CN115433735A - 乙醇酸的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了乙醇酸的生产方法。本发明提供了一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括使受体菌表达3‑磷酸甘油醛脱氢酶GapC的步骤；还包括对所述受体菌进行如下改造的步骤：抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达、抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达、和/或表达乙醛酸还原酶YcdW；所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。本发明所构建的大肠杆菌工程菌NZ‑G466在利用葡萄糖生产乙醇酸的摇瓶发酵试验中，乙醇酸产量可达5.3g/L，葡萄糖到乙醇酸转化率可达1.89mol/mol。本发明对于葡萄糖合成乙醇酸具有重要意义。

Description

乙醇酸的生产方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种乙醇酸的生产方法。
背景技术
乙醇酸(glycolate,glycolic acid)又称为羟基乙酸(hydroxyacetic acid)，甘醇酸，分子式为C2H4O3，含有一个羟基和一个羧基，兼有醇和酸的双重性质。在化学清洗，生物降解，日用化工，纺织工业等行业得到了普遍的应用。
国外主要的生产厂家有美国杜邦公司(Dupont)，美国联合碳化合物公司(UCC)，德国赫可特公司(Hoechst)，日本丸和公司(Midori Kagaku)等。国内主要厂家有北京化工厂、靖江宏泰化工有限公司，河北诚信有限公司等十多家。目前国际市场的年需求量约为20万吨。乙醇酸全球市场价值在2011年为9300万美元，据估计，该数字到2018年将会增加到2亿300万美元。因此，乙醇酸具有极为重要的市场价值和开发潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种乙醇酸的生产方法。
第一方面，本发明要求保护一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法。
本发明要求保护的构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，可包括使受体菌表达3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的步骤。所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。
进一步地，所述方法还可包括对所述受体菌进行如下改造的步骤：抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达、抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达、和/或表达乙醛酸还原酶YcdW。
具体而言，本发明所要求保护的构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，可包括如下步骤(A1)：
(A1)使受体菌表达3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，所得菌株命名为工程菌1(对应NZ-G400)；所述工程菌1为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。
进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A2)：
(A2)以所述工程菌1为出发菌株，抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达，所得菌株命名为工程菌2(对应NZ-G416)；所述工程菌2为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
更进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A3)：
(A3)以所述工程菌2为出发菌株，抑制其内源苹果酸合酶AceB、乙醇酸脱氢酶AdhE、醛脱氢酶AldA、乳酸脱氢酶LdhA、甲基已二醛合酶MgsA、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta、丙酮酸氧化酶PoxB的表达，所得菌株命名为工程菌3(对应NZ-G426)；所述工程菌3为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
再进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A4)：
(A4)以所述工程菌3为出发菌株，表达T7 RNA聚合酶并抑制内源鼠李糖降解途径酶RhaBAD的表达，将T7启动子整合于基因组中乙醛酸还原酶YcdW编码基因(即ycdW基因)的起始密码子前，表达乙醛酸还原酶YcdW并抑制内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，抑制内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，增强内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因(即aceA基因)的表达，所得菌株命名为工程菌4(对应NZ-G456)；所述工程菌4为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
又进一步地，所述方法还可包括如下步骤(A5)：
(A5)以所述工程菌4为出发菌株，抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达，所得菌株命名为工程菌5(对应NZ-G466)；所述工程菌5为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
在所述步骤(A1)中，使所述受体菌表达所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，可通过如下实现：用所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因(即gapC基因)替换所述受体菌基因组中所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的编码基因(即gapA基因)。进一步地，可通过同源重组实现。
在本发明的具体实施方式中，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC为源于丙酮丁酸梭菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC。
所述步骤(A2)可为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的异柠檬酸脱氢酶ICDH的编码基因(即icdA基因)，所得菌株即为所述工程菌2(对应NZ-G416)。
所述步骤(A3)可为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中的苹果酸合酶AceB的编码基因(即aceB基因)、乙醇酸脱氢酶AdhE的编码基因(即glcDEF基因)、醛脱氢酶AldA的编码基因(即aldA基因)、乳酸脱氢酶LdhA的编码基因(即ldhA基因)、甲基已二醛合酶MgsA的编码基因(即mgsA基因)、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的编码基因(即ackA-pta基因)、丙酮酸氧化酶PoxB的编码基因(即poxB基因)，所得菌株即为所述工程菌3(对应NZ-G426)。
