PT1685248E - Oxido-redutase de metschnikowia zobellii - Google Patents

Description

ΡΕ1685248 1 DESCRIÇÃO "OXIDO-REDUTASE DE METSCHNIKOWIA ZOBELLII" A presente invenção é referente a uma nova oxido-redutase dependente de NADPH de levedura, por exemplo do género Metschnikowia, especialmente da Metschnikowia zobellii, a um método enzimático de redução enantiosselectiva de compostos orgânicos ceto para os compostos hidroxilo correspondentes e a um método enzimático para a produção enantiosselectiva de compostos hidroxilo num sistema de duas fases utilizando a oxido-redutase sobre-expressa recombinantemente isolada a partir de Metschnikowia zobellii.

Os compostos hidroxilo opticamente activos são elementos quirais essenciais dentro de uma vasta gama de aplicações para a sintese de compostos farmacológicos eficazes, de substâncias aromáticas, de feromonas, de quimicos agrícolas ou de inibidores de enzimas. 0 número de carbonil redutases adequado para aplicações em larga escala nas biocatálises e disponível numa quantidade suficiente a um custo razoável é, no entanto, relativamente limitado. As álcool desidrogenases utilizáveis sob a forma de enzimas isoladas são por 2 ΡΕ1685248 enquanto principalmente álcool desidrogenases secundárias, cujo espectro de substrato está limitado a substratos com uma grande e uma pequena cadeia lateral adjacente para a função carbonilo com o comprimento máximo da mais pequena das duas cadeias laterais de três átomos de C.

Estas enzimas são por exemplo Álcool desidrogenase do figado de cavalo (HLADH) (Enzyme Engineering, vol 6, 1982, página 107). Álcool desidrogenase de levedura (YADH) (Alcohol dehydrogenases: The Enzymes, (1963) páginas 25-83. New

York: Academic Press),

Carbonil redutase de Candida parapsilosis (CPCR) (US 5,523,223 e US 5,763,236) ou de Pichia capsulate ADH (DE10327454.4).

Carbonil redutase de Rhodococcus erythropolis (RECR) (US 5.523.223) e de Norcardia fusca (Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (10) (1999), páginas 1721-1729), Álcool desidrogenase de Candida boidinii (Biochim.,

Biophys. Acta 716, (1982), páginas 298-307) ou Álcool desidrogenase de Sulfolobus solfataricus (FEMS Microbiology Letters, 170 (1999), páginas 31-39).

As álcool desidrogenases secundárias R-

especificas de organismos do género Lactobacillus (Lactobacillus kefir (US5200335), Lactobacillus brevis (DE 3 PE1685248 19610984 Al) , Lactobacillus minor (DE10119274) ou Pseudomonas (US 05385833).

Adicionalmente, enzimas dos organismos Candida magnolia (WO 98/35025), Kluyveromyces lactis (JP-A Hei 11-187869) e Sporobolomyces salmonicolor (FEMS Microbiology Letters 70 (1990) 45-48) são utilizadas para a redução ceto. Estas enzimas são homólogas à subunidade do complexo sintetase de ácidos gordos, cuja utilização tem até hoje sido restrita à redução do 4-cloroacetoacetato

Por enquanto, apenas umas quantas das ditas carbonil redutases foram utilizadas em aplicações em larga escala. A principal razão para tal é, à parte do espectro de substrato ser muitas vezes demasiado diminuto ou da baixa enantiosselectividade das enzimas, em particular a disponibilidade dessas enzimas. Não foi até agora possível disponibilizar a maioria destas enzimas numa quantidade suficiente a um custo razoável.

Foi descoberto que as ditas desvantagens dos métodos anteriores podem ser superadas através de uma nova oxido-redutase. De acordo com a invenção a oxido-redutase é uma nova oxido-redutase não contendo nenhuma relação ou homologia com as carbonil redutases até então conhecidas. A EP 0918090A descreve uma carbonil redutase que é obtida a partir da Zygosaccharomyces rouxii e que reduz enantiosselectivamente os substratos de cetona na presença 4 ΡΕ1685248 de NADPH e água para os compostos hidroxilo correspondentes.

Costello C.A. et al. (Eur. J. Biochem. 267, 2000:5493-5501) descreve também uma cetorredutase isolada a partir de Zygosaccharomyces rouxii, a qual catalisa a redução assimétrica de substratos de cetona particulares com a NADPH como uma coenzima. A estereosselectividade da oxido-redutase de acordo com a invenção não é apenas determinada pelo tamanho das cadeias laterais que flanqueiam o grupo carbonilo mas também pela sua hidrofobicidade. Por isso, o espectro de substrato e a enantiosselectividade da oxido-redutase de acordo com a invenção difere distintamente das classes de enzimas já conhecidas.

De acordo com a invenção, a oxido-redutase é caracterizada por reduzir os compostos carbonilo nos correspondentes compostos hidroxilo na presença de NADPH e água e em que mais de 70% dos aminoácidos são idênticos à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e que possui uma actividade especifica de mais do que 1 pmol per mg de proteína, com base na reacção de 2-oxo-4-fenil-etil-butirato a (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato. Pode, por exemplo, ser obtida a partir de leveduras do género Metschnikowia, especialmente a partir de Metschnikowia zobellii. 5 ΡΕ1685248 É preferida uma oxido-redutase da Metschnikowia zobellii contendo a sequência de DNA de acordo com a SEQ ID NO: 12 e a sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 13, como descrito no protocolo de sequência anexo. É preferida uma oxido-redutase na qual 80% a 99,5%, especialmente 90% a 99,5%, e com especial preferência por 99% a 99,5%, dos aminoácidos são idênticos à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. As medições da actividade especifica da oxido-redutase de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou dos seus derivados ou análogos como definido seguidamente são efectuadas através de um sistema de avaliação descrito no exemplo 1. São também adequadas oxido-redutases que contenham 1 a 40 aminoácidos a mais ou 1 a 40 aminoácidos a menos do que a oxido-redutase com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e que possuam uma actividade especifica de mais do que 1 pmol per mg de proteína, com base na reacção de 2-oxo-4-fenil-etil-butirato a (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato. São preferidas as oxido-redutases em que estejam presentes 1 a 25, especialmente preferida 3 a 10 aminoácidos a mais ou a menos do que na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.

Pode também ser utilizada uma oxido-redutase contendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e ser modificada uma, duas, três, quatro ou cinco vezes através 6 PE1685248 de um polímero solúvel em água e que apresente uma actividade específica de mais do que 1 pmol per mg de proteína, com base na reacção de 2-oxo-4-fenil-etil-butirato a (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato. 0 polietilenoglicol é um exemplo de um polímero solúvel em água. A ligação do polietilenoglicol tem lugar preferencialmente nas extremidade N-terminal da proteína de acordo com a SEQ ID NO: 13. A oxido-redutase de acordo com a SEQ ID NO: 13 pode também ser ligada a um corpo sólido, preferencialmente ao polietileno, ao poliestireno, ao polissacarídeo, à celulose ou a um derivado da celulose. A invenção refere-se também a fragmentos de proteína da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 com 5 a 30 aminoácidos per fragmento. São preferidos os fragmentos da SEQ ID NO: 13 com um comprimento de cadeia de 6 a 25 aminoácidos, preferencialmente 8 a 20 aminoácidos, especialmente preferidos 10 a 18 aminoácidos. Estes fragmentos podem ser utilizados, por exemplo, para detectar a oxido-redutase de acordo com a invenção a partir da Metschnikowia zobellii ou a partir de quaisquer outros microorganismos. A invenção refere-se também a uma proteína de fusão que compreende a oxido-redutase com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 ou a um fragmento daí resultante com 5 a 30 aminoácidos, que estão peptidicamente ligados com um polipeptídeo adicional à extremidade N- 7 ΡΕ1685248 terminal ou à extremidade carboxi-terminal.

As proteínas de fusão podem, por exemplo, ser mais facilmente separadas das outras proteínas, ou serem expressas em células em maior quantidade. A invenção refere-se também a anticorpos que se ligam especificamente à oxido-redutase de acordo com a SEQ ID NO: 13. A preparação destes anticorpos é realizada de acordo com métodos bem conhecidos através da imunização de mamíferos adequados e obtendo os anticorpos subsequentemente. Os anticorpos podem ser monoclonais ou policlonais. A invenção refere-se também à sequência de aminoácidos (isolada) que codifica para a oxido-redutase de acordo com a SEQ ID NO: 13. A invenção refere-se também à sequência (isolada) de ácido desoxirribonucleico (sequência de DNA) da oxido-redutase que catalisa a redução do composto carbonilo na presença de NADPH e água para o composto hidroxilo correspondente, com a sequência de DNA a ser seleccionada a partir do grupo: a) A sequência de DNA contendo a sequência de nucleótidos da SEQ ID NO: 12, da SEQ ID NO: 7 ou da SEQ ID NO: 8, ou cadeia complementar daí resultante, b) A sequência de DNA que hibridiza com uma ou várias das ΡΕ1685248 sequências de DNA de acordo com a) ou com as cadeias complementares dai resultantes, com a hibridização a ter lugar sob condições estringentes como descrito em (Sambrok and Russel, Molecular Cloning a laboratory Manual, Vol 1, Capitulo 1 Protocolo 30-32), e c) A sequência de DNA a qual, como resultado da degenerescência do código genético, codifica uma proteína que é também codificada por uma ou várias das sequências de DNA de acordo com a) ou com b). A invenção refere-se também a uma sequência de DNA na qual mais de 70% das bases dos ácidos nucleicos são idênticas à sequência de DNA da SEQ ID NO: 12 ou das cadeias complementares daí resultantes e que codifica uma oxido-redutase que possui uma actividade específica de mais do que 1 μιηοΐ per mg de proteína, com base na reacção de 2-oxo-4-fenil-etil-butirato a (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato. São preferidas sequências de DNA, nas quais 80% a 99,5%, preferencialmente 90% a 99,5%, particularmente preferida 99% a 99,5%, das bases dos ácidos nucleicos são idênticos à sequência de DNA da SEQ ID NO: 12. A invenção refere-se também a um vector de clonagem contendo um ou vários dos ácidos nucleicos ou das sequências de DNA acima mencionados. A invenção refere-se também a um vector de expressão presente numa célula bacteriana, de insecto, de planta ou de animal 9 ΡΕ1685248 (especialmente células mamíferas) e contendo um ou vários dos ácidos nucleicos ou das sequências de DNA anteriores que se encontram adequadamente ligadas com uma sequência de controlo da expressão. A invenção refere-se também a uma célula hospedeira que é uma célula bacteriana, de levedura, de insecto ou de planta e que foi transformada ou transfectada com um dos vectores de expressão anteriores.

