CZ299320B6 - Zpusoby a látky pro syntézu organických produktu - Google Patents

Abstract

Predmetem vynálezu jsou zpusoby a látky, týkajícíse produkce organických produktu, zejména ruznýchrekombinantních kvasinkových bunek, zpusobu kultivování kvasinkových bunek, zpusobu prípravy kvasinkových bunek, vytvorených struktur nukleové kyseliny.

Description

Tento vynález se týká způsobů a látek, které jsou zapojeny do přípravy organických produktů.

Dosavadní stav techniky

Organické produkty, jako je kyselina mléčná, mají mnoho důležitých průmyslových použití. Například mohou být organické kyseliny použity k syntéze plastických hmot, stejně jako jiných produktů. Za účelem vyhovět zvýšené potřebě organických produktů, byly vyvinuty účinnější a z hlediska nákladů účelnější způsoby přípravy. Jeden takový způsob zahrnuje použití bakterií. Zvláště mohou jisté bakterie, za jistých podmínek fermentace, produkovat velká množství specifických organických produktů. Použití živých bakterií jako výrobních jednotek, však je omezeno neschopností bakterií růst, jak se v prostředí růstu hromadí organický produkt. Za účelem obejití takových omezení, jsou během syntézy produktů používány různé čistící techniky produktů. Navíc byly učiněny pokusy s použitím jiných mikroorganismů než bakterií. Ve skutečnosti byla při pokusu připravit kyselinu mléčnou geneticky modifikována Sacharomyces cerevisiae, o které je známo, že snáší kyselinu. Přesně byly buňky Λ¹, cerevisiae modifikovány získáním buněk s komplementární DNA (cDNA) hovězího laktátu dehydrogenázy a divergencí endogenních genů pyruvát dekarboxylázy (PDC1, PDC a PDC6). Zatímco tyto modifikované buňky S. cerevisiae vyprodukovaly určité množství kyseliny mléčné, byl potlačen růst buněk, což vedlo k závěru, že jak růst buněk tak produkce kyseliny mléčné vyžadují zlepšení.

Dokument WO 97/16528 popisuje mutant řetězce E.coli, který nemá schopnost zúčastnit se katabolismu pyrovátu. Mutanty jsou vybrány na základě jejich schopnosti růst na glukóze v anaerobním prostředí. Mutantový řetězec je užitečný při produkování jantarové kyseliny.

Podle dokumentu EP 0370160 je mrazuodolný řetězec Kluyveromyces thermotolerans produkován pro použití jako kvasnice do pečivá růstem buněk v prostředí obsahujícím dusík a fosfor, dokud se nevyprodukuje 40 až 150 g/L buněk, pak se přidává až do 200 % hmotn. melasy, podle hmotnosti buněk kvasnic, a redukuje se zkypření. Tento způsob má produkovat kvasnice do pečivá s vynikající fermentační schopností při pečení.

Porro a kol. popsali mutant S.cerevisiae, obsahující gen exogenní laktát dehydrogenázy (LDH) a se sníženou PDC aktivitou. Viz WO 99/14335 and Biotech.Prog.1995, 11, str.294-298.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se obecně týká způsobů a látek pro přípravu organických produktů. Zvláště tento vynález poskytuje buňky kvasinek, způsoby pro pěstování kvasinkových buněk, struktury nukleové kyseliny a způsoby a látky pro přípravu různých organických produktů. Tento vynález je založen na objevu, že specifické mikroorganismy (např. bakteriální a houbové mikroorganismy) mohou být geneticky upraveny tak, že mají schopnost, za specifických růstových podmínek, růst, využívat různé zdroje uhlíku pro růst, stejně jako pro tvorbu produktu a produkovat požadovaný organický produkt pro průmyslové účely. Například, buňky kvasinek zde uváděné mohou růst a vytvářet organický produkt, když jsou pěstovány při nízkém pH a vysoké teplotě. To, že mají schopnost rychle růst a efektivně produkovat organické produkty za podmínek, například nízkého pH a vysoké teploty je zvláště výhodné. Zvláště schopnost mikroorganismu snášet nízké pH odstraňuje potřebu udržovat prostředí s neutrálním pH, což může být, během procesu výroby ve velkém měřítku, obtížné a nákladné. Navíc, způsoby a látky potřebné k získání požadovaného organického produktu z živné půdy o nízkém pH mohou být praktičtější a

- 1 CZ 299320 Β6 efektivnější než způsoby a látky požadované k získání některých organických produktů ze živné půdy, která má neutrálnější pH. Například se mohou jisté produkty organických kyselin vysrážet z roztoku, jak pH poklesne pod hodnotu pKa produktu, což činí získání zcela snadným. Dále schopnost mikroorganismu snášet vysoké teploty odstraňuje potřebu udržovat během růstové a produkční fáze chladicí teploty. Samozřejmě, snížení potřeby nižší teploty ve velkoobjemových nádržích s živnou půdou, během procesu výroby ve velkém měřítku, činí proces účinnější a méně nákladný. Mimoto schopnost mikroorganismu snášet jak nízké pH tak vysokou teplotu poskytuje, v průběhu procesu produkce ve velkém měřítku, výhodný způsob zabránění znečištění jinými méně odolnými mikroorganismy.

Je důležité si povšimnout, že kritickým aspektem týkajícím se schopnosti produkovat požadovaný organický produkt pro průmyslové účely, může být specifická produktivita s kterou je požadovaný organický produkt vyráběn. Například, použití způsobů a látek, jak jsou popsány zde, které poskytují vysokou specifickou produktivitu, může dovolit mikroorganismu vytvářet energii potřebnou pro zachování buňky, když je vystavena podmínkám růstu, jako jsou nízké pH a vysoká teplota. Tato potřebná energie může být vytvářena cestou fermentace za v podstatě anaerobních podmínek, spíše než, že spočívá na tvorbě energie cestou respirace. Získávání energie prostřednictvím fermentace je zvláště výhodné, když je produkován organický produkt, který nevyžaduje respiraci, jelikož v podstatě všechen poskytnutý zdroj uhlíku může být využit k produkci požadovaného organického produktu.

Tento vynález je založen na objevu, že využití zdroje uhlíku jistými geneticky upravenými mikroorganismy, může být řízeno a směrováno přednostně na produkci buď biomasy nebo požadovaného organického produktu. Obecně, tento vynález zahrnuje dva typy růstových procesů. Jeden růstový proces zahrnuje pěstování mikroorganismu za specifických růstových podmínek, které závisí na mikroorganismu a požadovaném výstupu, který podporuje produkci biomasy, zatímco druhý zahrnuje odlišný soubor podmínek růstu, také závisejících na mikroorganismu a požadovaném výstupu, který podporuje produkci požadovaného organického produktu. Samozřejmě to, že má schopnost ovlivňovat využití zdroje uhlíku během procesu produkce ve velkém měřítku, dává výrobci větší pružnost a větší kontrolu než je jinak možné.

Navíc je tento vynález založen na objevu, že jisté mikroorganismy mohou být geneticky upraveny tak, že většina, pokud ne všechen, zdroj uhlíku je využit pro produkci buď biomasy nebo požadovaného organického produktu. Zvláště tento vynález poskytuje buňky kvasinek, které jsou modifikované tak, že způsoby biosyntézy, které odklání využití zdroje uhlíku od produkce biomasy nebo požadovaného organického produktu nejsou aktivované. Inaktivace takových způsobů biosyntézy poskytuje mikroorganismy, které efektivně rostou a produkují požadovaný produkt.

Obecně, jsou charakteristickým rysem tohoto vynálezu buňky kvasinek obsahující molekuly exogenních nukleových kyselin, s molekulami exogenních nukleových kyselin kódujícími polypeptidy, které v rámci buňky vykazují enzymatickou aktivitu. Nukleová kyselina může být včleněna do genomu buňky. Enzymatická aktivita vede k tvorbě organického produktu, který, v některých ztělesněních, je vylučován z buňky. Buňka dále obsahuje Crabtree-negativní fenotyp kmene a produkuje organický produkt. Buňka může být například z genu Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon nebo Yamadazyma. Organickým produktem může být například, fermentační produkt, produkt odvozený od pyruvátu, organická kyselina nebo karboxylát, jako je laktát. V jednom ztělesnění může polypetid vykazovat aktivitu laktát dehydrogenázy. Například exogenní kyselina nukleová může kódovat bakteriální laktát dehydrogenázu nebo houbovou laktát dehydrogenázu, jako jsou houbová laktát dehydrogenáza K. lactis.