在所述步骤(A4)中，表达所述T7 RNA聚合酶并抑制所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的表达，可通过如下实现：将所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的编码基因(即rhaBAD基因)位置处。所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒中启动所述T7 RNA聚合酶的编码基因转录的启动子为Ptrc启动子。进一步地，可通过同源重组实现。其中，所述T7 RNA聚合酶为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶。
在所述步骤(A4)中，表达所述乙醛酸还原酶YcdW并抑制所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，可通过如下实现：将所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因(即ycdW基因)的表达盒整合到基因组中所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的编码基因(即araBAD基因)位置处。进一步地，所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因的表达盒中启动所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因转录的启动子为T7启动子。进一步地，可通过同源重组实现。其中，所述乙醛酸还原酶YcdW为内源乙醛酸还原酶YcdW。
在所述步骤(A4)中，抑制所述内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，可通过如下实现：敲除基因组中的所述DNA结合转录阻遏物IclR的编码基因(即iclR基因)。
在所述步骤(A4)中，增强所述内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因表达是通过如下实现的：采用核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的含有RBS序列的启动子片段启动所述异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达。
所述步骤(A5)可为：以所述工程菌4为出发菌株，敲除基因组中的NADPH转氢酶SthA的编码基因(即sthA基因)，所得菌株即为所述工程菌5(对应NZ-G466)。
在所述方法中，所述受体菌可为大肠杆菌。
在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌ATCC 8739。
所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC可为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质，或为SEQ ID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
所述T7 RNA聚合酶可为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质，或为SEQ IDNo.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
所述乙醛酸还原酶YcdW可为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质，或为SEQID No.3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。
其中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同源性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的氨基酸序列为YP_001724829.1。所述内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的氨基酸序列为YP_001725425.1。所述内源苹果酸合酶AceB的氨基酸序列为YP_001726942.1。所述乙醇酸脱氢酶AdhE的氨基酸序列为YP_001723723.1，YP_001723724.1，YP_001723725.1。所述醛脱氢酶AldA的氨基酸序列为YP_001725238.1。所述乳酸脱氢酶LdhA的氨基酸序列为YP_001725238.1。所述甲基已二醛合酶MgsA的氨基酸序列为YP_001725590.1。所述乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的氨基酸序列为YP_001724349.1，YP_001724348.1。所述丙酮酸氧化酶PoxB的氨基酸序列为YP_001725680.1。所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBAD的氨基酸序列为YP_001727038.1，YP_001727039.1，YP_001727040.1。所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的氨基酸序列为YP_001726535.1，YP_001726536.1，YP_001726537.1。所述内源DNA结合转录阻遏物IclR的氨基酸序列为YP_001726938.1。所述内源异柠檬酸裂解酶ICL的氨基酸序列为YP_001726941.1。所述内源NADPH转氢酶SthA的氨基酸序列为YP_001726980.1。上述各序列为在NCBI数据库中的相应序列。
所述T7启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因(即gapC基因)可为核苷酸序列如SEQID No.4所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.4所示的DNA分子杂交且编码SEQ IDNo.1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.4所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子。
所述T7 RNA聚合酶的编码基因可为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.5所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.5所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子。
所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因(即ycdW基因)可为核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.6所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.6所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子。
上述编码基因中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