As identidades do DNA ou das sequências de aminoácidos acima mencionados são calculadas através da adição do número de aminoácidos ou de bases dos ácidos nucleicos que são sequências idênticas ou parciais das respectivas proteínas ou sequências de DNA e dividindo então a soma pelo número total de aminoácidos ou de bases dos ácidos nucleicos e multiplicando o resultado por cem.

Os vectores de clonagem adequados são por exemplo o ppCR-Script, o pCMV-Script, o pBluescript (Stratagene), o vector de clonagem pDrive (Qiagen, Hilden, Germany), o pS Blue, o pET Blue, os vectores pET LIC (Novagen, Madison, USA) bem como os vectores de clonagem TA-PCR (Invitrogen, Karlsruhe, Germany).

Os vectores de expressão adequados são por exemplo o pKK223-3, o pTrc99a, o pUC, o pTZ, o pSK, o pBluescript, o pGEM, o pQE, o pET, o PHUB, o pPLc, o pKC30, o pRMl/pRM9, o pTrxFus, o pASl, o pGEx, o pMAL ou o pTrx.

As sequências de controlo da expressão adequadas 10 PE1685248 são por exemplo o promotor trp-lac (tac) , o promotor trp-lac (trc), o promotor lac, o promotor T7 ou o promotor XpL. A oxido-redutase da Metschnikowia zobellii é um monómero com um peso molecular determinado em gel de SDS de 36 ± 2 kDa. A temperatura óptima da oxido-redutase

encontra-se numa gama entre os 20 °C e os 25 °C, e o pH óptimo para a reacção de redução encontra-se entre os 5,5 e os 6,5. A oxido-redutase da Metschnikowia zobellii é estável durante 5 horas numa gama de pH de 5,5 a 8,5 e uma gama de temperatura entre os 15 °C e os 30 °C e apresenta adicionalmente boa estabilidade em solventes orgânicos. A enzima pode ser isolada especialmente a partir de leveduras do género Metschnikowia e pode ser detectada num teste espectrofotométrico através do decréscimo de NADPH a 34 0 nm na presença de um substrato adequado, por exemplo do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato.

Foi clonada uma oxido-redutase de acordo com a invenção a partir da Metschnikowia zobellii e pôde ser sobre-expressa em Escherichia coli (E. coli) com actividades de 1000 a 10000 U/g de peso líquido de E. coli. A enzima pode assim estar disponível a um custo razoável e em grandes quantidades.

Comparações de sequências em bases de dados demonstraram que as oxido-redutases de Metschnikowia 11 ΡΕ1685248 zobellii não possuem homologia directa com enzimas conhecidas, foi, no entanto, possível detectar uma relação distante com o grupo das hidroxiesteróide desidrogenases. A invenção refere-se também a um método para a obtenção da oxido-redutase de Metschnikowia zobellii. Por esta razão, o DNA que codifica a oxido-redutase de Metschnikowia zobellii é, por exemplo, expressa num microorganismo procariótico ou eucariótico adequado. Preferencialmente, a oxido-redutase de Metschnikowia zobellii é transformada e expressa numa estirpe de E. coli, em particular em células de E. coli BL21star n(DE3) (Invitrogen, catálogo número C6010-03). A oxido-redutase de Metschnikowia zobellii pode ser obtida, por exemplo, onde as células de E. coli recombinantes acima mencionadas são cultivadas, a expressão da oxido-redutase é induzida e subsequentemente, após 10 a 18 horas, as células são digeridas através de um tratamento ultra-sónico ou de moagem húmida com esferas de vidro num moinho de esferas (Retsch, GmbH, Haan Germany 10 min, 24 Hz) . O extracto celular obtido pode ser utilizado directamente ou pode ser adicionalmente purificado. Assim, o extracto celular é, por exemplo, centrifugado, e o sobrenadante obtido é sujeito a cromatografia de interacção hidrofóbica, por exemplo, numa Octil-sefarose Fast Flow® (Pharmacia). 12 PE1685248 A invenção refere-se ainda a um processo para a redução enantiosselectiva de compostos carbonilo para os compostos hidroxilo quirais correspondentes, caracterizados como a) um composto carbonilo é reduzido ao composto hidroxilo quiral correspondente na presença de uma oxido-redutase de acordo com a invenção, NADPH e água, e b) o composto hidroxilo quiral formado está isolado. 0 processo de acordo com a invenção possui uma vida operacional longa, uma pureza enantiomérica de mais de 90% dos compostos hidroxilo quirais formados e um elevado rendimento com base na quantidade de composto carbonilo utilizado. O termo "NADPH" refere-se à nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reduzida. O termo "NADP" refere-se à nicotinamida adenina dinucleótido fosfato.

O termo "composto carbonilo" refere-se, por exemplo, a compostos da fórmula I

Rl-C(O)-R2 (I).

Rl, por exemplo, significa 1) (C1-C20) -alquilo, que é de cadeia linear ou ramificada, 13 PE1685248 2) (C2-C20)-alquenilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma, duas, três ou quatro ligações duplas, dependendo do comprimento da cadeia, 3) (C2-C20) -alquinilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma, duas, três ou quatro ligações triplas, dependendo do comprimento da cadeia, 4) (C6-Ci4)-arilo, 5) (Ci-Cs) -alquilo- (C6-Ci4) -arilo, 6) (C5-C14)-heterociclo que é não substituído ou substituído uma a três vezes, preferencialmente por halogéneo, hidroxilo, amino ou nitro, ou 7) (C3-C7)-cicloalquilo, em que as porções mencionadas acima entre 1) a 7) são não substituídas ou substituídas uma, duas ou três vezes, independentemente umas das outras, por a) -OH, b) halogéneo tal como flúor, cloro, bromo ou iodo, c) -NO2 ou d) -NH2. R2, por exemplo, significa 1) (Ci-Cô)-alquilo, que é de cadeia linear ou ramificada, 2) (C2-C6) -alquenilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma, duas ou três ligações duplas, dependendo do comprimento da cadeia, 3) (C2-C6) -alquinilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma ou duas ligações triplas, 14 PE1685248 dependendo do comprimento da cadeia, 4) (C0-Cio)-alquilo-C (0)-0-(Ci-C6)-alquilo, em que o alquilo é linear ou ramificado e não substituído ou substituído uma a três vezes por halogéneo, hidroxilo, amino ou nitro, em que as porções mencionadas acima entre 1) a 4) são não substituídas ou substituídas uma, duas ou três vezes, independentemente umas das outras, por a) -OH, b) halogéneo tal como flúor, cloro, bromo ou iodo, c) -NO2 ou d) -NH2.

0 termo compostos hidroxilo quirais refere-se, por exemplo a compostos da fórmula II

Rl-C(OH)-R2 (II) em que o grupo OH se encontra numa configuração R- ou S-para o átomo de carbono ao qual está ligado, dependendo das porções RI e R2, e em que RI e R2 possuem o mesmo significado que o da fórmula I. 0 termo arilo refere-se a porções de carbono aromático com 6 a 14 átomos de carbono no anel. As porções arilo (C6-C14) são, por exemplo, fenilo, naftilo, por 15 ΡΕ1685248 exemplo 1-naftilo, 2-naftilo, bifenilo, por exemplo bifenil-2-ilo, bifenil-3-ilo e bifenil-4-ilo, antracenilo ou fluorenilo. As porções bifenilo, as porções naftilo e em particular as porções fenilo são porções arilo preferidas. 0 termo "halogéneo" refere-se a um elemento seleccionado a partir do flúor, do cloro, do bromo ou do iodo. 0 termo alquilo " (C1-C20) " refere-se a uma porção de carbono com uma cadeia de carbono linear ou ramificada e contendo 1 a 20 átomos de carbono. Os exemplos são o metilo, o etilo, o propilo, o isopropilo, o butilo, o tert-butilo, o pentilo, o hexilo, o heptilo, o octilo, o nonilo ou o decilo. O termo "C0-alquilo" refere-se a uma ligação covalente no que respeita à presente invenção. O termo " (C3-C7) -cicloalquilo" refere-se ás porções de carbono cíclico tais como o ciclopropilo, o ciclobutilo, o ciclopentilo, o ciclohexilo ou o cicloheptilo. O termo " (C5-C14) heterociclo" refere-se a um anel monocíclico ou bicíclico, heterocíclico de 5- a 14-membros que está em parte ou completamente saturado. Exemplos de heteroátomos são o N, o O e o S. Exemplos dos termos (C5-C14) heterociclo são porções que derivam do pirrol, furano, tiofeno, imidazol, pirazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, tetrazol, 1,2,3,5-oxatiadiazol-2-oxido, triazolona, oxadiazolona, isoxazolona, oxadiazolidindiona, triazol, que podem ser substituídos por F, -CN, -CF3 ou -CO-O- (C1-C4) -alquilo, 3- 16 PE1685248 hidroxi-pirrolidin-2,4-diona, 5-oxo-l,2,4-tiadiazol, piridina, pirazina, pirimidina, índole, isoindole, indazol, ftalazina, quinolina, isoquinolina, quinoxalina, quinazolina, cinolina, carbolina e benz-anelado, ciclopenta-, ciclohexa- ou ciclohepta-anelado derivados destes heterociclos. Especialmente preferidos são as porções 2- ou 3-pirrolilo, fenil-pirrolilo tal como o 4- ou 5-fenil-2-pirrolilo, 2-furilo, 2-tienilo, 4-imidazolilo, metil-imidazolilo, por exemplo l-metil-2-, -4- ou -5-imidazolilo, 1,3-tiazol-2-ilo, 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo, 2-, 3- ou 4-piridil-N-oxido, 2-pirazinilo, 2-, 4-ou 5-pirimidinilo, 2-, 3- ou 5-indolilo, 2-indolilo substituído, por exemplo 1-metil-, 5-metil-, 5-metoxi-, 5-benziloxi-, 5-cloro- ou 4,5-dimetil-2-indolilo, l-benzil-2-ou -3-indolilo, 4,5,6,7-tetrahidro-2-indolilo, ciclohepta[b]pirrol-5-ilo, 2-,3- ou 4-quinolilo, 1-, 3- ou 4-isoquinolilo, 1-oxo-l,2-dihidro-3-isoquinolilo, 2-quinoxalinilo, 2-benzofuranilo, 2-benzo-tienilo, 2-benzoxazolilo ou benzotiazolilo ou dihidropiridinilo, pirrolidinilo, por exemplo 2- ou 3-(N-metil-pirrolidinilo), piperazinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, tetrahidrotienilo ou benzodioxolanilo.

