ES2349466T3

ES2349466T3 - Oxidorreductasa de metschnikowia zobellii.

Info

Publication number: ES2349466T3
Application number: ES04818808T
Authority: ES
Inventors: Anke Zimmer; Maria Bobkova; Antje Gupta
Original assignee: IEP GmbH
Current assignee: Cambrex IEP GmbH
Priority date: 2003-11-21
Filing date: 2004-11-19
Publication date: 2011-01-03
Anticipated expiration: 2024-11-19
Also published as: DK1685248T3; PL1685248T3; WO2005049816A2; DE502004011271D1; EP1685248A2; ATE470715T1; EP1685248B1; WO2005049816A3; DE10354779A1; PT1685248E

Abstract

Oxidorreductasa, que en presencia de NADPH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, caracterizada porque más del 70% de sus aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y porque presenta una actividad específica superior a 1 μmol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4- fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2- hidroxi-4-fenil-butírico.

Description

La presente invención se refiere a una nueva oxidorreductasa dependiente de NADPH de levaduras, por ejemplo del género Metschnikowia, especialmente de Metschnikowia

zobellii,: a un procedimiento enzimático para la reducción

enantioselectiva: de cetocompuestos orgánicos para dar los

correspondientes: hidroxicompuestos y a un procedimiento

enzimático para la obtención enantioselectiva de hidroxicompuestos en el sistema de dos fases con el uso de la oxidorreductasa sobreexpresada recombinante aislada a partir de Metschnikowia zobellii.

Los hidroxicompuestos ópticamente activos son elementos estructurales quirales valiosos con amplia aplicación para la síntesis de compuestos farmacológicamente activos, sustancias aromáticas, feromonas, productos agroquímicos o inhibidores enzimáticos.

A este respecto, se encuentra muy limitado el número de carbonilrreductasas disponibles a buen precio en suficiente medida y adecuadas para aplicaciones a escala industrial en la biocatálisis. En el caso de las alcoholdeshidrogenasas que podían utilizarse hasta ahora en forma de enzimas aisladas, se trata en gran parte de alcoholdeshidrogenasas secundarias, cuyo espectro de sustratos se limita a sustratos con una cadena lateral grande y una pequeña en las proximidades de la función carbonilo, pudiendo ascender la longitud máxima de la cadena más pequeña de las dos cadenas laterales a tres átomos de C.

Tales enzimas son por ejemplo alcoholdeshidrogenasa de hígado de caballo (HLADH) (Enzyme Engineering, vol. 6, 1982, página 107).

Alcoholdeshidrogenasa de levadura (YADH) (Alcohol dehydrogenases: The Enzymes, (1963) páginas 25-83. New York: Academic Press), carbonilrreductasa de Candida parapsilosis (CPCR) (documentos US 5.523.223 y US 5.763.236) o ADH de Pichia capsulata (documento DE10327454.4). Carbonilrreductasa de Rhodococcus erythropolis (RECR) (documento US 5.523.223) y

Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), páginas 1721-1729), alcoholdeshidrogenasa de Candida boidinii (Biochim,. Biophys. Acta 716, (1982), páginas 298-307) o alcoholdeshidrogenasa de Sulfolobus solfataricus (FEMS Microbiology Letters, 170 (1999), páginas 31-39).

Alcoholdeshidrogenasas secundarias R-específicas de organismos del género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (documento US5200335), Lactobacillus brevis (documento DE 19610984 A1), Lactobacillus minor (documento DE10119274) o Pseudomonas (documento US 05385833).

Además, se usan también enzimas de los organismos Candida magnoliae (documento WO 98/35025), Kluyveromyces lactis (documento JP-A Hei 11-187869) y Sporobolomyces salmonicolor (FEMS Microbiology Letters 70 (1990) 45-48) para la cetorreducción. En el caso de estas enzimas se trataba de homólogos con respecto a la subunidad del complejo de ácido graso sintasa cuya aplicación permanecía limitada hasta ahora a la reducción de 4-cloroacetoacetato.

Hasta ahora, pocas de las carbonilrreductasas mencionadas han encontrado aplicación a escala industrial. El motivo principal para ello es, además de los espectros de sustratos con frecuencia demasiado estrechos o de la enantioselectividad reducida de las enzimas, sobre todo la disponibilidad de estas enzimas. La mayoría de las enzimas mencionadas no podían proporcionarse hasta ahora de manera recombinante en suficiente medida a buenos precios.

Ahora se encontró que mediante una nueva oxidorreductasa pueden solventarse las desventajas mencionadas de los procedimientos del estado de la técnica. En el caso de la oxidorreductasa según la invención se trata de una oxidorreductasa novedosa que no presenta ninguna semejanza ni homología con las carbonilrreductasas ya conocidas.

El documento EP 0 918 090 A describe una carbonilrreductasa, que se obtiene a partir de Zygosaccharomyces rouxii y reduce sustratos cetónicos en presencia de NADPH y agua de manera enantioselectiva para dar los correspondientes hidroxicompuestos.

Asimismo, Costello C.A. et al. (Eur. J. Biochem. 267, 2000: 5493-5501) describen una cetorreductasa aislada a partir de Zygosaccharomyces rouxii, que cataliza la reducción asimétrica de determinados sustratos cetónicos con NADPH como coenzima.

A este respecto, la estereoselectividad de la oxidorreductasa según la invención no se determina sólo mediante el tamaño de las cadenas laterales que flanquean al grupo carbonilo, sino también mediante su hidrofobicidad. De esta manera, el espectro de sustratos y la enantioselectividad de la oxidorreductasa según la invención se diferencian claramente de las clases de enzimas conocidas.

La oxidorreductasa según la invención se caracteriza porque en presencia de NADPH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales y más del 70% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y presenta una actividad específica

superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico. Puede obtenerse por ejemplo a partir de levaduras del género Metschnikowia, especialmente a partir de Metschnikowia zobellii.

Preferiblemente es una oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii, que presenta la secuencia de ADN según la SEQ ID NO: 12 y la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 13, tal como se describe en el protocolo de secuencias adjunto.

Preferiblemente es una oxidorreductasa, en la que del 80% al 99,5%, especialmente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13. La medición de la actividad específica de la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13 o sus análogos o derivados definidos como a continuación tiene lugar con el sistema de prueba que se describe en el ejemplo 1.

También son adecuadas oxidorreductasas, que presentan de 1 a 40 aminoácidos adicionalmente a o de 1 a 40 aminoácidos menos que la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID

NO: 13 y que muestra una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico. Se prefieren las oxidorreductasas, en las que hay de 1 a 25 aminoácidos, especialmente de 2 a 20 aminoácidos, de manera especialmente preferible de 3 a 10 aminoácidos más o menos en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

Puede usarse también una oxidorreductasa que presenta la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 y está derivatizada una, dos, tres, cuatro o cinco veces mediante un polímero soluble en agua y que presenta una actividad específica superior

a1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico. Un polímero soluble en agua es por ejemplo polietilenglicol. La unión del polietilenglicol tiene lugar preferiblemente en el extremo N terminal de la proteína según la SEQ ID NO: 13. La oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13 puede estar unida también a un componente sólido, preferiblemente de polietileno, poliestireno, polisacárido, celulosa o un derivado de celulosa.

La invención se refiere además a fragmentos de proteína de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 con de 5 a 30 aminoácidos cada fragmento. Se prefieren fragmentos de la SEQ ID NO: 13 con una longitud de cadena de desde 6 hasta 25 aminoácidos, preferiblemente de 8 a 20 aminoácidos, de manera especialmente preferible de 10 a 18 aminoácidos. Estos fragmentos pueden utilizarse por ejemplo para encontrar la oxidorreductasa según la invención de Metschnikowia zobellii o de cualquier otro microorganismo.

La invención se refiere además a una proteína de fusión, que comprende la oxidorreductasa con la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 o un fragmento de la misma con de 5 a 30 aminoácidos, que está unida de manera peptídica con un polipéptido adicional en el extremo N terminal o carboxilo terminal. Las proteínas de fusión pueden separarse por ejemplo

más fácilmente de otras proteínas o se expresan en una mayor medida en las células.

