JP2024518537A - 脂肪酸原料からアセトン及び／又はイソプロパノールを産生するための組換え酵母 - Google Patents

脂肪酸原料からアセトン及び／又はイソプロパノールを産生するための組換え酵母 Download PDF

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Abstract

アセトン及びイソプロパノールを産生するための脂肪酸の利用のために遺伝子を過剰発現するようにバイオ操作された組換え酵母、及びその使用方法。酵母は、アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセト－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、イソプロパノールデヒドロゲナーゼ、又はそれらの任意の組み合わせを発現、構成的に発現、又は過剰発現するように改変される。この方法は、組換え酵母を培養して、任意の脂肪酸含有原料をアセトン及び／又はイソプロパノールに変換することを含む。

Description

本発明は、脂肪酸原料からアセトン及び／又はイソプロパノールを産生するのに適した組換え酵母の株、並びに脂肪酸原料からアセトン及び／又はイソプロパノールを産生するための組換え酵母を使用する方法に関する。
イソプロパノール及びアセトンは、世界の化学産業において不可欠な汎用化学物質である。それらは、溶媒及び化学中間体として使用される。例えば、イソプロパノールは、酢酸イソプロピルを製造するために使用される。アセトンは、メチルメタクリレート、ビスフェノールＡ、メチルイソブチルアルコール、及びメチルイソブチルケトンを製造する中間体である。２０２０年のアセトン及びイソプロパノールの世界生産量は、７３０万トン及び２２０万トンであった。
市場のイソプロパノール及びアセトンのほとんどは、再生不可能な資源から作られている。イソプロパノールは、主にプロペンの間接的及び直接的な水和によって生成されるが、アセトンの水素化によっても製造することができる。アセトンは、一般に、クメンプロセスによって製造される。このプロセスは、ベンゼンとプロピレンからアセトンを合成する。
発酵からのイソプロパノール及びアセトンの産生は、長年の関心事である。アセトンは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ等のいくつかのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍクレードメンバーを使用した糖のＡＢＥ（アセトンブタノールエタノール）発酵によって糖から製造することができる。アセトンは、発酵中にブタノールの半分の量で産生される。イソプロパノールも、アセトンがイソプロパノールに置き換えられるＡＢＥ発酵と同様のプロセスで糖から製造することができる。このプロセスは、ＩＢＥ発酵と称され、異なる野生型Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株又は代謝的に操作されたＡＢＥ産生Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ株を用いて実施される。
研究者らはまた、糖からアセトン及びイソプロパノールを産生するためにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ及びＣａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓを操作した。この分野における最近の研究は、これら２つの溶媒を産生するための発酵ベースの再生可能プロセスへの商業的関心を示している。非再生可能な供給源プロセスと商業的に競合するための１つのアプローチは、原料としてより低い価値のセルロース糖又は合成ガスを使用することである。我々の知る限り、セルロース糖又は合成ガスのいずれかを原料として使用するイソプロパノール又はアセトンの現在の商業プロセスは存在しない。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ中のイソプロパノール及びアセトンの生合成は、アセチル－ＣｏＡから始まる（図１参照）。デキストロース中で増殖すると、糖の分子ごとに２つのアセチル－ＣｏＡ分子が解糖によって産生される。２つのアセチル－ＣｏＡを使用して、１つのアセトアセチル－ＣｏＡ及びＣｏＡの遊離分子が作製される。アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼが、この反応を触媒する。アセトアセチルＣｏＡは、ブチレート－アセトアセテートＣｏＡ－トランスフェラーゼによって触媒されるブチレート分子にＣｏＡを移すことによってアセトアセテートに変換される。次に、アセトアセテートデカルボキシラーゼが、アセトアセテートを脱炭酸してアセトンを産生する。次いで、イソプロパノールデヒドロゲナーゼを使用して、アセトンをイソプロパノールに還元する。ＮＡＤＰＨが反応のための水素を提供する。
Ｔａｍａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．２０１３は、デキストロースからイソプロパノールを産生するように酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓを操作した。この株は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のアセト－アセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｃｔｆＡ及びｃｔｆＢ）、並びにＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼ（ａｄｃ）及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（ｓａｄｈ）遺伝子をコードする遺伝子を発現した。更に、産生量を増加させるために、天然アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ及びアセチル－ＣｏＡシンターゼ遺伝子を過剰発現させた。
糖からのｇ／ｇベースでのアセトン及びイソプロパノールの最大理論収率は、０．４８及び０．４４である（Ｄｅｌｌｏｍａｒｃｏ ｅｔ ａｌ．２０１０）。対照的に、脂肪酸からの理論収率はそれぞれ１．３０及び１．２０である。植物油の価格は糖よりも高いが、経済的には依然として植物油が原料として好まれている。この利点は、セルロース糖などの安価な糖が、利用可能で発酵に適合させるために必要な処理のために使用するのが依然として高価であることを考慮すると、更に顕著になる。対照的に、使用済みの揚げ油及び脂肪酸蒸留物などの低価値の油流は、発酵における原料として使用される最小限の処理を必要とする。発酵のための適切な原料を有することに加えて、その原料を消費することができる生物が不可欠である。
脂肪酸含有原料からアセトン及びイソプロパノールを産生する酵母が必要である。
本発明は、組換え酵母を提供することによって、アセトン及びイソプロパノール産生の前述の必要性に対処する。組換え酵母は、例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸アルコール、植物油、及び他の脂肪酸含有原料をアセトン及びイソプロパノールに変換する方法で使用することができる。
本発明の一態様は、組換え酵母に関する。組換え酵母は、アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼのうちのいずれか１つ以上を発現、構成的に発現、又は過剰発現するように改変される。ある場合には、組換え酵母は、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ及びアセトアセテートデカルボキシラーゼのうちのいずれか１つ以上を発現するように改変される。ある場合には、組換え酵母は、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼのうちのいずれか１つ以上を発現するように改変される。本発明の組換え酵母は、必須汎用化学物質として使用するために脂肪酸をアセトン及びイソプロパノールに変換するために使用することができる。
また、本明細書では、産物を産生する方法も提供される。いくつかの変形形態は、第１の有機物を含む基質を本発明の酵母と接触させることを含み、酵母は第１の有機物を消費し、第２の有機物を産生する。いくつかの変形形態では、第１の有機物は脂肪酸を含む。いくつかの変形形態では、第２の有機物は、アセトン及びイソプロパノールのうちの１つ以上を含む。この方法は、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸アルコール、植物油、及び任意の他の脂肪酸含有原料をアセトン及びイソプロパノールに変換するために使用され得る。
本発明の目的及び利点は、付属の図面と併せて行われる本発明の好ましい実施形態の以下の詳細な説明からより十分に明らかになるであろう。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ中のアセトン及びイソプロパノールの生合成。 アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン経路。 アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン経路。 アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン経路。 ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン経路。 アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）を発現し、細胞質中にアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）を発現し、細胞質中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）を発現し、細胞質中にアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現し、細胞質中にイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現し、細胞質中にアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母におけるアセトン及びイソプロパノール経路。 アセトン標準物質のＧＣ解析。 例示的なＹＵ５酵母からのアセトンのＧＣ解析。 例示的なＹＵ６酵母からのアセトンのＧＣ解析。
本発明の態様は、組換え酵母を包含する。組換え酵母は、好ましくは、天然の対応物と比較して、アセトン及びイソプロパノールを産生する活性が強化されるように操作される。
組換え酵母は、好ましくは、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、及びＡｒｘｕｌａ ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ等の脂肪酸を消費する酵母に由来する。この点に関して、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉは特に好ましい酵母である。Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉは、アルカン及び脂肪酸を非常に速い速度で消費する。その遺伝子操作のための十分に確立されたプロトコル及びツールがあり、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉは、二塩基酸、カンナビノイド、３－ヒドロキシプロピオン酸、及びカロテノイドを産生するように操作されている。また、脂肪酸及びアルカンから二塩基酸を産生するために商業的に使用されており、工業環境でスケールアップして機能する能力を実証している。Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉにおける遺伝子操作は、様々な特許及び特許出願（カナダ国特許出願公開第３０６９７０８号明細書、米国特許第９９３８５４４号明細書、米国特許第９９５７５１２号明細書）に記載されるように、又は他の十分に確立された分子技術を使用して行う。
本発明の組換え酵母は、１つ以上の酵素を発現するように構成された１つ以上の組換え核酸を含む。１つ以上の組換え核酸は、好ましくは、１つ以上の酵素を構成的に発現するか、又は過剰発現するように構成される。１つ以上の組換え核酸は、好ましくは、１つ以上の酵素を構成的に発現するか、又は過剰発現するように構成される１つ以上の組換え遺伝子を含む。細胞が特定の酵素を内因的に発現する場合、その酵素を発現する核酸は、プロモーターを交換若しくは最適化するか、エンハンサーを交換若しくは最適化するか、又は酵素の発現の増加若しくは構成的発現をもたらす任意の他の遺伝的要素を交換若しくは最適化するように改変されてもよい。代替的又は追加的に、酵素の発現強化のために、遺伝子又はそのコード配列の１つ以上の追加のコピーが細胞に導入され得る。細胞が特定の酵素を内因的に発現しない場合、その酵素の発現のために、その酵素を発現するように構成された組換え核酸の１つ以上のコピーが、細胞に導入され得る。組換え核酸は、細胞のゲノムに組み込んでもよく、又は染色体外プラスミドに含有してもよい。遺伝子操作のための技術については、以下に更に詳細に記載される。本発明の遺伝子改変酵母は、本明細書において、「組換え」、「操作された」、又は「バイオ操作された」酵母とも、又は他の名称で称される。
本発明の組換え酵母は、アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼのうちのいずれか１つ以上を任意の組み合わせで発現するように構成される１つ以上の組換え核酸を含んでもよい。１つ以上の組換え核酸は、好ましくは、上記の酵素を発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含む。いくつかの変形形態では、各酵素は、別個の組換え遺伝子から発現される。いくつかの変形形態では、酵素のうちの１つ以上が人工オペロンの形態で単一の遺伝子から発現される。いくつかの変形形態では、酵素のうちの１つ以上がペルオキシソーム内に局在し得る。
一実施形態において、図２に示されるように、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図３に示されるように、アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させるために、他の遺伝子操作を使用してもよい。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図４に示されるように、アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図５に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。Ｃ末端シグナルの例としては、３つのアミノ酸、セリン、リジン及びロイシン（ＳＫＬ）（配列番号１８６）又はＧＲＲＡＫＬ（配列番号１８７）がある。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。
別の実施形態において、図６に示されるように、ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。
別の実施形態において、図７に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。
別の実施形態において、図８に示されるように、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図９に示されるように、アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチルＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図１０に示されるように、アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図１１に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。