上述编码基因中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述编码基因中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH的编码基因(即gapA基因)的核苷酸序列为Gene ID：6065095。所述异柠檬酸脱氢酶ICDH的编码基因(即icdA基因)的核苷酸序列为Gene ID：6065921。所述苹果酸合酶AceB的编码基因(即aceB基因)的核苷酸序列为GeneID：6064573。所述乙醇酸脱氢酶AdhE的编码基因(即glcDEF基因)的核苷酸序列为Gene ID：6065831，6066610，6065809。所述醛脱氢酶AldA的编码基因(即aldA基因)的核苷酸序列为Gene ID：6066995。所述乳酸脱氢酶LdhA的编码基因(即ldhA基因)的核苷酸序列为GeneID：6066995。所述甲基已二醛合酶MgsA的编码基因(即mgsA基因)的核苷酸序列为Gene ID：6064585。所述乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的编码基因(即ackA-pta基因)的核苷酸序列为Gene ID：6068166；6068169。所述丙酮酸氧化酶PoxB的编码基因(即poxB基因)的核苷酸序列为Gene ID：6066040。所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBAD的编码基因(即rhaBAD基因)的核苷酸序列为Gene ID：6065939；6065949；6065976。所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的编码基因(即araBAD基因)的核苷酸序列为Gene ID：6066889；6067404；6066010。所述内源DNA结合转录阻遏物IclR的编码基因(即iclR基因)的核苷酸序列为Gene ID：6064567。所述NADPH转氢酶SthA的编码基因(即sthA基因)的核苷酸序列为Gene ID：6065209。所述内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因(即aceA基因)的核苷酸序列为Gene ID：6064570。上述各Gene ID均为在NCBI数据库中的Gene ID。
在本发明的具体实施方式中，敲除基因组中的某个靶基因是通过包括如下步骤的方法实现的：(a1)在供体质粒placZ的基础上添加了lacI基因和针对自身质粒cat基因的N20-gRNA序列，得到供体质粒pV4；(a2)在所述供体质粒pV4的基础上构建用于敲除所述靶基因的pV4-del-target质粒，该质粒含有针对所述靶基因的target-N20-gRNA序列和敲除所述靶基因的上下游同源臂序列；(a3)将所述pV4-del-target质粒和pRedCas9质粒共同转化所述受体大肠杆菌，从而实现敲除所述受体大肠杆菌基因组中的所述靶基因。
更加具体的，步骤(a1)中，以placZ质粒为模板，使用引物Bone-F和引物Bone-R进行PCR扩增，得到DNA片段I(6.6kb左右的PCR产物)；以pACYC184-M质粒为模板，使用引物lacI-Ptrc-up和引物lacI-Ptrc-down进行PCR扩增，得到DNA片段II(1.5kb左右的PCR产物)；以placZ质粒为模板，用引物cat-N20-up和引物cat-N20-down进行PCR扩增，得到DNA片段III(400bp左右的PCR产物)；将所述DNA片段I、所述DNA片段II和所述DNA片段III用Golden Gate技术策略进行组装，得到所述供体质粒pV4。各引物序列见表2。
更加具体的，步骤(a2)中，以所述供体质粒pV4为模板，用引物N20-B-F1和引物N20-B-R1进行PCR扩增，得到DNA片段I’(4.1kb左右的PCR产物)；以所述供体质粒pV4为模板，用引物target-N20-B-F2(见表2，针对不同的靶基因，对应的引物名称为将“target-N20-B-F2”中的target替换为相应的靶基因名称)和引物N20-B-R2进行PCR扩增，得到DNA片段II’；以大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物target-F1(见表2，针对不同的靶基因，对应的引物名称为将“target-F1”中的target替换为相应的靶基因名称)和引物target-R1(见表2，针对不同的靶基因，对应的引物名称为将“target-R1”中的target替换为相应的靶基因名称)进行PCR扩增，获得DNA片段III’(上游同源臂片段)；以大肠杆菌的基因组DNA为模板，用引物target-F2(见表2，针对不同的靶基因，对应的引物名称为将“target-F2”中的target替换为相应的靶基因名称)和引物target-R2(见表2，针对不同的靶基因，对应的引物名称为将“target-R2”中的target替换为相应的靶基因名称)获得DNA片段IV’；将所述DNA片段I’、所述DNA片段II’、所述DNA片段III’和所述DNA片段IV’用Golden Gate技术策略进行组装，得到所述pV4-del-target质粒。
在本发明的具体实施方式中，用所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因(即gapC基因)替换所述受体菌基因组中所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的编码基因(即gapA基因)、将所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的编码基因(即rhaBAD基因)位置处、将所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因(即ycdW基因)的表达盒整合到基因组中所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的编码基因(即araBAD基因)位置处，完成这三步操作的方法与前文所述“敲除基因组中的某个靶基因”的方法相比，差别仅在于步骤(a2)中构建用于敲除所述靶基因的pV4-del-target质粒时同时引入待插入外源基因序列：以丙酮丁酸梭菌基因组DNA为模板，用引物gapC-F和引物gapC-R扩增得到gapC的基因片段；以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA为模板用引物T7-RNAP-F-AGCT和引物T7-RNAP-R-TGCG扩增得到T7-RNAP的基因片段，以pTrc99AM质粒为模板用引物Ptrc-F-CACT和引物Ptrc-R-AGCT扩增得到Ptrc启动子片段；以T7启动子调控ycdW重组大肠杆菌基因组DNA为模板，用引物T7-ycdW-F-GGTG和引物T7-ycdW-R-CTGG扩增得到带有T7启动子的ycdW基因片段。各引物序列见表2。
在本发明的具体实施方式中，将T7启动子整合于基因组中乙醛酸还原酶YcdW编码基因(即ycdW基因)的起始密码子前可通过包括如下步骤的方法实现：(c1)以pXZ-CS质粒为模板，使用引物ycdW-TK-cat-up和引物ycdW-TK-sacB-down进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段I，并将其整合于大肠杆菌基因组中ycdW基因的ATG前；(c2)以pUC57-Kan-T7质粒为模板，用引物ycdW-TK-T7-up和引物ycdW-TK-T7-down进行PCR扩增，得到同源重组的DNA启动子片段II，进行第二次同源重组，替换所述靶基因前的cat-sacB。
在本发明的具体实施方式中，采用核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的含有RBS序列的启动子片段启动所述异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达可通过包括如下步骤的方法实现：(d1)以pXZ-CS质粒为模板，使用引物aceA-cat-up和引物aceA-sacB-down进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段I，并将其整合于大肠杆菌基因组中所述靶基因的ATG前；(d2)以重组大肠杆菌M1-93的基因组DNA为模板，用引物aceA-P-up和引物aceA-RBSL-down进行PCR扩增，得到同源重组的DNA启动子片段II，进行第二次同源重组，替换所述靶基因前的cat-sacB。其中，引物aceA-RBSL-down中的NNNNNNY具体为TGTTTGC。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面所述方法构建得到的工程菌株。
第三方面，本发明要求保护前文第二方面所述工程菌株在利用葡萄糖生产乙醇酸中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种生产乙醇酸的方法。