La invención se refiere además a anticuerpos que se unen de manera específica a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13. La preparación de estos anticuerpos tiene lugar según métodos conocidos mediante inmunización de mamíferos adecuados y posterior obtención de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales.

La invención se refiere también a la secuencia de ácido nucleico (aislada) que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13.

La invención se refiere además a la secuencia de ácido desoxirribonucleico (aislada) (secuencia de ADN) de la oxidorreductasa, que cataliza la reducción de un compuesto carbonílico en presencia de NADPH y agua para dar los correspondientes hidroxicompuestos, seleccionándose la secuencia de ADN del grupo a) secuencia de ADN, que presenta la secuencia de nucleótidos

según la SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8 o la

cadena complementaria en cada caso, b) secuencia de ADN, que hibrida con una o varias de las

secuencias de ADN según a) o sus cadenas complementarias,

teniendo lugar la hibridación en condiciones rigurosas tal

como se describe (Sambrok and Russel, Molecular Cloning a

laboratory Manual, vol. 1, capítulo 1 protocolo 30-32), y c) secuencia de ADN, que debido a la degeneración del código

genético codifica para una proteína, que se codifica por

una o varias de las secuencias de ADN según a) o b).

La invención se refiere además a una secuencia de ADN, en la que más del 70% de las bases de ácido nucleico son idénticas a la secuencia de ADN según la SEQ ID NO: 12 o sus cadenas complementarias y que codifica para una oxidorreductasa, que presenta una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2hidroxi-4-fenil-butírico. Se prefieren secuencias de ADN, en las

que del 80% al 99,5%, preferiblemente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5%, de las bases de ácido nucleico son idénticas a la secuencia de ADN según la SEQ ID NO: 12.

La invención se refiere además a un vector de clonación que contiene una o varias de las secuencias de ácido nucleico o de ADN mencionadas anteriormente. La invención se refiere además a un vector de expresión, que se encuentra en una célula bacteriana, de insecto, vegetal o animal (especialmente célula de mamífero) y que contiene una o varias de las secuencias de ácido nucleico o de ADN mencionadas anteriormente, que están unidas de manera adecuada con una secuencia de control de la expresión. La invención se refiere además a una célula huésped, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o vegetal y que se ha transformado o transfectado con uno de los vectores de expresión mencionados anteriormente.

Las identidades de las secuencias de ADN o secuencia de aminoácidos mencionadas anteriormente se calculan sumando el número de aminoácidos o de bases de ácido nucleico que son idénticos a secuencias parciales de las proteínas o secuencias de ADN respectivas, dividiéndolo entre el número total de aminoácidos o bases de ácido nucleico y multiplicándolo por cien.

Vectores de clonación adecuados son por ejemplo ppCR- Script, pCMV-Script, pBluescript (Stratagene), pDrive cloning Vector (Qiagen, Hilden, Alemania), pS Blue, pET Blue, vectores pET LIC (Novagen, Madison, EE.UU.) así como vectores de clonación TA-PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania).

Vectores de expresión adecuados son por ejemplo pKK223-3, pTrc99a, pUC, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM, pQE, pET, PHUB, pPLc, pKC30, pRM1/pRM9, pTrxFus, pAS1, pGEx, pMAL o pTrx.

Secuencias de control de la expresión adecuadas son por ejemplo promotor trp-lac (tac), promotor trp-lac (trc), promotor lac, promotor T7 o promotor pL.

La oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii es un monómero con un peso molecular determinado en gel de SDS de 36  2 kDa.

La temperatura óptima de la oxidorreductasa se encuentra en el intervalo de desde 20ºC hasta 25ºC y el pH óptimo para la reacción de reducción se encuentra en el intervalo de desde 5,5 hasta 6,5. La oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii es estable en el intervalo de pH de desde 5,5 hasta 8,5 y en el intervalo de temperatura de desde 15ºC hasta 30ºC durante 5 horas y muestra además una buena estabilidad en disolventes orgánicos.

La enzima puede aislarse especialmente a partir de levaduras del género Metschnikowia y puede detectarse con una prueba espectrofotométrica a través de la disminución de NADPH a 340 nm en presencia de un sustrato correspondiente, por ejemplo éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico.

Se clonó una oxidorreductasa según la invención de Metschnikowia zobellii y pudo sobreexpresarse en Escherichia coli (E. coli) con actividades de desde 1000 hasta 10.000 U/g de peso húmedo de E. coli. Por consiguiente, la enzima está disponible a buen precio y en grandes cantidades.

Comparaciones de secuencias en bases de datos revelaron que la oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii no presenta ninguna homología directa con enzimas conocidas, pudo comprobarse una vaga semejanza con respecto al grupo de las hidroxiesteroide deshidrogenasas.

La invención se refiere también a un procedimiento para la obtención de la oxidorreductasa a partir de Metschnikowia zobellii. Para ello se expresa el ADN que codifica para la oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii, por ejemplo, en un microorganismo procariota o eucariota adecuado. Preferiblemente se transforma y expresa la oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii en una cepa de E. coli, especialmente en células de BL21star (DE3) de E. coli (Invitrogen, número de catálogo C601003).

La oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii puede obtenerse por ejemplo cultivando las células de E. coli recombinantes mencionadas anteriormente, induciendo la expresión de la oxidorreductasa y a continuación, tras aproximadamente de 10 a 18 horas, rompiendo las células mediante tratamiento con

ultrasonidos o mediante molienda en húmedo con perlas de vidrio en un molino de bolas (Retsch, GmbH, Haan, Alemania 10 min., 24 Hz). El extracto celular obtenido puede o bien usarse directamente o bien purificarse adicionalmente. Para ello, por ejemplo, se centrifuga el extracto celular y el sobrenadante obtenido se somete a una cromatografía de interacción hidrófoba, por ejemplo sobre Octyl Sepharose Fast Flow® (Pharmacia).

La invención se refiere además a un procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos carbonílicos para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales, que se caracteriza porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la

oxidorreductasa según la invención, NADPH y agua para

dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, y b) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

El procedimiento según la invención presenta un alto margen operacional, una pureza enantiomérica superior al 90% de los hidroxicompuestos quirales producidos y un alto rendimiento con respecto a la cantidad utilizada del compuesto carbonílico.

Por el término “NADPH” se entiende nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducida. Por el término “NADP” se entiende nicotinamida adenina dinucleótido fosfato.

Por la expresión “compuesto carbonílico” se entienden por ejemplo compuestos de fórmula I R1-C(O)-R2 (I). R1 significa por ejemplo

1): alquilo (C1-C20), que es de cadena lineal o

ramificado,

2): alquenilo (C2-C20), que es de cadena lineal o

ramificado: y, según la longitud de cadena,

contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces,

3): alquinilo (C2-C20), que es de cadena lineal o

ramificado: y, según la longitud de cadena,

contiene: uno, dos, tres o cuatro triples

enlaces,

4): arilo (C6-C14),

5) alquil(C1-C8)-arilo (C6-C14),

6) un heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o sustituido de una a tres veces, preferiblemente con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o

7) cicloalquilo (C3-C7), estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o estando sustituidos una, dos o tres veces independientemente entre sí con a) -OH, b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, c) -NO2 o d) -NH2.

R2 significa por ejemplo 1) alquilo (C1-C6), que es de cadena lineal o ramificado,

2) alquenilo (C2-C6), que es de cadena lineal o ramificado y, según la longitud de cadena, contiene uno, dos o tres dobles enlaces,

3) alquinilo (C2-C6), que es de cadena lineal o ramificado y, según la longitud de cadena, contiene uno o dos triples enlaces, o

4) alquil(C0-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), siendo alquilo lineal o ramificado y estando no sustituido o sustituido de una a tres veces con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 4) no sustituidos o estando sustituidos una, dos o tres veces independientemente entre sí con a) -OH, b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, c) -NO2 o d) -NH2.