Os compostos preferidos da fórmula I são, por exemplo, 2-oxo-4-fenil-etil-butirato, etil-fenil glioxilato, l-fenil-2-propanona, 2,3-dicloroacetofenona, 2-octanona, éster etílico do ácido 8-cloro-6-oxo-octanóico, éster 3-oxo-octano-l,8-diacid-dimetílico, éster etílico do 17 ΡΕ1685248 ácido 2-oxo-ciclohexanocarboxílico, 2-metilciclohexanona ou 3-metilciclohexanona.

Os S-álcoois correspondentes formados são, por exemplo, o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato, o (R) -mandelato de etilo, o (S)-2-octanol ou o ácido (R)-etil-8-cloro-6-hidroxi-octanóico, o (S)-l-fenil-2-propanol ou o (R)-2-cloro-l-(3-clorofenil)-etan-l-ol.

As oxido-redutases adequadas são originadas, por exemplo, a partir de Metschnikowia zobellii. A oxido-redutase pode ser utilizada no processo de acordo com a invenção quer completamente purificada ou parcialmente purificada, ou pode ser articulada com células contendo a oxido-redutase de acordo com a invenção. As células utilizadas podem ser nativas, permeabilizadas ou lisadas. A preferencialmente utilizada é a extraída a partir da oxido-redutase clonada da SEQ ID NO: 13. 0 volume de actividade da oxido-redutase utilizada é de 100 Unidades / ml (U/ml) a 5000 U/ml, preferencialmente cerca de 500 U/ml.

Per kg de composto da fórmula I a ser reagido, são utilizadas 5000 a 2000000 U da oxido-redutase, preferencialmente cerca de 10000 a 500000 U. A unidade enzimática 1 U corresponde à quantidade de enzima necessária para reagir 1 μιηοΐ do composto da fórmula I per 18 PE1685248 minuto (min). A invenção refere-se ainda a um processo para a redução enantiosselectiva de compostos carbonilo para os compostos hidroxilo quirais correspondentes, caracterizados como a) um composto carbonilo é reduzido ao composto hidroxilo quiral correspondente na presença da oxido-redutase, NADPH e água, b) o NADP formado pela oxido-redutase é simultaneamente reduzido para NADPH com uma desidrogenase e um co-substrato, e c) o composto hidroxilo quiral formado está isolado.

As desidrogenases adequadas são, por exemplo, álcool desidrogenases secundárias a partir de Thermoanaerobium brockii, de Lactobacillus kefir ou de Lactobacillus brevis, com estas enzimas a requerem NADPH como co-enzima (DE 19 610 984, EP 0 456 107, WO 97/32012).

Os co-substratos adequados utilizados para a álcool desidrogenase são álcoois do tipo 2-propanol (isopropanol), 2-butanol, 2-pentanol ou 2-octanol.

Adicionalmente, a redução de NADP pode também ser efectuada com as enzimas estabelecidas utilizadas para a regeneração de NADPH, por exemplo, com a glucose 19 PE1685248 desidrogenase ou a formato desidrogenase dependente de -NADPH (Tishkov et al., J. Biotechnol. Bioeng. [1999] 64, 187-193, Pilot-scale production and isolation of recombinant NAD and NADP specific formate dehydrogenase). 0 co-substrato adequado para o processo de acordo com a invenção é a glucose quando a glucose desidrogenase é utilizada. Os co-substratos adequados para a formato desidrogenase são, por exemplo, sais de ácido fórmico tais como o formato de amónio, o formato de sódio ou o formato de cálcio. São preferencialmente utilizadas as álcool desidrogenases de Lactobacillus minor (DE 101 19274) ou de Thermoanaerobium brockii. A álcool desidrogenase pode ser utilizada no processo de acordo com a invenção quer completamente purificada ou parcialmente purificada, ou podem ser utilizadas todas as células contendo a álcool desidrogenase. As células utilizadas podem ser nativas, permeabilizadas ou lisadas. São utilizadas 10000 U a 2000000 U da álcool desidrogenase per Kg de composto da fórmula I a serem reagidas, preferencialmente cerca de 20000 U a 500000 U. A unidade de enzima 1 U corresponde à quantidade de enzima requerida para reagir 1 pmol dos co-substratos (por 20 PE1685248 exemplo, 2-propanol) per minuto (min). É adicionado preferencialmente um tampão à água, por exemplo um tampão fosfato de potássio, o Tris/HCl ou a trietanolamina com um pH de 5 a 10, preferencialmente com um pH de 6 a 9. A Concentração do tampão é de 10 mM a 200 mM, preferencialmente 50 mM a 150 mM, particularmente preferível 100 mM. 0 tampão pode conter adicionalmente iões para estabilizar ou activar ambas as enzimas, por exemplo iões de magnésio para estabilizar a álcool desidrogenase do Lactobacillus minor.

Adicionalmente, o tampão pode conter detergentes, por exemplo o Triton® X100, o Triton X45, o Triton X114, o Triton X450, para mediar a reacção.

Nos métodos de acordo com a invenção a temperatura é de, por exemplo, 10 °C a 30 °C, preferencialmente 20 °C a 25 °C. A invenção refere-se ainda a um processo para a redução enantiosselectiva de compostos carbonilo para os compostos hidroxilo quirais correspondentes, caracterizados por a) um composto carbonilo é reduzido ao composto hidroxilo 21 PE1685248 quiral correspondente na presença da oxido-redutase de acordo com a invenção, NADPH e água, b) o NADP formado pela oxido-redutase é simultaneamente reduzido para NADPH com uma desidrogenase e um co-substrato, c) as reacções são levadas a cabo na presença de um solvente orgânico, e d) o composto hidroxilo quiral formado está isolado.

Os solventes orgânicos preferidos são, por exemplo, éter metil-tert-butílico, éter di-isopropílico, heptano, hexano ou ciclohexano ou misturas daí resultantes em várias combinações.

Quando se utiliza solventes adicionais, a reacção lote consiste em geral numa fase aquosa e numa fase orgânica. A fase orgânica é formada por um solvente adequado, no qual um substrato é dissolvido, ou pelo próprio substrato insolúvel em água. A fase orgânica em geral possui uma poção de 5 a 80%, preferencialmente 10 a 40%, com base no volume total da reacção.

No sistema de duas fases a água forma a primeira fase líquida, enquanto que o solvente orgânico forma a segunda fase líquida. Opcionalmente, pode também estar presente um sólido ou outra fase líquida, que se desenvolve por exemplo através da oxido-redutase e/ou da álcool desidrogenase não completamente dissolvida ou através do 22 ΡΕ1685248 composto de fórmula I. São, no entanto, preferíveis duas fases líquidas sem uma fase sólida. As duas fases líquidas são preferencialmente misturadas mecanicamente, para que se criem grandes superfícies entre as duas fases líquidas. A concentração do co-factor NADPH com base na fase aquosa é de 0,001 mM a 1 mM, especialmente 0,01 mM a 0,1 mM.

No processo de acordo com a invenção é também preferencialmente utilizado um estabilizador para a álcool desidrogenase. Os estabilizadores adequados são, por exemplo, a glicerina, o sorbitol ou o dimetilsulfóxido (DMSO).

Os compostos de fórmula I são utilizados no processo de acordo com a invenção numa quantidade de 2% a 30% (p/v), preferencialmente de 5% a 20% (p/v), especialmente 8% a 15% (p/v), com base no volume total. A quantidade do co-substrato para a regeneração de NADP para NADPH, tal como o isopropanol, é de cerca de 2% a 30%, preferencialmente 5% a 20%, especialmente preferível 8% a 15%, com base no volume total. O processo de acordo com a invenção é, por exemplo, efectuado num frasco de reacção fechado feito de vidro ou metal. Os componentes são individualmente 23 ΡΕ1685248 transferidos para o frasco de reacção e agitados numa atmosfera de, por exemplo, azoto ou ar. Dependendo do substrato e do composto de fórmula I utilizado, o tempo de reacção é de 1 hora até 96 horas, especialmente 2 horas até 24 horas.

Subsequentemente a mistura de reacção é processada. A fase aquosa é separada, e a fase orgânica é filtrada. A fase aquosa pode também opcionalmente ser extraida mais uma vez e processada adicionalmente como a fase orgânica. Subsequentemente, o solvente pode ser evaporado da fase orgânica clara. Isto resulta na produção de, por exemplo, (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato com uma pureza enantiomérica de mais de 90%. O rendimento total do processo após a destilação do produto é de cerca de 50% a 95%, com base na quantidade do material inicial. A invenção é explicada através dos seguintes exemplos: 24 ΡΕ1685248

Exemplo 1

Rastreio de leveduras quanto às carbonil redutases para a produção de (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato

Para o rastreio, foi cultivado um número de vários géneros de leveduras no seguinte meio: os números entre parêntesis são baseados em g/1 de água: extracto de levedura (3), extracto de malte (3), peptona (5) e glucose (10) . O meio foi esterilizado a 121 °C, e as leveduras foram cultivadas sem o ajuste de pH adicional a 25 °C e num agitador com 160 rotações per minuto (rpm). Seguidamente, foram ressuspensas 125 mg de células com 800 μΐ de tampão de digestão (100 mM de trietanolamina (TEA), pH = 7,0), misturados com 1 g de esferas de vidro e maceradas durante 10 minutos (min) a 4 °C e 24 Hz num moinho de esferas (Retsch) . O sobrenadante obtido após 2 minutos de centrifugação a 12000 rpm (lisado) foi utilizado no rastreio da actividade seguinte e para a determinação do excesso enantiomérico (valor de ee). Foi utilizado, como substrato, o 2-oxo-4-fenil-etil-butirato.