V jiném ztělesnění obsahuje buňka molekuly čtyř exogenních nukleových kyselin, přičemž každá ze čtyř exogenních nukleových kyselin kóduje odlišný polypeptid. Například, první ze čtyř molekul exogenní nukleové kyseliny může kódovat první polypeptid, který vykazuje aktivitu laktát dehydrogenázy, druhá může kódovat druhý polypeptid, který vykazuje aktivitu CoA-transferázy, třetí může kódovat třetí polypeptid, který vykazuje aktivitu laktyl-CoA dehydratázy a čtvrtá může .

CZ 299020 B6 kódovat čtvrtý polypeptid, který vykazuje aktivitu akrylyl-CoA hydratázy. Taková buňka může produkovat akrylát, jako karboxylátový produkt. Alternativně první ze čtyř molekul exogenní nukleové kyseliny může kódovat první polypeptid, který vykazuje aktivitu 2-dehydro-3-deoxy-Dpentanoát aldolázy, druhá může kódovat druhý polypeptid, který vykazuje aktivitu xylonát dehydratázy, třetí může kódovat třetí polypeptid, který vykazuje aktivitu xylon laktonázy a čtvrtá může kódovat čtvrtý polypetid, který vykazuje aktivitu dehydrogenázy D-xylózy. Taková buňka může produkovat cukr, jako je D-xylóza, jako organický produkt.

V ještě jiném ztělesnění obsahuje buňka šest molekul exogenních nukleových kyselin, každá ze šesti molekul exogenních nukleových kyselin kóduje odlišný polypeptid. Například, první ze šesti molekul exogenních nukleových kyselin může kódovat první polypeptid, který vykazuje aktivitu 2,5-dioxovalerát dehydrogenázy, druhá může kódovat druhý polypeptid, který vykazuje aktivitu 5-dehydro-4-deoxy-D-glukarát dehydrogenázy, třetí může kódovat třetí polypeptid, který vykazuje aktivitu glukarát dehydratázy, čtvrtá může kódovat čtvrtý polypeptid, který vykazuje aktivitu aldehyd dehydrogenázy, pátá může kódovat pátý polypeptid, který vykazuje aktivitu glukoronolakton reduktázy a šestá může kódovat šestý polypeptid, který vykazuje aktivitu L-gulonolakton oxidázy. Taková buňka může jako organický produkt produkovat vitamin, například L-askorbát.

Organický produkt může obsahovat více než tři atomy uhlíku a může jím být například aminokyselina.

V jiném ztělesnění je buňka schopna katabolizovat uhlík pentózy, jako jsou ribóza, arabinóza, xylóza a lyxóza.

V jiném ztělesnění má buňka sníženou aktivitu pyruvát dekarboxylázy nebo sníženou aktivitu alkohol dehydrogenázy. Například může buňka postrádat veškerou aktivitu pyruvát dekarboxylázy. Pyruvát dekarboxylázová aktivita může být snížená z důvodu divergence genetické sekvence, kde sekvence normálně obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje pyruvát dekarboxylázu. Alternativně může buňka obsahovat molekulu antimediátoru, jako je ribozym, který odpovídá sekvenci endogenní nukleové kyseliny tam, kde antimediátorová molekula snižuje pyruvát dekarboxylázovou aktivitu. Buňka může také obsahovat pomocnou molekulu exogenní nukleové kyseliny, která funguje jako smrtící plazmid.

V jiném ztělesnění vede enzymatická aktivita polypeptidu kódovaného exogenní nukleovou kyselinou k tvorbě organického produktu způsobem spotřebovávajícím redukovaný nikotin-amidadenindinukleotid (NADH).

V jiném ztělesnění produkuje buňka nejméně asi 60 gramů organického produktu na každých 100 gramů spotřebované glukózy, když je buňka kultivovaná pro produkci organického produktu za optimálních podmínek.

V jiném aspektu, tento vynález charakterizuje buňku, např. buňku kvasinky, která obsahuje molekulu exogenní nukleové kyseliny, kde molekula exogenní nukleové kyseliny kóduje polypeptid, který podporuje katabolizaci pentosového uhlíku buňkou. Polypeptidem může být například xylózo reduktáza, xylitol dehydrogenáza nebo xylulokináza a pentózovým uhlíkem může být například ribózový, arabinózový, xylózový a lyxózový. Buňka může dále katabolizovat hexózový uhlík a může pokud je to žádoucí současně katabolizovat hexózový a pentózový uhlík. Hexózovým uhlíkem může být například, allózový, altrózový, glukózový, mannózový, gulózový, jodózový, fruktózový, galaktózový a talózový.

V jiném aspektu, tento vynález věnuje pozornost buňce kvasinky obsahující molekulu exogenní nukleové kyseliny, ve které molekula exogenní nukleové kyseliny kóduje polypeptid, který podporuje akumulaci acetyl-CoA v cytoplasmě buňky. Polypeptid může být polypeptidem, který vykazuje aktivitu citrát lyázy nebo může být polypeptidem mitochondrální membrány, který pod-3CZ 299020 B6 póruje propustnost acetyl-CoA skrz mitochodriální membránu. Buňka může mít sníženou pyruvát dekarboxylázovou aktivitu nebo sníženou alkohol dehydrogenázovou aktivitu. Alternativně může kvasinková buňka postrádat schopnost tvorby ethanolu a může vykazovat rychlost růstu za podmínek kultivace bez ethanolu a acetátu, která je vyšší než rychlost růstu pozorovaná pro srovnatelnou kvasinkovou buňku postrádající schopnost produkce ethanolu.

V ještě jiném aspektu charakterizuje tento vynález kvasinkovou buňku, která vykazuje sníženou aktivitu mitochondrálního polypeptidu, ve kterém má buňka Crabtree-negativní fenotyp kmene. Taková buňka může být například z rodu Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon nebo Yamadazyma. Buňkám může zcela chybět aktivita. Buňky mohou postrádat divergovanou sekvenci, v místě kde sekvence normálně obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje mitochondrální polypeptid. Mitochondrální polypeptid může být enzymem Krebsova cyklu. Dále může buňka akumulovat produkt Krebsova cyklu. Buňka může obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, v místě kde molekula exogenní nukleové kyseliny kóduje polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu, takové, že buňka produkuje organický produkt. Organickým produktem může být například citrát, α-ketoglutarát, sukcinát, fumarát, malát a oxalacetát. Polypeptid může být polypeptidem, který se účastní katabolizace laktátu nebo acetátu.

V jiném aspektu, popisuje tento vynález způsob výroby organického produktu. Způsob zahrnuje získání kvasinkových buněk, kde buňky obsahují molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který v buňce vykazuje enzymatickou aktivitu, kde enzymatické působení vede k tvorbě organického produktu a kde buňky obsahují Crabtree-negativní fenotyp kmene a kultivaci buněk v takovém kultivačním prostředí, že je produkován organický produkt. Kvasinkové buňky mohou být z rodů Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon nebo Yamadazyma. Organickým produktem může být fermentační produkt, od pyruvátu odvozený produkt, organický produkt obsahující více než tři atomy uhlíku, karboxylát, cukr, aminokyselina, vitamin nebo lipidový produkt. Organickým produktem může dále být laktát, glycerol, akrylát, xylóza, askorbát, citrát, isocitrát, α-ketoglutarát, sukcinyl-CoA, sukcinát, fumarát, malát nebo oxalacetát. V některých ztělesněních je organický produkt vylučován buňkami. Způsob může končit buňkami, které mají sníženou pyruvát dekarboxylázovou aktivitu nebo sníženou alkohol dehydrogenázovou aktivitu. Enzymatická aktivita může vést k tvorbě organického produktu způsobem, který spotřebovává NADH.

Když je krok kultivace optimální pro produkci organického produktu mohou buňky připravené těmito způsoby produkovat nejméně asi 60 gramů organického produktu na každých 100 gramů spotřebované glukózy. Prostředí kultivace, které může být kapalné, může obsahovat inhibitor buněčné respirace, jako jsou antimycin A, kyanid nebo azid. Krok kultivace může zahrnovat pěstování buněk za aerobních podmínek, které jsou doprovázeny kontaktem uvedených buněk s inhibitorem buněčné respirace.

V alternativním ztělesnění zahrnuje krok kultivace inkubaci buněk za aerobních podmínek růstu.

V dalším alternativním ztělesnění zahrnuje krok kultivace růst buněk za aerobních podmínek, po kterém následuje inkubace buněk za anaerobních podmínek pěstování. Krok kultivace může také zahrnovat pěstování buněk při teplotě vyšší než asi 35 °C.