Por la expresión hidroxicompuesto quiral se entienden por ejemplo compuestos de fórmula II

R1-C(OH)-R2 (II),

en la que el grupo –OH, dependiendo de los restos R1 y R2 se encuentra en configuración R o en S con respecto al átomo de carbono al que está unido y R1 y R2 tienen el mismo significado que en la fórmula I.

Por el término arilo se entienden restos de carbono aromáticos con de 6 a 14 átomos de carbono en el anillo. Restos arilo (C6-C14) son por ejemplo fenilo, naftilo, por ejemplo 1naftilo, 2-naftilo, bifenililo, por ejemplo bifenil-2-ilo, bifenil-3-ilo y bifenil-4-ilo, antracenilo o fluorenilo. Restos arilo preferidos son restos bifenililo, restos naftilo y especialmente restos fenilo. Por el término “halógeno” se entiende un elemento de la serie flúor, cloro, bromo o yodo. Por el término “alquilo (C1-C20)” se entiende un resto de hidrocarburo, cuya cadena carbonada es lineal o ramificada y que contiene de 1 a 20 átomos de carbono. Ejemplos son metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, terc-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo o decilo. Por “alquilo C0” se entenderá, en relación con la presente invención, un enlace covalente.

Por la expresión “cicloalquilo (C3-C7)” se entienden restos de hidrocarburo cíclicos tales como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo o cicloheptilo.

La expresión “heterociclo (C5-C14)” significa un anillo heterocíclico de 5 miembros a 14 miembros, monocíclico o bicíclico, que está parcial o totalmente saturado. Ejemplos de heteroátomos son N, O y S. Ejemplos de las expresiones heterociclo (C5-C14) son restos que se derivan de pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-óxidos, triazolonas, oxadiazolonas, isoxazolonas, oxadiazolidindionas, triazoles, que pueden estar sustituidos con F, -CN, -CF3 o -CO-O-alquilo (C1C4), 3-hidroxi-pirrolidin-2,4-diona, 5-oxo-1,2,4-tiadiazol, piridina, pirazina, pirimidina, indol, isoindol, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, carbolina y derivados benzoanelados, ciclopenta-, ciclohexa-o cicloheptanelados de estos heterociclos. Se

prefieren especialmente los restos 2-o 3-pirrolilo, fenilpirrolilo tal como 4-o 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2tienilo, 4-imidazolilo, metil-imidazolilo, por ejemplo 1-metil2-, -4-o -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3piridilo, 4-piridilo, 2-, 3-o 4-piridil-N-óxido, 2-pirazinilo, 2-, 4-o 5-pirimidinilo, 2-, 3-o 5-indolilo, 2-indolilo sustituido, por ejemplo 1-metil-, 5-metil-, 5-metoxi-, 5benciloxi-, 5-cloro-o 4,5-dimetil-2-indolilo, 1-bencil-2-o -3indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclohepta[b]pirrol-5ilo, 2-, 3-o 4-quinolilo, 1-, 3-o 4-isoquinolilo, 1-oxo-1,2dihidro-3-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2benzotienilo, 2-benzoxazolilo o benzotiazolilo o dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por ejemplo 2-o 3-(N-metilpirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo o benzodioxolanilo.

Compuestos preferidos de fórmula I son por ejemplo éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico, glioxilato de etilfenilo, 1-fenil-2-propanona, 2,3-dicloroacetofenona, 2octanona, éster etílico del ácido 8-cloro-6-oxo-octanoico, éster dimetílico del diácido 3-oxooctan-1,8-octanoico, éster etílico del ácido 2-oxo-ciclohexanocarboxílico, 2-metil-ciclohexanona o 3-metilciclohexanona.

Los correspondientes S-alcoholes formados son por ejemplo éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico, (R)mandelato de etilo, (S)-2-octanol o ácido (R)-etil-8-cloro-6hidroxi-octanoico, (S)-1-fenil-2-propanol o (R)-2-cloro-1-(3clorofenil)-etan-1-ol.

Oxidorreductasas adecuadas proceden por ejemplo de Metschnikowia zobellii. La oxidorreductasa, en el procedimiento según la invención, puede utilizarse o bien completamente purificada o bien parcialmente purificada o realizarse con células que contienen la oxidorreductasa según la invención. A este respecto, las células utilizadas pueden encontrarse de manera nativa, permeabilizada o lisada. Preferiblemente se utiliza la oxidorreductasa clonada según la SEQ ID NO: 13.

La actividad volumétrica de la oxidorreductasa utilizada asciende a desde 100 unidades/ml (U/ml) hasta 5000 U/ml, preferiblemente a aproximadamente 500 U/ml.

Por cada kg de compuesto de fórmula I que va a hacerse reaccionar se utilizan de 5000 a 2.000.000 U de oxidorreductasa, de manera preferible aproximadamente de 10.000 a 500.000 U. A la unidad enzimática 1 U le corresponde a este respecto la cantidad

de enzima que se necesita para hacer reaccionar 1 mol del compuesto de fórmula I por minuto (min.).

La invención se refiere además a un procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos carbonílicos para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales, que se caracteriza porque

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de

oxidorreductasa, NADPH y agua para dar el

correspondiente hidroxicompuesto quiral,

b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa

con una deshidrogenasa y un cosustrato

simultáneamente para dar NADPH, y

c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.

Deshidrogenasas adecuadas son por ejemplo alcoholdeshidrogenasas secundarias de Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis, necesitándose estas enzimas como coenzima NADPH (documentos DE 19 610 984, EP 0 456 107, WO 97/32012).

Cosustratos adecuados para la alcoholdeshidrogenasa utilizada son alcoholes tales como 2-propanol (isopropanol), 2butanol, 2-pentanol o 2-octanol.

Además, la reducción de NADP puede realizarse también con las enzimas usadas para la regeneración de NADPH conocidas, por ejemplo con glucosa deshidrogenasa o formiato deshidrogenasa dependiente de NADPH (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999]64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase).

El cosustrato adecuado para el procedimiento según la invención, en el caso de la utilización de glucosa

deshidrogenasa, es glucosa. Cosustratos adecuados de la formiato deshidrogenasa son por ejemplo sales del ácido fórmico tales como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.

Preferiblemente se utilizan las alcoholdeshidrogenasas de Lactobacillus minor (documento DE 101 19274) o Thermoanerobium brockii.

La alcoholdeshidrogenasa puede utilizarse en el procedimiento según la invención o bien completamente purificada

o bien parcialmente purificada, o pueden usarse células completas, que contienen la alcoholdeshidrogenasa. A este respecto, las células utilizadas pueden encontrarse de manera nativa, permeabilizada o lisada.

Por cada kg de compuesto de fórmula I que va a hacerse reaccionar se utilizan de 10.000 U a 2.000.000 U de alcoholdeshidrogenasa, de manera preferible aproximadamente de

20.000 U a 500.000 U. A la unidad enzimática 1 U le corresponde

a este respecto la cantidad de enzima que se necesita para hacer reaccionar 1 mol del cosustrato (por ejemplo 2-propanol) por minuto (min.).

Preferiblemente, al agua se le añade un tampón, por ejemplo tampón fosfato de potasio, Tris/HCl o trietanolamina con un valor de pH de desde 5 hasta 10, preferiblemente un valor de pH de desde 6 hasta 9. La concentración de tampón asciende a desde 10 mM hasta 200 mM, preferiblemente desde 50 mM hasta 150 mM, especialmente 100 mM.

El tampón puede contener adicionalmente también iones para la estabilización o activación de ambas enzimas, por ejemplo iones magnesio para la estabilización de la alcoholdeshidrogenasa de Lactobaillus minor.

Además, el tampón puede contener detergentes, por ejemplo ®Triton X100, Triton X45, Triton X114, Triton X450 para facilitar la reacción.

En el procedimiento según la invención la temperatura asciende por ejemplo a desde aproximadamente 10ºC hasta 30ºC, preferiblemente desde 20ºC hasta 25ºC.

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la

oxidorreductasa según la invención, NADPH y agua para

dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral,

b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa

con una deshidrogenasa y un cosustrato

simultáneamente para dar NADPH,

c) se realizan las reacciones en presencia de un disolvente orgánico y d) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado. Los disolventes orgánicos preferidos son por ejemplo tercbutilmetil éter, diisopropil éter, heptano, hexano o ciclohexano

: o sus mezclas de distinta composición.