別の実施形態において、図１２に示されるように、ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。
別の実施形態において、図１３に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。これらの酵素は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。タンパク質は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。
別の実施形態において、図１４に示されるように、ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）を発現し、細胞質中にアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図１５に示されるように、ペルオキシソーム中にアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）を発現し、細胞質中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）、アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）が過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図１６に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）を発現し、細胞質中にアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）がペルオキシソーム中で過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図１７に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現し、細胞質中にイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現する組換え酵母が構築される。アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）がペルオキシソーム中で過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
別の実施形態において、図１８に示されるように、ペルオキシソーム中にアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）を発現し、細胞質中にアセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）を発現する組換え酵母が構築される。アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）は、Ｎ末端又はＣ末端シグナルを付加することによってペルオキシソームを標的とする。これらの酵素をコードする遺伝子は、強力な又は脂肪酸誘導性プロモーターの下に置かれ、ゲノムに組み込むことができる。他の遺伝子操作は、アセトアセチル－ＣｏＡ中間体に向かうフラックスを増加させ得る。例えば、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）がペルオキシソーム中で過剰発現され得る。内因性酵素又は異なる生物由来の同様の酵素を酵素源として使用し得る。
アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ１活性）には、酵素委員会（ＥＣ）番号３．１．２．１に該当する酵素が含まれる。発現され得る例示的なアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼとしては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来のＴｂＡＣＴ１（配列番号４～６）によってコードされるＴｂＡＣＴ１（配列番号１～３）が挙げられる。いくつかの変形形態における本発明の組換え酵母は、配列番号１～３のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼを発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含むことができる。
アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（Ｅ２活性）には、ＥＣ番号２．３．１．９に該当する酵素が含まれる。発現され得る例示的なアセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼとしては、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ由来のＣｖＥＲＧ１０（配列番号１１～１２）によってコードされるＣｖＥＲＧ１０（配列番号７～８）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ ＣＬＩＢ１２２由来のＹｌＥＲＧ１０（配列番号１３）によってコードされるＹｌＥＲＧ１０（配列番号９）、及びＣｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ ｊａｄｉｎｉｉ由来のＣｊＥＲＧ１０（配列番号１４）によってコードされるＣｊＥＲＧ１０（配列番号１０）が挙げられる。いくつかの変形形態における本発明の組換え酵母は、配列番号７～１０のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むアセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼを発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含むことができる。
アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ（Ｅ３活性）には、ＥＣ番号２．８．３．９に該当する酵素が含まれる。発現され得る例示的なアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの種由来のＣｂＣＴＦ１（配列番号２７～２８）によってコードされるＣｂＣＴＦ１（配列番号１５～１６）及びＣｂＣＴＦ２（配列番号２９～３０）によってコードされるＣｂＣＴＦ２（配列番号１７～１８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ由来のＣｓＣＴＦ１（配列番号３１）によってコードされるＣｓＣＴＦ１（配列番号１９）及びＣｓＣＴＦ２（配列番号３２）によってコードされるＣｓＣＴＦ２（配列番号２０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｌｇｉｄｉｃａｒｎｉｓ由来のＣａＣＴＦ１（配列番号３３）によってコードされるＣａＣＴＦ１（配列番号２１）及びＣａＣＴＦ２（配列番号３４）によってコードされるＣａＣＴＦ２（配列番号２２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ由来のＣｔＣＴＦ１（配列番号３５）によってコードされるＣｔＣＴＦ１（配列番号２３）及びＣｔＣＴＦ２（配列番号３６）によってコードされるＣｔＣＴＦ２（配列番号２４）、並びにＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のＥｃＣＴＦ１（配列番号３７）によってコードされるＥｃＣＴＦ１（配列番号２５）及びＥｃＣＴＦ２（配列番号３８）によってコードされるＥｃＣＴＦ２（配列番号２６）が挙げられる。いくつかの変形形態における本発明の組換え酵母は、配列番号１５～２６のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼを発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含むことができる。
アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ（Ｅ４活性）には、ＥＣ番号３．１．２に該当する酵素が含まれる。発現され得る例示的なアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼとしては、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ由来のＴｂＡＣＴ１（配列番号４～６）によってコードされるＴｂＡＣＴ１（配列番号１～３）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＨｉｙｂｇＣ（配列番号５１）によってコードされるＨｉｙｂｇＣ（配列番号３９）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ由来のＨｈｙｂｇＣ（配列番号５２）によってコードされるＨｈｙｂｇＣ（配列番号４０）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ由来のＨｐｙｂｇＣ（配列番号５３）によってコードされるＨｐｙｂｇＣ（配列番号４１）、Ｒｏｄｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ ｔｒｅｈａｌｏｓｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のＲｔｙｂｇＣ（配列番号５４）によってコードされるＲｔｙｂｇＣ（配列番号４２）、Ｒｏｄｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ ｍｙｏｄｉｓ由来のＲｍｙｂｇＣ（配列番号５５）によってコードされるＲｍｙｂｇＣ（配列番号４３）、Ｒｏｄｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ ｇｅｎｏｍｏｓｐ．２由来のＲｇＹＢＧＣ（配列番号５６）によってコードされるＲｇＹＢＧＣ（配列番号４４）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属の種由来のＢｘＳｒｆＡＤ（配列番号５７）によってコードされるＢｘＳｒｆＡＤ（配列番号４５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ由来のＢａＳｒｆＡＤ（配列番号５８）によってコードされるＢａＳｒｆＡＤ（配列番号４６）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ由来のＢｈＳｒｆＡＤ（配列番号５９）によってコードされるＢｈＳｒｆＡＤ（配列番号４７）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ由来のＳｍＡＣＬ（配列番号６０）によってコードされるＳｍＡＣＬ（配列番号４８）、Ｅｎｓｉｆｅｒの種由来のＥｘＡＣＬ（配列番号６１）によってコードされるＥｘＡＣＬ（配列番号４９）、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ由来のＳｆＡＣＬ（配列番号６２）によってコードされるＳｆＡＣＬ（配列番号５０）が挙げられる。いくつかの変形形態における本発明の組換え酵母は、配列番号１～３及び３９～５０のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼを発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含むことができる。
アセトアセテートデカルボキシラーゼ（Ｅ５活性）には、ＥＣ番号４．１．１．４に該当する酵素が含まれる。発現され得る例示的なアセトアセテートデカルボキシラーゼとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のＣｂＡＤＣ１（配列番号８３～８６）によってコードされるＣｂＡＤＣ１（配列番号６３～６６）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ． ＢＬ－８由来のＣｘＡＤＣ１（配列番号８７）によってコードされるＣｘＡＤＣ１（配列番号６７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｇａｓｉｇｅｎｅｓ由来のＣｘＡＤＣ１（配列番号８８）によってコードされるＣｇＡＤＣ１（配列番号６８）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｉｄｉｓｏｌｉ由来のＣａＡＤＣ１（配列番号８９）によってコードされるＣａＡＤＣ１（配列番号６９）、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ｏｖ０３１由来のＰｘＡＤＣ１（配列番号９０）によってコードされるＰｘＡＤＣ１（配列番号７０）、Ｈｅｙｎｄｒｉｃｋｘ ｓｐｏｒｏｔｈｅｒｍｏｄｕｒａｎｓ由来のＨｓＡＤＣ１（配列番号９１）によってコードされるＨｓＡＤＣ１（配列番号７１）、Ｖａｒｉｏｖｏｒａｘ ｓｐ． ＫＫ３由来のＶｘＡＤＣ１（配列番号９２）によってコードされるＶｘＡＤＣ１（配列番号７２）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｇａｅ由来のＣｃＡＤＣ１（配列番号９３）によってコードされるＣｃＡＤＣ１（配列番号７３）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のＣｐＡＤＣ１（配列番号９４）によってコードされるＣｐＡＤＣ１（配列番号７４）、Ｐｒｉｅｓｔｉａ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＰｍＡＤＣ１（配列番号９５）によってコードされるＰｍＡＤＣ１（配列番号７５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｃｏｌａ由来のＢａＡＤＣ１（配列番号９６）によってコードされるＢａＡＤＣ１（配列番号７６）、Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のＰｆＡＤＣ１（配列番号９７）によってコードされるＰｆＡＤＣ１（配列番号７７）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｅｓｔｅｒｔｈｅｔｉｃｕｍ由来のＣｅＡＤＣ１（配列番号９８～９９）によってコードされるＣｅＡＤＣ１（配列番号７８～７９）、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＢｘＡＤＣ１（配列番号１００）によってコードされるＢｘＡＤＣ１（配列番号８０）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ ＤＬ－ＶＩＩＩ由来のＣｄＡＤＣ１（配列番号１０１）によってコードされるＣｄＡＤＣ１（配列番号８１）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ由来のＣｓＡＤＣ１（配列番号１０２）によってコードされるＣｓＡＤＣ１（配列番号８２）が挙げられる。いくつかの変形形態における本発明の組換え酵母は、配列番号６３～８２のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むアセトアセテートデカルボキシラーゼを発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含むことができる。