Lote para o rastreio da actividade: 860 μΐ 0.1 Μ TEA pH = 7.0 20 μΐ NADPH ou NADH (10 mM) 25 ΡΕ1685248 20 μΐ lisado 100 μΐ 2-oxo-4-fenil-etil-butirato (10 mM) A reacção foi monitorizada durante 1 min a 240 nm.

Lote para a determinação do valor de ee 20 μΐ lisado 100 μΐ NADPH (50 mM) 2 μΐ 2-oxo-4-fenil-etil-butirato

Os lotes para a determinação do ee foram extraídos após 24 horas (h) com clorofórmio, e o excesso enantiomérico foi determinado através de uma cromatografia de gás (GC). O excesso dos enantiómeros foi calculado como se segue: ee (%) = ((R-álcool - S-álcool)/(R-álcool + S-álcool)) x 100 26 ΡΕ1685248

Tabela 1

N° DSMZ Nome do microorganismo 2-oxo-4-fenil-etil-butirato Actividade em U/g células do organismo hospedeiro NADH NADPH Valor de ee NADH Valor de ee NADPH 1345 Yarrowia lipolytika 0 3,4 - 32%S 3434 Kluyveromyces thermotolerans 0 7,1 - 60% S 3435 Metschnikowia zobellii 0 11, 6 - 86% R 3795 Kluyveromyces lactis 0 5,4 - Rac 70130 Pichia anómala 0 3 - 20% S 70277 Pichia angusta 0 6, 4 _ 30% R 70382 Pichia pastoris 0 3,2 - 70% R 70638 Candida magnolia 0 14,5 - 24% R 70125 Candida parapsilosis 0 6, 4 - 60% R 2147 Pichia methanolica 0 7,1 - 73% S 70260 Pichia capsulata 19 4,8 - 40% S 27 PE1685248 DSMZ significa Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células, Mascheroder Weg lb, 38124

Braunschweig.

Definição das unidades de enzima: 1 U representa a quantidade de enzimas requeridas para reagir com 1 pmol de substrato per minuto.

Exemplo 2

Isolamento de uma oxido-redutase dependente de NADPH a partir de Metschnikowia zobellii

De forma a isolar a oxido-redutase dependente de NADPH a partir de Metschnikowia zobellii, o microorganismo foi cultivado como descrito no exemplo 1. Após atingirem a fase estacionária, as células foram recolhidas e separadas do meio através de centrifugação. A libertação das enzimas foi obtida através de moagem húmida com esferas de vidro, podendo também, no entanto, ser realizada através de outros métodos de digestão. Para isso 66 g de Metschnikowia zobellii foram ressuspensas com 264 ml de tampão de digestão (trietanolamina a 100 mM, pH = 7,0) e homogeneizados através de uma prensa francesa. O estrato puro obtido após a centrifugação (7000 rpm) foi então purificado através de FPLC (cromatografia liquida rápida de proteina). 28 ΡΕ1685248 A oxido-redutase de acordo com a invenção pode ser purificada em três passos através de uma combinação de cromatografia de interacção hidrofóbica em Octil-sefarose Fast Flow, Butil-sefarose HiTrap (Pharmacia) e cromatografia de troca iónica em Uno Q (Biorad, Munich, Germany). 0 lisado obtido após a centrifugação foi aplicado directamente numa coluna de octil-sefarose FF equilibrada com tampão de trietanolamina a 100 mM, pH = 7,0, (NH4)2S04 a 1 M, e eluido com diminuição dos gradientes lineares de sais. A oxido-redutase foi eluida entre 0,2 e 0,3 M de (NH4)2S04. As fracções contendo a oxido-redutase foram combinadas e concentradas até um volume adequado via ultra filtração (limite de exclusão de 10 kDa).

Subsequentemente, as fracções concentradas da oxido-redutase foram adicionalmente purificadas através de Uno Q. Assim, a oxido-redutase foi directamente aplicada numa coluna Uno Q (Biorad) equilibrada com tampão fosfato de potássio a 50 mM, pH =7,0, e eluida com uma diminuição do gradiente linear de sal, com a oxido-redutase a eluir sem se ligar a NaCl a 0 M, com a maioria das impurezas a serem ligadas e eluidas a concentrações de sais mais elevadas. O terceiro passo de purificação foi efectuado numa coluna de butil-sefarose HiTrap (Pharmacia), com os 29 PE1685248 mesmos tampões a serem utilizados tal como no primeiro passo de purificação e com a oxido-redutase a eluir a uma concentração de (NH4)2S04 entre 0,6 e 0,5 M.

Subsequentemente, o peso molecular da oxido-redutase purificada obtida foi determinado via permeação em gel (Superdex 200 HR; Pharmacia, trietanolamina a 100 mM, pH = 7, NaCl a 0,15 M) . A catalase (232 kDa) , a aldolase (158 kDa), a albumina (69,8 kDa) e a ovalbumina (49,4 kDa) foram utilizadas como pesos moleculares padrão. A tabela 2 seguinte sumariza os resultados obtidos:

Tabela 2:

Passo de Purificação Volume [ml] Actividade [U/ml] Actividade Total [U] Actividade Especifica [U/mg] Rendimento Extracto Bruto 270 1,85 500 0,12 100% Octil-sefarose 18 5 90 4,3 18% Uno Q 1,8 41 75 59 15% Butil-sefarose HiTrap 1,5 13 19, 5 130 4% 30 ΡΕ1685248 A actividade enzimática da oxido-redutase foi determinada no sistema de teste de acordo com o exemplo 1 (lote para o rastreio da actividade, medição com NADPH), e a determinação da quantidade de proteína foi efectuada de acordo com Lowry et al., Journal of Biological Chemistry 193 (1951) 265-275 ou com Peterson et al., Analytical Biochemistry, 100 (1979) 201-220). O quociente da actividade da enzima e da quantidade de proteína determina a actividade específica, com a taxa de conversão de 1 pmol/min o que corresponde a 1 unidade (U). O peso molecular determinado via permeação em gel da oxido-redutase de acordo com a invenção foi de 36 ± 2 kDa no seu estado nativo.

Exemplo 3

Determinação de dois peptídeos internos de acordo com a digestão em gel purificada foi e digerida com foram separados (Vydac RP18., LC manualmente e (PE-Biosystems)) . Duas fracções da degradação sequenciadas A banda de SDS-PAGE da proteína reduzida com ditiotreitol, carboximetilada endoproteinase Lis-C. Os peptídeos obtidos via coluna capilar de HPLC 300 pm x 150 mm Packings). As fracções foram recolhidas rastreada via MALDI MS (Voyager-DE STR para peptídeos adequados para sequenciação adequadas foram sequenciadas através 31 ΡΕ1685248 automatizada de Edman e resultou nas seguintes sequências: SEQ ID 1:

ELLLPAVEGTK SEQ ID 2: LGPNDEVPSQ(SHW)(GSC)(G)FVDV Exemplo 4

Clonagem da oxido-redutase de Metschnikowia zobellii 0 microorganismo eucariótico Metschnikowia zobellii pertence à família Metschnikowiaceae. A estrutura do genoma deste organismo possui uma disposição Exão-Intrão. Por esta razão, foi preparada uma biblioteca de cDNA das células activas de Metschnikowia zobellii para a identificação da sequência do gene que codifica para a oxido-redutase enantiosselectiva. 4.1. Preparação do RNA total a partir das células de Metschnikowia zobellii 600 mg de células frescas de Metschnikowia zobellii foram ressuspensas em 2.5 ml de tampão LETS arrefecido com gelo (Tris-HCl a 10 mM, pH = 7.4, EDTA a 10 mM, LiCl a 100 mM, SDS a 0.2%) . 5 ml (cerca de 20 g) de esferas de vidro lavadas em ácido nítrico e equilibradas 32 PE1685248 com 3 ml de fenol (pH 7.0) foram adicionados à suspensão de células. A totalidade do lote foi então alternadamente vortexada durante 30 segundos (sec) (Vortex Genie 2, Scientific Industries Inc., New York, USA) e arrefecida em gelo durante 30 sec, sendo o tempo total de tratamento de 10 min. Subsequentemente, foram adicionados 5 ml adicionais de tampão LETS arrefecido em gelo. Esta suspensão de células foi centrifugada durante 5 min a 11000 g a 4 °C. A fase aquosa foi separada e extraída duas vezes com o mesmo volume de fenol:clorofórmio:3-metil-l-butanol (24:24:1). Este foi seguido por uma extracção com clorofórmio. Após a última extracção a totalidade do RNA obtido foi precipitado durante 4 horas através da adição de 1/10 vol de LiCl a 5 M a -20 °C. 1 mg do RNA isolado acima foi utilizado para o enriquecimento do mRNA via celulose oligo-dT (mRNA PrápKit, Qiagen). 4.2. Preparação de uma biblioteca de cDNA com base no mRNA de Metschnikowia zobellii

Após a precipitação subsequente foram utilizados 5 pg de mRNA para a síntese de cDNA (pBluescript IIXR cDNA Library Construction kit, Stratagene). A biblioteca construída de acordo com as instruções do fabricante foi transformada em E. coli XL-10 Gold e preparadas com um título de 4 x 106 unidades formadoras de colónias (ufc) 33 ΡΕ1685248 após a selecção azul-branco.