Generalmente, la mezcla básica de reacción consiste, en el caso de la utilización de disolventes adicionales, en una fase acuosa y una fase orgánica. La fase orgánica se forma por un disolvente adecuado en el que el sustrato se encuentra disuelto

: o se forma por el propio sustrato insoluble en agua. A este respecto, la fase orgánica tiene generalmente un porcentaje de desde aproximadamente el 5 hasta el 80%, preferiblemente del 10 al 40%, con respecto al volumen de reacción total.

En el sistema de dos fases, el agua forma una fase líquida y el disolvente orgánico forma la segunda fase líquida. Opcionalmente, también puede estar presente una fase sólida o líquida adicional, que se genera por ejemplo mediante oxidorreductasa y/o alcoholdeshidrogenasa no completamente disuelta o mediante el compuesto de fórmula I. Sin embargo se prefieren dos fases líquidas sin fase sólida. Las dos fases líquidas se mezclan preferiblemente de manera mecánica, de modo que se crean grandes superficies entre las dos fases líquidas.

La concentración del cofactor NADPH con respecto a la fase acuosa asciende a desde 0,001 mM hasta 1 mM, especialmente desde 0,01 mM hasta 0,1 mM.

Preferiblemente, en el procedimiento según la invención se utiliza también un estabilizador de la alcoholdeshidrogenasa. Estabilizadores adecuados son por ejemplo glicerina, sorbitol o dimetilsulfóxido (DMSO).

En el procedimiento según la invención, los compuestos de fórmula I se utilizan en una cantidad de desde el 2% hasta el 30% (p/v) con respecto al volumen total, preferiblemente desde el 5% hasta el 20% (p/v), especialmente del 8% al 15% (p/v).

La cantidad de cosustrato para la regeneración de NADP para dar NADPH, tal como isopropanol asciende a desde aproximadamente el 2% hasta el 30% con respecto al volumen total, preferiblemente desde el 5% hasta el 20%, especialmente desde el 8% hasta el 15%.

El procedimiento según la invención se realiza por ejemplo en un recipiente de reacción cerrado de vidrio o de metal. Para ello se pasan los componentes uno por uno al recipiente de reacción y se agita bajo una atmósfera de por ejemplo nitrógeno

o aire. Según el sustrato y compuesto de fórmula I utilizado, el tiempo de reacción asciende a desde 1 hora hasta 96 horas, especialmente desde 2 horas hasta 24 horas.

A continuación se trata la mezcla de reacción. Para ello se separa la fase acuosa, se filtra la fase orgánica. Opcionalmente puede extraerse la fase acuosa una vez más y tratarse adicionalmente tal como la fase orgánica. Después se evapora opcionalmente el disolvente de la fase orgánica transparente. De esta manera se obtiene por ejemplo el producto éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico con una pureza enantiomérica superior al 90%. El rendimiento total de los procesos asciende tras la destilación del producto a aproximadamente del 50% al 95%, con respecto a la cantidad de material de partida.

La invención se explicará con los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1

Selección en levaduras de carbonilrreductasas para la presentación de éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenilbutírico

Para la selección se cultivaron en el siguiente medio una serie de diferentes cepas de levadura: los datos entre paréntesis se refieren en cada caso a g por litro de agua: extracto de levadura (3), extracto de malta (3), peptonas (5) y

5 glucosa (10).

Se esterilizó el medio a 121ºC y se cultivaron las levaduras sin regulación del pH adicional a 25ºC y en un agitador a 160 revoluciones por minuto (rpm).

A continuación se resuspendieron 125 mg de células con 800 10 l de tampón de rotura (trietanolamina (TEA) 100 mM, pH = 7,0), se mezclaron con 1 g de perlas de vidrio y se rompieron durante 10 minutos (min.) a 4ºC y 24 Hz en el molino de bolas (Retsch). El sobrenadante (lisado) obtenido tras 2 min. de centrifugación a 12000 rpm se utilizó en la selección de la actividad siguiente

15 y para la determinación del exceso enantiomérico (valor de ee). Como sustrato se utilizó éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil butírico.

Mezcla básica para la selección de la actividad: 860 l TEA 0,1 M, pH = 7,0 20 l NADPH o NADH (10 mM) 20 l Lisado 100 l Éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico (10 mM)

20

La reacción siguió 1 min. a 340 nm.

Mezcla básica para la determinación del valor ee: 20 l Lisado 100 l NADPH (50 mM) 2 l Éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico

25 Se extrajeron con cloroformo las mezclas básicas para la determinación del ee tras 24 horas (h) y se determinó el exceso enantiomérico por medio de cromatografía de gases (CG).

Se calculó el exceso enantiomérico tal como sigue: ee(%) = ((alcohol R – alcohol S)/(alcohol R + alcohol S) x 100

Tabla 1

N.º DSMZ: Nombre de los microorganismos Actividad de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico en U/g de células de organismo huésped

NADH: NADPH Valor ee NADH Valor ee NADPH

1345: Yarrowia lipolytika 0 3,4 --- 32% de S

3434: Kluyveromyces thermotolerans 0 7,1 --- 60% de S

3435: Metschnikowia zobellii 0 11,6 --- 86% de R

3795: Kluyveromyces lactis 0 5,4 --- rac.

70130: Pichia anomala 0 3 --- 20% de S

70277: Pichia angusta 0 6,4 --- 30% de R

70382: Pichia pastoris 0 3,2 --- 70% de R

70638: Candida magnoliae 0 14,5 --- 24% de R

70125: Candida parapsilosis 0 6,4 --- 60% de R

2147: Pichia methanolica 0 7,1 -- 73% de S

70260: Pichia capsulata 19 4,8 --- 40% de S

DSMZ significa Colección Alemana de Microorganismos y 5 Cultivos Celulares, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig Definición de las unidades enzimáticas: 1 U corresponde a la cantidad de enzima que se necesita para hacer reaccionar 1 mol de sustrato por min.

10 Ejemplo 2 Aislamiento de una oxidorreductasa dependiente de NADPH a partir de Metschnikowia zobellii

Para el aislamiento de la oxidorreductasa dependiente de NADPH a partir de Metschnikowia zobellii se cultivó el microorganismo tal como se describe en el ejemplo 1. Tras alcanzar la fase estacionaria se recogieron las células y se separaron del medio mediante centrifugación. La liberación enzimática tuvo lugar mediante molienda en húmedo por medio de perlas de vidrio, pero también puede conseguirse mediante otros métodos de rotura. Para ello se suspendieron 66 g de Metschnikowia zobellii con 264 ml de tampón de rotura (trietanolamina 100 mM, pH =7,0) y se homogeneizaron por medio de una prensa francesa.

El extracto bruto obtenido tras la centrifugación (7000 rpm) se purificó adicionalmente entonces por medio de FPLC (fast protein liquid chromatography (cromatografía líquida rápida de proteínas).

La oxidorreductasa según la invención pudo purificarse en tres etapas mediante la combinación de cromatografía de interacción hidrófoba sobre Octylsepharose Fast Flow, Butylsepharose HiTrap (Pharmacia) y cromatografía de intercambio iónico sobre Uno Q (Biorad, Múnich, Alemania).

Para ello se aplicó el lisado obtenido tras centrifugación directamente sobre una columna de Octylsepharose FF equilibrada con un tampón trietanolamina 100 mM, pH = 7,0 (NH4)2SO4 1 M y se eluyó con gradientes de sal lineales decrecientes. A este respecto, se eluyó la oxidorreductasa con (NH4)2SO4 de 0,2 a 0,3

M. Se reunieron las fracciones que contenían oxidorreductasa y se concentraron por medio de ultrafiltración (límite de exclusión 10 kDa) hasta un volumen adecuado.