本发明要求保护的生产乙醇酸的方法，可包括如下步骤：将前文第二方面所述工程菌株在含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵培养，从发酵产物中获得乙醇酸。
进一步地，进行所述发酵培养时使用的发酵培养基的配方如下：每1L中含有葡萄糖20g，(NH4)2SO4 13.2g、KH2PO4 3.5g、K2HPO4 6.55g、(NH4)2HPO4 3.5g、MgSO4·7H2O 0.12g、甜菜碱-KCl 0.15g。FeCl3·6H2O 1.5μg、CoCl2·6H2O 0.1μg、CuCl2·2H2O 0.1μg、ZnCl20.1μg、Na2MoO4·2H2O 0.1μg、MnCl2·4H2O 0.2μg,H3BO3 0.05μg。或者在此基础上增加20g/L酵母膏。
在所述方法中，进行所述发酵培养的条件可为：37℃、250rpm培养24h。
实验证明，本发明所构建的大肠杆菌工程菌NZ-G466在利用葡萄糖生产乙醇酸的摇瓶发酵试验中，乙醇酸产量可达5.3g/L，葡萄糖到乙醇酸转化率可达1.89mol/mol。本发明对于葡萄糖产乙醇酸具有重要意义。
附图说明
图1为本发明中的乙醇酸生物合成路线。缩写：Glu葡萄糖；GAP 3-磷酸甘油醛；1,3-BPG 1,3-二磷酸甘油酸；PEP磷酸烯醇式丙酮酸；Ac-CoA酰基辅酶A；CIT柠檬酸；ICI异柠檬酸；Suc丁二酸；FUM富马酸；MAL苹果酸；OAA草酰乙酸；GLYX乙醛酸；GA乙醇酸；GapC 3-磷酸甘油醛脱氢酶；ICDH异柠檬酸脱氢酶；SthA NADPH转氢酶；NADPH还原型磷酸烟酰胺二核苷酸；NADP+氧化型磷酸烟酰胺二核苷酸；NADH还原型烟酰胺二核苷酸；NAD+氧化型烟酰胺二核苷酸；YcdW乙醛酸还原酶。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中的乙醇酸生物合成路线如图1所示(本发明涉及四个关键点：GapC的过表达、SthA的敲除、ICDH的敲除和YcdW的过表达；其中以GapC的过表达最为重要)。本发明所用的菌株如表1所示，所用的引物如表2所示，所涉及的质粒如表3所示。
表1、本发明中构建的菌株
Figure BDA0003098861970000091
表2、本发明中使用的引物
Figure BDA0003098861970000092
Figure BDA0003098861970000101
Figure BDA0003098861970000111
Figure BDA0003098861970000121
Figure BDA0003098861970000131
Figure BDA0003098861970000141
表3、本发明中所用以及构建的质粒
Figure BDA0003098861970000151
Figure BDA0003098861970000161
实施例1、重组大肠杆菌NZ-G400的构建
从大肠杆菌ATCC 8739(Gunsalus IC,Hand DB(1941)The use of bacteria inthe chemical determination of total vitamin C.J BiolChem 141:853-858.)出发，采用CRISPR/Cas9双质粒基因编辑系统整合gapC基因(GenBank No:AF043386.1，来源于丙酮丁酸梭菌Clostridium acetobutylicum)，获得重组大肠杆菌NZ-G400(表1)。
(1)供体质粒pV4的构建
供体质粒pV4在pRedCas9的作用下具有自剪切功能，是在供体质粒placZ(仇焕娜等，2018，微生物学通报，45(8)：1693-1704)的基础上添加了lacI基因和针对自身质粒cat基因的N20-gRNA序列，具体构建过程如下：
第一步，获得骨架DNA片段I。以placZ质粒为模板，使用引物Bone-F和Bone-R(表2)进行PCR扩增，得到6.6kb左右的PCR产物，即为骨架DNA片段I，含有cat、P15A和lacZ基因。
扩增体系为：NewEngland Biolabs Phusion 5X缓冲液10μl、dNTP(每种dNTP各2.5mM)1μl、DNA模板20ng、引物(10μM)各2μl、Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、蒸馏水33.5μl，总体积为50μl。
扩增条件为98℃预变性2分钟(1个循环)；98℃变性10秒、56℃退火10秒、72℃延伸2.5分(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。
第二步，获得lacI基因及Ptrc启动子片段II。以pACYC184-M(Zhao et al.2013,Metab Eng 17:42-50)质粒为模板，使用引物lacI-Ptrc-up和lacI-Ptrc-down(表2)进行PCR扩增，得到1.5kb左右的PCR产物，即为DNA片段II。扩增体系和扩增条件参考上文中的第一步。
第三步，获得cat-N20-gRNA片段III。以placZ质粒为模板，用引物cat-N20-up和cat-N20-down(表2)进行PCR扩增，得到400bp左右的PCR产物，即为DNA片段III。扩增体系和扩增条件参考上文中的第一步。
第四步，将骨架DNA片段I、lacI和Ptrc启动子片段II和cat-N20-gRNA片段III用Golden Gate技术策略(Engler et al.2008,PLoS One 3:e3647)进行组装(按照I、II和III的顺序顺次无缝连接)，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物V4-lacI-YZ-up和cat-YZ-down(表2)进行PCR验证，条带大小为1.7Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4质粒，该质粒添加了lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA元件，因此具有自剪切功能。
(2)整合质粒pV4-del-gapA-Ca-gapC的构建
在pV4质粒基础上构建gapC基因整合质粒pV4-del-gapA-Ca-gapC，该质粒含来源于丙酮丁酸梭菌的gapC基因，有目标整合位点gapA(Genbank No：6065095)的gapA-N20-gRNA序列和整合位点gapA基因的上下游同源臂序列。具体步骤如下：
第一步，获得gapC基因片段。以丙酮丁酸梭菌基因组DNA为模板，用gapC-F/gapC-R(表2)扩增得到gapC的基因片段，大小约1kb。gapC基因的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，其编码SEQ ID No.1所示蛋白质。
第二步，获得pV4质粒骨架片段I。以pV4质粒为模板，用引物N20-B-F1和N20-B-R1(表2)进行PCR扩增，得到4.1kb左右的PCR产物，即为pV4质粒骨架片段I。该片段含有cat、P15A和自剪切元件lacI-Ptrc-cat-N20-gRNA。扩增体系和扩增条件参考前文步骤(1)中的第一步。
第三步，获得gapA-N20-gRNA序列片段II。以pV4质粒为模板，用引物gapA-N20-B-F2和N20-B-R2(表2)进行PCR扩增，得到400bp左右的PCR产物，即为DNA片段II。扩增体系和扩增条件参考前文步骤(1)中的第一步。
第四步，获得gapA基因的上下游同源臂片段III和片段IV。以大肠杆菌ATCC 8739(Gunsalus et al.,1941,J Biol Chem 141:853-858)的基因组DNA为模板，用引物gapA-F1和gapA-R1(表2)进行PCR扩增，获得上游同源臂片段III，约500bp。同理，用引物gapA-F2和gapA-R2(表2)获得下游同源臂片段IV，约500bp。扩增体系和扩增条件参考前文步骤(1)中的第一步。
第五步，将gapC基因片段、pV4质粒骨架片段I、gapA-N20-gRNA序列片段II和gapA基因的上下游同源臂片段III和片段IV用Golden Gate技术策略进行组装(按照片段I、II、III、gapC基因片段和IV的顺序顺次无缝连接)，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-up和gapC-R(表2)进行PCR验证，条带大小为1.9Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-gapA-Ca-gapC质粒。
