las que (a) codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º: 12, o (b) codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.

Description

Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos

La presente invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce con una oxidorreductasa. La invención se refiere además a nuevas oxidorreductasas para su uso en la reducción enantioselectiva de compuestos cetónicos para dar compuestos de hidroxilo quirales.

Los compuestos de hidroxilo ópticamente activos son módulos quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente activos, sustancias aromáticas, feromonas, compuestos agroquímicos e inhibidores de enzimas. A este respecto se registra en particular en el sector farmacéutico una necesidad creciente de compuestos quirales y por consiguiente tecnologías de síntesis quirales, dado que en el futuro ya apenas se usarán como fármacos los compuestos racémicos.

La reducción asimétrica de compuestos cetónicos proquirales es un sector de la catálisis estereoselectiva, en el que la biocatálisis representa una tecnología de competencia eficiente con respecto a la catálisis química. La hidrogenación asimétrica química requiere el uso de catalizadores de metales pesados con alto grado de toxicidad y contaminantes, de condiciones de reacción extremas y por consiguiente que requieren mucha energía así como grandes cantidades de disolventes orgánicos. Además, estos procedimientos están caracterizados con frecuencia por reacciones secundarias y excesos enantioméricos insuficientes.

Las reducciones de compuestos cetónicos proquirales para dar compuestos de hidroxilo y a la inversa se producen en la naturaleza en numerosas rutas bioquímicas, tanto en el metabolismo primario como en el metabolismo secundario, en cualquier organismo y se catalizan por distintos tipos de alcoholdeshidrogenasas secundarias y oxidorreductasas. Por regla general, estas enzimas dependen de cofactores.

La factibilidad principal del uso de biocatalizadores para la reducción de compuestos cetónicos proquirales para dar compuestos de hidroxilo quirales se demostró en el pasado de manera repetida por medio de sistemas de modelo, trabajándose tanto con oxidorreductasas aisladas como con distintos sistemas de biotransformación de células completas. A este respecto resultó ventajoso el planteamiento biocatalítico esencialmente con respecto a las condiciones de reacción suaves, productos secundarios ausentes y excesos enantioméricos obtenibles con frecuencia esencialmente mejores. El uso de enzimas aisladas es ventajoso en comparación con procedimientos con células completas con respecto al exceso enantiomérico obtenible, la producción de productos de degradación y secundarios como también con respecto al aislamiento del producto. Además no es posible el uso de procesos de células completas en cualquier empresa química, dado que para ello son necesarios un equipamiento especial y conocimientos técnicos.

Recientemente pudo mostrarse que el uso de oxidorreductasas aisladas en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos con disolventes orgánicos es posible de manera sumamente eficaz, económica y también en altas concentraciones (> 5%). En los sistemas descritos, a este respecto el compuesto cetónico que va a reducirse, en la mayoría de los casos poco soluble en agua forma junto con el disolvente orgánico la fase orgánica. Parcialmente puede prescindirse también del propio disolvente orgánico, entonces la fase orgánica se forma por el compuesto cetónico que va a reducirse (documentos DE 10119274, DE 10327454.4, DE 103 37 401.9, DE 103 00 335.5). La regeneración de coenzimas se realiza a este respecto mediante la oxidación simultánea de alcoholes secundarios, usándose en la mayoría de los casos el 2-propanol miscible con agua, económico.

Son ejemplos de oxidorreductasas y deshidrogenasas R-y S-específicas adecuadas de alta enantioselectividad:

carbonilrreductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236, (Enzyme Microb Technol. 1993 Nov;15(11):950-8) ) y Pichia capsulata (documento DE10327454.4). Carbonilrreductasa de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223), Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63

(10) (1999), páginas 1721-1729), (Appl Microbiol Biotechnol. Sep de 2003; 62(4):380-6. Epub 26 de abril de 2003), y Rhodococcus ruber (J Org Chem. 24 de enero de 2003; 68(2):402-6.).

Alcoholdeshidrogenasas secundarias R-específicas de organismos del género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (documento US5200335), Lactobacillus brevis (documento DE 19610984 A1) (Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. diciembre de 2000; 56 Pt12:1696-8), Lactobacillus minor (documento DE10119274) o Pseudomonas (documento US 05385833) (Appl Microbiol Biotechnol. agosto de 2002; 59(4-5):483-7. Epub 26 de junio de 2002, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532)

Sin embargo, las enzimas conocidas actualmente no son ni remotamente suficientes para aprovechar todo el potencial comercial de reducciones estereoselectivas de compuestos cetónicos. Esto puede basarse por un lado en que las enzimas individuales disponen de propiedades muy distintas con respecto al espectro de sustrato, grados óptimos de pH así como estabilidades frente a temperatura y disolventes, que con frecuencia se complementan mutuamente. Por tanto, incluso enzimas homólogas proporcionalmente similares pueden presentar con respecto a un determinado sustrato un comportamiento de reacción completamente distinto. Por otro lado ni muchos menos todas las enzimas descritas están clonadas ni pueden sobre-expresarse en cantidad suficiente, lo que significa que

estas enzimas no están a disposición para una aplicación industrial. Por tanto es necesario para el aprovechamiento lo más amplio posible del potencial sintético de la hidrogenación asimétrica enzimática, disponer de una cartera lo más amplia posible de distintas oxidorreductasas accesibles industrialmente que además sean adecuadas para una aplicación en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos con disolventes orgánicos.

El objeto de la presente invención son ahora una serie de nuevas oxidorreductasas enantioselectivas, R-y Sespecíficas que se caracterizan por buena estabilidad en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos así como por buena capacidad de expresión en Escherichia coli (>500 unidades/g de biomasa húmeda de E. coli), así como un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral.

Las oxidorreductasas de acuerdo con la invención están caracterizadas porque presentan una secuencia de aminoácidos, en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 4.

El polipéptido que corresponde a SEC ID N.º 4 puede obtenerse a partir de bacterias del grupo Leuconostoc, en particular a partir de Leuconostoc carnosum DSMZ 5576. Es objeto de la invención además una secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º 12, que codifica una proteína con la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 4. El polipéptido es adecuado especialmente para la reducción de 2-octanona para dar R-2-octanol y para la oxidación de R-2-octanol. También es muy adecuado para la reducción de éster de 4-haloacetoacetato para dar ésteres de ácido S-4-halo-3hidroxibutírico.

La oxidorreductasa de Leuconostoc carnosum es un homodímero con un peso molecular determinado en gel SDS de 276 2 kDa. El grado óptimo de pH para la reacción de reducción se encuentra para esta oxidorreductasa en el intervalo de 5,0 a 6,0 y el grado óptimo de pH para la reacción de oxidación se encuentra en el intervalo de 6,0-9,0. La oxidorreductasa de Leuconostoc carnosum presenta una buena estabilidad frente a la temperatura, pH y disolventes y muestra en el intervalo de pH de 4,5 a 10 así como a temperaturas de hasta 35 ºC también en tiempos de incubación de varias horas una pérdida de actividad sólo baja.

La invención se refiere además a proteínas de fusión que están caracterizadas porque representan oxidorreductasas con la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 4, o sus homólogos, que están unidas peptídicamente con otro polipéptido en el extremo N terminal o carboxilo terminal. Las proteínas de fusión pueden separarse por ejemplo más fácilmente de otras proteínas o pueden expresarse de manera recombinante en cantidades mayores.

La invención se refiere además a anticuerpos que se unen específicamente a las oxidorreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 4, o sus homólogos. La preparación de estos anticuerpos se realiza de acuerdo con procedimientos conocidos mediante inmunización de mamíferos adecuados y posterior obtención de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.