A continuación se purificaron adicionalmente las fracciones concentradas de la oxidorreductasa por medio de Uno Q. Para ello se aplicó la oxidorreductasa directamente sobre una columna de Uno Q equilibrada con tampón fosfato de potasio 50 mM, pH = 7,0 (Biorad) y se eluyó con gradientes de sal lineales crecientes, eluyéndose la oxidorreductasa sin unión a NaCl 0 M, mientras que se unió una gran parte de las impurificaciones y pudieron eluirse a mayores concentraciones de sal.

La tercera etapa de purificación se realizó en una columna de Butylsepharose HiTrap (Pharmacia), utilizándose el mismo tampón que en la primera etapa de purificación y se eluyó la oxidorreductasa a una concentración (NH4)2SO4 de desde 0,6 hasta

5 0,5 M.

Después se determinó el peso molecular de la oxidorreductasa purificada obtenida con ayuda de permeación en gel (Superdex 200 HR; Pharmacia, trietanolamina 100 mM, pH = 7, NaCl 0,15 M). Como patrones de peso molecular se usaron catalasa

10 (232 kDa), aldolasa (158 kDa), albúmina (69,8 kDa) y ovoalbúmina (49,4 kDa). La siguiente tabla 2 resume los resultados obtenidos:

Etapa de purificación: Volumen [ml] Actividad [U/ml] Actividad total [U] Actividad específica [U/mg] Rendimiento

Extracto bruto: 270 1,85 500 0,12 100%

Octylsepharose: 18 5 90 4,3 18%

Uno Q: 1,8 41 75 59 15%

Butylsepharose HiTrap: 1,5 13 19,5 130 4%

15 Se determinó la actividad enzimática de la oxidorreductasa en el sistema de prueba según el ejemplo 1, (mezcla básica para la selección de la actividad, medición con NADPH) y la determinación de la cantidad de proteína tuvo lugar según Lowry et al. Journal of Biological Chemistry 193 (1951) 265-275 o

20 Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979) 201-220). El cociente de la actividad enzimática con respecto a la cantidad de proteína revela la actividad específica,

correspondiendo 1 unidad (U) a la reacción de 1 mol por min. El peso molecular de la oxidorreductasa según la invención 25 determinado por medio de permeación en gel ascendió en estado nativo a 36  2 kDa.

Ejemplo 3

Determinación de dos péptidos internos tras digestión en gel

Se redujo la banda de SDS-PAGE de la proteína purificada con ditiotreitol, se carboximetiló y se digirió con endoproteinasa Lys-C. Se separaron los péptidos obtenidos a

través de una columna para HPLC capilar de 300 m x 150 mm (Vydac RP18, LC Packings). Se reunieron las fracciones manualmente y se sometieron a prueba por medio de MALDI-EM (Voyager-DE STR (PE-Biosystems) de los péptidos adecuados para la secuenciación. Se secuenciaron dos fracciones adecuadas por medio de degradación de Edman automática y proporcionaron las siguientes secuencias: SEQ ID 1: ELLLPAVEGTK SEQ ID 2: LGPNDEVPSQ(SHW)(GSC)(G)FVDV

Ejemplo 4 Clonación de la oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii

El microorganismo eucariota Metschnikowia zobellii pertenece a la familia Metschnikowiaceae. La estructura genómica de este organismo presenta una disposición exón-intrón. Por tanto, para la identificación de la secuencia génica, que codifica para la oxidorreductasa enantioselectiva, se creó una biblioteca de ADNc a partir de las células activas de Metschnikowia zobellii.

4.1 Preparación del ARN total a partir de las células de

Metschnikowia zobellii

Se resuspendieron 600 mg de células nuevas de Metschnikowia zobellii en 2,5 ml de tampón LETS helado (Tris-HCl 10 mM, pH = 7,4, EDTA 10 mM, LiCl 100 mM, SDS al 0,2%). A la suspensión celular se le añadieron 5 ml (aproximadamente 20 g) de perlas de vidrio equilibradas con 3 ml de fenol (pH 7,0) y lavadas en ácido nítrico. Entonces se agitó la mezcla básica total alternativamente en cada caso 30 segundos (s) (Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc., Nueva York, EE.UU.) y se enfrió

durante 30 s sobre hielo y se trató en total 10 min. A continuación se le añadieron 5 ml adicionales de tampón LETS helado. Se centrifugó esta suspensión celular durante 5 min. a 11000 g a 4ºC. Se retiró la fase acuosa y se extrajo dos veces con el mismo volumen de fenol : cloroformo : 3-metil-1-butanol (24:24:1). A continuación tuvo lugar una extracción con cloroformo. Tras la última extracción, se precipitó el ARN obtenido total mediante la adición de 1/10 vol. de LiCl 5 M a -20ºC durante 4 horas.

Se utilizó 1 mg del ARN aislado anteriormente para el enriquecimiento en ARNm por medio de Oligo-dT-celulosa (kit de preparación de ARNm, Qiagen).

4.2 Preparación de una biblioteca de ADNc partiendo de ARNm de

Metschnikowia zobellii

Tras la precipitación posterior se usaron 5 g de ARNm para la síntesis de ADNc (pBluescript IIXR cDNA Library Construction kit, Stratagene). La biblioteca construida según las indicaciones del fabricante se transformó en XL-10 Gold E. coli y se estableció con un título de 4 x 106 unidades formadoras de colonias (ufc) según la selección azul-blanco.

4.3 Identificación del ADNc que codifica para una oxidorreductasa dependiente de NADPH 4.3.1Identificación del extremo N terminal.

Partiendo de las secuencias peptídicas Seq ID 1 y Seq ID 2, se derivaron cebadores degenerados adaptados a la utilización de codón de Metschnikowia (Seq. 3; Seq. 4; Seq. 5; Seq. 6) y se utilizaron en la reacción en cadena de la polimerasa. A este respecto, la biblioteca de ADNc de plásmido aislado a partir de células XL-10 Gold sirvió como matriz para la primera ronda de PCR. Dado que la biblioteca de ADNc se estableció como una biblioteca de plásmidos, también fue posible utilizar cebadores estacionarios en combinación con cebadores degenerados, derivados, en la reacción PCR. A este respecto se usaron los cebadores T3 y T7, que se unen en cada caso a la secuencia

flanqueante de inserto de ADNc en 5’ o en 3’ en la cadena principal del plásmido.

Seq ID 3 = Oligo MBme1-for: 5 ’-CCNGCHGTDGAAGGWACWAAR -3’ Seq ID 4 = Oligo MBme1-rev1: 5’-YTTWGTWCCTTCHACDGCMGG -3’ Seq ID 5 = Oligo MBme2-for: 5’-GGNCCNAAYGATGARGTNCC -3’ Seq ID 6 = Oligo MBme2-rev: 5’ -GGNACNTCATCRTTNGGRCC -3’ Seq ID 14 = Oligo T3-for: 5’ -AATTAACCCTCACTAAAGGG -3’ Seq ID 15 = Oligo T7-rev: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG -3’

La reacción PCR se realizó en la siguiente mezcla de reacción: Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCI 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTP Mix 1 mM, 30 pMol por cada cebador MBme2-rev y T3-for y 2,5 U de AmpliTag Gold (Applied Biosystems).

Tras una activación de la AmpliTag Gold polimerasa (5 min., 95ºC) y 25 ciclos posteriores de PCR (95ºC, 45 s; 55ºC, 45 s; 70ºC, 45 s) se enfrió la reacción hasta 4ºC y en parte se aplicó sobre un gel de agarosa al 1% para su análisis.

En una reacción PCR siguiente se reforzó la señal de amplificación mediante PCR “anidada”. A este respecto, en la reacción en cadena de la polimerasa, se utilizaron los cebadores

MBme1-rev y T3-for. Como matriz sirvieron 2 l de reacción PCR de la primera reacción. La reacción se realizó en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTP Mix 1 mM, 30 pMol por cada cebador MBme1-rev y T3-for y 2,5 U de AmpliTag Gold (Applied Biosystems).

Se identificó un fragmento específico de 500 pb, se purificó por medio del kit de extracción en gel de Qiagen y se ligó en el vector pCR2.1 (Invitrogen) con el fin de la posterior secuenciación. El análisis del plásmido así generado proporcionó una secuencia de ADNc, que correspondía al extremo N terminal de la oxidorreductasa buscada (Seq. ID 7) y que presentaba la secuencia de aminoácidos N terminal Seq ID 16.