(3)gapC基因整合
从大肠杆菌ATCC 8739出发，制备电转化感受态细胞，将质粒pRedCas9(Zhao etal.2016,Microb Cell Fact 15)和pV4-del-gapA-Ca-gapC同时转化到ATCC 8739电转化感受态细胞，涂卡纳霉素和氯霉素双抗平板，置于30℃过夜培养。挑取单克隆于2mL LB(含卡纳霉素和氯霉素；2.5％L(+)-阿拉伯糖)，250r/min转速，30℃过夜诱导同源重组和切割未发生重组的DNA。稀释涂LB平板(含卡纳霉素和氯霉素，2.5％L(+)-阿拉伯糖)，30℃过夜培养。挑取10个单克隆进行菌落PCR验证，引物为gapA-YZ-up和gapC-R(表2)，大小约1.8kb。阳性克隆命名为NZ-G400。
实施例2、重组大肠杆菌NZ-G400的发酵
对重组大肠杆菌NZ-G400进行发酵产乙醇酸评价。
NBS种子和发酵培养基：每1L中含有葡萄糖20g，(NH4)2SO4 13.2g、KH2PO4 3.5g、K2HPO4 6.55g、(NH4)2HPO4 3.5g、MgSO4·7H2O 0.12g、和甜菜碱-KCl 0.15g。FeCl3·6H2O1.5μg、CoCl2·6H2O 0.1μg、CuCl2·2H2O 0.1μg、ZnCl2 0.1μg、Na2MoO4·2H2O 0.1μg、MnCl2·4H2O 0.2μg、H3BO3 0.05μg。
摇瓶发酵：将LB平板上的单克隆转接于2ml NBS培养基中，37℃、250rpm培养12-24h，获得摇瓶发酵种子液。按1％(v/v)的接种量转接于20ml NBS培养基中，37℃、250rpm培养24h。
结果分析：取样离心，上清用HPLC分析乙醇酸产量，并计算转化率。发酵结果见表4，对照菌株ATCC 8739的乙醇酸产量为0，NZ-G400的乙醇酸产量为0.04g/L，转化率为0.02mol/mol。
表4、重组大肠杆菌产乙醇酸发酵
Figure BDA0003098861970000181
注：表中所示结果为3次以上重复的均值±标准差结果。
实施例3、重组大肠杆菌NZ-G416的构建和发酵
(1)icdA基因的敲除
从重组大肠杆菌NZ-G400出发，一步法敲除icdA(Gene ID：6065921)得到重组大肠杆菌NZ-G416。
以pTrac-99A-apr-93质粒(Zhao D et al.,(2021)Glycosylase base editorsenable C-to-A and C-to-G base changes.Nat Biotechnol.39,35-40.)DNA为模板用引物icdA-FRT-up/icdA-FRT-down(表2)进行PCR扩增，扩增体系和扩增条件参考实施例1步骤(1)中的第一步。PCR产物大小1.6kb，含有阿普拉抗性基因(apr)和icdA同源臂片段。将该片段电转导入NZ-G400感受态细胞中，孵育涂板，所得单克隆用引物Apr-YZ-up/icdA-YZ-down(表2)验证(目标产物大小为750bp左右)，正确克隆命名为NZ-G416。
(2)重组大肠杆菌NZ-G416菌株的发酵
NBS种子和发酵培养基同实施例2，同时添加20g/L酵母膏。摇瓶发酵及检测分析过程同实施例2。发酵结果显示，NZ-G416的乙醇酸产量为1.24g/L，葡萄糖到乙醇酸转化率为0.5mol/mol(表4)。
实施例4、重组大肠杆菌NZ-G426的构建和发酵
从重组大肠杆菌NZ-G416出发，依次敲除aceB(Gene ID：6064573)，glcDEF(GeneID：6065831，6066610，6065809)，aldA(Gene ID：6066995)，ldhA(Gene ID：6066995)，mgsA(Gene ID：6064585)，ackA-pta(Gene ID：6068166；6068169)，poxB(Gene ID：6066040)，得到重组大肠杆菌NZ-G426。
(1)pV4-del-aceB等质粒的构建
构建pV4-del-aceB敲除aceB基因的质粒，按照实施例1步骤(2)构建pV4-del-gapA-Ca-gapC质粒中的第二步到第三步，准备pV4质粒骨架片段I、aceB-N20-gRNA序列片段II和aceB基因的上下游同源臂片段III和片段IV。引物的命名方式同gapA基因，只是将gapA替换为aceB。第四步，将pV4质粒骨架片段I、aceB-N20-gRNA序列片段II和aceB基因的上下游同源臂片段III和片段IV用Golden Gate技术策略进行组装(按照I、II、III和IV的顺序顺次无缝连接)，转化化转感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-up和aceB-R2(表2)进行PCR验证，条带大小为1.3Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-aceB质粒。
按照相同的方式得到glcDEF，aldA，ldhA，mgsA，poxB，ackA-pta基因敲除质粒pV4-del-glcDEF，pV4-del-aldA，pV4-del-ldhA，ApV4-del-mgsA，pV4-del-poxB，pV4-del-ackA-pta。引物的命名方式同aceB基因，只是将aceB替换为glcDEF，aldA，ldhA，mgsA，poxB，ackA-pta。
(2)敲除aceB，glcDEF，aldA，ldhA，mgsA，poxB，ackA-pta基因
基因敲除的具体步骤以敲除aceB基因为例：从大肠杆菌NZ-G416出发，制备电转化感受态细胞，将质粒pRedCas9(Zhu et al.2017,Metab.Eng.43,37-45)和pV4-del-aceB同时转化到NZ-G416电转化感受态细胞，涂卡纳霉素和氯霉素双抗平板，置于30℃过夜培养。挑取单克隆于2mL LB(含卡纳霉素和氯霉素；2.5％L(+)-阿拉伯糖)，250r/min转速，30℃过夜诱导同源重组和切割未发生重组的DNA。稀释涂LB平板(含卡纳霉素和氯霉素，2.5％L(+)-阿拉伯糖)，30℃过夜培养。挑取10个单克隆进行菌落PCR验证，引物为aceB-YZ-up和aceB-YZ-down(表2)，大小约1.6kb。将正确的克隆通过划线消除pV4-del-aceB质粒。继续按照敲除aceB基因的方式敲除glcDEF，aldA，ldhA，mgsA，poxB，ackA-pta基因，经验证正确的菌株命名为NZ-G426。使用的引物序列见表2，其中引物的命名对应于敲除aceB基因所使用的引物的名称，仅将aceB替换为glcDEF，aldA，ldhA，mgsA，poxB，ackA-pta(使用验证引物验证的PCR产物大小为1kb-1.5kb)。
(3)重组大肠杆菌NZ-G426菌株的发酵
NBS种子和发酵培养基同实施例2，同时添加20g/L酵母膏。摇瓶发酵及检测分析过程同实施例2。发酵结果显示，NZ-G426的乙醇酸产量为2.36g/L，葡萄糖到乙醇酸的转化率为0.92mol/mol(表4)。
实施例5、重组大肠杆菌NZ-G456的构建和发酵
从重组大肠杆菌NZ-G426出发，依次整合T7-RNAP(GenBank No:253976916)基因到rhaBAD基因位点(Gene ID：6065939；6065949；6065976)、调控ycdW基因(Gene ID：6065906)、整合ycdW到araBAD基因位点、敲除iclR(Gene ID：6064567)、调控aceA(Gene ID：6064570)，得到重组大肠杆菌NZ-G456。
(1)T7-RNAP基因整合至rhaBAD位点