4.3. Identificação de cDNA que codifica uma oxido-redutase dependente de NADPH 4.3.1. Identificação do N-terminal

Com base nas sequências de peptídeos da Seq ID 1 e Seq ID 2 foram derivados iniciadores degenerados adaptados para a utilização do Codão de Metschnikowia (Seq. 3; Seq. 4; Seq. 5; Seq. 6) e introduzidos na reacção de polimerização em cadeia. A biblioteca de cDNA plasmidica, isolada a partir de células XL-10 Gold serve como uma matriz para o primeiro ciclo do PCR. Como a biblioteca de cDNA foi preparada como uma biblioteca de plasmídeos, é possível utilizar também iniciadores estacionários em combinação com iniciadores derivados e degenerados na reacção de PCR. Para isso, foram utilizados os iniciadores T3 e T7, que se ligam à sequência flanqueando o inserto de cDNA a 5' e a 3', respectivamente, na estrutura do plasmídeo.

Seq ID 3 = Oligo MBmel-for: 5'-CCNGCHGTDGAAGGWACWAAR-3'

Seq ID 4 = Oligo MBmel-revl: 5'-YTTWGTWCCTTCHACDGCMGG-3'

Seq ID 5 = Oligo MBme2-for: 5'-GGNCCNAAYGATGARGTNCC-3' 34 ΡΕ1685248

Seq ID 6 = Oligo MBme2-rev: 5'-GGNACNTCATCRTTNGGRCC-3'

Seq ID 14 = Oligo T3-for: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'

Seq ID 15 = Oligo T7-rev: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' A reacção de PCR foi efectuada na seguinte mistura de reacção:

Tris-HCl a 10 Λ (pH 8,3), KC1 a 50 mM, MgCl2 a 2 mM, dNTP Mix a 1 mM, 30 pMol per iniciador de MBme2-rev e de T3-for e 2,5 U de AmpliTag Gold (Applied Biosystems).

Após ter activado a polimerase AmpliTag Gold (5 min, 95 °C) e a seguir a 25 ciclos de PCR (95 °C, 45 sec; 55 °C, 45 sec; 70 °C, 45 sec), a reacção foi arrefecida até aos 4 °C e parcialmente aplicada num gel de agarose a 1% para análise.

Numa reacção de PCR subsequente, o sinal de amplificação foi amplificado por PCR "encaixado". Assim os iniciadores MBmel-rev e T3-for foram utilizados na reacção de polimerização em cadeia. 2 μΐ da reacção de PCR da primeira reacção serviram como matriz. A reacção foi efectuada num tampão de PCR [Tris-HCl a 10 mM (pH 8,3), KC1 a 50 mM, MgCl2 a 2 mM, dNTP Mix a 1 mM, 30 pMol per iniciador de MBmel-rev e de T3-for e 2,5 U de AmpliTag Gold (Applied Biosystems)]. 35 ΡΕ1685248

Um fragmento específico de 500 pb foi identificado, purificado através de um kit de extracção em gel da Qiagen e ligado ao vector pCR2.1 (Invitrogen) para a subsequente sequenciação. A análise do plasmídeo assim gerado originou uma sequência de cDNA correspondente ao N-terminal da oxido-redutase em estudo (Seq. ID 7) e contendo a sequência de aminoácidos N-terminal da Seq ID 16. 4.3.1. Identificação do C-terminal

Para a identificação do C-terminal do gene da oxido-redutase em estudo, a reacção de polimerização em cadeia foi efectuada com os iniciadores MBMe2-for e T7. A preparação do plasmídeo a partir da biblioteca de cDNA plasmídica de XL-10 Gold serviu como matriz. A reacção de amplificação foi efectuada na seguinte mistura de reacção a quarto temperaturas de ligação diferentes (53 °C; 55 °C; 57 °C; 59 °C).

Mistura de reacção:

Tris-HCl a 10 mM (pH 8,3), KC1 a 50 mM, MgCl2 a 2 mM, dNTP Mix a 1 mM, 30 pMol per iniciador de MBme2-for e de T3-rev e 2,5 U de AmpliTag Gold (Applied Biosystems).

Após a activação da polimerase AmpliTag Gold (5 min, 95 °C) e a seguir a 25 ciclos de PCR (95 °C, 45 sec; 55 °C, 45 sec; 70 °C, 45 sec), a reacção foi arrefecida até aos 4 °C e parcialmente aplicada num gel de agarose a 1% para análise. 36 PE1685248

Uma banda específica de tamanho de 500 pares de base (pb) foi identificada em todas as preparações do gradiente de PCR. Após a purificação fora do gel via kit de extracção em gel da Qiagen, o fragmento de PCR identificado foi ligado para a subsequente sequenciação no vector pCR2.1 (Invitrogen) . A análise da sequência de nucleótidos deste fragmento originou a sequência correspondente ao C-terminal da oxido-redutase em estudo (Seq. ID 8) e contendo a sequência de aminoácidos C-terminal da Seq ID 17. 4.4. Preparação do construtor de expressão para a produção recombinante da oxido-redutase de Metschnikowia zobellii

Com base nas sequências NO: 7 e NO: 8, foram construídos iniciadores específicos para clonar o gene de cadeia completa num sistema de expressão adequado. Por este motivo, foram modificados iniciadores 5' com uma sequência de identificação para Nde I e iniciadores 3' com uma sequência de identificação para Hind III para clonagem no vector de expressão pET21 (Seq. 9, Seq. 10) . Para a clonagem nos vectores da série pQE, foi fornecido o iniciador 5' com uma sequência de identificação para a endonuclease de restrição Bam Hl (Seq. 11). A biblioteca de cDNA de Metschnikowia zobellii preparada no plasmideo pBluescript (Stratagene) serviu como uma matriz para a reacção de polimerização em cadeia. A reacção de PCR foi efectuada num tampão de PCR [Tris-HCl a 37 PE1685248 10 mM (pH 8,3); KC1 a 50 mM; MgS04 a 10 mM; dNTP Mix a 1 mM; 30 pMol por cada iniciador e 2,5 U da polimerase Platinum Pfx DNA (Invitrogen)] com 300 mg do molde e com os seguintes ciclos de temperatura:

Ciclo 1: 94 °c, 2 min Ciclo 2 x 30 : 94 °c, 15 sec 58 °c, 30 sec 68 °c, 75 sec Ciclo 3: 68 °c, 7 min 4 °c, co

Após a purificação via gel de agarose a 1%, o amplificado (cerca de 1000 pb) foi digerido com recurso às endonucleases Nde I e Hind III ou com as endonucleases Bam Hl e Hind III, e foi ligado à estrutura do vector pET21a (Novagen) ou do vector pQE30 (Qiagen) tratados com as mesmas endonucleases. Após a transformação de 2 μΐ de bases de ligação nas células de E. coli Top 10F' (Invitrogen), os DNAs plasmidicos das colónias resistentes à ampicilina foram testados através da análise de restrição com as endonucleases Nde I e Hind III ou as endonucleases Bam Hl e Hind III quanto à presença de um inserto de 1000 pb. Os construtores de expressão pET21-MEvl#l e pQE-30-Mevl#9 foram sequenciados. O transcrito de Metschnikowia zobellii que codifica para uma oxido-redutase possui uma janela de leitura aberta de 1014 pb na totalidade (Seq. 12) , correspondendo a uma proteína de 338 aminoácidos (Seq. 13). 38 PE1685248 4.5 Produção de uma oxido-redutase recombinante a partir de Metschnikowia zobellii em Escherichia coli 4.5.1 Células de BL21 (De3)

Foram transformadas células competentes de

Escherichia coli StarBL21 (De3) (Invitrogen) com o construtor de expressão pET21-MEvl#l que codifica a oxido-redutase de acordo com a invenção. A estirpe foi cultivada em meio LB (triptona a 1%, extracto de levedura a 0,5%, NaCl a 1%, ampicilina a 50 yg/ml), e após atingirem uma densidade óptica de 0,5,

medida a 500 nm, foi induzida com IPTG a 1 mM (isopropiltiogalactósido) . A actividade obtida foi de 4000 U/g de peso biológico liquido. 4.5.2. E. coli RB7 91

Foram transformadas células competentes de

Escherichia coli RB791 com o vector de expressão pQE30-MEvl#9 que codifica a oxido-redutase de acordo com a invenção. A estirpe foi cultivada em meio LB (triptona a 1%, extracto de levedura a 0.5%, NaCl a 1%, ampicilina a 50 yg/ml), e após atingirem uma densidade óptica de 0,5,

medida a 50 0 nm, foi induzida com IPTG a 1 mM 39 ΡΕ1685248 (isopropiltiogalactósido). A actividade obtida foi de 320 U/g de peso biológico liguido.

Exemplo 5

Caracterização da oxido-redutase recombinante de Metschnikowia zobellii 5.1. pH óptimo

Foram produzidos os tampões listados na Tabela 3. A concentração dos respectivos componentes do tampão foi de 50 mM em cada caso.

Tabela 4

Valor de pH Sistema Valor de pH Sistema tampão tampão 4 Na-acetato / 7,5 KH2PO4/K2HPO4 ácido acético 4,5 Na-acetato / 8 KH2PO4/K2HPO4 ácido acético 5 KH2PO4/K2HPO4 LO 00 KH2PO4/K2HPO4 LO LO KH2PO4/K2HPO4 9 Glicina/NaOH 6 KH2PO4/K2HPO4 9,5 Glicina/NaOH LO KH2PO4/K2HPO4 10 Glicina/NaOH 7 KH2PO4/K2HPO4 11 Glicina/NaOH

Medição lote (25 °C) : 40 ΡΕ1685248 870 μΐ dos respectivos sistemas tampão listados na tabela 3 20 μΐ de NADPH a 10 mM (8,6 mg/ml de água) 10 μΐ de enzima diluída

Foi incubado durante 2 a 3 minutos, seguido da adição de 100 μΐ de solução de substrato (100 mM de 2-oxo-4-fenil-etil-butirato).