V jiném ztělesnění má prostředí kultivace hodnotu organického pH nižší než asi 3,0, a/nebo hodnotu anorganického pH nižší než asi 3,0. V jiném ztělesnění obsahuje prostředí pentózový uhlík, jako je ribóza, arabinóza, xylóza nebo lyxóza. Prostředí také může obsahovat hydrolyzát kukuřičných vláken, který má, například, hodnotu pH mezi asi 2,0 a asi 6,5.

V jiném aspektu zobrazuje tento vynález způsob výroby organických produktů, který zahrnuje

-4CZ 29Q320 B6

a) získání kvasinkových buněk, které obsahují molekulu exogenní nukleové kyseliny kódující polypeptid, který podporuje katabolizaci petózového uhlíku buňkou, kde buňka obsahuje enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě uvedeného organického produktu, a

b) kultivaci buněk pomocí takového prostředí kultivace, že je produkován organický produkt.

V ještě jiném aspektu, popisuje tento vynález způsob výroby organického produktu způsobem zahrnujícím

a) získání kvasinkových buněk, kde buňky obsahují molekulu exogenní nukleové kyseliny kódující polypeptid, který podporuje akumulací acetyl-CoA v cytoplasmě buňky a kde buňka obsahuje in enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu, a

b) kultivaci buněk pomocí takového prostředí kultivace, že je produkován organický produkt.

V jiném aspektu popisuje tento vynález způsob produkce organického produktu, který zahrnuje

a) získání kvasinkových buněk, které mají sníženou aktivitu mitochondrálního enzymu, ve kte15 fych snížení aktivity vede k akumulaci organického produktu, a

b) kultivaci uvedených buněk pomocí takového prostředí kultivace, že je produkován uvedený organický produkt.

V jiném aspektu popisuje tento vynález způsob pěstování kvasinkových buněk, které vykazují

2o Crabtree-negatívní fenotyp kmene, způsob zahrnující kultivaci buněk pomocí kultivačního prostředí, kde má kultivační prostředí hodnotu organického pH nižší než asi 3,0 a/nebo hodnotu anorganického pH nižší než asi 3,0. Krok kultivace může zahrnovat kultivaci buněk při teplotě vyšší než asi 35 °C. Kultivační prostředí může obsahovat inhibitor buněčné respirace. Kultivační prostředí může také obsahovat pentózový uhlík. V jiném ztělesnění může prostředí kultivace obsahovat hydrolyzát kukuřičných vláken.

V jiném aspektu popisuje tento vynález způsob pěstování kvasinkových buněk, které mají Crabtree-negatívní fenotyp kmene, způsob, kteiý zahrnuje kultivaci buněk pomocí prostředí kultivace, kde prostředí kultivace obsahuje hydrolyzát kukuřičných vláken.

V jiném aspektu tento vynález popisuje způsob kultivace kvasinkových buněk, které mají Crabtree-negatívní fenotyp kmene, způsob zahrnující kultivaci buněk pomocí prostředí kultivace při teplotě vyšší než asi 35 °C, pomocí prostředí kultivace, které má hodnotu anorganického pH nižší než 3,0.

V jiném aspektu tento vynález popisuje způsob kultivace kvasinkových buněk, které mají Crabtree-negatívní fenotyp kmene, způsob zahrnující kultivaci buněk pomocí kultivačního prostředí při teplotě vyšší než asi 35 °C, pomocí kultivačního prostředí obsahujícího pentózový uhlík.

V jiném aspektu tento vynález popisuje způsob kultivace kvasinkových buněk, které mají Crabtree-negatívní fenotyp kmene, způsob zahrnující kultivaci buněk pomocí kultivačního prostředí při teplotě vyšší než asi 35 °C, pomocí prostředí kultivace, které obsahuje hydrolyzát kukuřičných vláken.

V jiném aspektu popisuje tento vynález vytvořenou strukturu nukleové kyseliny, která obsahuje rekombinantní sekvenci a vybranou sekvenci, s rekombinantní sekvencí, která odpovídá genomové sekvenci buňky, která má Crabtree-negatívní fenotyp kmene s genomovou sekvencí a která kóduje enzym expresovaný buňkou, a s vybranou sekvencí, která kóduje enzym, který vede k tvorbě organického produktu v buňce. Vybraná sekvence může být v rámci rekombinantní sekvence, taková, že vybraná sekvence je na každém konci obklopena rekombinantní sekvencí.

-5 CZ 299320 Β6

V jiném aspektu popisuje tento vynález způsob přípravy rekobinantní kvasinkové buňky, zahrnující získání kvasinkové buňky, která má Crabtree-negativní fenotyp kmene, výběr konečného produktu, identifikaci, který exogenní enzym nebo enzymy je potřeba přidat do buňky k produkci konečného produktu, identifikaci, který endogenní enzym nebo enzymy, jejichž aktivita by měla být v uvedené buňce snížena, k umožnění produkce uvedeného konečného produktu, přidání identifikovaného exogenního enzymu nebo enzymů k získání kvasinkové buňky a snížení aktivity identifikovaného endogenního enzymu nebo enzymů v získané kvasinkové buňce, tak, že buňka za podmínek kultivace produkuje konečný produkt.

V jiném aspektu popisuje tento vynález hydrolyzát kukuřičných vláken, hydrolyzát, který má hodnotu pH mezi asi 2.0 a asi 6,5. Hydrolyzát může také obsahovat glukózu, xylózu a arabinózu. Hydrolyzát může obsahovat asi 40 g/litr glukózy, asi 40 g/litr xylózy a asi 20 g/litr arabinózy. Alternativně může hydrolyzát obsahovat 38,7 g/litr glukózy, asi 39,1 g/litr xylózy, asi 20,7 g/litr arabinózy a asi 1,6 g/litr furfuralu.

V jiném aspektu popisuje tento vynález způsob přípravy organického produktu, který zahrnuje

a) kultivaci mikroorganismu za podmínek kultivace, kde má mikroorganismus sníženou enzymatickou aktivitu; enzymatická aktivita může být aktivitou pyruvát dekarboxylázy, alkohol dehydrogenázy, aldehyd dehydrogenázy nebo acetyl-CoA syntázy; mikroorganismus vykazuje rychlost růstu za nepřítomnosti ethanolu a acetátu, kteráje nejméně asi 30 % rychlosti pozorované pro odpovídající mikroorganismus, který nemá uvedenou enzymatickou aktivitu sníženou, a

b) změnu podmínek kultivace pro podporu produkce organického produktu.

V jiném aspektu popisuje tento vynález způsob přípravy organického produktu zahrnující

a) kultivaci mikroorganismu za podmínek kultivace, které podporují buněčnou respiraci, kde má mikroorganismus sníženou enzymatickou aktivitu; enzymatickou aktivitou může být aktivita pyruvát dekarboxylázy, alkohol dehydrogenázy, aldehyd dehydrogenázy nebo acetyl-CoA syntázy, s mikroorganismy vykazujícími rychlost růstu za nepřítomnosti ethanolu a acetátu, kteráje nejméně asi 30 % rychlosti pozorované pro odpovídající mikroorganismy, které nemají takto sníženou enzymatickou aktivitu, a

b) změnu podmínek kultivace ke snížení buněčného dýchání, a tudíž k podpoře produkce organického produktu.

Pokud není jinak stanoveno, všechny technické a vědecké termíny zde použité mají stejný význam, jak jsou obecně chápány osobou běžně kvalifikovanou v oboru, kterého se tento vynález týká. Ačkoliv při praktickém provedení nebo testování podle tohoto vynálezu mohou být použity způsoby a látky podobné nebo ekvivalentní zde popsaným, vhodné způsoby a látky jsou popsány níže. Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a ostatní materiály zde uvedené jsou ve své celistvosti zahrnuty formou odkazů. V případě rozporu, bude rozhodující předkládaný popis včetně definic. Navíc, látky, způsoby a příklady jsou pouze pro vysvětlení a nejsou zamýšleny jako omezující.

Ostatní rysy a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a z patentových nároků.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr.l je schéma, popisující plasmid pHES. Na obr.2 je schéma, popisující plasmid pSEH. Na obr. 3 je schéma, znázorňující tvorbu plasmidů pCRIl, obsahujících bud’ Lh-ldh nebo Pa-ldh. Na obr.4 je schéma, popisující plasmidy Idh/pCRll. Na obr.5 je schéma, popisující tvorbu plasmidů pHES, obsahujících Lh-ldh nebo Pa-ldh.