Ciertas comparaciones de secuencias de aminoácidos pueden realizarse por ejemplo en la Internet en bancos de datos de proteína tales como por ejemplo SWISS-PROT, PIR así como en bancos de datos de ADN tales como por ejemplo EMBL, GenBank etc usando el programa FASTA o el programa BLAST.

El alineamiento óptimo se determina a este respecto con ayuda del algoritmo BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) (Altschul et al. 1990, Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 87: 2264-2268). Como matriz de puntuación para el cálculo de la analogía de secuencia se tomó como base la matriz PAM30. (Dayhoff; M.O., Schwarz, R.M., Orcutt,

B.C. 1978. “A model of evolutionary change in Proteins in “Atlas of Protein Sequence and structure” 5(3) M.O. Dayhoff (ed) 345-352, National Biomedical Research foundation).

La invención se refiere además a fragmentos de proteínas que están caracterizados porque representan fragmentos de la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 4, con un número de más de 18 aminoácidos por fragmento.

Es objeto de la invención además una carbonildeshidrogenasa microbiana que contiene en el extremo N terminal la secuencia de aminoácidos MTDRLKNKVA (SEC ID N.º 43) y/o en el extremo C terminal la secuencia de aminoácidos AEFVVDGGYLAQ (SEC ID N.º 44) y/o una de las secuencias parciales internas VVITGRRAN (SEC ID N.º 45), GGASIINMS (SEC ID N.º 46), TQTPMGHI (SEC ID N.º 47) o GYIKTPLVDG (SEC ID N.º 48).

La invención se refiere además a un vector de clonación que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico que codifican las carbonilrreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 4, o sus homólogos. La invención comprende además un vector de clonación de este tipo que contiene adicionalmente a la carbonilreductasa una enzima adecuada para la regeneración del NAD(P), tal como por ejemplo formiatodeshidrogenasas, alcoholdeshidrogenasas

o glucosadeshidrogenasa.

La invención se refiere además a un vector de expresión que se encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero y contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica las carbonilrreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 4, o sus homólogos y está unida de manera adecuada con una secuencia control de expresión. La invención se refiere además a una célula huésped recombinante que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto, vegetal o de mamífero y se transformó o se transfectó con un vector de expresión de este tipo así como a

un procedimiento de preparación para la obtención de una carbonilrreductasa que se basa en el cultivo de una célula huésped recombinante de este tipo.

Ciertos vectores de clonación adecuados son por ejemplo ppCR-Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Quiagen, Hilden, Alemania), pS Blue, pET Blue, vectores pET LIC (Novagen, Madison, EE.UU.) así como vectores de clonación de TA-PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).

Ciertos vectores de expresión adecuados son por ejemplo pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL o pTrx.

Ciertas secuencias control de expresión adecuadas son por ejemplo promotor trp-lac (tac), promotor trp-lac (trc), promotor lac, promotor T7 o promotor λpL.

Las oxidorreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 4, o sus homólogos pueden obtenerse de modo que se cultivan las células E. coli recombinantes mencionadas anteriormente, se induce la expresión de la correspondiente oxidorreductasa y a continuación tras aproximadamente de 10 a 18 horas (h) se rompen las células mediante tratamiento con ultrasonidos, mediante molienda en húmedo con perlas de vidrio en un molino de bolas (Retsch, GmbH, Haan Alemania 10 min, 24 Hz) o por medio de homogeneizador de alta presión. El extracto de células obtenido puede usarse o bien directamente o puede purificarse posteriormente. Para ello, por ejemplo, se centrifuga el extracto de células y el sobrenadante obtenido se somete a una cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico en Q-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia).

La invención se refiere además a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un co-factor con una oxidorreductasa, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SEC ID N.º 4.

Otra forma de realización preferente del procedimiento de acuerdo con la invención consiste en que el compuesto cetónico presenta la fórmula general I

R1-C(O)-R2 (I),

en la que R1 representa uno de los restos

1) alquilo (C1-C20), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 2) alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta cuatro dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14), 5) alquil-(C1-C8)-arilo (C6-C14), 6) heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o - NH2, o 7) cicloalquilo (C3-C7), estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, y R2 representa uno de los restos 8) alquilo (C1-C6), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) alquenilo (C2-C6), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta tres dobles enlaces, 10) alquinilo (C2-C6), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene dos triples enlaces, o 11) alquil-(C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o está sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, estando los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2.

La invención se refiere además a un procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un co-factor con una oxidorreductasa, que se caracteriza porque se usa una oxidorreductasa para la que

(a): codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º 12, o para la que

(b): codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.

Por el término arilo se entiende restos de hidrocarburo aromáticos con 6 a 14 átomos de carbono en el anillo. Los

restos arilo (C6-C14) son por ejemplo fenilo, naftilo, por ejemplo 1-naftilo, 2-naftilo, bifenililo, por ejemplo 2-bifenililo, 3bifenililo y 4-bifenililo, antrilo o fluorenilo. Los restos bifenililo, restos naftilo y en particular restos fenilo son restos arilo preferentes. Por el término “halógeno” se entiende un elemento de la serie flúor, cloro, bromo o yodo. Por el término “alquilo (C1-C20)” se entiende un resto de hidrocarburo, cuya cadena de carbono es lineal o ramificada y contiene de 1 a 20 átomos de carbono por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonenilo o decanilo. Por el término “alquilo C0” se entiende un enlace covalente.

Por el término “cicloalquilo (C3-C7)” se entiende restos de hidrocarburo cíclicos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.

El término “heterociclo (C5-C14)” representa un anillo heterocíclico de 5 miembros a 14 miembros monocíclico o bicíclico, que está parcialmente saturado o completamente saturado. Son ejemplos de heteroátomos N, O y S. Son ejemplos de los términos heterociclo (C5-C14) restos que se derivan de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 2-óxidos de 1,2,3,5-oxatiadiazol, triazolonas, oxadiazolonas, isoxazolonas, oxadiazolidindionas, triazoles, que están sustituidos con F, -CN, -CF3 o -C(O)-O-alquilo (C1-C4), 3-hidroxipirro-2,4dionas, 5-oxo-1,2,4-tiadiazoles, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinnolina, carbolina y derivados benzocondensados, derivados ciclopentacondensados, ciclohexacondensados o cicloheptacondensados de estos heterociclos. En particular se prefieren los restos 2-o 3pirrolilo, fenilpirrolilo tal como 4-o 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2-tienilo, 4-imidazolilo, metil-imidazolilo, por ejemplo 1metil-2-, -4-o -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, N-óxido de 2-, 3-o 4-piridilo, 2-pirazinilo, 2-, 4-o 5-pirimidinilo, 2-, 3-o 5-indolilo, 2-indolilo sustituido, por ejemplo 1-metil-, 5-metil-, 5-metoxi-, 5-benciloxi-, 5cloro-o 4,5-dimetil-2-indolilo, 1-bencil-2-o -3-indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclohepta[b]-5-pirrolilo, 2-, 3-o 4quinolilo, 1-, 3-o 4-isoquinolilo, 1-oxo-1,2-dihidro-3-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2-benzo-tienilo, 2benzoxazolilo o benzotiazolilo o dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por ejemplo 2-o 3-(N-metilpirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo o benzodioxolanilo.

Los compuestos preferentes de fórmula I son por ejemplo 4-cloroacetoacetato de etilo, acetoacetato de metilo, ácido etil-8-cloro-6-oxooctanoico, 3-oxovaleriato de etilo, 4-hidroxi-2-butanona, 2-oxovaleriato de etilo, ácido etil-2-oxo-4fenilbutírico, piruvato de etilo, fenilglioxilato de etilo, 1-fenil-2-propanona, 2-cloro-1-(3-clorofenil)etan-1-ona, acetofenona, 2-octanona, 3-octanona, 2-butanona, 1-[3,5-bis(trifluorometil)fenil]etan-1-onas, 2,5-hexanodiona, 1,4dicloro-2-butanona, acetoxiacetona, cloruro de fenacilo, 4-bromoacetoacetato de etilo, 1,1-dicloroacetona, 1,1,3tricloroacetona o 1-cloroacetona.