Para a determinação do pH óptimo, a reacção enzimática foi determinada no respectivo tampão listado na tabela 3. Para a determinação do pH óptimo para a redução, foi utilizado como co-factor o NADPH e como substrato o 2-oxo-4-fenil-etil-butirato. Foi assim possível determinar um pH óptimo entre 5,5 e 6,5 para a enzima de acordo com a invenção para a reacção de redução. 5.2.1 Temperatura óptima

Para a determinação da temperatura de teste óptima, a actividade da enzima foi medida num lote padrão na gama de temperaturas de 15 °C a 7 0 °C. Como pode ser observado na tabela 4, a enzima alcançou a sua actividade máxima aos 25 °C, subsequentemente a actividade diminui rapidamente. 41 PE1685248

Tabela 4

Temperatura (°C) Actividade em U/ml de enzima não diluída Temperatura (°C) Actividade em U/ml de enzima não diluída 15 115 45 0 20 86 50 0 25 135 55 0 30 112 60 0 35 0 65 0 40 0 70 0 5.3. Estabilidade da temperatura

De uma forma análoga à descrita no exemplo 5.1., a estabilidade da temperatura foi determinada para a gama entre 15 °C e 70 °C. Desta forma, uma diluição de 1:20 da oxido-redutase purificada foi incubada durante 60 min e 180 min à respectiva temperatura e subsequentemente medida com o teste lote anterior. Também aqui, o valor de medição que foi obtido imediatamente após a diluição da oxido-redutase purificada em tampão fosfato de potássio a 50 mM e pH =7,0 foi estabelecido como um valor inicial. Este valor foi também estabelecido como valor 100% neste exemplo. A enzima apresentou estabilidade durante diversos dias a uma temperatura abaixo dos 25 °C, enquanto que a 42 PE1685248 actividade da enzima decresceu rapidamente em poucas horas a temperaturas acima dos 25 °C. 5.4. Espectro do substrato / excesso enantiomérico 0 espectro do substrato da oxido-redutase de acordo com a invenção foi determinado através da medição da actividade da enzima com um número de cetonas, ésteres dos ácidos oxo e cetonas cíclicas. Para este fim, a medição padrão de lote de acordo com o exemplo 5.1 foi utilizada com vários substratos. A actividade com o 2-oxo-4-fenil-etil-butirato foi estabelecida como 100%, e todos os outros substratos foram determinados em relação a esta.

Para a determinação do valor de ee foi utilizada a seguinte reacção lote para os substratos seleccionados: 100 μΐ de TEA a 100 mM pH = 7 100 μΐ de NADPH (50 mM) 60 μΐ de substrato (100 mM) + 1 a 2 U da oxido-redutase de acordo com a invenção

Os lotes para a determinação de ee foram extraídos com clorofórmio após 24 horas, e o excesso enantiomérico do álcool resultante foi determinado através de GC. - 43 - ΡΕ1685248

Tabela 5

Substrato Actividade relativa % Estereo- selectividade Substrato Actividade relativa ¾ Estereo-selectividade l-fenil-2-propanona 15¾ 97¾S éster etílico do ácido 4-cloroaceto-acético 100¾ rac 2-cloro-l-(3-cloro-fenil)-etan-l-ona 5¾ 97¾R éster etílico do ácido 8-cloro-6-oxo-octanóico 50¾ 100ÍR acetofenona 0¾ n.d. éster metílico do 3-oxo-1,8-dimetiloctano-díácído 35¾ n.d. caprilofenona 0¾ n.d. ciclohexanona 3¾ n.d. butan-2-ona 0¾ n.d. éster etílico do ácido 2-oxo-cíclohexanóíco 20¾ n.d. l,4-dicloro-butan-2- ona 27¾ 40%S 2-metilciclo- hexanona 8¾ n.d. - 44 - ΡΕ1685248

Ácido etil-2-οχο-valeriano 100¾ 62IR 3-metilciclo- hexanona 8¾ n.d. etil 2-oxo-4-fenil-butirato 100¾ 95%R éster etílico do ácido (2-clorofenil)-oxoacético 50¾ 99.5%R Etil bromopiruvato 28¾ n.d. éster etílico do ácido 2-oxo-ciclopentanóico 8¾ n.d. Etil-fenil-glioxilato 50¾ 99.5¾R éster 3-oxo-octano-l,8-diacid-dimetílico n.d. significa não determinado 45 PE1685248

Como pode ser observado na Tabela 5, a oxido-redutase de acordo com a invenção reduz enantiosselectivamente um vasto espectro de compostos carbonilo alifáticos e cíclicos, especialmente ésteres do ácido 2-oxo. Não são aceitáveis álcoois secundários de cadeia curta. Isto significa que aqui o substrato acoplado à regeneração da co-enzima com álcoois secundários como co-substratos não pode ser aplicado. 5.5. Exemplos de reacção 5.5.1 Redução do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato para o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato

Para a redução do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato, foi estratificada uma mistura de 800 μΐ de tampão (TEA a 100 mM, pH = 8, ©Triton X 100 a 10%) , 100 μΐ de isopropanol (1,3 mmol) , 0,1 mg de NADP (0,1 pmol) ) , 10 U da oxido- redutase recombinante de Metschnikowia zobellii e 5 unidades da álcool desidrogenase de Thermoanerobium brockii com 50 μΐ do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato (0,25 mmol) dissolvido em 600 μΐ de n-heptano e incubada durante 24 h a 25 °C sob agitação constante.

Após 24 h, 92% do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato utilizado foi reduzido. 0 excesso enantiomérico do (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato obtido foi superior a 90%. 46 PE1685248 5.5.2 Redução do éster etílico do ácido 8-cloro-6-oxo-octanóico para o éster etílico do ácido (R)-8-cloro-6-hidroxi-octanóico

Para a redução do éster etílico do ácido 8-cloro-6-oxo-octanóico, foi estratificada uma mistura de 800 μΐ de tampão (TEA a 100 mM, pH = 8, ©Triton X 100 a 5%), 80 μΐ de isopropanol (1,04 mmol) , 0,1 mg de NADP (0,1 pmol) ) , 25 U da oxido-redutase recombinante de Metschnikowia zobellii e 5 unidades da álcool desidrogenase de Thermoanerobium brockii com 50 μΐ do éster etílico do ácido 8-cloro-6-oxo-octanóico (0,25 mmol) dissolvido em 600 μΐ de ciclohexano e incubada durante 24 h a 25 °C sob agitação constante.

Após 24 h, 55% do éster etílico do ácido 8-cloro-6-oxo-octanóico utilizado foi reduzido. O excesso enantiomérico do éster etílico do ácido (R)-8-cloro-6-hidroxi-octanóico obtido foi superior a 97%. 5.5.3 Redução da 2-cloro-l-feniletan-l-ona para o (lR)-2-cloro-l-feniletan-l-ol

Para a redução da 2-cloro-l-feniletan-l-ona, foi estratificada uma mistura de 800 μΐ de tampão (TEA a 100 mM, pH = 8, ©Triton X 100 a 5%), 100 μΐ de isopropanol (1,3 mmol), 0,1 mg de NADP (0,1 pmol) ) , 20 U da oxido-redutase recombinante de Metschnikowia zobellii e 5 unidades da álcool desidrogenase de Thermoanerobium brockii com 50 mg 47 PE1685248 da 2-cloro-l-feniletan-l-ona (0,33 iranol) dissolvida em 400 μΐ de ciclohexano/éter metil-tert-butílico (50:50) e incubada durante 24 h a 25 °C sob agitação constante.

Após 48 h, 75% da 2-cloro-l-feniletan-l-ona utilizado foi reduzido. O excesso enantiomérico do (lR)-2-cloro-l-feniletan-l-ol obtido foi superior a 94%. 5.5.4 Redução do etil-fenil-glioxilato para o (1R)-mandelato de etilo

Para a redução do etil-fenil-glioxilato, foi estratificada uma mistura de 800 μΐ de tampão (TEA a 100 mM, pH = 8, ©Triton X 100 a 5%), 100 μΐ de isopropanol (1,3 mmol) , 0,1 mg de NADP (0,1 pmol) ) , 20 U da oxido-redutase recombinante de Metschnikowia zobellii e 10 unidades da álcool desidrogenase de Thermoanerobium brockii com 50 μΐ do etil-fenil-glioxilato (0,31 mmol) dissolvido em 600 μΐ de ciclohexano e incubada durante 24 h a 25 °C sob agitação constante.

Após 48 h, 50% do etil-fenil-glioxilato utilizado foi reduzido. O excesso enantiomérico do (IR)-mandelato de etilo obtido foi superior a 99%. ΡΕ1685248 48

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <Ί 1 Q> Juelich Enzyme Products GmbH <12G> Oxidoreduktase aus Metschnikowia zobeiiii < 130> Metschníkowia <160> 1? <' 70> Patentln vecsion 3,1

<210> 1 <211> 11 <212> PBT <21 S> Metschníkowía zobelííí <4Ó0> 1

Glu Leu Leu Leu Pro Ala Vai Glu Gly Thr Lys X S 10

<210> 2 <211 >21 <212> PRT <213> Metechnikowia zobeliii <400>2 49 ΡΕ1685248 I*eu Gly Pro Asn Asp Glu Vai Pro Ser Gin Ser His Trp Gly Ser Cys 15 10 15

Gly Phe Vai Asp Vai 20 <210>3 «211» 21 «212> PHT «213> Artificial <400> 3

Cya Cys Asn Gly Cys His Gly Thr Asp Gly Ala Ala Gly Gly Trp Ala . 15 10 15

Cys Trp Ala Ala Arg 20 <210> 4 <211 >21 <212> PRT <2i3> Artificiai <400> 4

Tyr Thr Thr Trp Gly ‘Thr Trp Cys Cys Thr Thr Cys His Ala Cya Asp 1 S 10 15

Gly Cya Mefc Gly Gly 20 <210>5 <211 >20 <212> PRT <213> Artificial <400>5

Gly Gly Asn Cys Cya Asn Ala Ala Tyr Gly Ala Thr Gly Ala Arg Gly 1 5 10 15

Thr Asn Cys Cys 20 50 PE1685248 <210> 6 <211 >20 <212 » PRT <213> Artificia! <400> 6 <?iy Gly Asn Ala Cys Asn Thr Cy& Ala Thr Cys Arg Thr Thr Asa Gly X 5 10 is