-6CZ 299320 B6

Na obr.óa je schéma, znázorňující tvorbu posunutého fragmentu pyruvát dekarboxylázy (PDC). Na obr.ób je schéma, popisující fragment 5,5 tisíců párů bází (dále kbp), obklopující 1,7 kbp PDC1 K. marxianus. Na obr.óc je schéma, popisující deleci 400 párů bází (dále bp) z homologické oblasti 5,5 kbp PDC a inzerci genu pro kanamyacinovou resistenci. Na obr.ód je schéma, popisující oblast 4 kbp genu kanamyacinové resistence a okolní 2,3 tisíce párů bází PDC1. Na obr.óe je schéma, popisující 7,5 tisíc párů bází K. thermotolerans PDC1 a okolní oblast. Na obr.óf je schéma popisující deleci 750 párů bází z 1,7 tisíců párů bází genu PDC1 a vložení genu kanamyacinové resistence.

Obr.7 představuje graf, znázorňující růst (optická hustota; OD) v závislosti na času (hodiny) pro ío Kluyveromyces marxianus, kultivovaný za podmínek nízkého pH (pH 2,5) a vysoké teploty (40 °C).

Na obr.8 je graf, znázorňující růst (OD) v závislosti na času (hodiny) pro K. marxianus kultivované s glukózou, xylózou nebo arabinózou při 30 °C.

Na obr.9 je graf, znázorňující růst (OD) v závislosti na času (hodiny) pro K. marxianus kultivovaný s hydrolyzátem kukuřičných vláken při 30 °C.

Na obr. 10 je graf, znázorňující růst (OD) v závislosti na času (hodiny) pro K. marxianus kultivovaný při 30 °C a daném pH.

Na obr. 11 je graf, znázorňující růst (OD) v závislosti na času (hodiny) pro K. marxianus kultivovaný při 30 °C a daném pH za přítomnosti 40 g kyseliny mléčné.

Na obr.12 jsou tři grafy, znázorňující (A) produkci biomasy; (B) spotřebu glukózy; a (C) produkci ethanolu z S. uvarum a K. marxianus, když jsou kultivovány v anorganickém prostředí s 2 % glukózy za aerobních podmínek.

Obr. 13 zobrazuje tři grafy, znázorňující (A) produkci biomasy; (B) spotřebu glukózy; a (C) produkci ethanolu z 5. uvarum a K. marxianus, když jsou kultivovány v anorganickém prostředí s 2 % glukózy za anaerobních podmínek.

Na obr. 14 je plasmidová mapa promotor vektoru PDC 1.

Příklady provedení vynálezu

Tento vynález poskytuje způsoby a látky týkající se produkce organických produktů. Podrobně poskytuje tento vynález kvasinkové buňky, způsoby kultivace kvasinkových buněk, způsoby přípravy kvasinkových buněk, vytvořené struktury nukleové kyseliny a způsoby a látky pro produkci různých organických produktů.

Kvasinkové buňky poskytované zde mohou být použity k produkci organických produktů. Takové organické produkty mohou být použity v širokém rozsahu aplikací. Například organické produkty produkované kvasinkovými buňkami, zde popsanými, mohou být použity jako konzervační činidla nebo přísady v potravinách, farmaceutických nebo kosmetických produktech a mohou být použity k výrobě plastů stejně jako jiných produktů.

Pro účely tohoto vynálezu je organickým produktem jakákoliv sloučenina obsahující atom uhlíku. Organickými produkty jsou například karboxyláty (např. laktát, akry lát, citrát, isocitrát, α-ketoglutarát, sukcinát, fumarát, malát, oxaloacetát), cukry (např. D-xylosa), alditoly (např.

xylitol, arabitol, ribitol), aminokyseliny (např. glycin, tryptofan, glutamát), lipidy, estery, vitaminy (např. L-askorbát), polyoly (např. glycerol, 1,3-propandiol, erythritol), aldehydy, alkeny, alkiny a ketony. Tudíž může organický produkt obsahovat jeden, dva, tři, čtyři, pět, šest, sedm, osm, devět, deset nebo více atomů uhlíku. Navíc může mít organický produkt molekulovou hmotnost, která je nižší než asi 1000 (např. nižší než asi 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300,

2 00 nebo 100). Například D-xylóza (C₅H₁₀O₅) je organický produkt, který má molekulovou hmotnost 150. Dále mohou být organickými produkty produkty fermentace. Termín produkt

-7CZ 2958320 B6 fermentace, jak je používán zde, se týká jakékoliv organické sloučeniny, která je produkována procesem fermentace. Obecně zahrnuje proces fermentace anaerobní enzymatickou konverzi organických sloučenin, jako jsou cukry na sloučeniny jako jsou ethylalkohol, jejímž výsledkem je energie ve formě adenosin trifosfátu (ATP). Tudíž se fermentace odlišuje od buněčné respirace tím, že jsou jako příjemci elektronů používány spíše organické produkty než molekulární kyslík. Příklady produktů fermentace zahrnují, bez omezení, acetát, ethanol, butyrát a laktát.

Organickými produkty mohou být také produkty odvozené od pyruvátu. Výraz produkty odvozené od pyruvátu, jak je používán zde, se týká jakékoliv sloučeniny, která je syntetizována z pyruvátu v průběhu ne více než patnácti enzymatických kroků. Enzymatický krok je jakákoliv chemická reakce nebo řada reakcí katalyzovaná polypetidem, který vykazuje enzymatickou aktivitu. Výraz polypetid, který vykazuje enzymatickou aktivitu, jak je používán zde, se týká jakéhokoliv polypeptidu, který katalyzuje chemickou reakci jiných látek aniž by byl sám do dokončení této reakce nebo reakcí rozložen nebo změněn. Obecně, katalyzuje enzymatický polypeptid tvorbu jednoho nebo více produktů z jednoho nebo více substrátů. Takové polypeptidy mohou vykazovat jakýkoliv typ enzymatické aktivity včetně, bez omezení, enzymatické aktivity spojené s enzymy jako jsou akonitáza, isocitrát dehydrogenáza, ketoglutarát dehydrogenáza, sukcinát thiokináza, sukcinát dehydrogenáza, fumaráza, malát dehydrogenáza, citrát syntáza, 2,5-dioxovalerát dehydrogenáza, 5-dehydro-4-deoxy-D-glukarát dehydrogenáza, glukarát dehydratáza, aldehyd dehydrogenáza, glukoron lakton reduktáza, L-gulonolakton oxidáza, 2-dehydro-3-deoxy-D-pentanoát aldoláza, xylonát dehydratáza, xylonolaktonáza, D-xylóza dehydrogenáza, laktát dehydrogenáza, CoA-transferáza, laktyl-CoA dehydratáza nebo akryrylCoA hydratáza.

Je důležité si všimnout, že polypeptidy, které vykazují specifickou enzymatickou aktivitu mohou být polypeptidy, které se přírodně vyskytují nebo které se přírodně nevyskytují. Přírodně se vyskytující polypeptid je jakýkoliv polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, jak se vyskytuje v přírodě, včetně divokých typů a polymorfních polypeptidů. Takové přírodně se vyskytující polypeptidy mohou být získány z jakýchkoliv druhů, včetně bez omezení savčích, houbových a bakteriálních druhů. V přírodě se nevyskytující polypeptid je jakýkoliv polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se nevyskytuje v přírodě. Tak, může být přírodně se nevyskytující polypeptid mutovanou verzí přírodně se vyskytujícího polypeptidu nebo technicky vytvořeným polypeptidem. Například přírodně se nevyskytující polypeptid, vykazující aktivitu citrát syntázy, může být mutovanou verzí přírodně se vyskytujícího polypeptidu, který vykazuje aktivitu citrát syntázy nebo který si zachovává přinejmenším určitou aktivitu citrát syntázy. Polypeptid může být mutovaný, například přidáním, deleci a/nebo substitucí sekvencí.

Organický produkt není produktem odvozeným od pyruvátu, jestliže je tento produkt syntetizován z pyruvátu způsobem vyžadujícím více než patnáct enzymatických kroků. Příklady produktů odvozených od pyruvátu zahrnují bez omezení, citrát, α-ketoglutarát, sukcinát, fumarát, malát, oxalacetát, 2-dehydro-3-deoxy-D-xylonát, D-xylonát, D-xylonolakton, D-xylózu, akrylát, acetát, ethanol, butyrát a laktát.