以大肠杆菌BL21(DE3)的基因组DNA为模板用引物T7-RNAP-F-AGCT/T7-RNAP-R-TGCG(表2)扩增得到T7-RNAP的基因片段(T7-RNAP基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，其编码SEQ ID No.2所示蛋白质)，以pTrc99A-M质粒(Zhao et al 2013,Metab Eng 17:42-50)为模板用Ptrc-F-CACT/Ptrc-R-AGCT引物(表2)扩增得到Ptrc启动子片段。按照实施例1步骤(2)构建pV4-del-gapA-Ca-gapC质粒中的第二步到第三步，准备pV4质粒骨架片段I、rhaBAD-N20-gRNA序列片段II和rhaBAD基因上下游同源臂片段III和片段IV。其中引物的命名对应于整合gapC基因过程中所使用的引物的名称，仅将gapA替换为rhaBAD(rhaBAD-R1-AGTG和rhaBAD-F2-CGCA除外，分别对应整合gapC基因过程中所使用的引物gapA-R1和gapA-F2)。然后与用GoldenGate进行组装(pV4质粒骨架片段I、rhaBAD-N20-gRNA序列片段II、rhaBAD基因上游同源臂片段III、Ptrc启动子片段、T7-RNAP的基因片段和rhaBAD基因下游同源臂片段IV顺次无缝连接)，转化感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-up和rhaBAD-R2(表2)进行PCR验证，条带大小为4.4Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-rhaBAD-T7-RNAP质粒。
整合T7-RNAP的方式同gapC基因整合过程(参见实施例1相关步骤)，验证引物为rhaBAD-YZ-up/T7-RNAP-YZ-down(表2)，使用验证引物验证的PCR产物大小为1kb。经验证正确的整合了T7-RNAP的重组大肠杆菌进行下一步操作。
(2)在金斯瑞生物科技有限公司全合成T7启动子，如下：CCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGACGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATGAGCCCGTATTGTTAGCATGCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC(SEQ ID No.8)，将该序列克隆于pUC57-Kan载体(金斯瑞生物技术公司提供)的NdeI和NcoI之间，经测序验证正确后得到pUC57-Kan-T7质粒。
(3)调控ycdW基因的表达
从步骤(1)获得的整合了T7-RNAP的重组大肠杆菌出发，利用两步法同源重组，调控ycdW基因的表达，具体方法见文献(Tan et al.,2016,Biotechnol Biofuels 9；Chen etal.,2014,Appl Microbiol Biotechnol 95:2197-2205)。以pXZ-CS质粒(Tan,et al.,2013,Appl.Environ.Microbiol.79,4838-4844.)为模板，使用引物ycdW-TK-cat-up/ycdW-TK-sacB-down(表2)进行PCR扩增，得到同源重组的cat-sacB片段I，并将其整合于ycdW基因的ATG前。以pUC57-Kan-T7的质粒DNA为模板，用引物ycdW-TK-T7-up/ycdW-TK-T7-down(表2)得到同源重组的T7启动子片段II，进行第二次同源重组，替换ycdW基因前的cat-sacB，用T7启动子调控ycdW的表达。用引物ycdW-TK-YZ-up/ycdW-TK-down(表2)进行PCR验证和测序分析(PCR扩增得到2kb片段且测序正确为阳性)。
(4)整合ycdW于araBAD基因位点
从步骤(3)得到的菌株出发，整合ycdW于araBAD基因位点，即用T7-ycdW片段替换大肠杆菌基因组中的araBAD基因(Gene ID:6066889；6067404；6066010)。
pV4-del-araBAD-T7-ycdW整合质粒的构建：按实施例1(2)构建质粒pV4-del-gapA-Ca-gapC的方式，构建pV4-del-araBAD-T7-ycdW整合质粒。
ycdW基因片段以步骤(3)得到的菌株出发基因组DNA为模板，用引物T7-ycdW-F-GGTG/T7-ycdW-R-CTGG(表2)扩增得到T7-ycdW片段(即由T7启动子启动转录的ycdW基因，ycdW基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，其编码SEQ ID No.3所示蛋白质)。按照实施例1步骤(2)构建pV4-del-gapA-Ca-gapC质粒中的第二步到第三步，准备pV4质粒骨架片段I、araBAD-N20-gRNA序列片段II和araBAD基因上下游同源臂片段III和片段IV。其中引物的命名对应于整合gapC基因过程中所使用的引物的名称，仅将gapA替换为araBAD(araBAD-R1-CACC和araBAD-F2-CCAG除外，分别对应整合gapC基因过程中所使用的引物gapA-R1和gapA-F2)。然后用GoldenGate进行组装(pV4质粒骨架片段I、araBAD-N20-gRNA序列片段II、araBAD基因上游同源臂片段III、T7-ycdW片段和araBAD基因下游同源臂片段IV顺次无缝连接)，转化感受态细胞TransT1(北京全式金生物技术公司)。得到的克隆用引物P15A-up和T7-ycdW-R-CTGG(表2)进行PCR验证，条带大小为2.5Kb，阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-araBAD-T7-ycdW质粒。
整合T7-ycdW的方式同gapC基因整合过程(参见实施例1相关步骤)，验证引物为araBAD-YZ-up/ycdW-YZ-down(表2)，使用验证引物验证的PCR产物大小为2.4Kb。经验证正确的整合了T7-ycdW的重组大肠杆菌进行下一步操作。
(5)敲除iclR基因
按照实施例4(1)构建pV4-del-aceB的步骤构建pV4-del-iclR质粒，引物的命名方式同aceB基因，只是将aceB替换为iclR。阳性克隆提取质粒DNA送样测序分析，得到正确的pV4-del-iclR质粒。
从步骤(4)所得的菌株出发，敲除iclR基因。按照实施例4(2)敲除aceB的步骤敲除iclR，正确克隆验证引物的命名方式同aceB基因，只是将aceB替换为iclR。经验证正确的菌株进行下步操作。
(6)调控aceA基因的表达
从步骤(5)所得的菌株出发，用RBS库调控aceA基因的表达。
根据两步法同源重组，具体方法见文献(Tan et al.,2016,Biotechnol Biofuels9；Chen et al.,2014,Appl Microbiol Biotechnol 95:2197-2205)。以pXZ-CS质粒为模板，使用引物aceA-cat-up/aceA-sacB-down(表2)进行PCR扩增,得到同源重组的cat-sacB片段I，并将其整合于aceA基因的ATG前。以重组大肠杆菌M1-93(Lu et al.,2012,ApplMicrobiol Biotechnol.93:2455-2462)的基因组DNA为模板，用引物aceA-P-up/aceA-RBSL-down(表2)得到同源重组的DNA启动子片段II，进行第二次同源重组，替换aceA基因前的cat-sacB，从而库调控aceA的表达。用引物AP1-up/aceA-TK-YZ-down200进行PCR验证。对aceA库调控菌株进行发酵评价，乙醇酸产量最高的菌株用于进一步的改造。
该步骤得到的乙醇酸产量最高的菌株命名为NZ-G456。在菌株NZ-G456中，aceA基因由SEQ ID No.7(即引物aceA-RBSL-down中的NNNNNNY具体为TGTTTGC)所示的含有RBS序列的启动子片段启动表达。
(7)重组大肠杆菌NZ-G456发酵
NBS种子和发酵培养基同实施例2，同时添加20g/L酵母膏。摇瓶发酵及检测分析过程同实施例2。发酵结果显示，NZ-G456的乙醇酸产量为3.17g/L，转化率为1.19mol/mol(表4)。
实施例6、重组大肠杆菌NZ-G466的构建和发酵
(1)pV4-del-sthA质粒的构建
按照实施例4(1)构建pV4-del-aceB的步骤构建pV4-del-sthA质粒，引物的命名方式同aceB基因，只是将aceB替换为sthA。经验证正确后进行下一步操作。
(2)sthA基因的敲除
从重组大肠杆菌NZ-G456出发，敲除sthA基因，得到重组大肠杆菌NZ-G466。
按照实施例4(2)敲除aceB的步骤敲除sthA(Gene ID:6065209)，正确克隆验证引物的命名方式同aceB基因，只是将aceB替换为sthA。验证正确的菌株即为重组大肠杆菌NZ-G466。