イソプロパノールデヒドロゲナーゼ（Ｅ６活性）には、ＥＣ番号１．１．１．８０に該当する酵素が含まれる。発現され得る例示的なイソプロパノールデヒドロゲナーゼとしては、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のＣｂＡＤＨ１（配列番号１１０～１１１）によってコードされるＣｂＡＤＨ１（配列番号１０３～１０４）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のＮｃＡＤＨ１（配列番号１１２～１１３）によってコードされるＮｃＡＤＨ１（配列番号１０５～１０６）、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ由来のＣｐＡＤＨ１（配列番号１１４～１１５）によってコードされるＣｐＡＤＨ１（配列番号１０７～１０８）、及びＣａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ由来のＣｖＡＤＨ１（配列番号１１６）によってコードされるＣｖＡＤＨ５（配列番号１０９）が挙げられる。いくつかの変形形態における本発明の組換え酵母は、配列番号１０３～１０９のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含むイソプロパノールデヒドロゲナーゼを発現するように構成された１つ以上の組換え遺伝子を含むことができる。
本発明の組換え遺伝子から発現され得る好適な酵素としては、本明細書の上記又は他の場所に列挙される配列のいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一のポリペプチド配列を含むものが挙げられる。発現され得る他の好適な酵素としては、上記の酵素のオーソログ及びパラログが挙げられる。発現され得る他の好適な酵素としては、上記の酵素のオーソログ及びパラログと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％同一のポリペプチド配列を含む酵素が挙げられる。オーソログは、好ましくは、本明細書に記載される酵母のいずれか等の酵母由来である。酵素をコードする組換え遺伝子は、イントロンを含んでもよく、又は天然な遺伝子内にイントロン、又はいずれか若しくは全ての他の非コード領域を含まなくてもよい。本明細書に包含されるポリペプチド配列を発現することができる任意のヌクレオチド配列は、許容される。本明細書に記載される例示的なヌクレオチド配列からの大きな変異は、遺伝暗号の冗長性及びコドン最適化に起因して可能である。
組換え遺伝子中の上述の酵素のコード配列は、好ましくはプロモーターに作動可能に連結されている。プロモーターは、異種プロモーターであり得る。プロモーターは、脂肪酸誘導性プロモーター又は強力なプロモーターであり得る。「脂肪酸プロモーター」とは、脂肪酸によって誘導される誘導性プロモーターを指す。プロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。プロモーターは、コード配列に対して異種であり得る。上述の酵素のコード配列に作動可能に連結され得る例示的なプロモーターとしては、ＰＯＸ４（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ４）プロモーター（配列番号１１７）、ＰＥＸ１１（ペルオキシソーム膜タンパク質）プロモーター（配列番号１１８）、ＥＴＦ１（伸長転写因子１アルファ）プロモーター（配列番号１１９）、ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム３）プロモーター（配列番号１２０）、ＡＣＴ１（アクチン）プロモーター（Ｄａ Ｓｉｌｖａ ＆ Ｓｒｉｋｒｉｓｈｎａｎ，ＦＥＭＳ Ｙｅａｓｔ Ｒｅｓ ２０１２，１２：１９７－２１４）、ＰＯＸ５（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ５）プロモーター（Ｊｕｒｅｔｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．２０００，５：３２０－３２６）又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％同一の配列バリアントが挙げられる。上述の酵素のコード配列に作動可能に並べられ得る脂肪酸誘導性プロモーターの非限定的なリストには、ＰＯＸ１（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ１）プロモーター、ＰＯＸ２（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ２）プロモーター、ＰＯＸ４（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ４）プロモーター、ＰＯＸ５（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ５）プロモーター、Ｇ３Ｐ（グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＩＣＬ１（イソシトレートリアーゼ）プロモーター、ＰＯＴ１（３－オキソ－アシル－ＣｏＡチオラーゼ）プロモーター、ＬＩＰ２（リポイルリガーゼ）プロモーター、ＴＤＨ１（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム１）プロモーター、ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム３）プロモーター、及びＰＥＸ１１（ペルオキシソーム膜タンパク質）プロモーター（Ｊｕｒｅｔｚｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇ．２０００，５：３２０－３２６、Ｔｒａｓｓａｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ ２０１７，１６：１４１、Ｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｇ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２０２０，２０：１８６－１９６、Ｙａｚａｗ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２００７，７３（２１）：６９６５－６９７１、Ｄｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２，５９：２２４－２３０）、及び前述のうちのいずれかのバリアントが含まれる。バリアントは、好ましくは、前述のうちのいずれかと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、又は少なくとも約９９％同一の配列を含む。
組換え遺伝子中の上述の酵素のコード配列は、好ましくはターミネーターに作動可能に連結されている。ターミネーターは、コード配列に対して異種であり得る。上述の酵素のコード配列に作動可能に連結され得る例示的なターミネーターとしては、ＰＯＸ４ターミネーター（配列番号１２１）、ＥＴＦ１ターミネーター（配列番号１２２）、又はそれと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、若しくは少なくとも約９９％同一の配列バリアントが挙げられる。
本明細書に記載される改変を有する本発明の組換え酵母は、好ましくは、非組換え対照と比較して、アセトン産生の増加、アセトン分泌の増加、イソプロパノール産生の増加、及びイソプロパノール分泌の増加からなる群から選択される特性を示す。
本発明の組換え酵母は、本明細書に明示的に記載される特定の遺伝子若しくは遺伝子産物又はその相同体のうちのいずれかを発現又は過剰発現するように遺伝的に改変され得る。タンパク質及び／又はタンパク質配列は、それらが、共通の祖先タンパク質又はタンパク質配列に天然又は人工的に由来する場合、「相同」である。同様に、核酸及び／又は核酸配列は、それらが、共通の祖先核酸又は核酸配列に天然又は人工的に由来する場合、相同である。本明細書に記載の遺伝子又は遺伝子産物を含む任意の既知の遺伝子の核酸又は遺伝子産物（アミノ酸）配列は、検索用語として遺伝子名又は受託番号を使用して、当該技術分野で既知の任意の配列データベースを検索することによって決定することができる。一般的な配列データベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）、ＥｘＰＡＳｙ（ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）、ＫＥＧＧ（ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ）などが挙げられる。相同性は、一般に、２つ以上の核酸又はタンパク質（又はその配列）の間の配列類似性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列間の類似性の正確なパーセンテージは、問題の核酸及びタンパク質によって異なるが、５０、１００、１５０以上の残基（ヌクレオチド又はアミノ酸）にわたるわずか２５％の配列類似性（例えば、同一性）が、相同性を確立するために日常的に使用される（例えば、比較される２つの配列の全長にわたって）。より高いレベルの配列類似性（例えば、同一性）、例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％以上も、相同性を確立するために使用することができる。したがって、本明細書に記載の遺伝子又は遺伝子産物の相同体は、本明細書に記載の遺伝子又は遺伝子産物と、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有する遺伝子又は遺伝子産物を含む。配列類似性パーセンテージを決定するための方法（例えば、デフォルトのパラメータを使用したＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）は、本明細書に記載されており、一般に利用可能である。相同タンパク質は、同等の活性を示し、酵素の場合、同じ又は類似の経路に関与する必要がある。相同体としては、オーソログ及びパラログが挙げられる。「オーソログ」は、種形成によって共通の祖先遺伝子から進化した異なる種における遺伝子及びその産物である。通常、オーソログは、進化の過程で同じ又は同様の機能を保持する。パラログは、ゲノム内の重複によって関連付けられる遺伝子及びその産物である。本明細書で使用される場合、「オーソログ」及び「パラログ」は、「相同体」という用語に含まれる。
配列比較及び相同性決定のために、１つの配列は、典型的には、試験配列が比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列がコンピュータに入力され、必要に応じて子配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。本発明の典型的な参照配列は、本明細書に記載される遺伝子又は遺伝子産物に対応する核酸又はアミノ酸配列である。
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、又は目視検査（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（２００８年を通じて増補）を参照されたい）によって行うことができる。
相同体を定義する目的でパーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通じて公開されている。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワードと整列したときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するか、又は満たす、クエリ配列内の長さＷの短いワードを識別することによって、高いスコア配列ペア（ＨＳＰ）を識別することを伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，上記）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、累積アライメントスコアを増加させることができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一対のマッチする残基の報酬スコア、常に＞０）及びＮ（ミスマッチする残基のペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。各方向へのワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大達成値から数量Ｘだけ低下するとき、１つ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロ以下になるとき、又はいずれかの配列の終わりに達するときに停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、カットオフ１００、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照されたい）。
パーセント配列同一性を計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５７８７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を提供する。例えば、核酸は、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、参照配列と同様とみなされる。上記の技術は、本明細書に記載される方法で使用される相同配列を同定するのに有用である。
「同一の」又は「パーセンテージ同一性」という用語は、２つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列に関して、上記の配列比較アルゴリズムのうちの１つ（又は当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、又は目視検査によって測定される、最大一致について比較及び整列させたときに、同じか又は同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドの指定されたパーセンテージを有する２つ以上の配列又は子配列を指す。
２つの核酸又はポリペプチドに関して「実質的に同一の」という語句は、配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定される、最大一致について比較及び整列させたときに、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０、約９５％、約９８％、又は約９９％以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基同一性を有する２つ以上の配列又は子配列を指す。そのような「実質的に同一の」配列は、実際の祖先に関係なく、典型的には「相同」であるとみなされる。好ましくは、「実質的な同一性」は、少なくとも約５０個の残基の長さである配列の領域にわたって、より好ましくは少なくとも約１００個の残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０個の残基、少なくとも約２５０個の残基、又は比較される２つの配列の全長にわたって実質的に同一である。
遺伝子操作に関連する本明細書で使用される用語は、以下のように定義される。
欠失：核酸分子から１つ以上のヌクレオチドを、又はタンパク質から１つ以上のアミノ酸を除去することであり、両側の領域が一緒に連結される。
由来：核酸又はタンパク質に関して使用される場合、「由来」とは、核酸又はポリペプチドが、記載されている供給源から単離されているか、又は記載されている供給源に含まれる核酸若しくはポリペプチドと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上同一であることを意味する。