Pro účely tohoto vynálezu, karboxylátové produkty, které mohou být ve formě volné kyseliny nebo soli, budou označovány za použití nomenklatury pro solné formy. Například, kyselina mléčná bude označována jako laktát. Tak, v tomto příkladě, bude oceněno, že termín laktát zahrnuje kyselinu mléčnou stejně jako laktát. Výraz nukleová kyselina jak je používán zde, zahrnuje jak RNA tak DNA, včetně komplementární DNA (cDNA), genomovou DNA a syntetickou DNA (např. chemicky syntetizovanou). Nukleová kyselina může být dvouřetězcová nebo jednořetězcová. Když je nukleová kyselina jednořetězcová může být s negativním řetězcem nebo s pozitivním řetězcem. Navíc může být nukleová kyselina kružnicová nebo lineární.

Výraz exogenní, jak je používán zde s odkazem na molekulu nukleové kyseliny a specifickou buňku, se týká jakékoliv molekuly nukleové kyseliny, která nepochází z této specifické buňky, jak se vyskytuje v přírodě. Tak, všechny molekuly nukleové kyseliny, které se přírodně nevysky-8CZ 299820 Β6 tují, se považují vůči buňce za exogenní, jak jsou jednou do buňky vneseny. Je důležité si všimnout, že přírodně se nevyskytující molekuly nukleových kyselin mohou obsahovat sekvence nukleových kyselin nebo fragmenty sekvencí nukleových kyselin, které se vyskytují v přírodě za předpokladu, že molekula nukleové kyseliny jako celek v přírodě neexistuje. Například molekula nukleové kyseliny obsahující ve vektoru exprese genomickou sekvenci DNA se považuje za molekulu nukleové kyseliny, která se přírodně nevyskytuje a tak se považuje vůči buňce za exogenní, jakmile je jednou do buňky vnesena, jelikož tato molekula nukleové kyseliny jako celek (genomová DNA plus vektor DNA) v přírodě neexistuje. Tak, jakýkoliv vektor, autonomně replikující plasmid nebo virus (např. retrovir, adenovir nebo herpes vir), který jako celek v přírodě neexistuje, je považován za přírodně se nevyskytující molekulu nukleové kyseliny. Z toho vyplývá, že genomové fragmenty DNA produkované pomocí PCR nebo zpracováním restrikční endonukleázy stejně jako komplementárních DNA jsou považovány za přírodně se nevyskytující molekuly nukleové kyseliny, jelikož existují jako samostatné molekuly, které nelze nalézt v přírodě. Také z toho vyplývá, že jakákoliv molekula nukleové kyseliny, která obsahuje sekvenci promotoru a sekvenci kódující polypeptid (např. cDNA nebo genomová DNA) v uspořádání, které se v přírodě nevyskytuje, je považována za molekulu nukleové kyseliny, která se přírodně nevyskytuje.

Výraz endogenní se týká genomového materiálu, který není exogenní. Obecně se endogenní genomový materiál vyvíjí v organismu, tkáni nebo buňce a není vložen nebo modifikován pomocí rekombinantní technologie. Endogenní genomový materiál ve svém rámci zahrnuje přírodně se vyskytující variace.

Je také důležité si povšimnout, že molekula nukleové kyseliny, která se přírodně vyskytuje může být vůči specifické buňce exogenní. Například celý chromosom izolovaný z buňky osoby X bude považován za exogenní molekulu nukleové kyseliny vzhledem k buňce osoby Y, jakmile je tento chromosom vložen do buňky osoby Y.

Jak je používána zde, týká se fráze geneticky modifikovaný organismu, jehož genom byl modifikován, například adicí, substitucí nebo deleci genetického materiálu. Způsoby adice nebo delece genetického materiálu jsou známé a zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, nahodilou mutagenézi, bodovou mutaci včetně inzercí, deleci a substitucí, technologie posunu a transformace organismu pomocí sekvence nukleové kyseliny za použití rekombinantní technologie, včetně jak stabilních tak přechodných transformantů. Kvasinkové buňky mohou také katabolizovat škrob, buď přírodně nebo z důvodu genetické modifikace a mohou dokonce být geneticky modifikovány tak, že prostřednictvím adice katabolízují celulózy, například na houbách založené celulázy.

1. Buňky kvasinek, které obsahují Crabtree-negativní fenotyp kmene

Tento vynález poskytuje řadu různých geneticky upravených kvasinkových buněk, které obsahují Crabtree-negativní fenotyp kmene. Takové rekombinantní kvasinkové buňky mohou být použity k produkci organických produktů. Například tento vynález poskytuje kvasinkovou buňku, která má Crabtree-negativní fenotyp kmene a obsahuje molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu. Takové kvasinkové buňky poskytované v rámci tohoto vynálezu produkují organický produkt. Je významné, že vytvářený organický produkt může být vylučován z kvasinkových buněk, což eliminuje potřebu porušení buněčné membrány pro získání organického produktu. Obvykle kvasinková buňka podle tohoto vynálezu produkuje organický produkt s výtěžkem, který je nejméně asi 40 gramů (např. nejméně asi 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 nebo 95 gramů) organického produktu na každých 100 gramů spotřebované glukózy, při kultivaci za optimálních podmínek výroby produktu. Když je stanovován výtěžek výroby organického produktu ze specifické kvasinkové buňky, může být použita jakákoliv metoda. Viz např. Kiers a kol., Yeast, 14(5), 459 až 469 (1998). Významné je také, že enzymatická aktivita kódovaného polypeptidu může vést ke tvorbě organického produktu způsobem spotřebovávajícím NADH.

-9CZ 299020 Β6

Jinými slovy, produkce organické sloučeniny, může jako zdroj energie vyžadovat NADH. Výraz NAD (nikotin-amidadenindinukleotid) se týká kofaktorů, které v specifických oxidačněredukčních reakcích fungují jako nosiče elektronů a vodíku, zatímco výraz NADH (redukovaný nikotinamidadenindinukleotid) se týká redukované formy NAD. Příklady organických produktů, jejichž syntézy vyžadují NADH zahrnují, bez omezení, laktát, ethanol, acetát a akrylát. Obvykle, kvasinkové buňky v rozsahu tohoto vynálezu katabolizují hexózový uhlík, jako je glukózový. Avšak, takové kvasinkové buňky mohou také katabolizovat pentózový uhlík (např. ribózový, arabinózový, xylózový a lyxózový). Jinými slovy, může kvasinková buňka v rozsahu tohoto vynálezu buď přírodně využívat pentózový uhlík nebo může být technicky upravena k využití pentózového uhlíku. Například, kvasinková buňka může být určena exogenní molekulou nukleové kyseliny, která kóduje xylózo reduktázu, xylitol dehydrogenázu a/nebo xylulokinázu, tak, že může být katabolizována xylóza. Kvasinkové buňky mohou také katabolizovat škrob, buď přírodně nebo z důvodu genetické modifikace a mohou být dokonce geneticky modifikované tak, že katabolizují celulózu prostřednictvím adice, například na houbách založených celuláz.

Kvasinková buňka, která obsahuje Crabtree-negativní fenotyp kmene, je jakoukoliv kvasinkovou buňkou, která nevykazuje Crabtree účinek. Výraz Crabtree-negativní se týká jak přírodně se vyskytujících, tak geneticky modifikovaných organismů. Stručně řečeno je Crabtree účinek definován jako inhibice spotřeby kyslíku mikroorganismy, když jsou kultivovány za aerobních podmínek, způsobených přítomností vysoké koncentrace glukózy (např. 50 gramů glukózy/1). Jinými slovy kvasinková buňka, která vykazuje Crabtree-pozitivní fenotyp kmene, pokračuje díky přítomnosti glukózy ve fermentaci, bez ohledu na dostupnost kyslíku, zatímco kvasinková buňka, která obsahuje Crabtree-negativní fenotyp kmene nevykazuje glukózou zprostředkovanou inhibici spotřeby kyslíku. Příklady kvasinkových buněk, které vykazují Crabtree-negativní fenotyp kmene zahrnují, bez omezení, kvasinkové buňky z následujících rodů: Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon a Yamadazyma.

Jak je zde popsáno, poskytuje tento vynález mnoho různých typů rekombinantních kvasinkových buněk schopných produkovat široký rozsah různých organických produktů. Například může kvasinková buňka obsahovat exogenní molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje aktivitu laktát dehydrogenázy, takovou, že je produkován laktát. Příklady takových polypeptidů zahrnují, bez omezení, laktát dehydrogenázu hovězího séra, bakteriální laktát dehydrogenázu a houbovou laktát dehydrogenázu (např. houbovou laktát dehydrogenázu K. laktis nebo K. thermotolerans). Opět, polypeptidy, které vykazují enzymatickou aktivitu, jako je aktivita laktát dehydrogenázy se mohou vyskytovat přírodně nebo se přírodně vyskytovat nemusí.