4.3.1Identificación del extremo C terminal.

Para la identificación del extremo C terminal del gen de la oxidorreductasa buscada se realizó una reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores MBme2-for y T7. Como matriz sirvió la preparación de plásmido a partir de la biblioteca de plásmidos de ADNc de XL-10 Gold. La reacción de amplificación se realizó en la siguiente mezcla de reacción a 4 temperaturas de unión diferentes (53ºC; 55ºC; 57ºC; 59ºC).

Mezcla de reacción: Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dNTP Mix 1 mM, 30 pMol por cada cebador MBme2-for y T7-rev y 2,5 U de AmpliTag Gold (Applied Biosystems).

Se identificó una banda específica de un tamaño de 500 pares de bases (pb) en todas las mezclas básicas de los gradientes de PCR. Tras una purificación del gel por medio del kit de extracción en gel de Qiagen Gel se ligó el fragmento de PCR identificado para una secuenciación posterior en el vector pCR2.1 (Invitragen). El análisis de la serie de nucleótidos de este fragmento proporcionó la secuencia, que correspondía al extremo C terminal de la oxidorreductasa buscada (Seq. ID 8) y que presentaba la secuencia de aminoácidos C terminal Seq ID 17.

4.4 Preparación del constructo de expresión para la producción recombinante de la oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii

Basándose en las secuencias n.º: 7 y n.º: 8 se construyeron cebadores específicos para una clonación del gen de longitud completa en un sistema de expresión adaptado. A este respecto se modificaron el cebador en sentido de 5’ con una secuencia de reconocimiento para Nde I y el cebador en sentido de 3’ con una secuencia de reconocimiento para Hind III para la clonación en el vector de expresión pET21a (Seq. 9, Seq. 10). Para la clonación en vectores de la serie pQE se dotó el cebador en

sentido de 5’ con una secuencia de reconocimiento para la endonucleasa de restricción Bam HI (Seq. 11). La biblioteca de ADNc establecida en el plásmido pBluescript (Stratagene) de Metschnikowia zobellii sirvió como

5 matriz para la reacción en cadena de la polimerasa. La reacción PCR se realizó en un tampón de PCR [Tris-HCl 10 mM, (pH 8,0); KCl 50 mM; MgSO4 10 mM; dNTP Mix 1 mM; 30 pMol por cada cebador y 2,5 U Platinum Pfx ADN-polimerasa (Invitrogen)] con 300 ng de molde y los siguientes ciclos de temperatura:

10

Ciclo 1: 94ºC, 2 min.

Ciclo 2 x 30: 94ºC, 15 s 58ºC, 30 s 68ºC, 75 s

Ciclo 3: 68ºC, 7 min. 4ºC, 

El producto amplificado (de aproximadamente 1000 pb) se digirió tras la purificación sobre un gel de agarosa al 1% con ayuda de las endonucleasas Nde I e Hind III, o con las

15 endonucleasas Bam HI e Hind III y se ligó en la cadena principal tratada con las mismas endonucleasas del vector pET21a (Novagen), o del vector pQE30 (Qiagen). Tras la transformación

de 2 l de la mezcla básica de ligación en células Top 10 F’ de

E. coli (Invitrogen) se sometieron a prueba colonias resistentes

20 a ampicilina de ADN de plásmido por medio de un análisis de restricción con las endonucleasas Nde I e Hind III,o endonucleasas Bam HI e Hind III para determinar la existencia de un gran inserto de 1000 pb. Se secuenciaron el constructo de expresión pET21-MEvl#1 y pQE-30-Mevl#9. El transcrito que

25 codifica para una oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii presenta un marco de lectura abierto de 1014 pb en total (Seq. 12) lo que correspondía a una proteína de 338 aminoácidos (Seq. 13).

4.5 Producción de la oxidorreductasa recombinante de Metschnikowia zobellii en Escherichia coli

4.5.1 Células BL 21 (De3)

Se transformaron células de Escherichia coli competentes StarBL21(De3) (Invitrogen) con el constructo de expresión pET21MEvl#1 que codifica para la oxidorreductasa según la invención.

Se cultivó la cepa en medio LB (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%, ampicilina 50 g/ml) y al alcanzar una densidad óptica de 0,5, medida a 500 nm, se indujo con IPTG 1 mM (isopropiltiogalactósido). La actividad alcanzada ascendía a 4000 U/g peso húmedo de material biológico.

4.5.2 RB791 de E. coli

Se transformaron células de Escherichia coli competentes RB791 con el constructo de expresión pQE30-MEvl#9 que codifica para la oxidorreductasa según la invención.

Se cultivó la cepa en medio LB (triptona al 1%, extracto de levadura al 0,5%, NaCl al 1%, ampicilina 50 g/ml) y al alcanzar una densidad óptica de 0,5, medida a 500 nm, se indujo con IPTG

1 mM (isopropiltiogalactósido). La actividad alcanzada ascendía a 320 U/g peso húmedo de material biológico.

Ejemplo 5 Caracterización de la oxidorreductasa r: ecombinante de

Metschnikowia zobellii

5.1 pH-Óptimo Se prepararon los tampones expuestos en: la tabla 3. La

concentración de los respectivos componentes de tampón ascendía en cada caso a 50 mM.

Tabla 3

Valor: Sistema tampón Valor Sistema tampón

de pH
de pH

4: Acetato de Na/Ácido acético 7,5 KH2PO4/K2HPO4

4,5: Acetato de Na/Ácido acético 8 KH2PO4/K2HPO4

5: Acetato de Na/Ácido acético 8,5 KH2PO4/K2HPO4

5,5: KH2PO4/K2HPO4 9 Glicina/NaOH

6: KH2PO4/K2HPO4 9,5 Glicina/NaOH

6,5: KH2PO4/K2PO4 10 Glicina/NaOH

7: KH2PO4/K2HPO4 11 Glicina/NaOH

Mezcla básica de medición (25ºC): 870 l del sistema tampón respectivo mencionado en la tabla 3 5 20 l NADPH 10 mM (8,6 mg/ml de agua) 10 l enzima diluida Se incubó aproximadamente de 2 a 3 min., después tuvo lugar la adición de 100 ml disolución de sustrato (éste etílico del ácido 2-oxo10 4-fenil-butírico 100mM). Para la determinación del pH óptimo se determinó la reacción enzimática en el respectivo tampón expuesto en la tabla

3. Para la determinación del pH óptimo para la reducción se utilizó como cofactor NADPH y como sustrato éster etílico del

15 ácido 2-oxo-4-fenil-butírico. A este respecto, para la enzima según la invención, pudo calcularse un pH óptimo de desde 5,5 hasta 6,5 para la reacción de reducción.

5.2.1 Temperatura óptima

20 Para la determinación de la temperatura de prueba óptima se midió la actividad enzimática en el intervalo de temperatura de desde 15ºC hasta 70ºC en la mezcla básica de medición patrón. Como es evidente a partir de la tabla 4, la enzima tiene su actividad máxima a 25ºC, a continuación la actividad desciende

25 rápidamente.

Tabla 4

Temperatura (ºC): Actividad en U/ml de enzima no diluida Temperatura (ºC) Actividad en U/ml de enzima no diluida

15: 115 45 0

20: 86 50 0

25: 135 55 0

30: 112 60 0

35: 0 65 0

40: 0 70 0

5.3 Estabilidad frente a la temperatura De manera análoga a como se describió en el ejemplo 5.2, se

5 determina la estabilidad frente a la temperatura para el intervalo de desde 15ºC hasta 70ºC. Para ello se incubó en cada caso una dilución 1:20 de la oxidorreductasa purificada durante 60 min. y 180 min. a la temperatura respectiva y a continuación se midió a 30ºC con la mezcla básica de prueba anterior. También

10 en este caso se tomó como valor de partida el valor de medición, que se obtiene directamente tras la dilución de la oxidorreductasa purificada en tampón fosfato de potasio 50 mM a pH = 7,0. Este valor se estableció, también en este ejemplo como el valor del 100%.