内因性：特定の細胞における核酸分子、遺伝子要素（例えば、遺伝子、プロモーターなど）、又はポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「内因性」とは、細胞内にあり、組換え操作技術を使用して細胞に導入されなかったか、又は細胞のゲノム内に移されなかった核酸分子、遺伝子要素、又はポリペプチドを指す。例えば、内因性遺伝子要素は、細胞が元々自然から単離されたときに、ゲノム内のその特定の遺伝子座内の細胞に存在した遺伝子要素である。
外因性：特定の細胞における核酸分子、遺伝子要素（例えば、遺伝子、プロモーターなど）、又はポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「外因性」とは、組換え操作技術を使用して細胞に導入されたか、又は細胞のゲノム内に移された任意の核酸分子、遺伝子要素、又はポリペプチドを指す。例えば、外因性遺伝子要素は、細胞が元々自然から単離されたときに、ゲノム内のその特定の遺伝子座に存在しなかった遺伝子要素である。
発現：遺伝子のコードされた情報が、タンパク質、トランスファーＲＮＡ、又はリボソームＲＮＡなどの細胞の構造及び機能に変換されるプロセス。発現遺伝子には、ｍＲＮＡに転写され、次いでタンパク質に翻訳される遺伝子、及びＲＮＡに転写されるがタンパク質に翻訳されない遺伝子（例えば、トランスファー及びリボソームＲＮＡ）が含まれる。
導入：核酸等の遺伝物質及び細胞に関して使用される場合、「導入する」とは、遺伝物質が細胞内で発現することができるような方法で、遺伝物質を細胞に送達することを指す。遺伝物質の導入には、形質転換及びトランスフェクションの両方が含まれる。形質転換は、核酸分子を原核細胞又は非動物真核細胞等の細胞に導入することができる技術を包含する。トランスフェクションは、核酸分子を動物細胞等の細胞に導入することができる技術を包含する。これらの技術には、限定されないが、コンジュゲーション、エレクトロポレーション、リポフェクション、感染、及び粒子銃加速による核酸の導入が含まれる。
単離：「単離された」生物学的成分（核酸分子、ポリペプチド、又は細胞など）は、その成分が天然に存在する他の生物学的成分、例えば、他の染色体並びに染色体外ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質から実質的に分離又は精製されている。「単離されている」核酸分子及びポリペプチドには、標準的な精製方法によって精製された核酸分子及びポリペプチドが含まれる。この用語はまた、細胞内での組換え発現によって調製された核酸分子及びポリペプチド、並びに化学的に合成された核酸分子及びポリペプチドを含む。一例では、「単離された」とは、天然に存在する核酸分子であって、それが由来する生物の天然に存在するゲノム内で直ちに連続している配列の両方（５’末端、３’末端のいずれか）と直ちに連続していない天然に存在する核酸分子を指す。
遺伝子：遺伝子は、コード配列に作動的に連結されたプロモーターを最小限に含み、コード配列の転写及び／又は翻訳を促進若しくは調節する他の要素を含み得る。
異種：「異種」という用語は、天然には存在しない別の要素との配置における要素を指す。例えば、所与の細胞に対して異種である遺伝子又はタンパク質は、天然の細胞には存在しない遺伝子又はタンパク質である。所与のコード配列に異種であるプロモーターは、天然のコード配列に作動可能に連結されないプロモーターである。所与のタンパク質（酵素など）に対して異種である分泌シグナル配列は、天然のタンパク質と作動可能に連結されていない分泌シグナル配列である。
核酸：ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及びｍＲＮＡを含むがこれらに限定されないＲＮＡ分子及びＤＮＡ分子の両方を包含する。核酸には、化学合成又は組換え的に産生されるもの等の合成核酸分子も含まれる。核酸は、二本鎖又は一本鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖、アンチセンス鎖、又はその両方であり得る。加えて、核酸は、環状又は直鎖状であり得る。
作動可能に連結されている：第１の要素は、第１の要素が第２の要素との機能的関係に置かれるとき、第２の要素と作動可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写又は発現に影響を与える場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。ペルオキシソーム標的化配列が、酵素をペルオキシソームに標的化する場合、ペルオキシソーム標的化配列は、タンパク質（酵素など）に作動可能に連結される。
過剰発現：遺伝子が、その遺伝子の内因性又は基礎的転写速度と比較して高い速度で転写される場合。いくつかの例では、過剰発現は、その遺伝子の内因性翻訳速度と比較して、遺伝子の翻訳速度の上昇を更に含む。過剰発現の試験方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、転写されたＲＮＡレベルは、ＲＴ－ＰＣＲを使用して評価することができ、タンパク質レベルは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析を使用して評価することができる。
組換え：組換え核酸又はポリペプチドは、天然には存在しない配列を含むものである。組換え遺伝子は、組換え核酸配列を含む、天然に存在しない細胞内に存在する、及び／又は対応する天然細胞内とは異なる特定の細胞内の遺伝子座（例えば、遺伝子座又は染色体外プラスミド上）に存在する遺伝子である。組換え細胞（組換え酵母など）は、組換え核酸、組換え遺伝子、又は組換えポリペプチドを含むものである。
ベクター又は発現ベクター：核酸の発現のために、細胞に核酸を導入するか、又は核酸とともに導入することができる核酸分子を含むエンティティ。ベクターは、それが細胞内で複製することを可能にする核酸配列、例えば複製起点を含むことができる。ベクターはまた、１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子及び当該技術分野で既知の他の遺伝的要素を含むことができる。好適なベクターの例が以下に見出される。
別段の説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様又は同等の方法及び材料を、本開示の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。
エレクトロポレーション、酢酸リチウム形質転換、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、コンジュゲーション、形質導入などを含む、当該技術分野で周知の技術を使用して、外因性核酸を安定的又は一過性に細胞に導入することができる。安定した形質転換のために、核酸は、選択可能なマーカーを更に含むことができる。好適な選択可能なマーカーとして、例えば、フレオマイシン、ノーセオスリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、ネオマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、又はカナマイシンに対する耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子、栄養不良性欠乏症を補完する遺伝子などが挙げられる。（詳細は以下を参照されたい）
本発明の様々な実施形態は、代謝又は生合成経路に関与するタンパク質をコードする組換え核酸を含む発現ベクターを使用する。好適な発現ベクターとしては、ウイルスベクター、ファージベクター、バクテリオファージベクター、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、Ｐｌ系人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び目的の細胞に特異的な任意の他のベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
有用なベクターは、形質転換細胞の選択のための表現型形質を提供するための１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含むことができる。選択可能なマーカー遺伝子は、選択的培地中で増殖した形質転換細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択可能なマーカー遺伝子を含有するベクターで形質転換されていない細胞は、培地中で生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えば、ノーセオスリシン、Ｇ４１８、ハイグロマイシンＢ、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、若しくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養不良性欠乏症を補完するタンパク質、又は（ｃ）複合体培地から入手できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。代替の実施形態において、選択可能なマーカー遺伝子は、オロチジン５’－リン酸デカルボキシラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼをコードするか、又はネオマイシン耐性を付与する（真核細胞培養に使用するための）遺伝子である。
発現ベクター内のコード配列は、コードされた遺伝子産物の合成を指示するために、適切な発現制御配列（プロモーター、エンハンサー等）に作動可能に連結されている。そのようなプロモーターは、内因性又は外因性源に由来し得る。したがって、本発明の組換え遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位などの異種遺伝子要素に作動可能に連結されたコード配列を含むことができる。この文脈における「異種」は、天然のコード配列に作動可能に連結されない遺伝子要素を指す。利用される細胞／ベクター系に応じて、いくつかの好適な転写及び翻訳制御要素のうちのいずれか、例えば、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を、発現ベクターに使用することができる（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい）。
真核細胞内で使用するための好適なプロモーターの非限定的な例には、典型的にはウイルス由来であり、マウスメタロチオネインＩ遺伝子のプロモーター（Ｈａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３）、ヘルペスウイルスのＴＫプロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：３５５）、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２９０：３０４）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ ４５：１０１）、及び酵母ｇａ１４遺伝子プロモーター（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８２）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）７９：６９７１、Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８１：５９５１が挙げられる。
コード配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結され得る。誘導性プロモーターは、エフェクターの付加が発現を誘導するものである。好適なエフェクターとしては、発現を誘導することができるタンパク質、代謝産物、化学物質、又は培養条件が挙げられる。
あるいは、コード配列は、抑制可能なプロモーターに作動可能に連結され得る。抑制可能なプロモーターは、エフェクターの付加が発現を抑制するものである。
いくつかの変形形態では、細胞は、構成的プロモーターに作動可能に連結されている生合成経路遺伝子産物をコードする組換え核酸で遺伝子改変される。好適な構成的プロモーターは当該技術分野で既知である。
細胞で発現されることが望ましいタンパク質をコードする核酸は、その特定のタイプの細胞に対してコドン最適化されてもよい。コドン最適化は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）による「ＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ」ブランド遺伝子設計システムによって、任意の核酸に対して実施することができる。
組換えＤＮＡで酵母細胞を形質転換し、そこからポリペプチドを産生する方法は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ（「ＹＥＡＳＴＭＡＫＥＲ」ブランド酵母形質転換システムキットの製品プロトコルにおいて）、Ｒｅｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ９９：１９３－１９８、Ｍａｎｉｖａｓａｋａｍ ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｓｔｌ（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１（１８）：４４１４－５、及びＧａｎｅｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １２１：１５９－６４によって開示されている。多くの酵母株への形質転換のための発現及び形質転換ベクターが利用可能である。例えば、以下の酵母のために発現ベクターが開発されている：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ（Ｋｕｒｔｚ，ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：１４２）、Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｌｔｏｓａ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３４５９）及びＲｏｇｇｅｎｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２：３０２）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５８：１１６５）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｅ Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４：７３７）、及びＶａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：１３５）、Ｐｉｃｈｉａ ｑｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ（Ｋｕｎｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：１４１）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｃｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３３７６、米国特許第４，８３７，１４８号、及び米国特許第４，９２９，５５５号）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：１９２９及びＩｔｏ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３）、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ３００：７０６）、並びにＹａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３８０－４７１及びＧａｉｌｌａｒｄｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１０：４９）。代謝工学のための遺伝子形質転換システムは、Ｍｕｃｏｒ ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ－Ｓｇｍ １５３，２０１３－２０２５）、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｘｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４，１５－２１）、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｓ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ９７（１１）：４９２７－３６）、及びＲｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３）を含む多くの酵母に対して特別に開発されている。