Je důležité si povšimnout, že kvasinkové buňky zde popsané mohou obsahovat jednu kopii nebo mnohočetné kopie (např. asi 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 nebo 150 kopií) specifické exogenní molekuly kyseliny nukleové. Například může kvasinková buňka obsahovat asi 450 kopií molekuly X exogenní nukleové kyseliny. Je také důležité si povšimnout, že kvasinkové buňky popsané zde, mohou obsahovat více než jednu specifickou molekulu exogenní nukleové kyseliny. Například kvasinková buňka může obsahovat asi 50 kopií molekuly X exogenní nukleové kyseliny stejně jako asi 75 kopií molekuly Y exogenní nukleové kyseliny. V těchto případech, každá různá molekula nukleové kyseliny může kódovat různý polypeptid, který vykazuje svou vlastní zvláštní enzymatickou aktivitu. Například kvasinková buňka může obsahovat čtyři různé molekuly exogenní nukleové kyseliny, tak že je produkován akrylát. V tomto příkladě může taková kvasinková buňka obsahovat první molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu laktát dehydrogenázy, druhou, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu laktyl-CoA transferázy, třetí, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu laktyl-CoA dehydratázy a čtvrtou, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu akryryl-CoA hydratázy. V jiném případě může kvasinková buňka obsahovat čtyři různé molekuly exogenní nukleové kyseliny tak, že je produkována D-xylóza. Zvláště může taková kvasinková buňka obsahovat první molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu 2-dehydro-3-deoxy-D-pentanoát aldolázy, druhou, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu xylonát dehydratázy, třetí, která kóduje polypeptid vykazující aktivitu xylonolaktonázy a čtvrtou,

- 10CZ 299J20 Β6 která kóduje polypeptid vykazující aktivitu dehydrogenázy D-xylózy. V ještě dalším příkladě může kvasinková buňka obsahovat šest různých molekul exogenní nukleově kyseliny tak, že je produkován vitamin L-askorbát. Zvláště může taková kvasinková buňka obsahovat molekuly první exogenní nukleově kyseliny, které kódují polypeptid vykazující aktivitu 2,5-dioxovalerát dehydrogenázy a druhé, které kódují polypeptid vykazující aktivitu 5-dehydro-4-deoxy-D-glukarát dehydrogenázy, třetí, které kódují poylpetid vykazující aktivitu glukarát dehydratázy a čtvrté, které kódují polypeptid vykazující aktivitu aldehyd dehydrogenázy, páté, které kódují polypeptid vykazující aktivitu glukoronlakton reduktázy a šesté, které kódují polypeptid vykazující aktivitu L-gulonlakton oxidázy.

Je důležité si povšimnout, že enzymatické polypeptidy mohou být použity tak, že požadovaný organický produkt je opticky čistý (např. asi 90, 95, 99% čistý). Například polypeptid, který vykazuje aktivitu (L)-laktát dehydrogenázy může být použit k výrobě (L)-laktátu.

Kvasinkové buňky zahrnuté v rámci tohoto vynálezu mohou také vykazovat redukovanou enzymatickou aktivitu, jako jsou redukovaná aktivita pyruvát dekarboxylázy a/nebo alkohol dehydrogenázy. Výraz redukovaný, jak je používán zde s ohledem na buňku a specifickou enzymatickou aktivitu se týká nižší úrovně enzymatické aktivity, než je aktivita měřená v srovnatelné kvasinkové buňce stejného druhu. Tak je kvasinková buňka postrádající pyruvát dekarboxylázovou aktivitu považována za buňku se sníženou pyruvát dekarboxylázovou aktivitou poněvadž většina, pokud ne všechny, srovnatelné kvasinkové buňky vykazují při nejmenšim určitou pyruvát dekarboxylázovou aktivitu. Tak mohou být snížené enzymatické aktivity výsledkem nižší koncentrace enzymu, nižší specifické aktivity enzymu nebo jejich kombinace. K přípravě kvasinkové buňky, která má sníženou enzymatickou aktivitu může být použito mnoho různých metod. Například může být kvasinková buňka použitím běžné mutagenéze nebo technologie posunu technicky upravena tak, že má divergované enzym kódující místo. Viz např. Methods in Yeast Genetics, vydání 1997, Adams, Gottschling, Kaiser and Stems, Cold Spring Harbor Press (1998). Alternativně může být k snížení enzymatické aktivity použita antimediátorová technologie. Například může být kvasinková buňka technicky upravena tak, že obsahuje cDNA, která kóduje antimediátorovou molekulu, která brání vytvoření enzymu. Výraz antimediátorová molekula jak je používán zde, zahrnuje jakoukoliv molekulu nukleově kyseliny, která obsahuje sekvence, které odpovídají pozitivnímu DNA-řetězci endogenního polypeptidu. Antimediátorová molekula může také mít hraniční sekvence (např. regulační sekvence). Tak mohou být antimediátorovými molekulami ribozomy nebo antimediátorové oligonukleotidy. Ribozomy mohou mít jakoukoliv obvyklou strukturu zahrnující, bez omezení, struktury vlásenkové, T-hlavové nebo sekerové, za předpokladu, že molekula odštěpuje RNA.

Kvasinkové buňky, které mají sníženou enzymatickou aktivitu mohou být identifikovány použitím jakékoliv metody. Například kvasinková buňka, která má sníženou pyruvát dekarboxylázovou aktivitu může být snadno identifikována použitím běžných metod. Viz např. Ulbrich, Methods in Enzymology, 18, 109 až 115 (1970).

2. Kvasinkové buňky, které obsahují Crabtree-positivní nebo negativní fenotyp kmene

Tento vynález také poskytuje řadu geneticky upravených kvasinkových buněk, které nemusí obsahovat Crabtree-negativní fenotyp kmene, tj. takové buňky mohou být buďto Crabtree-pozitivní nebo Crabtree-negativní. Takové rekombinantní kvasinkové buňky mohou být použity k výrobě organických produktů. Například tento vynález poskytuje kvasinkovou buňku obsahující molekulu exogenní nukleově kyseliny, která kóduje polypeptid, který podporuje katabolizaci pentózového uhlíku (např. ribózového, arabinózového, xylózového a lyxózového) buňkou. Zvláště kvasinková buňka může obsahovat molekulu exogenní nukleově kyseliny, která kóduje xylózo reduktázu, xylitol reduktázu, xylitol dehydrogenázu a/nebo xylulokinázu tak, že xylóza může být katabolizována účinnějším způsobem. Navíc, kvasinkové buňky schopné katabolizace pentózového uhlíku mohou být také schopné katabolizace hexózového uhlíku (např. allózového, altrózového, glukózového, mannózového, gulózového, iodózového, galaktózového a talózového) buď

-11CZ 299320 B6 sekvečně nebo simultánně. Například může být kvasinková buňka technicky vytvořena tak, že jsou simultánně katabolizovány xylóza a glukóza. Významné je, že kvasinkové buňky, které mají zvýšenou schopnost katabolizovat pentózový uhlík mohou být použity k technické úpravě kvasinkových buněk, které mohou produkovat ze zdrojů pentózového uhlíku organický produkt. Tato charakteristická vlastnost je zvláště výhodná, jelikož zdroje pentózového uhlíku, jako je xylóza, jsou obecně levnější než zdroje hexózového uhlíku, jako je glukóza. Jiné zdroje uhlíku, které mohou být katabolizovány zahrnují, bez omezení, melibiózu, sacharózu, fruktózu, rafinózu, stachyózu, škrob (např. kukuřičný a pšeničný škrob) a hydrolyzát (např. hydrolyzát kukuřičných vláken a jiné celulózové hydrolyzáty).