Las oxidorreductasas pueden usarse en el procedimiento de acuerdo con la invención o bien de manera completamente purificada o de manera parcialmente purificada o pueden realizarse con células que contienen las oxidorreductasas de acuerdo con la invención. Las células usadas pueden encontrarse a este respecto de manera nativa, permeabilizada o lisada. Preferentemente se usan las oxidorreductasas clonadas de acuerdo con SEC ID N.º 4, o sus homólogos.

Por cada kg de compuesto de fórmula I que va a reaccionar se usan de 5000 a 10 millones de U de oxidorreductasa. (abierto hacia arriba) La unidad enzimática 1 U corresponde a este respecto a la cantidad de enzima que se requiere para hacer reaccionar 1 mol del compuesto de fórmula I por minuto (min).

La propia reducción enzimática se desarrolla en condiciones suaves, de modo que los alcoholes generados no reaccionen posteriormente. Los procedimientos de acuerdo con la invención presentan un alto tiempo de permanencia y una pureza enantiomérica de por regla general más del 95 % de los alcoholes quirales preparados y un alto rendimiento con respecto a la cantidad usada de compuestos cetónicos.

El compuesto de carbonilo se usa en el procedimiento de acuerdo con la invención en una cantidad del 3 % al 50 % con respecto al volumen total, preferentemente del 5 % al 40 %, en particular del 10 % -30 %.

Una forma de realización preferente de la invención está caracterizada además porque el NAD o NADP formado en la reducción se reduce continuamente con un cosustrato para dar NADH o NADPH.

Como cosustrato se usan a este respecto preferentemente alcoholes primarios y secundarios, tales como etanol, 2propanol, 2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-heptanol, 2-octanol o ciclohexanol.

Estos cosustratos se hacen reaccionar con ayuda de una oxidorreductasa y NAD o NADP para dar los correspondientes aldehídos o cetonas y NADH o NADPH. Debido a ello se produce la regeneración del NADH o NADPH. La proporción del cosustrato para la regeneración asciende a este respecto a del 5 % al 95 % en volumen, con respecto al volumen total.

Para la regeneración del cofactor puede añadirse adicionalmente una alcoholdeshidrogenasa. Las alcoholdeshidrogenasas dependientes de NADH adecuadas pueden obtenerse por ejemplo de levadura de panadería, de Candida boidinii, Candida parapsilosis o Pichia capsulata. Las alcoholdeshidrogenasas dependientes de NADPH adecuadas se producen además en Lactobacillus brevis (documento DE 196 10 984 A1), Lactobacillus minor (documento DE 101 19 274), Pseudomonas (US 5.385.833) o en Thermoanaerobium brockii. Los cosustratos adecuados para estas alcoholdeshidrogenasas son los alcoholes secundarios ya mencionados tales como etanol, 2

propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol , 4-metil-2-pentanol, 2-octanol o ciclohexanol.

Además puede realizarse la regeneración del cofactor por ejemplo también por medio de formiato-deshidrogenasa dependiente de NAD o NADP (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific Formate dehydrogenase). Los cosustratos adecuados de la formiatodeshidrogenasa son por ejemplo sales del ácido fórmico tales como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio. Preferentemente se realizan los procedimientos de acuerdo con la invención sin embargo sin una deshidrogenasa adicional de este tipo, es decir no tiene lugar una regeneración de coenzima acoplada al sustrato.

La parte acuosa de la mezcla de reacción, en la que se desarrolla la reducción enzimática, contiene preferentemente un tampón, por ejemplo tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina, con un valor de pH de 5 a 10, preferentemente un valor de pH de 6 a 9. El tampón puede contener adicionalmente aún iones para la estabilización

o activación de las enzimas, por ejemplo iones zinc o iones magnesio.

La temperatura asciende durante la realización de los procedimientos de acuerdo con la invención convenientemente a de aproximadamente 10 ºC a 70 ºC, preferentemente de 20 ºC a 40 ºC.

En otra forma de realización preferente de los procedimientos de acuerdo con la invención se realiza la reacción enzimática en presencia de un disolvente orgánico no miscible con agua o miscible con agua sólo de manera limitada. Este disolvente es por ejemplo un dialquil(C1-C6)éter simétrico o asimétrico, un alcano de cadena lineal o ramificada o cicloalcano o un alcohol secundario insoluble en agua, que a la vez representa el cosustrato. Los disolventes orgánicos preferentes son por ejemplo dietiléter, terc-butilmetiléter, diisopropiléter, dibutiléter, acetato de butilo, heptano, hexano, 2-octanol, 2-heptanol, 4-metil-2-pentanol o ciclohexano. El disolvente puede servir a este respecto también simultáneamente como cosustrato para la regeneración del cofactor.

La mezcla de reacción, en caso del uso de disolventes insolubles en agua o cosustratos, está compuesta de una fase acuosa y de una fase orgánica. El sustrato se distribuye de manera correspondiente a su solubilidad entre la fase orgánica y la acuosa. La fase orgánica tiene generalmente una proporción del 5 % al 95 %, preferentemente del 10 % al 90 % con respecto al volumen de reacción total. Las dos fases líquidas se mezclan preferentemente de manera mecánica, de modo que se genera entre las mismas una gran superficie. También en esta forma de realización puede reducirse el NAD o NADP formado en la reducción enzimática con un cosustrato, tal como se ha descrito, de nuevo para dar NADH o NADPH.

La concentración del cofactor NADH o NADPH en la fase acuosa asciende generalmente a de 0,001 mM a 1 mM, en particular de 0,01 mM a 0,1 mM.

En los procedimientos de acuerdo con la invención puede usarse aún un estabilizador de la oxidorreductasa/deshidrogenasa. Los estabilizadores adecuados son por ejemplo glicerina, sorbitol, 1,4-DLditiotreitol (DTT) o dimetilsulfóxido (DMSO).

El procedimiento de acuerdo con la invención se realiza por ejemplo en un recipiente de reacción cerrado de vidrio o metal. Para ello se transfieren los componentes individualmente al recipiente de reacción y se agitan bajo una atmósfera de por ejemplo nitrógeno o aire. El tiempo de reacción asciende a de 1 hora a 48 horas, en particular de 2 horas a 24 horas.

A continuación se procesa la mezcla de reacción. Para ello se separa la fase acuosa, se filtra la fase orgánica. La fase acuosa puede extraerse eventualmente otra vez y como la fase orgánica puede procesarse posteriormente. Después se evapora eventualmente el disolvente de la fase orgánica filtrada.

La invención se refiere además a un procedimiento para la obtención de compuesto de hidroxilo quiral de fórmula II,

R1-C(OH)-R2 (II)

en la que R1 y R2 se definen como anteriormente, que se caracteriza porque

a) se incuba una mezcla que contiene el compuesto racémico de fórmula II en presencia de una de las oxidorreductasas de acuerdo con la invención de acuerdo con SEC ID N.º 4, o sus homólogos, NAD(P) y agua, convirtiéndose un enantiómero de compuesto de hidroxilo de fórmula II en el compuesto cetónico correspondiente y NAD(P)H, y b) se aísla el enantiómero que queda del compuesto de hidroxilo de fórmula II.

En caso del uso de las carbonilrreductasas de acuerdo con SEC ID N.º 4 se obtienen a este respecto preferentemente los correspondientes compuestos de S-hidroxilo quirales.