(3)重组大肠杆菌NZ-G466发酵
NBS种子和发酵培养基同实施例2，同时添加20g/L酵母膏。摇瓶发酵及检测分析过程同实施例2。发酵结果显示，NZ-G466的乙醇酸产量为5.3g/L，转化率为1.89mol/mol(表4)。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 乙醇酸的生产方法
<130> GNCLN211453
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 334
<212> PRT
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gctgcgaacc tgttcaaagc agtgcgcgaa actatggttg acacatatga gtcttgtgat 2520
gtactggctg atttctacga ccagttcgct gaccagttgc acgagtctca attggacaaa 2580
atgccagcac ttccggctaa aggtaacttg aacctccgtg acatcttaga gtcggacttc 2640
gcgttcgcgt aa 2652
<210> 6
<211> 939
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
atggatatca tcttttatca cccaacgttc gatacccaat ggtggattga ggcactgcgc 60
aaagctattc ctcaggcaag agtcagagcg tggaaaagcg gagataatga ctctgctgat 120
tatgctttag tctggcatcc tcctgttgaa atgctggcag ggcgcgatct taaagcggtg 180
ttcgcactcg gggccggtgt tgattctatt ttgagcaagc tacaggcaca ccctgaaatg 240
ctgaagcctt ctgttccact ttttcgcctg gaagataccg gtatgggcga gcaaatgcag 300
gaatatgctg tcagtcaggt gctgcattgg tttcgacgtt ttgacgatta tcgcatccag 360
caaaatagtt cgcattggca accgctgcct gaatatcatc gggaagattt taccatcggc 420
attttgggcg caggcgtact gggcagtaaa gttgctcaga gtctgcaaac ctggcgcttt 480
ccgctgcgtt gctggagtcg aacccgtaaa tcgtggcctg gcgtgcaaag ctttgccgga 540
cgggaagaac tgtctgcatt tctgagccaa tgtcgggtat tgattaattt gttaccgaat 600
acccctgaaa ccgtcggcat tattaatcaa caattactcg aaaaattacc ggatggcgcg 660
tatctcctca acctggcgcg tggtgttcat gttgtggaag atgacctgct cgcggcgctg 720
gatagcggga aagttaaagg cgcaatgctg gatgttttta atcgtgaacc cttaccgcct 780
gaaagtccgc tctggcaaca tccacgcgtg acgataacac cacatgtcgc cgcgattacc 840
cgtcccgctg aagctgtgga gtacatttct cgcactattg cccagctcga aaaaggggag 900
agggtctgcg ggcaagtcga ccgcgcacgc ggctactaa 939
<210> 7
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ttatctctgg cggtgttgac aagagataac aacgttgata taattgagcc cgtattgtta 60
gcatgtacgt ttaaaccagg aggcaaaca 89
<210> 8
<211> 124
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cccgactgga aagcgggcag tgacgatccc gcgaaattaa tacgactcac tataggggat 60
gagcccgtat tgttagcatg ccctctagaa ataattttgt ttaactttaa gaaggagata 120
tacc 124

Claims (10)

1.一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括使受体菌表达3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的步骤；
进一步地，所述方法还包括对所述受体菌进行如下改造的步骤：抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达、抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达、和/或表达乙醛酸还原酶YcdW；
所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。
2.一种构建能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株的方法，包括如下步骤(A1)：
(A1)使受体菌表达3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株；
所述受体菌能够以葡萄糖作为碳源。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A2)：
(A2)以所述工程菌1为出发菌株，抑制内源异柠檬酸脱氢酶ICDH的表达，所得菌株命名为工程菌2；所述工程菌2为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A3)：
(A3)以所述工程菌2为出发菌株，抑制其内源苹果酸合酶AceB、乙醇酸脱氢酶AdhE、醛脱氢酶AldA、乳酸脱氢酶LdhA、甲基已二醛合酶MgsA、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta、丙酮酸氧化酶PoxB的表达，所得菌株命名为工程菌3；所述工程菌3为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A4)：
(A4)以所述工程菌3为出发菌株，表达T7 RNA聚合酶并抑制内源鼠李糖降解途径酶RhaBAD的表达，将T7启动子整合于基因组中乙醛酸还原酶YcdW编码基因的起始密码子前，表达乙醛酸还原酶YcdW并抑制内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，抑制内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，增强内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达，所得菌株命名为工程菌4；所述工程菌4为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤(A5)：
(A5)以所述工程菌4为出发菌株，抑制内源NADPH转氢酶SthA的表达，所得菌株命名为工程菌5；所述工程菌5为能够利用葡萄糖生产乙醇酸的工程菌株。
7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：在所述步骤(A1)中，使所述受体菌表达所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC，并抑制所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的表达，通过如下实现：用所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因替换所述受体菌基因组中所述内源3-磷酸甘油醛脱氢酶GapA的编码基因；