Navíc tento vynález poskytuje kvasinkovou buňku, obsahující molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který podporuje akumulaci acetyl-CoA v cytoplasmě buňky. Například může kvasinková buňka obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje aktivitu citrát lyázy. Alternativně může kvasinková buňka obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid mitochondrální membrány, který podporuje prostupnost acetyl-CoA mitochondrální membránou. Je významné, že mnoho kvasinkových buněk postrádající schopnost produkovat ethanol nemůže růst za nepřítomnosti ethanolu a acetátu. Obvykle bude kvasinková buňka postrádat schopnost produkovat ethanol, když určitým způsobem postrádá buď pyruvát dekarboxylázovou nebo alkohol dehydrogenázovou aktivitu. Například Crabtree-pozitivní kvasinka (například Sacharomyces), postrádající pyruvát dekarboxylázovou aktivitu, roste za nepřítomnosti ethanolu a acetátu spoře. Úprava takové Crabtree-pozitivní kvasinky způsobem, který redukuje produkci ethanolu za účelem přesměrování využití pyruvátu na jiné organické produkty (např. laktát a akrylát), má za výsledek chabé růstové vlastnosti, když není přítomen ethanol a acetát, zvláště protože Crabtree-pozitivní kvasinka omezuje buněčnou respiraci, když se vyskytuje za přítomnosti glukózy. Jak je zde popsáno, mohou kvasinkové buňky určitým způsobem, jiným než tím, který spočívá na koncentraci cytoplasmického acetátu a aktivitě acetyl-CoA syntázy podporovat akumulaci cytoplasmického acetyl-CoA, růst za nepřítomnosti ethanolu a acetátu, dokonce i když nejsou schopny produkovat ethanol. Je významné, že kvasinkové buňky mají schopnost růst za nepřítomnosti ethanolu a acetátu, zatímco nedostatek schopnosti produkovat ethanol může přesměrovat využití pyruvátu na produkci organických produktů jiných než ethanol.

Jakýkoliv typ kvasinky může obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který podporuje akumulaci acetyl-CoA v cytoplasmě buňky. Například kvasinková buňka mající Crabtree-negativní nebo pozitivní fenotyp kmene může obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který podporuje akumulaci acetyl-CoA v cytoplasmě buňky. Obvykle mohou být takové kvasinkové buňky identifikovány pomocí (1) úpravy buňky, která obsahuje molekulu exogenní nukleové kyseliny, tak, že postrádá pyruvát dekarboxylázovou nebo alkohol dehydrogenázovou aktivitu, (2) stanovením charakteristických růstových vlastností buňky zatímco je kultivována za přítomnosti titračního množství inhibitoru respirace (např. antimycinu A, kyanidu nebo azidů), a (3) srovnáním těchto charakteristických růstových vlastností s vlastnostmi pozorovanými u srovnatelné kvasinkové buňky, která neobsahuje molekulu exogenní nukleové kyseliny, která byla ještě také upravena tak, že postrádá pyruvát dekarboxylázovou nebo alkohol dehydrogenázovou aktivitu. Pomocí takového srovnání jsou kvasinkové buňky určené k tomu, aby měly příznivější růstové vlastnosti díky přítomnosti molekuly exogenní nukleové kyseliny, považovány za buňky, které obsahují molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který podporuje akumulaci acetyl-CoA v cytoplasmě buňky.

Kvasinkové buňky obsahující molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který podporuje akumulaci acetyl-CoA v cytoplasmě buňky mohou také mít sníženou enzymatickou aktivitu, takovou jako je snížená pyruvát dekarboxylázová a/nebo alkohol dehydrogenázová aktivita. Například může kvasinková buňka postrádat schopnost produkovat ethanol. Obvykle

- 12CZ 299320 B6 mají takové kvasinkové buňky, za podmínek kultivace bez ethanolu a acetátu, rychlost růstu, která je vyšší (např. o 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100, 150, 200 % nebo více) než rychlost růstu pozorovaná pro srovnatelné kvasinkové buňky (tj. kvasinkové buňky postrádající schopnost produkovat ethanol), které neobsahují exogenní nukleovou kyselinu a byly ještě kultivovány za podobných podmínek (tj. podmínek bez ethanolu a acetátu).

Tento vynález také poskytuje kvasinkovou buňku, která vykazuje sníženou aktivitu polypeptidu. Takové kvasinkové buňky mohou mít Crabtree-pozitivní nebo negativní fenotyp kmene. Například kvasinkové buňky podle tohoto vynálezu mohou mít sníženou aktivitu polypeptidu plasmové membrány (např. transportéru plasmovou membránou), cytoplasmického polypeptidu (např. pyruvát dekarboxylázovou), a/nebo mitochondrálního polypetidu (např. pyruvát dehydrogenázovou). Výraz transportér plasmovou membránou se týká polypeptidu, který zajišťuje pohyb organických produktů plasmovou membránou. Příklady takových polypeptidů zahrnují, bez omezení, transportéry karboxylových kyselin, jako jsou JEN1 v S. cerevisiae (přírůstkové číslo genové banky U24155). Výraz mitochondrální polypetid se týká jakéhokoliv polypetidu, který působí v mitochondrii zahrnující, bez omezení, pyruvát dehydrogenázové polypeptidy, které se účastní katabolizace laktát acetyl-CoA (např. cytochrom b2 polypeptidů) a Krebsova cyklu enzymů. Krebsův cyklus enzymů zahrnuje akonitázu, isocitrát dehydrogenázu, ketoglutarát dehydrogenázu, sukcinát thiokinázu, sukcinát dehydrogenázu, fumarázu, malát dehydrogenázu a citrát syntázu. Jak je zde popsáno, kvasinková buňka vykazující sníženou enzymatickou aktivitu zahrnuje kvasinkovou buňku, která zcela postrádá specifickou enzymatickou aktivitu. Důležité je si povšimnout, že výraz snížený, jak je používán zde ve vztahu k aktivitě kvasinkové buňky a polypeptidu se týká nižší úrovně aktivity než je aktivita naměřená u srovnatelné kvasinkové buňky stejného druhu za podobných podmínek. Tak, kvasinková buňka postrádající specifickou transportní aktivitu je považována za buňku se sníženou transportní aktivitou, jestliže srovnatelná buňka vykazuje při nejmenším nějakou transportní aktivitu. Takové snížené aktivity polypeptidů mohou být výsledkem nižší koncentrace polypeptidu, nižší specifické aktivity polypeptidu nebo jejich kombinace. Jakákoliv z různých metod může být použita k přípravě kvasinkové buňky, která má sníženou polypeptidovou aktivitu. Například, místo, které obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje mitochodrální polypeptid může být ponecháno neaktivní pomocí, například, běžné mutageneze nebo technologie posunu.

Významné je, že kvasinkové buňky, které mají sníženou aktivitu mitochondrálních enzymů mohou akumulovat produkty Krebsova cyklu (např. citrát, isocitrát, α-ketoglutarát, sukcinylCoA, sukcinát, fumarát, malát a oxalacetát). Například kvasinkové buňky, které mají sníženou fumarázovou aktivitu mohou akumulovat fumarát. Navíc může kvasinková buňka obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu tak, že buňka produkuje organický produkt.

Je důležité si povšimnout, že některé produkty Krebsova cyklu nemohou pronikat mitochondrální membránou (např. α-ketoglutarát a sukcinyl-CoA). Tak snížení aktivity specifických enzymů Krebsova cyklu bude mít za následek akumulaci jistých produktů Krebsova cyklu v rámci průchodu mitochondrii. V těchto případech kvasinkové buňky, vykazující sníženou aktivitu enzymů Krebsova cyklu mohou být technicky připraveny tak, že obsahují jednu nebo více různých molekul exogenní nukleové kyseliny, z nichž každá kóduje polypeptid, který vykazuje odlišnou enzymatickou aktivitu, tak, že se požadovaný produkt Krebsova cyklu akumuluje v cytoplasmě. Například snížení aktivity ketoglurát dehydrogenázy povede k akumulaci α-ketoglutarátu, která po řadě povede k akumulaci isocitrátu. α-Ketoglutarát nemůže pronikat procházet mitochondrální membránou, zatímco isocitrát pronikat mitochondrální membránou může. Tak se isocitrát může akumulovat v cytoplasmě buňky. Avšak kvasinkové buňky také obsahují molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje aktivitu isocitrát dehydrogenázy a vyjadřuje, že funkční polypeptid může v cytoplasmě produkovat cytoplasmický a-ketoglutarát. Tak, snížení aktivity specifických enzymů Krebsova cyklu, zatímco poskytuje molekuly exogenní nukleové kyseliny, které kódují stejné (nebo různé) enzymy Krebsova cyklu tak, že

- 13 CZ 299320 Β6 jsou funkční v rámci cytoplasmy, mohou vést k produkci různých produktů Krebsova cyklu (nebo produktů odvozených od produktů Krebsova cyklu) v cytoplasmě.

Tento vynález dále poskytuje kvasinkovou buňku se sníženou aktivitu enzymu, který převádí využití zdroje uhlíku z produkce bud’ biomasy nebo požadovaného organického produktu. Například, enzymy v rámci glycerolových nebo acetoinových způsobů mohou být divergovány tak, že je v rámci kultivačního prostředí přednostně využíván zdroj uhlíku k produkci biomasy nebo požadovaného organického produktu. Příklady enzymů glycerolového způsobu zahrnují, bez omezení, dihydroxyacetonfosfát reduktázu. Příklady enzymů acetoinového způsobu zahrnují, bez omezení, α-acetolaktát syntázu a α-acetolaktát dekarboxylázu. Opět může být k snížení aktivity enzymu použit jakýkoliv způsob.