Gly Arg Cys Cys 20

«210> 7 «211 >451 «212> DNA «21 S> fv1etsehr?íiwwía zcbsliii <400>7 tfcaattaacc cggccgetet agaactagtg tcatcfcgetc tacctccaca ggctfceattg etc&ctaaag 60 gatccceegg 120 scfcfc-atcatg 100 ggaaaaaaag gctgcaggaa aecacttcag

Gtggagotcc tteggcacga tctttgtctc accgcggtgg ggctcaaact fcS9tgccacc cccagcacgt tccgteagtaa ccgcegagaa acctacgagg fcggtgcccaa catccagagg tgtctgtgtt attgagaaag cgtcaaactc 240 aggcaagaac 300 acfccgaagcg 360 tttgcacacg 420 cttcfcctcga ctageaaagc ccfcggtgccfe gcctcgcccg aaggcfcacaa tafcfcfcggcac ttgacgaggc tcacctfctga cgtcgttggc cggctcetfcc cttggaaaag cgtcaaggae

aafctgctfccfc caacgccgta gaaggaacaa a 4SX

<210> 6 «211 > 484 «212> DMA <213> Metschnikowia zobeliií <400>8 51 PE1685248 aattcggctt tcgacgtgag ggteegaatg 60 afcgaagttec ctcgcaactg ggsggtttcg agacgfcggec agcgccfcfctfc aaggctcacfc 120 fcggcegcatfc cgagggcgga cfccfccgaacc gettagaaeg ataagtttgfc gcagcgttfca 180 atgcgcaacg cgtgcttgac ataatcaaca taacttgaga aaagcactgg ggacagttgc 240 ecactggaac gccttgtaaa ggcgagccsfcg ctctgbg&cg ccgacttgga gacaattcga 300 gaaccaagaa gfctattgaac ttcccagcca gaactgtgtg ttttgtaagc gtggactcgg 360 ttacccagct catgaagtce eagaagaagg gcacatagtg tcgagggggg aatcaaaaag 420 tacagtgaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaac gcccggta.oe geacactgge ggcc 484 <210> 9 <211 >36 «212> DMA <213» Artificiei «400>9 caafctcgccc 480 fcatagtgagt cgtattaaag ccgaatfccea ggaattccat atgatgacca cttcagtctt tgtcfcc 36 <210> 10 <211 >30 <2f2> DMA <213» Artsfíciaf <400> 10 cccaagcfctc gctfcacaaaa ecttcttcfcg 30 <210» 11 <211 >33 <212> DMA <213> Artificiai <400» 11 52 ΡΕ1685248 gcgcggaticc atgaccactt cagtctttgt cfcc 33

<210> 12 <211» 1156 <212> DMA <213> Metschnifcowía zobefiii <400> 12 fcgagcgg&fca gaga ta taca caattcccct 60 ctagaaataa tfcfcfcgfcfetaa ctfctaagaag tafcgatgaec agcacgtagt actfccagtct 120 fcfcgtctcfcgg tgcrcaccggc fcteattgcec caaacfccctt ccgagaaagg etcbcgaaag 180 gctacaacgt cgfcfcggctec gtcagaaccg csagaac ofea tgcccaaact gcaaagctat 240 tfcggcacegg ctcettcacc fcacgaggfcgg cgaagcgoct etgfcgtttett ggtgccttfcg 300 aegaggecfct ggaaaagcat ccagaggtgt gcasacgçjcc fcgcttcfcccc tcgcccgfcca 360 cctfctgacgfc caaggacafcfc gagaaagagt cgccgfcc&ag cgcagatcaa ggcaccaaaa 420 acgtetttag fcgccatcaaa gcecacggcc aaacgfcçgtg acofcggaoce gtgacgtcct 480 ctgttgctgc ggcaefccgafc cccgctagaa cacgttcact cgaagcagaa gtgaafcgaag 540 actcfcfcggaa cccaatctcg tgggaggact cgeeatgace gggafcfctfcgt gggtactttg 600 gefcccaagaa gtttgeagag aaggccgcgt ggaagccgag aagoccaact ttcfcgfctgaa caccgtgttg ccegtgtacg ΡΕ1685248 - 53 - fccttfcggccc 660 ccaggçgfcfcfc tcatcaacaa gactccgagg 720 teaagggcga gctcaactac tctgccgaa» gfctgttgaag tcgtcgacgt tfcgggaccca 780 acgacgaagt gccctegcaa ctggggggtt gagagacgtg accagcgcct gccaaggctc 840 actfcggecgc attcgagggc ggactctcga fctfcgcttaga acaataagtt acggcagcgt 900 tfcaatgcgca acgcgtgctt gacataatca tgttaacttg çtgaaagcac agaggacagfc 960 fcgcecacfcgg aacgccfctgt aaaggcgagc fcggctctgtg ccafccgactt acggacaafet 1020 cgagaaecaa gaagttattg aacfcteccag ggagaactgfc aggtfcttgta gfcggfcggact 1080 cggttaceca gctcatgaag tcceagaaga agcgaagctfc cggctgcfcaa gcggccgcac 1140 tcgagcacca ccaceaceac caetgagãte caaagccnga aagga 1155

<210> 13 <211 >338 <212> PRT <213> Meíschnikowía zobeil <400> 13

Mefc Thr Thr Ser vai Phe Vai Ser Gly Ala Thr Gly Pha lie Ala Gin 1 S 10 15

Mis Vai Vai Lys Leu Leu Leu Ser Lys oly Tyr Asn Vai Vai Gly Ser 20 25 30

val Arg Thr Ala Glu Lys Gly Lys Asn Leu Ala Lys Leu phe Gly Thr 35 40 4S

Gly Ser Phe Thr Tyr Glu Val Val Pr o hys Leu Glu Ala Pro Gly Ala 50 55 60

Phe Aep Glu Ala Leu Glu Lys His Pro Glu Val Ser Val Phe Leu His 65 70 75 80 54 ΡΕ1685248

Thr Ala Ser Pro Vai Thr Phe Asp Vai Lys Asp ile Glu Lys Glu Leu 85 90 9S

Leu Leu Pro Ala Vai Glu Gly Thr Lys Asn Vai Phe Ser Ala Ile Lys 100 105 110

Ala Hís Gly Pro Gin Ile Lys Asn Vai Vai Vai Thr Ser Ser Vai Ala 115 120 125

Ala Ala Leu Asp Pro Ala Arg Asn Leu Asp Pro Thr Phe Thr Vai Asn 130 135 140

Glu Asp Ser Trp Asn. Pro Ile Ser Trp Glu Asp Ser Lys Gin Asn Ala 145 150 155 160

Met Thr Gly Tyr Phe Gly Ser Lys Lys Phe Ala Glu Lys Ala Ala Trp 165 170 175

Asp Phe Vai Glu Ala Glu Lys Pro Asn Phe Leu Leu Asn Thr Vai Leu ISO 185 190

Pro Vai Tyr Vai Phe Gly Pro Gin Ala Phe Asp Ser Glu Vai Lys Gly 195 200 205

Glu Leu Asn Tyr Ser Ala Glu Ile Ile Asn Lys Leu Leu Lys Leu Gly 210 215 220

Pro Asn Asp Glu Vai Pro Ser Gin Leu Gly Gly Phe Vai Asp vai Arg 225 230 235 240

Asp Vai Ala Lys Ala His Leu Ala Ala Phe Glu Gly Gly Leu Ser Asn 245 250 255

Gin Arg Leu Leu Leu Arg Thr Ala Ala Phe Asn Ala Gin Arg Vai Leu 260 265 270 55 ΡΕ1685248

Asp Ile JXle Asn Asn Lys Phe Vai Asn leu Arg Glv Gin Leu Pro Thr 275 280 285

Gly Thr Pro Cys Lys Gly Glu Pro Glu Ser Thr Gly Ser Vai Thr Asp 2S0 235 300

Asn Ser Arg Thr lys Lys Leu Leu Asn Phe Pro Ala Ile Asp Leu Glu 305 310 315 320

Asn Cys Vai Vai Asp Ser Vai Thr Gin Leu Met Lys Ser Gin Lya Lys 325 330 335

Vai Leu <2iG> 14 <211 >20 <212» DMA <213> Artificiai <4GG> 14 aattaaccct cactaaaggg 20 <21Q> 15 <211 >20 <212> DNA <213> Artificial <400> 15 taatacgact cactataggg 20

<210> 16 <211> 104 <212> PRT <213> MeíscítnSkowia zobeífB <400> 18 56 ΡΕ1685248

Met Thr Thr Ser Vai Phe Vai Ser Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Gin 1 S 10 15

Kis Vai Vai Lys Leu Leu Leu Ser Lys Gly Tyr Asn Vai Vai Gly Ser 20 25 30

Vai Arg Thr Ala Glu Lys Gly Lys Asn Leu Ala Lys Leu Phe Gly Thr 35 40 45

Gly Ser Phe Thr Tyr Glu Vai Vai Pro Lys Leu Glu Ala Pro Gly Ala 50 55 50

Phe Asp Glu Ala Leu Glu Lys Kis Pro Glu Vai Ser Vai Phe Leu His 55 70 75 80

Thr Ala Ser Pro Vai Thr Phe Asp Vai Lys Asp Ile Glu Lys Glu Leu 85 PO 95

Leu Leu Pro Ala Vai Glu Gly Thr 100 <210> 17 <211> 12?