进一步地，所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC为源于丙酮丁酸梭菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC；
和/或
所述步骤(A2)为：以所述工程菌1为出发菌株，敲除基因组中的异柠檬酸脱氢酶ICDH的编码基因，所得菌株即为所述工程菌2；
和/或
所述步骤(A3)为：以所述工程菌2为出发菌株，敲除基因组中的苹果酸合酶AceB的编码基因、乙醇酸脱氢酶AdhE的编码基因、醛脱氢酶AldA的编码基因、乳酸脱氢酶LdhA的编码基因、甲基已二醛合酶MgsA的编码基因、乙酸激酶AceK和磷酸转乙酰酶Pta的编码基因、丙酮酸氧化酶PoxB的编码基因，所得菌株即为所述工程菌3；
和/或
在所述步骤(A4)中，表达所述T7 RNA聚合酶并抑制所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的表达，通过如下实现：将所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源鼠李糖降解途径酶RhaBDA的编码基因位置处；
进一步地，所述T7 RNA聚合酶的编码基因的表达盒中启动所述T7 RNA聚合酶的编码基因转录的启动子为Ptrc启动子；和/或
进一步地，所述T7 RNA聚合酶为来源于大肠杆菌BL21(DE3)的T7 RNA聚合酶；
和/或
在所述步骤(A4)中，表达所述乙醛酸还原酶YcdW并抑制所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的表达，通过如下实现：将所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因的表达盒整合到基因组中所述内源阿拉伯糖降解途径酶AraBAD的编码基因位置处；
进一步地，所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因的表达盒中启动所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因转录的启动子为T7启动子；和/或
进一步地，所述乙醛酸还原酶YcdW为内源乙醛酸还原酶YcdW；
和/或
在所述步骤(A4)中，抑制所述内源DNA结合转录阻遏物IclR的表达，通过如下实现：敲除基因组中的所述DNA结合转录阻遏物IclR的编码基因；
和/或
在所述步骤(A4)中，增强所述内源异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因表达是通过如下实现的：采用核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的含有RBS序列的启动子片段启动所述异柠檬酸裂解酶ICL的编码基因的表达；
和/或
所述步骤(A5)为：以所述工程菌4为出发菌株，敲除基因组中的NADPH转氢酶SthA的编码基因，所得菌株即为所述工程菌5；
和/或
所述受体菌为大肠杆菌；
进一步地，所述大肠杆菌为大肠杆菌ATCC 8739；
和/或
所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC为氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质，或为SEQID No.1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.1具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.1所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或
所述T7 RNA聚合酶为氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质，或为SEQ ID No.2经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQID No.2具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；或
所述乙醛酸还原酶YcdW为氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白质，或为SEQ ID No.3经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或为与SEQ ID No.3具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质，或为在SEQ ID No.3所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白；
和/或
所述3-磷酸甘油醛脱氢酶GapC的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.4所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.4所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.1所示的蛋白质的DNA分子；或
所述T7 RNA聚合酶的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.5所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.5所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.2所示的蛋白质的DNA分子；或
所述乙醛酸还原酶YcdW的编码基因为核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子，或在严格条件下与SEQ ID No.6所示的DNA分子杂交且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子，或与SEQ ID No.6所限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码SEQ ID No.3所示的蛋白质的DNA分子。
8.利用权利要求1-7中任一所述方法构建得到的工程菌株。
9.权利要求8所述工程菌株在利用葡萄糖生产乙醇酸中的应用。
10.一种生产乙醇酸的方法，包括如下步骤：将权利要求8所述工程菌株在含有葡萄糖的发酵培养基中进行发酵培养，从发酵产物中获得乙醇酸。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107603998A (zh) * 2017-10-11 2018-01-19 北京化工大学 利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN108315289A (zh) * 2018-02-02 2018-07-24 江南大学 一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
CN112852656A (zh) * 2020-08-31 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107603998A (zh) * 2017-10-11 2018-01-19 北京化工大学 利用乙酸生产乙醇酸的基因工程菌及其构建方法和应用
CN108315289A (zh) * 2018-02-02 2018-07-24 江南大学 一种提高大肠杆菌中乙醇酸产率的方法
CN112852656A (zh) * 2020-08-31 2021-05-28 中国科学院天津工业生物技术研究所 一株利用葡萄糖和乙酸双碳源生产乙醇酸的大肠杆菌工程菌

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