Las condiciones de reacción son esencialmente las mismas que en el procedimiento mencionado anteriormente para la reducción enantioespecífica del compuesto cetónico de fórmula I. Sin embargo, en lugar de una reducción enantioselectiva del compuesto cetónico de fórmula I, de la mezcla racémica del compuesto de fórmula II se oxida únicamente un enantiómero del compuesto de hidroxilo de fórmula II de manera enantioselectiva para dar el correspondiente compuesto cetónico. Debido a ello permanece el enantiómero opuesto del compuesto de hidroxilo

de fórmula II y puede aislarse. Además, en el procedimiento se usa en lugar de los alcoholes usados como cosustratos tales como etanol, 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol o 2-octanol, sus correspondientes cetonas tales como acetona para la regeneración del NAD. Por ejemplo se hace reaccionar la acetona y NAD(P)H con la oxidorreductasa de acuerdo con la invención o una deshidrogenasa adicional para dar NAD e isopropanol.

Las formas de realización preferentes de la invención se explican aún en más detalle con los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1:

Cultivo de organismos y selección según la actividad carbonilrreductasa

La cepa Leuconostoc carnosum DSMZ 5576 se cultivó en el siguiente medio: glucosa (20), extracto de levadura (5), extracto de carne (10), hidrogenocitrato de di-amonio (2), acetato de sodio (5), sulfato de magnesio (0,2), sulfato de manganeso (0,05), hidrogenofosfato de di-potasio (2). El medio se esterilizó a 121 ºC y el organismo se cultivó a 30 ºC sin regulación de pH posterior o alimentación de oxígeno. La cepa Microbacterium spec. DSMZ 20028 se cultivó en un medio de extracto de levadura (3) y tripticasa de harina de soja (30) a 30 ºC y 160 revoluciones por minuto (rpm).

A continuación se resuspendieron 125 mg de células con 800 l de tampón de disgregación (trieetanolamina (TEA) 100 mM, pH = 7,0), se mezclaron con 1 g de perlas de vidrio y se trataron durante 10 minutos (min) a 4 ºC en el molino de bolas (Retsch). El sobrenadante (lisado) obtenido tras centrifugación de 2 min a 12000 rpm se usó en la siguiente selección de actividad y para la determinación del exceso enantiomérico (valor ee). Como sustratos se usaron distintas cetonas, tales como 2-butanonas, 2-octanona, 4-cloroacetoacetato de etilo, acetofenona o ácido de etil-2-oxo-4-fenilbutírico.

Mezcla de reacción para la selección de actividad:

860 l KH2PO4/K2PO4 0,1 M pH = 7,0, MgCl2 1 mM

20 l NADPH o NADH (10 mM)

20 l lisado

100 l sustrato (100 mM)

La reacción se siguió durante 1 min a 340 nm.

Mezcla de reacción para la determinación del valor ee:

20 l lisado

100 l NADH o NADPH (50 mM)

60 l sustrato (100 mM)

Las mezclas de reacción para la determinación del ee se extrajeron tras 24 horas (h) por ejemplo con cloroformo y por medio de cromatografía de gases (CG) se determinó el exceso enantiomérico. El exceso enantiomérico se calcula tal como sigue:

Tabla 1

N.º de DSMZ: Microorganismo Actividad en U/g de células de organismos huésped

2-Butanona: 2-Octanona

NADH: NADPH NADH NADPH

5576: Leuconostoc carnosum ----- 77 ------ 77

DSMZ representa la Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellculturen (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares), Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig. Definición de las unidades de enzima: 1 U corresponde a la cantidad de enzima que se requiere para hacer reaccionar 1 mol de sustrato por min.

Ejemplo 2:

Aislamiento y purificación de oxidorreductasas microbianas dependientes de NAD(P)H

Para el aislamiento de las oxidorreductasas microbianas dependientes de NAD(P)H se cultivaron los microorganismos tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Tras alcanzar la fase estacionaria se recogieron las

células y mediante centrifugación se separaron del medio. La liberación de enzimas se realizó mediante molienda en húmedo por medio de perlas de vidrio, sin embargo puede conseguirse también mediante otros procedimientos de disgregación. Para ello se suspendieron por ejemplo 100 g de masa húmeda de células con 400 ml de tampón de disgregación (trietanolamina 100 mM, MgCl2 1 mM, pH =7,0) y se homogeneizaron por medio de una prensa francesa.

El extracto bruto obtenido tras la centrifugación (7000 rpm) se purificó posteriormente entonces por medio de FPLC (fast protein liquid chromatography, cromatografía de líquidos rápida de proteínas).

Todas las oxidorreductasas de acuerdo con la invención pudieron purificarse mediante combinaciones distintas de cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo en Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) o Uno Q (Biorad, Múnich, Alemania), de cromatografía de interacción hidrófoba, por ejemplo en Octylsepharose Fast Flow o Butylsepharose Fast Flow (Pharmacia), cromatografía en cerámica-hidroxiapatita y permeación en gel.

Ejemplo 3:

Determinación de la secuencia N terminal de una oxidorreductasa de acuerdo con la invención

Las preparaciones de enzima de acuerdo con el ejemplo 2 se separaron tras la permeación en gel en el gel de dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10 % y se transfirieron sobre una membrana de poli(difluoruro de vinilideno) (membrana PVDF). La banda llamativa se sometió a una secuenciación en el extremo N terminal por medio de degradación de Edman (Procise 492 (PE-Biosystems).

Ejemplo 4:

Estrategia de clonación general de una alcoholdeshidrogenasa enantioselectiva aislada de levaduras

Se extrae ADN cromosómico de acuerdo con el procedimiento descrito en “Molecular cloning” de Manniatis & Sambrook. El ácido nucleico resultante sirve como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores degenerados. A este respecto se derivan cebadores en 5’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 66; 72; 80) y los cebadores en 3’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 67; 73, 81) con inclusión del código genético específico para el organismo (SEC ID N.º 68; 69; 74; 75; 82; 83).

La amplificación se realiza en tampón de PCR [Tris-HCl 67 mM (pH 8,3), (NH4)2SO4 16 mM, MgCl2 115 mM, Tween 20 al 0,01 %], mezcla de desoxi-nucleotidotrifosfato (dNTPs) 0,2 mM, 40 pmol por cebador y 2,5 U de polimerasa BioTherm Star (Genecraft, Lüdingshausen, Alemania)]. Tras una activación de la polimerasa BioTherm Star (8 min 95 ºC) y 45-50 ciclos posteriores de una PCR Touch-Down se enfría la reacción hasta 4 ºC y toda la mezcla de reacción de PCR se aplica en un gel de agarosa al 1 % para su análisis.

El fragmento específico que resulta de la reacción en cadena de la polimerasa se liga en el vector de clonación TA pCR2.1 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se secuencia con los cebadores M13 rev (SEC ID N.º 65) y M13 uni (SEC ID N.º 128) con ayuda del secuenciador de ADN ABI.

Las zonas de extremo 5’ y 3’ terminales de la secuencia génica codificante se determinan con ayuda del procedimiento RACE (rapid amplification of cDNA ends, amplificación rápida de extremos de ADNc). Basándose en la secuencia de ácido nucleico del fragmento específico se construyen oligonucleótidos para 3’-RACE y 5’-RACE. Como matriz para la síntesis de la primera cadena de ADNc con ayuda del sistema 3’-RACE (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) sirve ARN total preparado a partir de las células. Sigue una amplificación y una reamplificación del ADNc específico con ayuda de oligonucleotidos 3’-RACE (SEC ID N.º 76; 77; 84; 85). A continuación se aplica la mezcla de reacción para su análisis en un gel de agarosa al 1 %. El fragmento específico, que lleva la información de secuencia flanqueante en 3’ ausente, se liga de manera aislada en un vector de clonación TA pCR2.1 y se secuencia.