<212> PRT <213> Metechnikowia zobellii <400> 17 57 PE1685248

Ile Arg Leu Cly Pro Asn Asp Glu Vai Pro Ser Gin Leu Gly Gly Phe 1 S 10 15

Vai Asp Vai Arg Asp Vai Ala Lys Ala His leu Ala Ala Phe Glu Gly 20 25 30

Gly Leu Sar Asn Gin Arg Leu Leu I»eu Arg Thr Ala Ala Phe Asn Ala 35 40 45

Gin Arg Vai Leu Asp Ile Ile Asn Asn Lys Phe Vai Aan Leu Arg Gly 50 55 60

Gin Leu Pro Thr Gly Thr Pro Cys Lys Gly Glu Pro Glu Ser Thr Gly 65 70 75 80

Ser Vai Thr Asp Asn Ser Arg Thr Lys Lys Leu Leu Asn Phe Pro Ala 85 90 95

Ile Asp Leu Glu Asn Cys Vai Vai Asp Ser Vai Thr Gin Leu fifefc Lys 100 105 110

Ser Gin Lys Lys Vai Leu Ala His Ile Vai Asn Gin Lys Vai Gin 115 120 125

Lisboa, 9 de Setembro de 2010

Claims (29)

1. ΡΕ1685248 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma oxido-redutase que reduz um composto carbonilo ao composto hidroxilo quiral correspondente na presença de NADPH e água, caracterizada por mais de 70% dos seus aminoácidos serem idênticos à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e por possuir uma actividade especifica de mais do que 1 mol per mg de proteina, com base na reacção do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato para o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato.
2. 2. A oxido-redutase de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por 80% a 99,5%, preferencialmente 90% a 99,5%, particularmente preferível 99% a 99,5%, dos aminoácidos serem idênticos à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
3. 3. A oxido-redutase de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e por ser codificada pela sequência de DNA da SEQ ID NO: 12.
4. 4. A oxido-redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada por poder ser obtida a partir de leveduras do género Metschnikowia, em particular a partir da Metschnikowia zobellii. 2 ΡΕ1685248
5. 5. A oxido-redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada por possuir, adicionalmente, 1 a 40 aminoácidos a mais do que ou 1 a 40 aminoácidos a menos do que a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13 e que possui uma actividade especifica de mais do que 1 mol per mg de proteina, com base na reacção do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato para o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato.
6. 6. A oxido-redutase de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por possuir 1 a 25 aminoácidos, em particular 2 a 20 aminoácidos, mais preferencialmente 3 a 10 aminoácidos, a mais ou a menos do que na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
7. 7. A oxido-redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, por ser modificada uma, duas, três, quatro ou cinco vezes através de um polímero solúvel em água e por apresentar uma actividade específica de mais do que 1 mol per mg de proteína, com base na reacção do 2-oxo-4-fenil-etil- butirato para o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato.
8. 8. A oxido-redutase de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por o polímero solúvel em água ser o polietilenoglicol. 3 PE1685248
9. 9. Um anticorpo, caracterizado por se ligar especificamente à oxido-redutase de acordo com a SEQ ID NO: 13.
10. 10. Uma sequência de DNA que codifica para a oxido-redutase de acordo com a SEQ ID NO: 13.
11. 11. Uma sequência de DNA que codifica para uma oxido-redutase que catalisa a redução de um composto carbonilo para o composto hidroxilo quiral correspondente na presença de NADPH e água, em que a sequência de DNA a) corresponde à SEQ ID NO: 12 ou à cadeia complementar dai resultante, ou b) é uma sequência de DNA que hibridiza com a sequência de DNA de acordo com a) ou com a cadeia complementar dai resultante, com a hibridização a ter lugar sob condições de estringência, ou c) é uma sequência de DNA que, como resultado da degeneração do código genético, codifica uma proteina que é também codificada por uma sequência de DNA de acordo com a) ou com b).
12. 12. Uma sequência de DNA, caracterizada por mais de 70% das suas base de ácido nucleico serem idênticas à sequência de DNA da SEQ ID NO: 12 ou à cadeia complementar dai resultante e que codifica uma oxido-redutase que possui uma actividade especifica de mais do que 1 mol per mg de 4 PE1685248 proteína, com base na reacção do 2-oxo-4-fenil-etil-butirato para o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato.
13. 13. A sequência de DNA de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por 80% a 99,5%, preferencialmente 90% a 99,5%, particularmente preferível 99% a 99,5%, das base de ácido nucleico serem idênticas à sequência de DNA da SEQ ID NO: 12.
14. 14. Um vector de clonagem, caracterizado por compreender uma ou várias das sequências de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 13.
15. 15. Um vector de expressão, caracterizado por compreender uma ou várias das sequências de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 13 e por se encontrar ligado a uma sequência de controlo da expressão.
16. 16. Uma célula hospedeira que é uma célula bacteriana, de levedura, de insecto ou de planta e que foi transformada ou transfectada com um vector de expressão de acordo com a reivindicação 15.
17. 17. Um processo para a redução enantiosselectiva de compostos carbonilo para os compostos hidroxilo quirais correspondentes, caracterizado por a) um composto carbonilo é reduzido para o composto 5 ΡΕ1685248 hidroxilo quiral correspondente na presença de uma oxido-redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, NADPH e água, e b) o composto hidroxilo quiral formado é isolado.
18. 18. Um processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por um composto de fórmula I Rl-C(0)-R2 (I) ser utilizado como o composto carbonilo, em que RI significa 1) (C1-C20)-alquilo, que é de cadeia linear ou ramificada, 2) (C2-C20)-alquenilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma, duas, três ou quatro ligações duplas, dependendo do comprimento da cadeia, 3) (C2-C20)-alquinilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma, duas, três ou quatro ligações triplas, dependendo do comprimento da cadeia, 4) (C6-C14)-arilo, 5) (C1-C8)-alquilo-(C6-C14)-arilo, 6) (C5-C14)-heterociclo que se encontra não substituído ou substituído uma a três vezes, preferencialmente por halogéneo, hidroxilo, amino ou nitro, ou 7) (C3-C7)-cicloalquilo, em que as porções mencionadas acima entre 1) e 7) se encontram não substituídas ou substituídas uma, duas ou três vezes, independentemente umas das outras, por a) -OH 6 ΡΕ1685248 b) halogéneo tal como o flúor, o cloro, o bromo ou o iodo, c) -N02 ou d) -NH2, e R2 significa 1) (C1-C6)-alquilo, que é de cadeia linear ou ramificada, 2) (C2-C6)-alquenilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma, duas ou três ligações duplas, dependendo do comprimento da cadeia, 3) (C2-C6)-alquinilo, que é de cadeia linear ou ramificada e contém uma ou duas ligações triplas, dependendo do comprimento da cadeia, 4) (C0-C10)-alquilo-C(0)-0-(C1-C6)-alquilo, em que alquilo é linear ou ramificado e encontra-se não substituído ou substituído uma a três vezes, preferencialmente por halogéneo, hidroxilo, amino ou nitro, em que as porções mencionadas acima entre 1) e 4) se encontram não substituídas ou substituídas uma, duas ou três vezes, independentemente umas das outras, por a) -OH, b) halogéneo tal como o flúor, o cloro, o bromo ou o iodo, c) -N02 ou d) -NH2.
19. 19. 0 processo de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado por a) um composto carbonilo ser reduzido para o composto hidroxilo quiral correspondente na presença da oxido- 7 ΡΕ1685248 redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, NADPH e água, b) o NADP formado pela oxido-redutase ser reduzido a NADPH com um co-substrato, e c) o composto hidroxilo quiral formado ser isolado.
20. 20. O processo de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado por a) um composto carbonilo ser reduzido para o composto hidroxilo quiral correspondente na presença da oxido- redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, NADPH e água, b) o NADP formado pela oxido-redutase ser reduzido a NADPH com uma desidrogenase e um co-substrato, e c) o composto hidroxilo quiral formado ser isolado.
21. 21. O processo de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado por a) um composto carbonilo ser reduzido para o composto hidroxilo quiral correspondente na presença da oxido- redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, NADPH e água, b) a reacção ser efectuada na presença de um solvente orgânico, e c) o composto hidroxilo quiral formado ser isolado.
22. ΡΕ1685248 22. 0 processo de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado por a) um composto carbonilo ser reduzido para o composto hidroxilo quiral correspondente na presença da oxido-redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, NADPH e áqua, b) a reacção ser efectuada na presença de um solvente orqânico, c) o NADP formado pela oxido-redutase ser reduzido a NADPH com um co-substrato, e d) o composto hidroxilo quiral formado ser isolado.
23. 23. 0 processo de acordo com as reivindicações 17 ou 18, caracterizado por a) um composto carbonilo ser reduzido para o composto hidroxilo quiral correspondente na presença da oxido-redutase de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, NADPH e água, b) o NADP formado pela oxido-redutase ser simultaneamente reduzido a NADPH com uma desidrogenase e um co-substrato, c) a reacção ser efectuada na presença de um solvente orgânico, e d) o composto hidroxilo quiral formado ser isolado.
24. 24. 0 processo de acordo com as reivindicações 19, 20, 22 ou 23, caracterizado por o 2-propanol, o 2- 9 ΡΕ1685248 butanol, o 2-pentanol ou o 2-octanol serem utilizados como o co-substrato.
25. 25. 0 processo de acordo com as reivindicações de 17 a 24, caracterizado por o 2-oxo-4-fenil-etil-butirato originar o (R)-2-hidroxi-4-fenil-etil-butirato, o 8-cloro-6-oxo-etil-caprilato originar o (R)-8-cloro-6-hidroxi-etil-caprilato, a 2-cloro-l-fenil-etan-l-ona originar o (lR)-2-cloro-l-fenil-etan-l-ol ou o etil-fenil-glioxilato originar o (lR)-etil mandelato.
26. 26. 0 processo de acordo com as reivindicações 20 ou 23, caracterizado por ser utilizada uma desidrogenase de Thermoanaerobium brockii, de Lactobacillus kefir ou de Lactobacillus brevis.
27. 27. O processo de acordo com as reivindicações 20 ou 23, caracterizado por a formato desidrogenase dependente de NADPH ser utilizada como a desidrogenase e por ser utilizado um sal do ácido fórmico tal como o formato de amónio, o formato de sódio ou o formato de cálcio como o co-substrato.
28. 28. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, caracterizado por o éter metil-butílico terciário, o éter di-isopropilico, o heptano, o hexano ou o ciclohexano ou misturas dai resultantes ser / serem utilizado/utilizados como o solvente orgânico. 10 ΡΕ1685248
29. 29. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 21 a 23, caracterizado por o solvente orgânico formar uma fase cuja proporção é de 5% a 80%, preferencialmente 10 to 40%, com base no volume de reacção total. Lisboa, 9 de Setembro de 2010