本発明の一態様は、産物を産生する方法を含む。いくつかの実施形態における方法は、本発明の組換え酵母を、産物を産生するのに十分な時間、培地中で培養することを含む。いくつかの変形形態では、培地は脂肪酸を含む。いくつかの変形形態では、産物は、アセトン及びイソプロパノールのうちの１つ以上を含む。
培地中の脂肪酸は、様々な形態のいずれかで存在することができる。そのような形態としては、遊離脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪酸アルコール、植物油、及び他の脂肪酸含有原料が挙げられる。
本発明の様々な変形形態では、脂肪酸は、少なくとも０．１％ｖ／ｖ、少なくとも０．５％ｖ／ｖ、少なくとも１％ｖ／ｖ、少なくとも２％ｖ／ｖ、少なくとも３％ｖ／ｖ、少なくとも４％ｖ／ｖ、少なくとも５％ｖ／ｖ、少なくとも６％ｖ／ｖ、少なくとも７％ｖ／ｖ、少なくとも８％ｖ／ｖ、少なくとも９％ｖ／ｖ、少なくとも１０％ｖ／ｖ、少なくとも１５％ｖ／ｖ、少なくとも２０％ｖ／ｖ、少なくとも２５％ｖ／ｖ、少なくとも３０％ｖ／ｖ、少なくとも３５％ｖ／ｖ、少なくとも４０％ｖ／ｖ、又は少なくとも４５％ｖ／ｖの量で培地中に存在する。本発明の様々な変形形態では、脂肪酸は、最大１０％ｖ／ｖ、最大１５％ｖ／ｖ、最大２０％ｖ／ｖ、最大２５％ｖ／ｖ、最大３０％ｖ／ｖ、最大３５％ｖ／ｖ、最大４０％ｖ／ｖ、最大４５％ｖ／ｖ、又は最大５０％ｖ／ｖの量で培地中に存在する。
本発明のいくつかの変形形態では、脂肪酸は、少なくとも０．１％ｖ／ｖ、少なくとも０．５％ｖ／ｖ、少なくとも１％ｖ／ｖ、少なくとも２％ｖ／ｖ、少なくとも３％ｖ／ｖ、少なくとも４％ｖ／ｖ、少なくとも５％ｖ／ｖ、少なくとも６％ｖ／ｖ、少なくとも７％ｖ／ｖ、少なくとも８％ｖ／ｖ、少なくとも９％ｖ／ｖ、少なくとも１０％ｖ／ｖ、少なくとも１５％ｖ／ｖ、少なくとも２０％ｖ／ｖ、少なくとも２５％ｖ／ｖ、少なくとも３０％ｖ／ｖ、少なくとも３５％ｖ／ｖ、少なくとも４０％ｖ／ｖ、又は少なくとも４５％ｖ／ｖの量で培地中に存在する遊離脂肪酸を含む。本発明のいくつかの変形形態では、脂肪酸は、最大１０％ｖ／ｖ、最大１５％ｖ／ｖ、最大２０％ｖ／ｖ、最大２５％ｖ／ｖ、最大３０％ｖ／ｖ、最大３５％ｖ／ｖ、最大４０％ｖ／ｖ、最大４５％ｖ／ｖ、又は最大５０％ｖ／ｖの量で培地中に存在する遊離脂肪酸を含む。
本発明の様々な変形形態では、脂肪酸は、少なくとも０．１％ｗ／ｖ、少なくとも０．５％ｗ／ｖ、少なくとも１％ｗ／ｖ、少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖ、少なくとも９％ｗ／ｖ、少なくとも１０％ｗ／ｖ、少なくとも１５％ｗ／ｖ、少なくとも２０％ｗ／ｖ、少なくとも２５％ｗ／ｖ、少なくとも３０％ｗ／ｖ、少なくとも３５％ｗ／ｖ、少なくとも４０％ｗ／ｖ、又は少なくとも４５％ｗ／ｖの量で培地中に存在する。本発明の様々な変形形態では、脂肪酸は、最大１０％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大２０％ｗ／ｖ、最大２５％ｗ／ｖ、最大３０％ｗ／ｖ、最大３５％ｗ／ｖ、最大４０％ｗ／ｖ、最大４５％ｗ／ｖ、又は最大５０％ｗ／ｖの量で培地中に存在する。
本発明のいくつかの変形形態では、脂肪酸は、少なくとも０．１％ｗ／ｖ、少なくとも０．５％ｗ／ｖ、少なくとも１％ｗ／ｖ、少なくとも２％ｗ／ｖ、少なくとも３％ｗ／ｖ、少なくとも４％ｗ／ｖ、少なくとも５％ｗ／ｖ、少なくとも６％ｗ／ｖ、少なくとも７％ｗ／ｖ、少なくとも８％ｗ／ｖ、少なくとも９％ｗ／ｖ、少なくとも１０％ｗ／ｖ、少なくとも１５％ｗ／ｖ、少なくとも２０％ｗ／ｖ、少なくとも２５％ｗ／ｖ、少なくとも３０％ｗ／ｖ、少なくとも３５％ｗ／ｖ、少なくとも４０％ｗ／ｖ、又は少なくとも４５％ｗ／ｖの量で培地中に存在する遊離脂肪酸を含む。本発明のいくつかの変形形態では、脂肪酸は、最大１０％ｗ／ｖ、最大１５％ｗ／ｖ、最大２０％ｗ／ｖ、最大２５％ｗ／ｖ、最大３０％ｗ／ｖ、最大３５％ｗ／ｖ、最大４０％ｗ／ｖ、最大４５％ｗ／ｖ、又は最大５０％ｗ／ｖの量で培地中に存在する遊離脂肪酸を含む。
脂肪酸に加えて、培地は、本発明の酵母の成長に適した他の成分を含むことができる。
本発明のいくつかの変形形態では、培地は、デキストロースを含有しないか、又は４５％ｗ／ｖ未満、４０％ｗ／ｖ未満、３５％ｗ／ｖ未満、３０％ｗ／ｖ未満、３５％ｗ／ｖ未満、３０％ｗ／ｖ未満、２５％ｗ／ｖ未満、２０％ｗ／ｖ未満、１５％ｗ／ｖ未満、１０％ｗ／ｖ未満、５％ｗ／ｖ未満、１％ｗ／ｖ未満、０．５％ｗ／ｖ未満、０．１％ｗ／ｖ未満、０．０５％ｗ／ｖ未満、若しくは０．０１％ｗ／ｖ未満など、５０％ｗ／ｖ未満のデキストロースを含有する。
本発明のいくつかの変形形態では、培地は、発酵性糖を含有しないか、又は４５％ｗ／ｖ未満、４０％ｗ／ｖ未満、３５％ｗ／ｖ未満、３０％ｗ／ｖ未満、３５％ｗ／ｖ未満、３０％ｗ／ｖ未満、２５％ｗ／ｖ未満、２０％ｗ／ｖ未満、１５％ｗ／ｖ未満、１０％ｗ／ｖ未満、５％ｗ／ｖ未満、１％ｗ／ｖ未満、０．５％ｗ／ｖ未満、０．１％ｗ／ｖ未満、０．０５％ｗ／ｖ未満、若しくは０．０１％ｗ／ｖ未満など、５０％ｗ／ｖ未満の発酵性糖を含有する。発酵性糖の例としては、とりわけ、アドニトール、アラビノース、アラビトール、アスコルビン酸、キチン、セルビオース、デキストロース、ダルシトール、エリスルロース、フルクトース、フコース、ガラクトース、グルコース、グルコネート、イノシトール、ラクトース、ラクツロース、リキソース、マルチトール、マルトース、マルトトリオース、マンニトール、マンノース、メレジトース、メリビオース、パラチノース、ペンタエリスリトール、ラフィノース、ラムノース、リボース、ソルビトール、ソルボース、デンプン、スクロース、トレハロース、キシリトール、キシロース、及びその水和物が挙げられる。
本発明の特定の変形形態では、培地を発酵装置内で組換え酵母と接触させる。発酵は、米国特許第９，９５７，５１２号明細書に記載される条件下で実施することができる。酵母によって産生された有機物は、他の用途での下流使用のために、使用済み培地の任意の他の成分から分離又は精製され得る。例えば、酵母によって産生されたアセトン及びイソプロパノールは、溶媒として、及び他の化学物質を製造するための化学中間体として使用され得る。
本明細書における体積への全ての言及は、２５℃及び１ＡＴＭにおける体積に関するものと理解される。
本明細書に記載の要素及び方法のステップは、明示的に記載されているかどうかにかかわらず、任意の組み合わせで使用することができる。
本明細書で使用される方法のステップの全ての組み合わせは、特に指定されない限り、又は参照される組み合わせが行われる文脈によって反対のことが明確に示唆されない限り、任意の順序で実施することができる。
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうではないと指示しない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書で使用される数値範囲は、具体的に開示されているかどうかにかかわらず、その範囲内に含まれる全ての数及び数のサブセットを含むことが意図される。更に、これらの数値範囲は、その範囲内の任意の数又は数のサブセットに向けられた特許請求の範囲を支持するものとして解釈されるべきである。例えば、１～１０の開示は、２～８、３～７、５～６、１～９、３．６～４．６、３．５～９．９などの範囲を支持するものと解釈されるべきである。
本明細書に引用される全ての特許、特許公報、及び査読付き公報（すなわち、「参考文献」）は、各々の個々の参考文献が参照により組み込まれるものとして具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により明示的に組み込まれる。本開示と組み込まれた参照との間に矛盾がある場合、本開示は制御する。
本発明は、本明細書に例示及び説明される部分の特定の構造及び配置に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に入るようなそのような変更された形態を包含することを理解されたい。
ゲノムＤＮＡ抽出
１．５ｍｌの一晩培養物からの酵母細胞を１．７ｍｌのスクリューキャップチューブにスピンダウンし、２００μｌの２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、１％ ＳＤＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭ、１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０中に再懸濁した。２００μｌの０．５ｍｍジルコニアビーズに２００μｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）溶液を加え、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．０で安定化させ、飽和させた。次いで、混合物を少なくとも２分間ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。水層を新しいチューブに移動させ、２００μｌのクロロホルムを加えた。混合物を１０秒間ボルテックスし、１分間１３，０００ｒｐｍ回転させた。水層を除去し、１．３ｍｌの１００％エタノールを含む新しいチューブに入れ、ＤＮＡを－８０℃で少なくとも３０分間沈殿させた。ＤＮＡを１３０００ｒｐｍで５分間スピンダウンし、ペレットを１ｍｌの７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットを空気乾燥させ、４００μｌの水に再懸濁させた。
Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉの形質転換
５０ｍｌのＹＰＤ培地を２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入れ、ウラシル栄養不良株の新たに画線したプレートから１つのコロニーを接種し、振盪しながら３０℃で一晩成長させた。細胞を収集し、回転させ、２５ｍｌの滅菌水で洗浄した。細胞をスピンダウンさせ、１ｍｌの滅菌水に再懸濁させた。次いで、細胞を再度沈殿させ、１ｍｌの１００ｍＭ酢酸リチウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０で洗浄した。細胞を３００μｌの１００ｍＭの酢酸リチウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０中に再懸濁し、３０℃で少なくとも１５分間振盪しながらインキュベートした。５０μｌの細胞を、５μｌの煮沸して速やかに冷却した剪断したサーモン精子ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）及び１０～２０μｌ（１～５ｕｇ）のＰａｃＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）消化したプラスミドＤＮＡと組み合わせた。３００μｌの新たに作製した４０％ポリエチレングリコール３３５０、１００ｍＭの酢酸リチウム、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、及び１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．０を加え、チューブを穏やかにタップすることによって酵母を再懸濁した。次いで、混合物を３０℃で少なくとも１５分間振盪しながらインキュベートした。細胞をスピンダウンし、１ｍｌの水で洗浄し、２００μｌの水に再懸濁し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。コロニーが現れるまで、プレートを３０℃又は３２℃でインキュベートした。
培地調製
ＹＰＤは、１０ｇの酵母抽出物、２０ｇのペプトンを８００ｍｌの水に加えることによって作製した。２０ｇのデキストロースを２００ｍｌの水に加えた。両方の溶液を別々にオートクレーブ化し、組み合わせた。２０ｇの寒天を酵母抽出物及びペプトン溶液に加えたことを除いて、同様にＹＰＤ寒天を作製した。
ＳｃＤ－ｕｒａ培地を、１．７ｇの酵母窒素塩基、５ｇの硫酸アンモニウム、２ｇのＳｃ－ｕｒａアミノ酸混合物（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ）、及び２０ｇのデキストロースを１リットルの水中に加えることによって作製した。次いで、溶液を濾過して滅菌した。ＳｃＤ－ｕｒａプレートについて、１．７ｇの酵母窒素塩基、５ｇの硫酸アンモニウム、２ｇのＳｃ－ｕｒａアミノ酸混合物（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＵＳＡ）、及び２０ｇのデキストロースを２５０ｍｌの水に加えた。この溶液をフィルター滅菌し、６０℃に加熱し、２０ｇの寒天を７５０ｍｌの水に加えた７５０ｍｌの寒天溶液に加え、加熱滅菌する。
ＳｍＰ培地は、最終体積１リットルまでの、１．７ｇの酵母窒素塩基、５ｇの硫酸アンモニウム、１ｇの一塩基性リン酸カリウム、及び１ｇの二塩基性リン酸カリウムであり、フィルター滅菌された。
アセトン及びイソプロパノールの測定
固相マイクロ抽出（ＳＰＭＥ）ヘッドスペース法によるＧＣ及びＧＣ－ＭＳ分析によるアセトン及びイソプロパノールの測定。
遺伝子標的の同定
異なる種由来のアセトン及びイソプロパノール産生に関与するいくつかの酵素遺伝子を選択し、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉで過剰発現させ、活性解析を行った。これらの遺伝子は、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉで高発現遺伝子のコドンの好みに基づいて独自のアルゴリズムを使用してコドン最適化され、必要に応じて手動で調整された。調査した遺伝子、それらの起源の種、及び対応する配列番号の概要を表１に提供する。

マルチコピー組み込みベクターの構築
表２のｐＶＭプラスミドを、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）によって合成した。

ｐＭＷベクターの構築
ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄに触発された方法を使用してクローニングを行った（Ｓａｒｒｉｏｎ－Ｐｅｒｄｉｇｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１３）。１２５μｌのＰＣＲチューブにおいて、５ｎｇの受容ベクター及びインサートを含有する３倍等モルの１つ、２つのプラスミド、２つのアニールされたオリゴ、又はＰＣＲ断片を組み合わせた。１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．５μｌのＢｓａＩ又はＳａｐＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、及び水を、１０μｌの最終体積まで加えた。次いで、反応物をサーモサイクラーに入れ、以下のプログラムに供した：
３７℃、３０秒間の１サイクル