Las secuencias codificantes y no codificantes en extremo 5’ terminal se determinan con ayuda del sistema 5’-RACE (Invitrogen). Para ello se acumula con ayuda de oligo dT-celulosa (NEB, Beverly, EE.UU.) ARNm a partir del ARN total obtenido previamente y se aplica en la síntesis de la primera cadena de ADNc con los oligonucleótidos específicos del gen (SEC ID N.º 70; 71; 78; 79; 86; 87). La amplificación y reamplificación posteriores del ADNc específico da como resultado un fragmento que se liga para el análisis en un vector de clonación TA pCR2.1 (Invitrogen). El plásmido que contiene el fragmento se analiza con ayuda de un secuenciador de ADN ABI. Por consiguiente se obtiene la información de secuencia ausente sobre el extremo en 5’ del gen.

Basándose en la secuencia que codifica el gen de longitud completa se construyen cebadores específicos para una clonación posterior de este segmento de ADN en un sistema de expresión adecuado. Para ello se modifican por ejemplo el cebador en 5’ con una secuencia de reconocimiento para Nde I, o con una secuencia de reconocimiento para Sph I, o para BamHI y cebador en 3’ con una secuencia de reconocimiento para Hind III (SEC ID N.º 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96).

El ADN cromosómico sirve como matriz en la siguiente PCR. El segmento de ADN que codifica la respectiva

oxidorreductasa se amplifica con ayuda de polimerasa Platinum pfx (Invitrogen). El producto de PCR resultante se trata tras la purificación a través de un gel agarosa al 1 % con correspondientes ADN endonucleasas y se liga en la estructura principal del vector pET21a (Novagen, Madison, EE.UU.), o la estructura principal del vector pQE70 (Qiagen, Hilden, Alemania) tratada con las mismas endonucleasas.

El constructo de expresión producido se lleva a la secuenciación en cepa de expresión BL21 Star (Invitrogen), o RB791 (E. coli genetic stock, Yale, EE.UU.).

Ejemplo 5:

Estrategia de clonación general de una oxidorreductasa enantioselectiva aislada de bacterias

Se extrae ADN cromosómico de acuerdo con el procedimiento descrito en “Molecular cloning” de Manniatis & Sambrook. El ácido nucleico resultante sirve como matriz para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores degenerados. A este respecto se derivan cebadores en 5’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 104; 112) y los cebadores en 3’ de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N.º 105; 113) con inclusión del código genético específico para el organismo (SEC ID N.º 106; 107; 114; 115).

Las zonas flanqueantes en 5’ y 3’ de la secuencia génica codificante se determinan con ayuda del procedimiento de reacción en cadena de la polimerasa inversa (iPCR). Basándose en la secuencia de ácido nucleico del fragmento interno específico se construyen oligonucleótidos de SEC ID N.º 100; 101; 102; 103; 108; 109; 110; 111; 116; 117; 118; 119. El ADN genómico se digiere con ayuda de una endonucleasa de restricción y se usa en una religación, de modo que circularizan segmentos de ADN más pequeños. Esta mezcla de religación se usa entonces como matriz para una iPCR y cebadores de SEC ID N.º 100; 102; 108; 110; 116; 118. La señal de PCR se refuerza mediante PCR anidada posterior con cebadores de SEC ID N.º 101; 103; 109; 111; 117; 119. El fragmento específico resultante se liga tras la elución del gel de agarosa al 1 % en el vector pCR2.1 (Invitrogen).

Por consiguiente, el análisis de secuenciación del vector pCR2.1 que contiene el fragmento proporciona la información de secuencia ausente sobre zonas codificantes en 3’ y 5’ del gen de alcoholdeshidrogenasa / reductasa.

Proteína: Leuconostoc carnosum

Péptidos secuenciados: NIEETTYEDWK(SEC ID N.º 97)

Cebador para PCR Touch-Down: GACAGAWMGWTTNAARGGW AARGTHGC (SEC ID N.º 98) GCBGTRTAWCCNCCRTCDAC DACRAAYTC (SEC ID N.º 99)

Cebador para iPCR: CTAAGCCAATACCAAGTGTA CCA (SEC ID N.º 100) GAACAAATCGTGCTACTGATT CATCAC (SEC ID N.º 101) GAAGAAGCCCAATCACAAAG AACTC (SEC ID N.º 102) GGCAGTCTATTTAGCTAGTGA AG (SEC ID N.º 103)

Basándose en la secuencia que codifica el gen de longitud completa (SEC ID N.º 12) se construyen cebadores específicos para una clonación posterior de este segmento de ADN en un sistema de expresión adecuado. A este respecto se modifican cebador en 5’ con una secuencia de reconocimiento para Nde I, o con una secuencia de reconocimiento para Sph I, o para BamHI y cebador en 3’ con una secuencia de reconocimiento para Hind III (SEC ID N.º 120; 121; 122; 123; 124; 125; 126; 127).

La amplificación del ADN de longitud completa que codifica la proteína a partir del ADN genómico con restricción y ligación posterior en el vector de expresión se realiza tal como se ha descrito en el ejemplo 3. La cepa de expresión BL21Star (Invitrogen), o RB791 (E. coli genetic stock, Yale, EE.UU.) se transforma con el constructo de expresión producido.

Ejemplo 6:

Expresión de alcoholdeshidrogenasas / reductasas recombinantes en E. coli

Las cepas de Escherichia coli transformadas con el constructo de expresión BL21 Star (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), o RB791 (E. coli genetic stock, Yale, EE.UU.) se cultivaron en 200 ml de medio LB (1 % de triptona, 0,5 5 % de extracto de levadura, 1 % de NaCl) con ampicilina (50 g / ml), o carbenicilina (50 g / ml), hasta que se consiguió una densidad óptica medida a 550 nm de 0,5. La expresión de proteína recombinante se indujo mediante adición de isopropiltiogalactósido (IPTG) en una concentración de 0,1 mM. Tras inducción durante 8 horas, o tras inducción durante 16 horas a 25 ºC y 220 rpm se recogieron las células y se congelaron a -20 ºC. Para la prueba de actividad se mezclaron 10 mg de células con 500 l de tampón TEA 100 mM pH 7,0 y 500 l de perlas de vidrio y se

10 trataron durante 10 min por medio de un molino de bolas. El lisado obtenido se usó entonces de manera diluida para las mediciones correspondientes. La prueba de actividad se compone tal como sigue: 870 l de tampón TEA 100 mM pH 7,0, 160 g de NAD(P)H, 10 l de lisado celular diluido. La reacción se inició con la adición de 100 l de una disolución de sustrato 100 mM a la mezcla de reacción.

vector de expresión: cepa de expresión sustrato Actividad U / g

SEC ID N.º 4: pET21a BL21 Star CLAEE 8300 U/g

15 Ejemplo 7: Caracterización de las oxidorreductasas recombinantes 7a: grado óptimo de pH Se prepararon los tampones mencionados en la tabla 4. La concentración de los respectivos componentes de tampón ascendía respectivamente a 50 mM.