15 A este respecto, la enzima resulta estable a temperaturas inferiores a 25ºC durante varios días, mientras que la actividad enzimática se reduce rápidamente a temperaturas superiores a 25ºC en el plazo de pocas horas.

20 5.4 Espectro de sustratos/exceso enantiomérico El espectro de sustratos de la oxidorreductasa según la invención se determinó mediante la medición de la actividad enzimática con una serie de cetonas, ésteres de oxoácidos y cetonas cíclicas. Para ello se usó la mezcla básica de medición

25 patrón según el ejemplo 5.1 con distintos sustratos. La actividad con éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico se

28

estableció igual al 100% y todos los demás sustratos se establecieron en relación a ello. Para la determinación del valor ee se usó la siguiente mezcla básica de reacción para los sustratos seleccionados: 5 100 l TEA100mMpH=7 100 l NADPH (50 mM) 60 l Sustrato (100 mM)

+ 1 a 2 U de la oxidorreductasa según la invención

10 Las mezclas básicas para la determinación del ee se extrajeron tras 24 h con cloroformo y se determinó el exceso enantiomérico del alcohol resultante por medio de CG.

Tabla 5

Sustrato: Actividad relativa % Estereoselectividad Sustrato Actividad relativa % Estereoselectividad

1-Fenil-2propanona: 15% 97% de S Éster etílico del ácido 4-cloroacetoacético 100% rac.

2-cloro-1-(3cloro-fenil)etan-1-ona: 5% 97% de R Éster etílico del ácido 8-cloro-6oxo-octanoico 50% 100% de R

Acetofenona: 0% n.d. Éster dimetílico del diácido 3-oxo1,8-octanoico 35% n.d.

Caprilofenona: 0% n.d. Ciclohexanona 3% n.d.

Butan-2-ona: 0% n.d. Éster etílico del ácido 2-oxociclohexanocarboxílico 20% n.d.

1,4-Diclorobutan-2-ona: 27% 40% de S 2Metilciclohexanona 8% n.d.

Ácido etil-2oxovaleriánico: 100% 62% de R 3Metilciclohexanona 8% n.d.

Ácido etil-2oxo-4-fenilbutírico: 100% 95% de R Éster etílico del ácido (2clorofenil)-oxoacético 50% 99,5% de R

Bromopiruvato de etilo: 28% n.d. Éster etílico del ácido 2-oxociclopentanocarboxílico 8% n.d.

Glioxilato de etilfenilo: 50% 99,5% de R

n.d. significa no determinado

Tal como es evidente a partir de la tabla 5, se reducen de manera enantioselectiva un amplio espectro de compuestos carbonílicos alifáticos y cíclicos, especialmente ésteres de 2

5 oxoácidos, por la oxidorreductasa según la invención. No se aceptan alcoholes secundarios de cadena corta. Esto significa que en este caso no puede aplicarse la regeneración de coenzimas acoplada a sustratos con alcoholes secundarios como cosustrato.

10 5.5 Ejemplos de reacción

5.5.1 Reducción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenilbutírico para dar éster etílico del ácido (R)-2hidroxi-4-fenil-butírico

Para la reducción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil

15 butírico se cubrió una mezcla de 800 l de tampón (TEA 100 mM, pH = 8, 10% de ®Triton X 100), 100 l de isopropanol (1,3, mmol), 0,1 mg de NADP (0,1 mol) 10 U de oxidorreductasa recombinante de Metschnikowia zobellii y 5 unidades de alcoholdeshidrogenasa de Thermoanerobium brockii con 50 l de

20 éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico (0,25 mmol) disuelto en 600 l de n-heptano y se incubó durante 24 h a 25ºC con mezclado continuo.

Tras 24 h se había reducido el 92% del éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico utilizado. El exceso enantiomérico 25 del éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico

obtenido ascendió a más del 90%.

5.5.2. Reducción de éster etílico del ácido 8-cloro-6-oxo

octanoico para dar éster etílico del ácido (R)-830 cloro-6-hidroxi-octanoico

Para la reducción de éster etílico del ácido 8-cloro-6-oxooctanoico se cubrió una mezcla de 800 l de tampón (TEA 100 mM, pH = 8, 5% de Triton X 100), 80 l de isopropanol (1,04, mmol), 0,1 mg de NADP (0,1 mol) 25 U de oxidorreductasa recombinante de Metschnikowia zobellii y 5 unidades de alcoholdeshidrogenasa de Thermoanerobium brockii con 50 l de éster etílico del ácido 8-cloro-6-oxo-octanoico (0,23 mmol) disuelto en 600 l de ciclohexano y se incubó durante 24 h a 25ºC con mezclado

continuo.

Tras 24 h se había reducido el 55% del éster etílico del ácido 8-cloro-6-oxo-octanoico utilizado. El exceso enantiomérico del éster etílico del ácido (R)-8-cloro-6-hidroxi-octanoico obtenido ascendió a más del 97%.

5.5.3. Reducción de 2-cloro-1-fenil-etan-1-ona para dar (1R)-2-cloro-1-fenil-etan-1-ol Para la reducción de 2-cloro-1-fenil-etan-1-ona se cubrió una mezcla de 800 l de tampón (TEA 100 mM, pH = 8, 5% de Triton

X 100), 100 l de isopropanol (1,3 mmol), 0,1 mg de NADP (0,1 mol) 20 U de oxidorreductasa recombinante de Metschnikowia zobellii y 10 Unidades de alcoholdeshidrogenasa de Thermoanerobium brockii con 50 mg de 2-cloro-1-feniletan-1-ona

(0,33 mmol) disuelta en 400 l de ciclohexano/terc-butil-metil éter (50:50) y se incubó durante 24 h a 25ºC con mezclado continuo.

Tras 48 h se había reducido el 75% de la 2-cloro-1-feniletan-1-ona utilizada. El exceso enantiomérico del (1R)-2-cloro1-fenil-etan-1-ol obtenido ascendió a más del 94%.

5.5.4. Reducción de glioxilato de etilfenilo para dar (1R)mandelato de etilo Para la reducción de glioxilato de etilfenilo se cubrió una mezcla de 800 l de tampón (TEA 100 mM, pH = 8, 5% de Triton X

100), 100 l de isopropanol (1,3 mmol), 0,1 mg de NADP (0,1 mol) 20 U de oxidorreductasa recombinante de Metschnikowia

zobellii y 10 unidades de alcoholdeshidrogenasa de Thermoanerobium brockii con 50 l de glioxilato de etilfenilo (0,31 mmol) disuelto en 600 l de ciclohexano y se incubó durante 24 h a 25ºC con mezclado continuo.

Tras 48 h se había reducido el 50% del glioxilato de

etilfenilo utilizado. El exceso enantiomérico del (1R)-mandelato

de etilo obtenido ascendió a más del 99%.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Juelich Enzyme Products GmbH

<120> Oxidorreductasa de Metschnikowia zobellii

5

<130> Metschnikowia

<160> 17 10 <170> PatentIn versión 3.1

<210> 1 15 <211> 11

<212> PRT

<213> Metschnikowia zobellii

<400> 1

imagen1

<210> 2

<211> 21

<212> PRT 25 <213> Metschnikowia zobellii

<400> 2

imagen2

30 <210> 3

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

imagen3

<210> 4

<211> 21

<212> PRT 10 <213> Artificial

<400> 4

imagen2

15 <210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial

20 <400> 5

imagen2

<210> 6

<211> 20 25 <212> PRT

<213> Artificial

<400> 6

imagen2

5 <210> 7

<211> 451

<212> ADN

<213> Metschnikowia zobellii

10 <400> 7

imagen2

<210>: 8 15 <211> 484

<212> ADN

<213> Metschnikowia zobellii

<400> 8

<210> 9

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 9

<210>: 11 20 <211> 33

imagen2

10

<210> 10

<211> 30

<212> ADN

<213> Artificial

15

<400> 10

imagen2

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 11

imagen2

5

<210> 12

<211> 1155

<212> ADN

<213> Metschnikowia zobellii

10

<400> 12

imagen2

<210> 13

<211> 338

<212> PRT

<213> Metschnikowia zobellii

<400> 13

imagen2

<210> 14

<211> 20

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 14

imagen2

10

<210> 15

<211> 20

<212> ADN 15 <213> Artificial

<400> 15

imagen2

20 <210> 16

<211> 104

<212> PRT

<213> Metschnikowia zobellii

<400> 16

imagen2

5 <210> 17

<211> 127

<212> PRT

<213> Metschnikowia zobellii

10 <400> 17

imagen2

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Oxidorreductasa, que en presencia de NADPH y agua reduce un compuesto carbonílico para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, caracterizada porque más del 70% de sus aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y porque presenta una actividad

específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2hidroxi-4-fenil-butírico.
2.