３７℃、２分間、続いて１６℃、５分間の２５サイクル
３７℃、１０分間の１サイクル
８０℃、５分間の１サイクル
次いで、１μｌの反応物を、製造業者によって推奨されるように、ＤＨ５アルファ細胞（Ｍｏｎｓｅｒａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，ＵＳＡ）に形質転換し、選択的培地中にプレートした。正しい最終構築物を制限酵素分析によって検証した。各ｐＭＷプラスミドに使用される特定のインサートについては、表３を参照されたい。ｏ５６／ｏ５７は、オリゴｏ５６とｏ５７とのアニールされた混合物を意味する。
以下のｐＭＷプラスミドは、ＰＣＲ産物からの少なくとも１つのインサートを有した。
ｐＭＷ１４及びｐＭＷ１７を作製するためのｐＶＭ６のＣＢＴ１オープンリーディングフレームを、製造業者によって推奨されるように、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用してオリゴｏ１及びｏ３で増幅した。ＰＣＲ断片を、製造業者（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）によって推奨されるように、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５，Ｃａｐｐｅｄ Ｃｏｌｕｍｎｓを使用して精製した。濃度は、推奨されるように、Ｄｅｎｏｖｉｘ（ＵＳＡ）によるＤＳ ＤＮＡブロードレンジキットを使用して決定した。
次いで、ＰＣＲ産物を上記のようなＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄライゲーションのインサートとして、以下の表に示される他の部分とともに使用して、ｐＭＷ１４及びｐＭＷ１７を作製した。正しい最終構築物を、制限酵素分析、及び増幅されたオープンリーディングフレームの配列検証によって検証した。
ＣＢＴ１オープンリーディングフレームと同様に、ｐＶＭ１３のＣｊＥＲＧ１０オープンリーディングフレームをオリゴｏ１及びｏ３６を用いて増幅してｐＭＷ２０を作製し、ｐＶＭ８のＣｂＡＤＨ１オープンリーディングフレームをオリゴｏ１及びｏ３４を使用して増幅してｐＭＷ２６及びｐＭＷ３５を作製し、ｐＶＭ９のＮｃＡＤＨ１オープンリーディングフレームをオリゴｏ１及びｏ３５を使用して増幅してｐＭＷ２７及びｐＭＷ３６を作製し、ｐＶＭ１４のＣｐＡＤＨ１オープンリーディングフレームをオリゴｏ１及びｏ３７を使用して増幅してｐＭＷ２８及びｐＭＷ６１を作製した。
表４は、ｐＭＷプラスミドに使用される特定のインサートを示す。
ｃａｔ２欠失株の構築
ＡＴＣＣ２０９１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）をＰａｃＩで消化したｐＭＷ９で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一のコロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤ一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ８及びｏ１１、並びにオリゴｏ９及びｏ１０を使用して、ＣＡＴ１の第１の対立遺伝子の欠失をＰＣＲによって検証した。正しい増幅バンドを有する株をＹＵ１０と名付けた。
１００μｌのＹＵ１０の一晩分を、ＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレートにプレートし、３０℃で数日間インキュベートした。５－ＦＯＡ耐性コロニーをＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレート中で再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＡＴ１遺伝子座におけるＵＲＡ３からのループを、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ８及びｏ９を使用してＰＣＲによって検証した。正しい増幅バンドを有する株をＹＵ１４と名付けた。
ＹＵ１４を、ＰａｃＩで消化したｐＭＷ１０で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一のコロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ１２、ｏ１３、ｏ１４、及びｏ１５を使用して、ＣＡＴ２の第２の対立遺伝子の欠失をＰＣＲによって検証した。オリゴｏ１２及びｏ１３は、アクチン遺伝子の８０３ｂｐヌクレオチド断片を増幅し、一方、ｏ１４及びｏ１５は、ＣＡＴ２遺伝子の４８６ｂｐヌクレオチド断片を増幅する。正しい増幅バンドを有する株をＹＵ１８及びＹＵ１９と命名した。
１００μｌのＹＵ１８の一晩分を、ＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレートにプレートし、３０℃で数日間インキュベートした。５－ＦＯＡ耐性コロニーをＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレート中で再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＣＡＴ２遺伝子座におけるＵＲＡ３からのループを、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ８及びｏ９を使用してＰＣＲによって検証した。正しい増幅バンドを有する株をＹＵ２０及びＹＵ２１と命名した。
特定の遺伝子の組み込みの検証
４オリゴＰＣＲ法を開発した。それは、アクチン遺伝子の８０３ｂｐ断片の増幅を陽性対照として使用し、２つの遺伝子特異的オリゴによる対象の遺伝子の増幅を使用して、より小さい増幅子が得られた。Ａｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）は、製造業者の推奨に従って使用した。表５は、各オープンリーディングフレームに使用されるオリゴを示す。表６は、本実施例で使用されるオリゴの配列を示す。

ＹＵ３、ＹＵ４、ＹＵ５、ＹＵ６、ＹＵ８、ＹＵ９株の構築
ＹＵ１を、Ｐａｃ１消化ｐＶＭ１、ｐＭＷ１１＋ｐＭＷ１３、又はｐＭＷ１２＋ｐＭＷ１４プラスミドで形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みを検証した。
得られた株の特徴を表７に示す。
ＹＵ３、ＹＵ５、ＹＵ６、ＹＵ８、及びＹＵ９の発酵
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ５、ＹＵ６、ＹＵ８、及びＹＵ９の一晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートから単一のコロニーから開始し、３０℃で一晩インキュベートした。１ｍｌを使用して、２５０ｍｌフラスコで３０ｍｌのＹＰＤに接種し、３０℃で２４時間振盪した。
培養物をスピンダウンし、細胞を１５ｍｌのＳｍＰ培地中に再懸濁した。次いで、培養物を深いバッフル付きの２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移した。６７０μｌのオレイン酸及び７０μｌの５０％グリセロール溶液を加え、３０℃で４８時間インキュベートした。試料を採取し、アセトンの量をＧＣにより測定した。
ＹＵ５及びＹＵ６は、ＧＣによって決定されるように少量のアセトンを有した（図１９Ａ～１９Ｃ）。ＧＣ－ＭＳ分析は、ＹＵ５中のアセトンの存在を検証した。これらのデータは、ＣｂＣＴＦ１、ＣｂＣＴＦ２、及びＣｂＡＤＣ１が酵母において活性であり、脂肪酸からアセトンを産生し得ることを実証した。
ＹＵ３２、ＹＵ３３、ＹＵ３４、ＹＵ３５、ＹＵ３６、ＹＵ３８、ＹＵ３９、ＹＵ４２、及びＹＵ４３株の構築
ＹＵ１を、ｐＭＷ１１＋ｐＭＷ２５、又はｐＭＷ１１＋ｐＭＷ２５＋ｐＭＷ２６のいずれかのＰａｃ１消化で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みを検証した。
ＹＵ２０を、ｐＭＷ１２＋ｐＭＷ２４、又はｐＭＷ１２＋ｐＭＷ２１＋ｐＭＷ２４のいずれかのＰａｃ１消化で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みを検証した。
得られた株の特徴を表８に示す。
ＹＵ３、ＹＵ３２、ＹＵ３３、ＹＵ３４、ＹＵ３５、ＹＵ３７、ＹＵ３９、ＹＵ４２、及びＹＵ４３の発酵
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ１８、ＹＵ３２、ＹＵ３３、ＹＵ３４、ＹＵ３５、ＹＵ３７、ＹＵ３９、ＹＵ４２、及びＹＵ４３の一晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートから単一のコロニーから開始し、３０℃で一晩インキュベートした。１ｍｌを使用して、２５０ｍｌのフラスコで３０ｍｌのＹＰＤに接種し、３０℃で２４時間振盪した。
培養物をスピンダウンし、細胞を１５ｍｌのＳｍＰ培地中に再懸濁した。次いで、培養物を深いバッフル付きの２５０ｍｌのフラスコに移した。６７０μｌのオレイン酸及び７０μｌの５０％グリセロール溶液を加え、３０℃で４８時間インキュベートした。試料を採取し、アセトンの量をＧＣにより測定した。
ＹＵ２２、ＹＵ２３、ＹＵ２４、ＹＵ２５、ＹＵ２６、ＹＵ２７、ＹＵ２８、ＹＵ２９、ＹＵ３０、ＹＵ３１、ＹＵ４０、及びＹＵ４１株の構築
ＹＵ１を、Ｐａｃ１消化ｐＭＷ２１、ｐＭＷ２２、ｐＭＷ２３、ｐＭＷ２６、ｐＭＷ２７、又はｐＭＷ２８プラスミドで形質転換した。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌ ＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みを検証した。
得られた株の特徴を表９に示す。
ＹＵ３、ＹＵ２２、ＹＵ２３、ＹＵ２４、ＹＵ２５、ＹＵ２６、ＹＵ２７、ＹＵ２８、ＹＵ２９、ＹＵ３０、ＹＵ３１、ＹＵ４０及びＹＵ４１株の発酵
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ２２、ＹＵ２３、ＹＵ２４、ＹＵ２５、ＹＵ２６、ＹＵ２７、ＹＵ２８、ＹＵ２９、ＹＵ３０、ＹＵ３１、ＹＵ４０、及びＹＵ４１の一晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートから単一のコロニーから開始し、３２℃で一晩インキュベートした。３ｍｌを使用して、２５０ｍｌフラスコで３０ｍｌのＹＰＤを接種し、３２℃で２４時間インキュベートした。
培養物をスピンダウンし、細胞を１５ｍｌのＳｍＰ培地中に再懸濁した。次いで、培養物を深いバッフル付きの２５０ｍｌのフラスコに移した。６７０μｌのオレイン酸及び７０μｌの５０％グリセロール溶液を加え、３２℃で６時間インキュベートした。６時間後、１５０μｌのアセトンを加え、２４時間インキュベートした。試料を採取し、アセトンの量をＧＣにより決定した。
ＹＵ４５、ＹＵ５０、ＹＵ５３、ＹＵ５４、及びＹＵ５５株の構築
ＹＵ２０を、Ｐａｃ１消化ｐＭＷ１２又はｐＭＷ１２＋ｐＭＷ３１プラスミドのいずれかで形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌ ＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みを検証した。
得られた株の特徴を表１０に示す。
ＹＵ３、ＹＵ４、ＹＵ１８、ＹＵ１９ ＹＵ４５、ＹＵ５０、ＹＵ５３、ＹＵ５４、及びＹＵ５５の発酵
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ４、ＹＵ１８、ＹＵ１９、ＹＵ４５、ＹＵ５０、ＹＵ５３、ＹＵ５４、及びＹＵ５５の一晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートから単一のコロニーから開始し、３０℃で一晩インキュベートした。３ｍｌを使用して、２５０ｍｌのフラスコで３０ｍｌのＹＰＤに接種し、３０℃で２４時間振盪した。
培養物をスピンダウンし、細胞を１５ｍｌのＳｍＰ培地中に再懸濁した。次いで、培養物を深いバッフル付きの２５０ｍｌのフラスコに移した。６７０μｌのオレイン酸及び７０μｌの５０％グリセロール溶液を加え、３０℃で４８時間インキュベートした。１．５ｍｌの試料を採取し、１．７ｍｌの微量遠心管に入れた。細胞をスピンダウンさせ、上清を０．２２ｕｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過した。試料を水で１０倍に希釈し、製造業者によって推奨されるように、アセテート比色アッセイ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）又はアセトアセテート比色アッセイ（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、アセテート及びアセトアセテートを決定した。いずれの試料においても、酢酸及びアセトアセテートの明らかな増加は観察されなかった。その結果を表１１に示す。
ＹＵ７２、ＹＵ７３、ＹＵ７４、ＹＵ７５、ＹＵ７６、及びＹＵ７７株の構築
ＹＵ１を、ｐＭＷ５４＋ｐＭＷ５５又はｐＭＷ５５＋ｐＭＷ５８プラスミドのいずれかのＰａｃ１消化で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌ ＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みの検証を実施した。
得られた株の特徴を表１２に示す。
ＹＵ３、ＹＵ７２、ＹＵ７３、ＹＵ７４、ＹＵ７５、ＹＵ７６、及びＹＵ７７の発酵
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ７２、ＹＵ７３、ＹＵ７４、ＹＵ７５、ＹＵ７６、及びＹＵ７７の三晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートの単一のコロニーから開始し、３０℃で一晩インキュベートした。３ｍｌを使用して、２５０ｍｌのフラスコで３０ｍｌのＹＰＤに接種し、３０℃で２４時間振盪した。
培養物をスピンダウンし、６％デキストロースを含む１５ｍｌのＳｍＰ培地中に細胞を再懸濁した。次いで、培養物を深いバッフル付きの２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移し、３０℃で２日間インキュベートした。試料を採取し、細胞を遠心分離し、上清を０．２２ｕｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過した。イソプロパノール及びアセトンの濃度を決定した。
ＹＵ３、ＹＵ７２、ＹＵ７３、及びＹＵ７４の発酵
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ７２、ＹＵ７３、及びＹ７４の三晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートの単一のコロニーから開始し、３０℃で一晩インキュベートした。３ｍｌを使用して、２５０ｍｌのフラスコで３０ｍｌのＹＰＤに接種し、３０℃で２４時間振盪した。
培養物をスピンダウンし、４％デキストロースを含む１５ｍｌのＳｍＰ培地中に細胞を再懸濁した。次いで、培養物を深いバッフル付きの２５０ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに移し、３０℃で６時間インキュベートした。６時間後、７４μｌのアセトンを１つのセットに加え、１．５ｍｌの酢酸リチウム溶液（５０ｇ／Ｌ）を別のセットに加えた。１時間後及び３時間後、試料を採取した。細胞を遠心分離し、上清を０．２２ｕｍのＰＴＦＥフィルターを通して濾過した。イソプロパノール及びアセトンの濃度を決定した。その結果を表１３に示す。
アセトン又はアセトアセテートリチウムを加えなかった場合、アセトン又はイソプロパノールは検出されなかった。対照的に、アセトンを加えたときに産生されるイソプロパノールの増加は、ＹＵ３対照と比較して、ＹＵ７２、ＹＵ７３、及びＹＵ７４において観察された。この結果は、ＣｂＡＤＨ１遺伝子の活性と一致している。アセトアセテートリチウムを加えたときに、アセトン又はイソプロパノールの一定の増加は観察されなかった。