20 Tabla 4

Valor de pH: Sistema tampón Valor de pH Sistema tampón

4: acetato de Na/ácido acético 7,5 KH2PO4/K2PO4

4,5: acetato de Na/ácido acético 8 KH2PO4/K2PO4

5: acetato de Na/ácido acético 8,5 KH2PO4/K2PO4

5,5: KH2PO4/K2PO4 9 Glicina/NaOH

6: KH2PO4/K2PO4 9,5 Glicina/NaOH

6,5: KH2PO4/K2PO4 10 Glicina/NaOH

7: KH2PO4/K2PO4 11 Glicina/NaOH

Reducción del grado de óptimo de pH de la mezcla de reacción de medición (30 ºC):

870 l: de los sistemas tampón mencionados respectivamente en la tabla 3

20 l: NAD(P)H 10 mM

25: 10 l enzima diluida

Se incubó durante aproximadamente de 2 a 3 min, después se realizó la adición de

100 l de disolución de sustrato (100 mM)

Como sustrato se usaron, dependiendo de la oxidorreductasa, 2-butanona o 2-octanona. La reacción se siguió durante 1 min a 340 nm. Para la determinación del grado óptimo de pH se determinó la reacción enzimática en el 30 respectivo tampón mencionado en la tabla 4. Para la determinación del grado óptimo de pH para la reacción de oxidación se usó como cofactor NAD(P) y como sustrato 2-propanol o 2-octanol.

En la tabla 5 están agrupados los resultados para las oxidorreductasas de acuerdo con la invención.

Tabla 5:

N.º de DSMZ: microorganismo grado óptimo de pH de reducción grado óptimo de pH de oxidación

5576: Leuconostoc carnosum 5,0-6 6,5-9,5

7b: estabilidad frente a pH

La determinación de la actividad de las oxidorreductasas recombinantes se sometió a estudio mediante almacenamiento en los sistemas tampón mencionados en la tabla 4. Para ello se fijaron los distintos tampones (50

5 mM) en el intervalo de pH de 4 a 11 y las oxidorreductasas preparadas de acuerdo con el ejemplo 4 se diluyeron con esto. Tras incubación durante 30, 60 y 120 min se extrajeron de la mezcla de reacción 10 l y se usaron en la prueba de la actividad de acuerdo con el ejemplo 1.

El valor de partida es a este respecto el valor de medición, que se obtuvo directamente tras la dilución (1:20) de la enzima en tampón fosfato de potasio 50 mM pH = 7,0. Este valor correspondía en las condiciones predeterminadas

10 a una modificación de la extinción de aproximadamente 0,70 /min y se estableció como el valor del 100 % y todos los valores de medición siguientes se establecieron con respecto a este valor en proporción.

En la tabla 6 están agrupados los intervalos de pH para las oxidorreductasas de acuerdo con la invención, presentando la enzima, con incubación durante 120 min, no menos del 50 % de la actividad de partida.

Tabla 6:

N.º de DSMZ: Microorganismo Estabilidad frente a intervalo de pH

5576: Leuconostoc carnosum 4,5-9,5

7c: grado óptimo de temperatura

Para la determinación de la temperatura de prueba óptima se midió la actividad enzimática para las oxidorreductasas de acuerdo con la invención en el intervalo de temperatura de 15 ºC a 70 ºC en la mezcla de reacción de medición patrón.

20 Los grados óptimos de temperatura determinados están resumidos en la tabla 7:

Tabla 7

N.º de DSMZ: Microorganismo Grado óptimo de T

5576: Leuconostoc carnosum 60 °C

7d: estabilidad frente a la temperatura

De manera análoga tal como se ha descrito en el ejemplo 5c se determinó la estabilidad frente a la temperatura para

25 el intervalo de 15 ºC a 70 ºC. Para ello se incubó respectivamente una dilución de las oxidorreductasas de acuerdo con la invención durante 60 min y 180 min a la respectiva temperatura y a continuación a 30 ºC se midió con la mezcla de reacción de prueba anterior. En la tabla 8 están agrupados los intervalos de temperatura para las oxidorreductasas de acuerdo con la invención, presentando las enzimas con incubación durante 120 min no menos del 50 % de la actividad de partida.

30 Tabla 8

N.º de DSMZ: Microorganismo Estabilidad frente a la temperatura

5576: Leuconostoc carnosum 15-35 ºC

7e: espectro de sustrato

El espectro de sustrato de las oxidorreductasas de acuerdo con la invención se determinó mediante medición de la actividad enzimática para la reducción y oxidación con una serie de cetonas y alcoholes. Para ello se usó la mezcla 35 de reacción de medición patrón de acuerdo con el ejemplo 1 con distintos sustratos.

La actividad con acetoacetato de metilo se fijó para todas las enzimas igual al 100 % y todos los otros sustratos se fijaron en proporción con respecto a ésta.

Tabla 9: reducción de los espectros de sustrato

Sustrato: Leuconostoc carnosum SEC ID N.º 4

1-Fenil-2-propanona: 13 %

Cloruro de fenacilo: 37 %

Acetofenona: 28 %

Acetonaftona: n.d.

Butirofenona: 0 %

2-Octanona: 28 %

3-Octanona: 18 %

2-Butanona: 36 %

2-Oxovaleriato de etilo: 25 %

Ácido etil-2-oxo-4-fenilbutírico: 10 %

Piruvato de etilo: 122 %

Fenilglioxilato de etilo: 4 %

4-Cloroacetoacetato de etilo: 80 %

Acetoacetato de metilo: 100 %

3-Oxovaleriato de etilo: 30 %

Acetona: 28 %

5 7f: estabilidad en el sistema de dos fases acuoso/orgánico

La estabilidad de las oxidorreductasas novedosas en sistemas de dos fases acuoso/orgánicos se sometió a estudio diluyendo los lisados obtenidos en el ejemplo 6 (de expresión recombinante) en un tampón acuoso adecuado para la respectiva oxidorreductasa (aproximadamente 10 unidades/ml de tampón). A la oxidorreductasa diluida en el tampón se añadió entonces el mismo volumen de un disolvente orgánico, no miscible con agua y la mezcla de reacción se

10 incubó a temperatura ambiente con mezclado constante (termomezclador con 170 rpm). Tras incubación durante 24 h se extrajeron respectivamente de la fase acuosa 10 l y se usaron para la determinación de la actividad enzimática en la mezcla de reacción de prueba patrón (tampón fosfato de potasio (KPP) 100 mM, pH = 7,0, NAD(P)H 0,2 mM, sustrato 10 mM). También en este caso se fijó el valor de partida directamente tras dilución en el tampón igual al 100 % y todos los otros valores se fijaron en proporción con respecto a éste.

15 Tabla 9: actividad enzimática tras incubación durante 24 h en el sistema de dos fases acuoso-orgánico

Sistema: Tampón Acetato de butilo Dietiléter MTBE Diisopropiléter Heptano Ciclohexano

Leuconostoc carnosum SEC ID N.º 4: 100 % 80-100 % 80-100 % 80-100 % 80-100 % 80-100 % 80-100 %

MTBE = metil-terc-butiléter

Tabla 10: oxidación de espectros de sustrato

Sustrato: Leuconostoc carnosum SEC ID N.º 4

S-2-Octanol: 0 %

R-2-Octanol: 100 %

S-2-Butanol: 56 %

R-2-Butanol: 178 %

S-Fenil-2-propanol: 0 %

R-Fenil-2-propanol: 6 %

(S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo: 0 %

(R)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo: 0 %

2-Propanol: 67 %

Ciclohexanol: n.d.