Oxidorreductasa según la reivindicación 1, caracterizada porque del 80 al 99,5%, preferiblemente del 90 al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99 al 99,5% de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.
3.

Oxidorreductasa según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y se codifica por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 12.
4.

Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque puede obtenerse a partir de levaduras del género Metschnikowia, especialmente a partir de Metschnikowia zobellii.
5.

Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque presenta de 1 a 40 aminoácidos adicionalmente a o de 1 a 40 aminoácidos menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13 y porque presenta

una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico.
6.

Oxidorreductasa según la reivindicación 5, caracterizada porque presenta de 1 a 25 aminoácidos, especialmente de 2 a 20 aminoácidos, de manera especialmente preferible de 3 a 10 aminoácidos, más o menos que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.
7.

Oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque presenta la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13, está modificada una, dos, tres, cuatro o cinco veces por un polímero soluble en agua y muestra una

actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)2-hidroxi-4-fenil-butírico.
8.

Oxidorreductasa según la reivindicación 7, caracterizada porque el polímero soluble en agua es polietilenglicol.
9.

Anticuerpo, caracterizado porque se une de manera específica a la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13.
10.

Secuencia de ADN, que codifica para la oxidorreductasa según la SEQ ID NO: 13.
11.

Secuencia de ADN, que codifica para una oxidorreductasa, que en presencia de NADPH y agua cataliza la reducción de un compuesto carbonílico para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, en la que la secuencia de ADN a)

corresponde a la SEQ ID NO: 12 o su cadena complementaria o b) es una secuencia de ADN, que hibrida con la secuencia de ADN según a) o su cadena complementaria, teniendo lugar la hibridación en condiciones rigurosas, o c) es una secuencia de ADN, que debido a la degeneración del código genético codifica para una proteína, tal como se codifica también por una secuencia de ADN según a) o b).
12.

Secuencia de ADN, caracterizada porque en ella más del 70% de las bases de ácido nucleico son idénticas a la secuencia de ADN SEQ ID NO: 12 o su cadena complementaria y porque codifica para una oxidorreductasa, que presenta

una actividad específica superior a 1 mol por mg de proteína, con respecto a la reacción de éster etílico del ácido 2-oxo-4-fenil-butírico para dar éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico.
13.

Secuencia de ADN según la reivindicación 12, caracterizada porque del 80% al 99,5%, preferiblemente del 90% al 99,5%, de manera especialmente preferible del 99% al 99,5%, de las bases de ácido nucleico son idénticas a la secuencia de ADN SEQ ID NO: 12.
14.

Vector de clonación, caracterizado porque comprende una o varias de las secuencias de ADN según una de las reivindicaciones 10 a 13.
15.

Vector de expresión, caracterizado porque comprende una o varias de las secuencias de ADN según una de las reivindicaciones 10 a 13 y está unido a una secuencia de control de la expresión.
16.

Célula huésped, que es una célula bacteriana, de levadura, de insecto o vegetal, y que se ha transformado o transfectado con un vector de expresión según la reivindicación 15.
17.

Procedimiento para la reducción enantioselectiva de compuestos carbonílicos para dar los correspondientes hidroxicompuestos quirales, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de una oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, y b) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
18.

Procedimiento según la reivindicación 17, caracterizado porque como compuesto carbonílico se utiliza un compuesto de fórmula I,

R1-C(O)-R2 (I) en la que R1 significa 1) alquilo (C1-C20), que es de cadena lineal o ramificado, 2) alquenilo (C2-C20), que es de cadena lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro dobles enlaces, 3) alquinilo (C2-C20), que es de cadena lineal o ramificado y según la longitud de cadena contiene uno, dos, tres o cuatro triples enlaces, 4) arilo (C6-C14),

5) alquil(C1-C8)-arilo (C6-C14), 6) heterociclo (C5-C14), que está no sustituido o sustituido de una a tres veces, preferiblemente con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, o 7) cicloalquilo (C3-C7),

estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 7) no sustituidos o estando sustituidos una, dos o tres veces independientemente entre sí con a) -OH, b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, c) -NO2 o d) -NH2, y

R2 significa 1) alquilo (C1-C6), que es de cadena de cadena lineal o ramificado,

2) alquenilo (C2-C6), que es de cadena lineal o ramificado y, según la longitud de cadena, contiene uno, dos o tres dobles enlaces,

3) alquinilo (C2-C6), que es de cadena lineal o ramificado y, según la longitud de cadena, contiene uno o dos triples enlaces, o

4) alquil(C0-C10)-C(O)-O-alquilo (C1-C6), siendo alquilo lineal o ramificado y estando no sustituido o sustituido de una a tres veces, preferiblemente con halógeno, hidroxilo, amino o nitro, estando los restos mencionados anteriormente en 1) a 4) no sustituidos o sustituidos una, dos o tres veces independientemente entre sí con a) -OH, b) halógeno, tal como flúor, cloro, bromo o yodo, c) -NO2 o d) -NH2.
19.

Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8,

NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con un cosustrato para dar NADPH, y c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
20.

Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato para dar NADPH, y c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
21.

Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se realiza la reacción en presencia de un disolvente orgánico y c) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
22.

Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se realiza la reacción en presencia de un disolvente orgánico, c) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con un cosustrato para dar NADPH, y d) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
23.

Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, caracterizado porque

a) se reduce un compuesto carbonílico en presencia de la oxidorreductasa según una de las reivindicaciones 1 a 8, NADPH y agua para dar el correspondiente hidroxicompuesto quiral, b) se reduce el NADP formado mediante la oxidorreductasa con una deshidrogenasa y un cosustrato simultáneamente para dar NADPH, c) se realiza la reacción en presencia de un disolvente orgánico y d) se aísla el hidroxicompuesto quiral formado.
24.

Procedimiento según la reivindicación 19, 20, 22 ó 23, caracterizado porque como cosustrato se usa 2-propanol, 2butanol, 2-pentanol o 2-octanol.
25.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 17 a 24, caracterizado porque éster etílico del ácido 2-oxo-4fenil-butírico se transforma en éster etílico del ácido (R)-2-hidroxi-4-fenil-butírico, éster etílico del ácido 8cloro-6-oxo-octanoico se transforma en éster etílico del ácido (R)-8-cloro-6-hidroxi-octanoico, 2-cloro-1-feniletan-1-ona se transforma en (1R)-2-cloro-1-fenil-etan-1-ol

o glioxilato de etilfenilo se transforma en (1R)-mandelato de etilo.
26.

Procedimiento según la reivindicación 20 ó 23, caracterizado porque se utiliza una deshidrogenasa de Thermoanaerobium brockii, Lactobacillus kefir o Lactobacillus brevis.
27.

Procedimiento según la reivindicación 20 ó 23, caracterizado porque se utilizan como deshidrogenasa formiato deshidrogenasa dependiente de NADPH y como cosustrato una sal del ácido fórmico tal como formiato de amonio, formiato de sodio o formiato de calcio.
28.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque como disolvente orgánico se utilizan terc-butilmetil éter, diisopropil éter, heptano, hexano o ciclohexano o sus mezclas.
29.

Procedimiento según una de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizado porque el disolvente orgánico forma una

48 fase, cuyo porcentaje asciende a del 5 al 80%, preferiblemente del 10 al 40%, con respecto al volumen de reacción total.