ＹＵ５８、ＹＵ５９、ＹＵ６１、ＹＵ６２、及びＹＵ６３株の構築
ＹＵ１を、ｐＭＷ３８、ｐＭＷ３９、又はｐＭＷ４０プラスミドのいずれかのＰａｃ１消化で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートした。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌ ＳｃＤ－ｕｒａの一晩分を３０℃で開始した。ゲノムＤＮＡを抽出し、上記ＰＣＲ法で組み込みを検証した。
得られた株の特徴を表１４に示す。
ＹＵ３、ＹＵ５８、ＹＵ５９、ＹＵ６１、ＹＵ６２、及びＹＵ６３の発酵。
３ｍｌのＳｃＤ－ｕｒａ培地中のＹＵ３、ＹＵ５８、ＹＵ５９、ＹＵ６１、ＹＵ６２、及びＹＵ６３の一晩分を、新たに画線されたＳｃＤ－ｕｒａプレートの単一のコロニーから開始し、３０℃で一晩インキュベートした。３ｍｌを使用して、２５０ｍｌのフラスコで３０ｍｌのＹＰＤに接種し、３０℃で２４時間振盪した。細胞をスピンダウンし、２５ｍｌの水で洗浄し、１５ｍｌのＳｍＰに再懸濁した。細胞を深いバッフル付きの２５０ｍｌのシェイクフラスコに移し、６７０μｌのオレイン酸及び１００μｌの５０％グリセロール溶液を加えた。６時間のインキュベーション後、７５μｌのイソプロパノール又はアセトンを加えた。試料を１時間及び３時間で採取し、アセトン及びイソプロパノールの濃度をＧＣによって決定した。その結果を表１５に示す。
ＹＵ５８及びＹＵ５９は、他のどの株よりも多くのイソプロパノールをアセトンから産生した。これは、ＣｂＡＤＨ１の活性と一致する。対照的に、本発明者らは、ＹＵ５８及びＹＵ５９を除く全ての株において、イソプロパノールからのアセトンの高い産生を見た。この結果は、内因性二級アルコールデヒドロゲナーゼの上昇と一致している。最も可能性の高いアルコールデヒドロゲナーゼは、よく特徴付けられた二級アルコールであるＣｐＡＤＨ１との高い同一性を有するＣｖＡＤＨ５である。ＣｐＡＤＨ１及びＮｃＡＤＨ１は、ＮＡＤＨを補因子として利用して、アセトンをイソプロパノールに還元する。
対照的に、ＣｂＡＤＨ１はＮＡＤＰＨを使用した。これらの結果は、高レベルのＮＡＤＰＨ及び低レベルのＮＡＤＨと一致する。ＣｂＡＤＨ１が存在する場合、それは、アセトンのイソプロパノールへの変換を推進する。それが存在しない場合、内因性活性が、イソプロパノールからアセトンへの逆変換を推進する。
追加のｐＶＭプラスミドの構築
表１６のｐＶＭプラスミドは、Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＵＳＡ）によって合成される。

ｐＦＰプラスミドの構築
ＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄに触発された方法を使用してクローニングを行う（Ｓａｒｒｉｏｎ－Ｐｅｒｄｉｇｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．２０１３）。１２５μｌのＰＣＲチューブにおいて、５ｎｇの受容ベクター及びインサートを含有する３倍等モルの１つ、２つのプラスミド、２つのオリゴ、又はＰＣＲ断片を組み合わせた。１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）、０．５μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）、０．５μｌのＢｓａＩ又はＳａｐＩ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）、及び水を、１０μｌの最終体積まで加える。次いで、反応物をサーモサイクラーに入れ、以下のプログラムに供する：
３７℃、３０秒間の１サイクル
３７℃、２分間、続いて１６℃、５分間の２５サイクル
３７℃、１０分間の１サイクル
８０℃、５分間の１サイクル
次いで、１μｌの反応物を、製造業者によって推奨されるように、ＤＨ５アルファ細胞（Ｍｏｎｓｅｒａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ，ＵＳＡ）に形質転換し、選択的培地中にプレートする。最終構築物を制限酵素分析によって検証する。各ｐＦＰプラスミドに使用される特定のインサートについては、表１７を参照されたい。
ｐＶＭ１３からｐＦＰ４を作製するためのＣｖＥＲＧ１０のオープンリーディングフレームを、製造業者によって推奨されるように、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）を使用してオリゴｏ１及びｏ３で増幅する。ＰＣＲ断片を、製造業者（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＵＳＡ）によって推奨されるように、ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－５，Ｃａｐｐｅｄ Ｃｏｌｕｍｎｓを使用して精製する。濃度は、推奨されるように、Ｄｅｎｏｖｉｘ（ＵＳＡ）によるＤＳ ＤＮＡブロードレンジキットを使用して決定する。
ＰＣＲ産物を上記のようなＧｏｌｄｅｎＢｒａｉｄライゲーションのインサートとして、以下の表に示される他の部分とともに使用して、ｐＦＰ４を作製する。最終構築物を、制限酵素分析、及び増幅されたオープンリーディングフレームの配列検証によって検証する。
ａｄｈ５欠失株の構築
ＡＴＣＣ２０９１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）をＰａｃＩで消化したｐＦＰ１で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートする。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一のコロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を３０℃で開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏｆ１及びｏ１１、並びにオリゴｏｆ２及びｏ１０を使用して、ＡＤＨ５の第１の対立遺伝子の欠失をＰＣＲによって検証する。正しい増幅バンドを有する株をＦＹ１と名付ける。
１００μｌのＦＹ１の一晩分を、ＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレートにプレートし、３０℃で数日間インキュベートする。５－ＦＯＡ耐性コロニーをＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレート中で再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＤＨ５遺伝子座におけるＵＲＡ３からのループを、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏｆ１及びｏｆ２を使用してＰＣＲによって検証する。正しい増幅バンドを有する株をＦＹ２と名付ける。
ＦＹ２を、ＰａｃＩで消化したｐＦＰ２で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートする。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一のコロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を３０℃で開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ１２及びｏ１３、並びにオリゴｏｆ４及びｏｆ５を使用して、ＡＤＨ５の第２の対立遺伝子の欠失をＰＣＲによって検証する。オリゴｏ１２及びｏ１３は、アクチン遺伝子の８０３ｂｐヌクレオチド断片を増幅し、一方、ｏｆ４及びｏｆ５は、ＡＤＨ５遺伝子の３６６ヌクレオチド断片を増幅する。正しい増幅バンドを有する株をＦＹ３と名付ける。
１００μｌのＦＹ３の一晩分を、ＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレートにプレートし、３０℃で数日間インキュベートする。５－ＦＯＡ耐性コロニーをＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレート中で再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＤＨ５遺伝子座におけるＵＲＡ３からのループを、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ１及びｏ３並びにオリゴｏ１及びｏ２を使用してＰＣＲによって検証する。正しい増幅バンドを有する株をＦＹ４と名付ける。
次いで、この株を使用して、異なる二級アルコールデヒドロゲナーゼを試験する。内因性活性が有害である場合、この株はその後、全ての遺伝子操作のための基礎株となる。
ＣｖＥＲＧ１０を過剰発現する株の構築
ＡＴＣＣ２０９１３（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＵＳＡ）をＰａｃＩで消化したｐＦＰ５で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートする。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一のコロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を３０℃で開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、隣接領域及び挿入されたＤＮＡ片に相補的な領域に外部で結合するオリゴを使用するＰＣＲによって、ＡＤＨ５の第１の対立遺伝子の欠失を検証する。次のステップには、正しい増幅バンドを有する株を使用する。
１００μｌの正しい株の一晩分をＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレートにプレートし、３０℃で数日間インキュベートする。５－ＦＯＡ耐性コロニーをＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレート中で再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＤＨ５遺伝子座におけるＵＲＡ３からのループを、Ａｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲによって検証する。次のステップには、正しい増幅バンドを有する株を使用する。
正しい株を、ＰａｃＩで消化したｐＦＰ６で形質転換し、ＳｃＤ－ｕｒａプレートにプレートする。ＵＲＡ＋コロニーを再度画線し、単一のコロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を３０℃で開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、オリゴｏ１２、ｏ１３、オリゴｏ４、及びｏ５を使用して、ＡＤＨ５の第２の対立遺伝子の欠失をＰＣＲによって検証する。オリゴｏ１２及びｏ１３は、アクチン遺伝子の８０３ヌクレオチド断片を増幅し、一方、ｏ４及びｏ５は、ＡＤＨ５遺伝子の３６６ヌクレオチド断片を増幅する。次のステップには、正しい増幅バンドを有する株を使用する。
ＵＲＡ３が別の遺伝子操作に必要な場合、１００μｌの正しい株の一晩分をＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレートにプレートし、３０℃で数日間インキュベートする。５－ＦＯＡ耐性コロニーをＳｃＤ＋５－ＦＯＡプレート中で再度画線し、単一コロニーを使用して５ｍｌのＹＰＤの一晩分を開始する。ゲノムＤＮＡを抽出し、ＡＤＨ５遺伝子座におけるＵＲＡ３からのループを、推奨されるようにＡｐｅｘ Ｔａｑ ＲＥＤ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｇｅｎｅｓｅｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＣＲによって検証する。次のステップには、正しい増幅バンドを有する株を使用する。
ＡＤＨ５遺伝子座に加えて、ゲノムの他の領域により多くのコピーを挿入することができる。
ＧＲＥ３遺伝子座へのＣｖＥＲＧ１０の２つのコピーの挿入。
ｐＦＰ５及びｐＦＰ６の代わりにｐＦＰ７及びｐＦＰ８がそれぞれ使用されることを除いて、前の実施例と同様の方法が使用される。
他のＥＲＧ１０遺伝子の発現。
他のＥＲＧ１０遺伝子も、脂肪酸からのアセトン及びイソプロパノール産生収率を増加させ得る。ＣｖＥＲＧ１０のオープンリーディングがｐＶＭ６７からのＣｊＥＲＧ１０のオープンリーディングフレームに置き換えられることを除いて、記載されたものと同様の実施例が繰り返される。
アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ酵素の発現
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ由来のアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼに加えて、他のアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼを使用して、アセトアセチル－ＣｏＡからアセトアセテートへの工程を触媒することができる。これらの遺伝子には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｌｇｉｄｉｃａｒｎｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来の遺伝子が含まれる。
これらのタンパク質の発現は、ＣｂＣＴＦ１及びＣｂＣＴＦ２の発現と同様の方法で行われる。ＣｂＣＴＦ１及びＣｂＣＴＦ２のオープンリーディングフレームは、それぞれ、プラスミドｐＶＭ９９、ｐＶＭ１００、ｐＶＭ１０１、ｐＶＭ１０２、ｐＶＭ１０３、ｐＶＭ１０４、ｐＶＭ１０５、及びｐＶＭ１０６に見られるＣｓＣＴＦ１及びＣｓＣＴＦ２、ＣａＣＴＦ１及びＣａＣＴＦ２、ＣｔＣＴＦ１及びＣｔＣＴＦ２、又はＥｃＣＴＦ１及びＥｃＣＴＦ２のオープンリーディングフレームに置き換えられる（表１６）。次いで、発現の効果を、前述したように発酵によって決定する。
チオエステラーゼ酵素の発現
アセトアセチル－ＣｏＡからアセトアセテートへの工程を触媒する別の選択肢は、チオエステラーゼを使用することである。潜在的なチオエステラーゼ活性を有するいくつかの例は、それぞれＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｒｏｄｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ ｔｒｅｈａｌｏｓｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｒｏｄｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ ｍｙｏｄｉｓ、Ｒｏｄｅｎｔｉｂａｃｔｅｒ ｇｅｎｏｍｏｓｐ．２、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｔｒｏｐｈａｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、Ｅｎｓｉｆｅｒ、又はＳｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ由来のＨｉｙｂｇＣ、ＨｈｙｂｇＣ、ＨｐｙｂｇＣ、ＲｔｙｂｇＣ、ＲｍｙｂｇＣ、ＲｇＹＢＧＣ、ＢｘＳｒｆＡＤ、ＢａＳｒｆＡＤ、ＢｈＳｒｆＡＤ、ＳｍＡＣＬ、ＥｘＡＣＬ、及びＳｆＡＣＬである。
これらのタンパク質の発現は、ＣｂＣＴＦ１をチオエステラーゼのオープンリーディングフレームに置き換え、ＣｂＣＴＦ２を使用しない以外は、ＣｂＣＴＦ１とＣｂＣＴＦ２の発現と同様の方法で行われる。ＣｂＣＴＦ１のオープンリーディングフレームを、それぞれプラスミドｐＶＭ８８、ｐＶＭ９０、ｐＶＭ１０７、ｐＶｍ１０８、ｐＶＭ１０９、ｐＶＭ８９、ｐＶＭ１１１、ｐＶＭ１１２、ｐＶＭ１１３、ｐＶＭ１１４、ｐＶＭ１１５、ｐＶＭ１１６に見られるＨｉｙｂｇＣ、ＨｈｙｂｇＣ、ＨｐｙｂｇＣ、ＲｔｙｂｇＣ、ＲｍｙｂｇＣ、ＲｇＹＢＧＣ、ＢｘＳｒｆＡＤ、ＢａＳｒｆＡＤ、ＢｈＳｒｆＡＤ、ＳｍＡＣＬ、ＥｘＡＣＬ、又はＳｆＡＣＬ に置き換える（表１６）。次いで、発現の効果を、前述したように、発酵によって決定する。