Ejemplo 8: reacciones preparativas

Síntesis de ácido etil-(S)-4-cloro-3-hidroxibutírico con oxidorreductasa de Leuconostoc carnosum

5 Para la reacción se incubó una mezcla de 8 ml de tampón (TEA 100 mM, pH = 7, MgCl2 1 mM), 24 ml de isopropanol, 8 ml de 4-cloroacetoacetato de etilo, 2 mg de NADP y 6,7 kU (= 6 ml) de oxidorreductasa recombinante de Leuconostoc carnosum DSMZ 5576 durante 24 h a temperatura ambiente con mezclado constante. Tras 24 h se redujo más del 99 % del 4-cloroacetoacetato de etilo usado para dar ácido etil-(S)-4-cloro-3-hidroxibutírico. La mezcla de reacción se procesó eliminando en primer lugar el 2-propanol por medio de un rotavapor. La mezcla de

10 reacción se extrajo a continuación con acetato de etilo, se eliminó el disolvente por medio de un rotavapor y se obtuvo el producto bruto. El producto bruto obtenido de esta manera (S)-4-cloro-3-hidroxibutirato de etilo presentaba un exceso enantiomérico de > 99,5 %.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> IEP GmbH 15 <120> Oxidorreductasas para la reducción estereoselectiva de compuestos cetónicos

<130> I 11029B

<140> A 1261/2005

<141>

<160> 130 20 <170> PatentIn versión 3.3

<210> 1

<211> 282

<212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa 25 <400> 1

<210> 2

<211> 254

<212> PRT

<213> Pichia farinosa

<400> 2

<210> 3

<211> 336

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<400> 3

<210> 4

<211> 252

<212> PRT

<213> Leuconostoc carnosum

<400> 4

<210> 5

<211> 347

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

<400> 5

<210> 6

<211> 347

<212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<400> 6

<210> 7

<211> 339

<212> PRT

<213> Pichia trehalophila

<400> 7

<210> 8

<211> 254

<212> PRT

<213> Candida nemodendra

<400> 8

<210> 9

<211> 849

<212> ADN

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> gen

<222> (1)..(849)

<400> 9

10 <210> 10

<211> 765

<212> ADN

<213> Pichia farinosa

<220> 15 <221> gen

<222> (1)..(765)

<400> 10

<210> 11

<211> 1011 5 <212> ADN

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1011)

10 <400> 11

<210> 12

<211> 759 5 <212> ADN

<213> Leuconostoc carnosum

<220>

<221> gen

<222> (1)..(759)

10 <400> 12

<210> 13

<211> 1044 5 <212> ADN

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1044)

10 <400> 13

<210> 14

<211> 1044

<212> ADN

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1044)

<400> 14

<210> 15

<211> 1020

<212> ADN

<213> Pichia trehalophila

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1020)

<400> 15

<210> 16

<211> 765

<212> ADN

<213> Candida nemodendra

<220>

<221> gen

<222> (1)..(765)

<400> 16

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 17

<210> 18

<211> 13 5 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(13)

10 <400> 18

<210> 19

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

20 <400> 19

<210> 20

<211> 14 25 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(14)

30 <400> 20

<210> 21

<211> 8 35 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

40 <400> 21

<210> 22

<211> 8 5 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

10 <400> 22

<210> 23

<211> 10 15 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

20 <400> 23

<210> 24

<211> 10 25 <212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

30 <400> 24

<210> 25

<211> 10 35 <212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

40 <400> 25

<210> 26

<211> 12 5 <212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(12)

10 <400> 26

<210> 27

<211> 9 15 <212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

20 <400> 27

<210> 28

<211>: 16 25 <212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(16)

<210> 29

<211>: 9 35 <212> PRT

30 <400> 28

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

40 <400> 29

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 30

<210> 31

<211> 8

<212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 31

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 32

<210> 33

<211> 11

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 33

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 34

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 35

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 36

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 37

<210> 38

<211> 8

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 38

<210> 39

<211> 9

<212> PRT 5 <213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 39

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

15 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 40

<210> 41

<211> 10

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

25 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 41

30 <210> 42

<211> 8

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220> 35 <221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 42

<210> 43 40 <211> 10

<212> PRT

<213> Leuconostoc carnosum

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 43

5 <210> 44

<211> 12

<212> PRT

<213> Leuconostoc carnosum

<220> 10 <221> PÉPTIDO

<222> (1)..(12)

<400> 44

<210> 45 15 <211> 9

<212> PRT

<213> Leuconostoc carnosum

<220>

<221> PÉPTIDO 20 <222> (1)..(9)

<400> 45

<210> 46

<211> 9 25 <212> PRT

<213> Leuconostoc carnosum

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

30 <400> 46

<210> 47

<211> 8

<212> PRT 35 <213> Leuconostoc carnosum

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 47

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> Leuconostoc carnosum

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 48

<210> 49

<211> 11

<212> PRT 10 <213> Microbacterium sp.

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 49

<210> 50

<211> 14

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

20 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(14)

<400> 50

<210> 51

<211> 12

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

30 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(12)

<400> 51

35 <210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

<220> 40 <221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 52

<210> 53

<211> 13

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(13)

<400> 53

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(12)

<400> 54

<210> 55

<211> 9

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 55

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 56

<210> 57

<211> 10

<212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 57

<210> 58

<211> 9

<212>: PRT 10 <213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 58

<210> 59

<211> 11

<212>: PRT 20 <213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 59

<210> 60

<211> 8

<212> PRT 30 <213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 60

<210> 61

<211> 8

<212> PRT 40 <213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

<400> 61

<210> 62

<211> 8 5 <212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

10 <400> 62

<210> 63

<211> 8 15 <212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(8)

20 <400> 63

<210> 64

<211> 14 25 <212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(14)

30 <400> 64

35: <210> 65 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

40: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18)

<400> 65 caggaaacag ctatgacc: 18

<210> 66

<211> 10

<212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 66

10 <210> 67

<211> 9

<212> PRT

<213> Rhodotorula mucilaginosa

<220> 15 <221> PÉPTIDO

<222> (1)..(9)

<400> 67

20: <210> 68 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

30: <400> 68 ccraaytcva cvgcvgtsgc 20

<210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

40: <400> 69

gcctgytcga cvgcytcrcc: 20

45: <210> 70 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(22)

<400> 70 ctccgaggtg ttgagcgcat tg: 22

<210> 71 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(25)

<400> 71 gacgaggttc ttgatgtcgt cctcc: 25

<210> 72 <211> 12 <212> PRT <213> Pichia farinosa

<220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(12)

<400> 72

<210> 73

<211> 14

<212> PRT

<213> Pichia farinosa

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(14)

<400> 73

<210> 74

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 74 ytgytcyaan gcyaadgtyt g 21

<210> 75 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

5: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(25)

10: <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n es a, c, g, o t

15: <400> 75 chaayaargt ngchathaty achgg 25

<210> 76 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

20: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(25)

25: <400> 76 caacgttctg aagagatgac ttatg
25

30: <210> 77 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

35: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

<400> 77 ggtggagtga agttattgac: 20

40: <210> 78 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

45: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23)

<400> 78 gccattctta gcctgttcga gag: 23

50: <210> 79 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(25)

<400> 79 gtcatctctt cagaacgttg atctt 25

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(7)

<400> 80

<210> 81

<211> 11

<212> PRT

<213> Pichia stipitis

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 81

<210> 82

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 82 gcygaycarg tnttrttraa r 21

<210> 83

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<400> 83 ctyaargcya artcdccyaa r: 21

5: <210> 84 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

10: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

<400> 84 ctaccatgcc atgagattag: 20

15: <210> 85 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

20: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

25: <400> 85 gctgtagacg tcgctaagag 20

<210> 86 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

30: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

35: <400> 86 gattctcaag gctaagtcac 20

40: <210> 87 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

45: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

<400> 87 gatctaacac cagctaatct: 20

50: <210> 88 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

5: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22)

<400> 88 ccaaaggagc ttatagcagt ct: 22

10: <210> 89 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

15: <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (29)

<400> 89 gggaaattcc atatgcctgc cactctccg: 29

20: <210> 90 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

25: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33)