アセトアセテートデカルボキシラーゼの発現
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ由来のアセトアセテートデカルボキシラーゼに加えて、他のアセトアセテートデカルボキシラーゼを使用して、アセトアセテートからアセトンへの工程を触媒することができる。これには、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｇａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｐｒｉｅｓｔｉａ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｉｃｏｌａ、Ｐｅｌｏｓｉｎｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｅｓｔｅｒｔｈｅｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ ＤＬ－ＶＩＩ、及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｐｅｒｂｕｔｙｌａｃｅｔｏｎｉｃｕｍ由来の遺伝子が含まれる。
これらのタンパク質の発現は、ＣｂＡＤＣ１の発現と同様に行われる。ＣｂＡＤＣ１のオープンリーディングフレームを、それぞれプラスミドｐＶＭ９２、ｐＶＭ９３、ｐＶＭ１１７、ｐＶＭ１１８、ｐＶＭ１１９、ｐＶＭ１２０、ｐＶＭ１２１、ｐＶＭ１２２、又はｐＶＭ１２３に見られるＣｄＡＤＣ１、ＣｓＡＤＣ１、ＣｃＡＤＣ１、ＣｐＡＤＣ１、ＰｍＡＤＣ１、ＢａＡＤＣ１、ＰｆＡＤＣ１、ＣｅＡＤＣ１、又はＢｘＡＤＣ１に置き換える（表１６）。次いで、発現の効果を、前述したように、発酵によって決定する。
その他のプロモーター
他のプロモーターを使用して、アセトアセテート－ＣｏＡ Ｃ－トランスフェラーゼ、チオエステラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、又は二級アルコールデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を駆動することができる。これらのプロモーターは、高レベルの発現、構成的又は脂肪酸誘導性プロモーターを有する。中心的炭素代謝、一般転写又は一般翻訳に関与する酵素をコードする遺伝子からのプロモーターは、高発現構成的プロモーターの良い候補である。脂肪酸の酸化又は分解に関与する遺伝子をコードするプロモーターは、好適な誘導性プロモーターであり得る。タンパク質の開始コドンの５００～１０００ｂｐ上流に、ＥＴＦ１、ＰＯＸ４、又はＰＥＸ１１プロモーターが融合されたのと同様に発現されるオープンリーディングフレームと融合してクローニングされる。
酵素のペルオキシソームへの局在化。
イソプロパノール経路の酵素の全部又は一部をペルオキシソームに局在化することに利益があり得る。酵素は、ペルオキシソーム標的化シグナル（ＰＴＳ）の付加によってペルオキシソームを標的とする。ＧＲＲＡＫＬをコードする更なる１８の塩基対を、タンパク質のカルボキシル末端でオープンリーディングフレームに付加する。ペルオキシソーム標的化オープンリーディングフレームは、非ペルオキシソーム標的化オープンリーディングフレームを上記のクローニングに置き換え、それらは、上記のようにゲノムに組み込まれる。次いで、発現の効果を、前述したように、発酵によって決定する。酵素の局在化のための異なる選択肢については、表１８を参照されたい。
アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼの発現
アセトアセテート－ＣｏＡ Ｃ－トランスフェラーゼに加えてアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼの発現は、アセテートをペルオキシソームから移動させるか、又はアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼにアセテートを提供することによって、アセトン若しくはイソプロパノールの産生を改善し得る。ＴｂＡＣＴ１によってコードされる酵素などの酵素をコードするオープンリーディングフレームは、他の遺伝子について記載されるように、構成的プロモーター又は脂肪酸プロモーターの制御下に置かれる。次に、遺伝子をランダムに挿入するか、又は特定のゲノム部位に組み込む。次いで、発現の効果を、前述したように、発酵によって決定する。
参考文献
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Claims (27)

  1. １つ以上の組換え遺伝子を含む組換え酵母であって、前記１つ以上の組換え遺伝子が、アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセト－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、アセトアセテートデカルボキシラーゼ、及びイソプロパノールデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるいずれか１つ以上の酵素を発現するように構成されている、組換え酵母。
  2. 前記１つ以上の組換え遺伝子が、配列番号１～３のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含むアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、配列番号７～１０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含むアセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ、配列番号１５～２６のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含むアセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、配列番号１～３及び３９～５０のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含むアセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼ、配列番号６３～８２のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含むアセトアセテートデカルボキシラーゼ、及び配列番号１０３～１０９のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含むイソプロパノールデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるいずれか１つ以上の酵素を発現するように構成されている、請求項１に記載の組換え酵母。
  3. 前記１つ以上の組換え遺伝子が、前記アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼ、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼ、及び前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼからなる群から選択されるいずれか１つ以上の酵素を発現するように構成されている、請求項１又は２に記載の組換え酵母。
  4. 前記１つ以上の組換え遺伝子が、前記アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼを発現するように構成されている、請求項１～３のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  5. 前記アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号１５及び１７のうちのいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  6. 前記１つ以上の組換え遺伝子が、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼを発現するように構成されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  7. 前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、配列番号６３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  8. 前記１つ以上の組換え遺伝子が、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼを発現するように構成されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  9. 前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  10. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの少なくとも１つが異種プロモーターを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  11. 前記１つ以上の組換え遺伝子のそれぞれが、異種プロモーターを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  12. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの少なくとも１つが、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  13. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの１つが、前記アセチル－ＣｏＡチオエステラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  14. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの１つが、前記アセト－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  15. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの１つが、前記アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  16. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの１つが、前記アセトアセチル－ＣｏＡチオエステラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  17. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの１つが、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  18. 前記１つ以上の組換え遺伝子のうちの１つが、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  19. 各脂肪酸誘導性プロモーターが、独立して、ＰＯＸ１（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ１）プロモーター、ＰＯＸ２（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ２）プロモーター、ＰＯＸ４（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ４）プロモーター、ＰＯＸ５（アシル－ＣｏＡオキシダーゼ５）プロモーター、Ｇ３Ｐ（グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＩＣＬ１（イソシトレートリアーゼ）プロモーター、ＰＯＴ１（３－オキソ－アシル－ＣｏＡチオラーゼ）プロモーター、ＬＩＰ２（リポイルリガーゼ）プロモーター、ＴＤＨ１（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム１）プロモーター、ＴＤＨ３（グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、アイソザイム３）プロモーター、ＰＥＸ１１（ペルオキシソーム膜タンパク質）プロモーター、又は前述のうちのいずれかのバリアントから選択される、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  20. 各脂肪酸誘導性プロモーターが、独立して、配列番号１１７、１１８、及び１２０のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  21. 前記酵母がＣａｎｄｉｄａの種である、先行請求項のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  22. 前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉである、先行請求項のいずれか一項に記載の組換え酵母。
  23. 前記酵母が、Ｃａｎｄｉｄａ ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉであり、前記１つ以上の組換え遺伝子が、
    前記アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む組換え遺伝子であって、前記アセトアセチル－ＣｏＡトランスフェラーゼが、配列番号１５及び１７のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含み、前記脂肪酸誘導性プロモーターが、配列番号１１７、１１８及び１２０のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、組換え遺伝子と、
    前記アセトアセテートデカルボキシラーゼを発現するように構成され、脂肪酸誘導性プロモーターを含む組換え遺伝子であって、前記アセトアセテートデカルボキシラーゼが、配列番号６３と少なくとも９５％同一の配列を含み、前記脂肪酸誘導性プロモーターが、配列番号１１７、１１８、及び１２０のうちのいずれか１つと少なくとも９５％同一の配列を含む、組換え遺伝子と、を含む、請求項１に記載の組換え酵母。
  24. 前記１つ以上の組換え遺伝子が、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼを発現するように構成された組換え遺伝子を含み、前記イソプロパノールデヒドロゲナーゼが、配列番号１０３と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項２３に記載の組換え酵母。
  25. 産物を産生する方法であって、前記産物を産生するのに十分な時間の間、脂肪酸を含む培地中でいずれかの先行請求項に記載の酵母を培養することを含み、前記産物がアセトン及びイソプロパノールのうちの１つ以上を含む、方法。
  26. 前記脂肪酸が、少なくとも１％ｖ／ｖの量で前記培地中に存在する、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記培地が、発酵性糖を含まないか、又は２５％ｗ／ｖ未満の発酵性糖を含有する、請求項２５又は２６に記載の方法。
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