<400> 90 cggcaagctt attacgcctt gggagccaag ttg: 33

30: <210> 91 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial

35: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(32)

40: <400> 91 ggaaattcca tatggcctat aacttcacta ac 32

<210> 92 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

45: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(33)

50: <400> 92 cactgcatgc tgatggccta taacttcact aac 33

<210> 93 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial

5: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(30)

10: <400> 93 cgcaagctta ttactgggct gtatatcctc 30

15: <210> 94 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

20: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(33)

<400> 94 ggaaattcca tatgatgtct attcctgcta cac: 33

25: <210> 95 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

30: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31)

<400> 95 cactgcatgc gaatgtctat tcctgctaca c: 31

35: <210> 96 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

40: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23)

<400> 96 cccaagctta tcatggtttg aacacgactc tac: 33

45: <210> 97 <211> 10 <212> PRT <213> Leuconostoc carnosum

50: <220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(10)

<400> 97

5: <210> 98 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

10: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(27)

15: <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n es a, c, g, o t

<400> 98 gacagavvmgw ttnaarggwa argthgc: 27

20: <210> 99 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

25: <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (29)

30: <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n es a, c, g, o t

<400> 99 gcbgtrtawc cnccrtcdac dacraaytc: 29

35: <210> 100 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

40: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(23)

<400> 100 ctaagccaat accaagtgta cca: 23

45: <210> 101 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

50: <220>

<221> misc_feature <222> (1)..(27)

<400> 101 gaacaaatcg tgctactgat tcatcac: 27

5: <210> 102 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial

10: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(25)

15: <400> 102 gaagaagccc aatcacaaag aactc 25

<210> 103 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

20: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(23)

25: <400> 103 ggcagtctat ttagctagtg aag 23

30: <210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Microbacterium sp.

<220> <221> PÉPTIDO <222> (1)..(14)

<400> 104

<210> 105

<211> 11

<212> PRT

<213> Microbacterium sp.

40 <220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(11)

<400> 105

<210> 106

<211> 20

<212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

5: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

<400> 106 ctscartaca cvaagatcgg: 20

10: <210> 107 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

20: <400> 107 gcbgcsagbg cytcrtabgc
20

<210> 108 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(20)

30: <400> 108 tcctcgctga ggctcatcac 20

35: <210> 109 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

40: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22)

<400> 109 gcttctcgat ctcgacgact tc: 22

45: <210> 110 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

50: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19)

<400> 110 gcgcagcgaa ctgatcgag 19

<210> 111

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(22)

<400> 111 gatccagcgc tactcactcg ac 22

<210> 112

<211> 10

<212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(10)

<400> 112

<210> 113

<211> 13

<212> PRT

<213> Gordona rubropertinctus

<220>

<221> PÉPTIDO

<222> (1)..(13)

<400> 113

<210> 114

<211> 26

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (26)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9) .. (9)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 114 atgaargcna tycaratyat ycarcc 26

<210> 115

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

5: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22)

10: <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n es a, c, g, o t

<220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n es a, c, g, o t

15: <400> 115 cytcrtangg ytgngtraar aa 22

20: <210> 116 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

25: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21)

<400> 116 gaggacgaag tcgtccgaat g: 21

30: <210> 117 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

35: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21)

<400> 117 gccgtcacct tcagcaacac c: 21

40: <210> 118 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

45: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21)

<400> 118 ctcgacgtga gcgacgacaa g: 21

50: <210> 119 <211> 21

<212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

5: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21)

<400> 119 gcaagatcac cggcaacgat g: 21

10: <210> 120 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

15: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(37)

20: <400> 120 catatggcta gcatgacaga tcggttaaag aataaag 37

<210> 121 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

25: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(35)

30: <400> 121 gcgcggatcc atgacagatc ggttaaagaa taaag 35

35: <210> 122 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

40: <220> <221> misc_feature <222> (1) .. (29)

<400> 122 cccaagcttc ttattgtgcc aaatagccg: 29

45: <210> 123 <211> 31 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

50: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(31)

<400> 123 ggaaattcca tatgaaggca ctccagtaca c: 31

5: <210> 124 <211> 32 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

10: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32)

<400> 124 cactgcatgc tgatgaaggc actccagtac ac: 32

15: <210> 125 <211> 28 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> constructo sintético

20: <220> <221> misc_feature <222> (1)..(28)

<400> 125 cccaagctta acgtcagggg acgatgac: 28

25: <210> 126 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

30: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(33)

35: <400> 126 cactgcatgc gaatgaaggc cattcagatc atc 33

<210> 127 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial

40: <220> <223> constructo sintético

<220> <221> misc_feature <222> (1)..(33)

45: <400> 127 cccaagctta ttagtcaggc accacgactg ctc 33

50: <210> 128 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> constructo sintético

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(18)

5 <400> 128 tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 129

<211> 336

<212> PRT 10 <213> Lodderomyces elongisporus

<400> 129

<210> 130

<211> 1012 5 <212> ADN

<213> Lodderomyces elongisporus

<220>

<221> gen

<222> (1)..(1011)

10 <400> 130

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce en presencia de un cofactor con una oxidorreductasa, caracterizado porque

5 se usa una oxidorreductasa que se selecciona del grupo que está constituido por las oxidorreductasas para las que

(a)

codifica la secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º: 12, o

(b)

codifica una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia de ácido nucleico mencionada en (a) en condiciones altamente rigurosas.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el compuesto cetónico presenta la 10 fórmula general I

R1-C(O)-R2 (I),

en la que R1 representa uno de los restos

1) alquilo (C1-C20), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 2) alquenilo (C2-C20), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta cuatro

15 dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14), 5) alquil-(C1-C8)-arilo (C6-C14),

20 6) heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, o 7) cicloalquilo (C3-C7), estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2,

25 y R2 representa uno de los restos 8) alquilo (C1-C6), en el que alquilo es de cadena lineal o ramificada, 9) alquenilo (C2-C6), en el que alquenilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene hasta tres dobles enlaces, 10) alquinilo (C2-C6), en el que alquinilo es de cadena lineal o ramificada y eventualmente contiene dos triples

30 enlaces, o 11) alquil-(C1-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), en el que alquilo es lineal o ramificado y está no sustituido o está sustituido una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2, estando los restos mencionados anteriormente en 8) a 11) no sustituidos o independientemente entre sí están sustituidos una, dos o tres veces con -OH, halógeno, -NO2 y/o -NH2.

35 3. Vector de clonación, que contiene una o varias secuencias de ácido nucleico que codifican la oxidorreductasa de acuerdo con SEC ID N.º: 4.
4. Vector de expresión, que se encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero in vitro y contiene una secuencia de ácido nucleico que codifica la oxidorreductasa de acuerdo con SEC ID N.º: 4 y está unida con una secuencia control de expresión.

40 5. Célula huésped recombinante que es una célula bacteriana, de insecto, vegetal o de mamífero y se transformó o se transfectó con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.
6. Oxidorreductasa para su uso en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque se codifica por la secuencia de ácido nucleico que se selecciona del grupo que está constituido por SEC ID N.º: 12 y una secuencia de ácido nucleico cuya cadena complementaria se hibrida con la secuencia SEC ID N.º: 12 en

45 condiciones altamente rigurosas.
7. Procedimiento para la reducción enzimática enantioselectiva de un compuesto cetónico para dar el correspondiente compuesto de hidroxilo quiral, en el que el compuesto cetónico se reduce con una oxidorreductasa en presencia de un co-factor, caracterizado porque se usa una oxidorreductasa que presenta una secuencia de aminoácidos en la que al menos el 75 % de los aminoácidos son idénticos a los aminoácidos de la secuencia de

50 aminoácidos SEC ID N.º: 4.