Mimoto, jakékoliv kvasinkové buňky zde poskytované mohou obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která působí jako plazmid-zabíječ. Výraz plazmid-zabíječ, jak je používán zde, se týká molekuly nukleové kyseliny, která poskytuje jeden druh kvasinky se schopností zabít jiné druhy kvasinek. Například kvasinkové buňky zrodu Kluyveromyces obsahující plazmidzabíječ mohou zabránit růstu kvasinky z rodu Saccharomyces. Tak mohou být kvasinkové buňky obsahující plazmid-zabíječ použity k prevenci kontaminačních problémů, které vyvstávají během způsobů výroby ve velkém měřítku. Navíc do kvasinkové buňky může být vnesen jakýkoliv typ plazmidu-zabíječe. Například plazmid-zabíječ izolovaný z K. lactis může být vnesen do kvasinkové buňky K. marxianus. Kvasinkové buňky obsahující plazmid-zabíječ mohou být snadno identifikovány použitím běžných metod. Viz např. Gunge a kol., J. Bacteriol. 145 (1), 382 až 390 (1981), Gunge a Kitada, Eur. J. Epidemiol., 4, 409 až 414 (1988) a Wesolowski-Louvel a kol., Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, vyd. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlin, 138 až 201 (1996).

Podobně jakékoliv kvasinkové buňky zde poskytované mohou obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje ATPázovou aktivitu modifikovanou tak, že se kvasinková buňka stává tolerantnější k prostředí o nízkém pH. Například může být do kvasinkové buňky vnesena ATPáza, které účinně udržuje nízkou koncentraci protonů v cytoplasmě, když je koncentrace mimobuněčných protonů vysoká. Takové polypeptidy mohou být technicky připraveny podle popisu v práci Morsomme a kol., EMBO J., 15, 5513 až 5526 (1996).

Je důležité si povšimnout, že jakékoliv rekombinantní kvasinkové buňky popsané zde mohou obsahovat jakoukoliv kombinaci popsaných genetických úprav. Například kvasinková buňka, která má Crabtree-pozitivní fenotyp kmene může obsahovat molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu.

3. Vhodné organismy

V souladu s tímto vynálezem je pro použití vhodná řada různých organismů. Navíc ke Crabtreenegativním a Crabtree- pozitivním kvasinkovým mikroorganismům, jako jsou Saccharomyces sp. včetně 5. cerevisiae a S. uvarum, Kluyveromyces včetně K. thermotolerans, K. lactis a K. marxianus, Pichia, Hansenula včetně H. polymorpha, Candidia, Trichosporon, Yamadazyma včetně Y stipitis, nebo Torulaspora pretoriensis, mohou organismy z širokého seskupení mikrobiálních druhů sloužit jako hostitelé pro produkci kyseliny mléčné. Například organismus jako je Rhizopus oryzae, přírodní producent kyseliny mléčné, může být geneticky upraven pokud jde o snášenlivost kyseliny, zvýšení výtěžku a optickou čistotu kyseliny mléčné. Aspergillus spp. jsou také známé z hlediska produkce řady různých organických kyselin, jako je kyselina citrónová a snášenlivosti nízkého pH. Způsoby genetické úpravy Aspergillus spp. pro produkci kyseliny mléčné jsou dostupné. Mimoto, houby, jako jsou Rhizopus a Aspergillus spp. produkují enzymy, které jim umožňují pro použití jako zdroj uhlíku degradovat škrob a jiné sacharidové polymery na sacharidové monomery.

- 14CZ 299320 Β6

Prokaryoty, jako jsou Escherichia coli, Zymomonas mobilis aBacillus spp., jsou nebo mohou být, pokud jde o produkci kyseliny mléčné, geneticky modifikované. Mikroorganismy, které byly identifikovány jako Bacillus coagulans, jsou také přírodními producenty kyseliny mléčné, kteří mohou být dále geneticky modifikováni k zlepšení produkce kyseliny mléčné při nízkém pH.

Navíc extremeofilní organismus z čeledi Archea může snášet extrémně nízké pH a vysoké teploty. Genetická modifikace vybraných druhů z této čeledi může poskytnout kmen produkující kyselinu mléčnou.

4. Genetické aspekty

Molekula nukleové kyseliny kódující polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu může být identifikována a získána použitím jakéhokoliv způsobu. Například standardní techniky sekvencování nukleových kyselin a softwarové programy, které převádějí sekvence nukleové kyseliny na sekvence aminokyselin, založené na genetickém kódu mohou být použity pro určení, zda specifická nukleová kyselina má nebo nemá jakoukoliv sekvenční homologii se známými enzymatickými polypeptidy. Pro srovnání různých sekvencí může být použit software sekvenčního seskupení, jako je MEGALIGN® (DNASTAR, Madison,WI, 1997). Navíc, molekuly nukleové kyseliny kódující známé enzymatické polypeptidy mohou být mutovány za použití běžných molekulárních klonovacích technik (např. sekvenčně specifické indukce mutageneze). Možné mutace zahrnují, bez omezení, delece, inzerce a substituce bází, stejně jako kombinace delecí, inzercí a substitucí bázi. Dále mohou být k identifikaci sekvence nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu, použity databáze nukleových kyselin a aminokyselin (např. GenBank®). Stručně jakákoliv sekvence aminokyseliny, která vykazuje určitou homologii s polypeptidem, který vykazuje enzymatickou aktivitu nebo jakákoliv sekvence nukleové kyseliny mající určitou homologii se sekvencí kódující polypetid s enzymatickou aktivitou, může být použita jako dotaz pro hledání v GenBank®. Identifikované polypeptidy pak mohou být analyzovány pro stanovení zda vykazují nebo nevykazují enzymatickou aktivitu.

Molekuly nukleové kyseliny, které kódují polypeptid, vykazující enzymatickou aktivitu mohou být identifikovány a získány použitím běžných postupů a technik molekulárního klonování nebo chemické syntézy nukleové kyseliny, včetně PCR. PCR se týká postupu nebo techniky, při kterém je cílová nuleová kyselina amplifikována způsobem podobným způsobu popsanému v patentu US 4 683 195, a následnými modifikacemi postupu v něm popsaného. Obecně jsou pro projekt oligonukleotidových primerů, které jsou v sekvencích identické nebo podobné opozitním řetězcům potenciální matrice, která má být amplifikována, používány sekvenční informace z konce zájmové oblasti nebo mimo ní. Použitím PCR, může být sekvence nukleové kyseliny amplifikována z DNA nebo RNA. Například sekvence nukleové kyseliny může být izolována pomocí PCR amplifikace z celkové buněčné RNA, celkové genomové DNA a cDNA, stejně jako z bakteriofágových sekvencí, plasmidových sekvencí, virových sekvencí a podobných. Když se používá jako zdroj matrice RNA, může být k syntéze komplementárních řetězců DNA použita reverzní transkriptáza.

Dále mohou být k identifikaci a získání molekuly nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, vykazující enzymatickou aktivitu, použity techniky hybridizace nukleové kyseliny. Stručně jakákoliv molekula nukleové kyseliny, která kóduje známý enzymatický polypeptid nebo jeho fragment, může být použita jako sonda pro identifikaci podobných molekul nukleové kyseliny pomocí hybridizace za podmínek od mírné do vysoké přísnosti. Tak podobné molekuly nukleové kyseliny mohou pak být izolovány, sekvencovány a analyzovány pro stanovení, zda kódují polypeptid, který vykazuje enzymatickou aktivitu.

Hybridizace k identifikaci DNA nebo RNA sekvence, respektive, která hybridizuje zkušební činidlo, může být provedena pomocí Southemovy nebo northemové analýzy. Zkušební činidlo může být označkováno pomocí radioizotopu, jako je P, enzym, digoxygenin nebo pomocí biotinylace. DNA nebo RNA, které mají být analyzovány, mohou být elektroforeticky odděleny na

- 15 CZ 299820 Β6 agarovém nebo polyakrylamidovém gelu, převedeny do nitrocelulózové, nylonové nebo jiné vhodné membrány, a hybridizovány za pomoci zkoušky využívající standardní techniky dobře známé v oboru, jako jsou techniky popsané v práci Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York, oddíly 7.39 až 7.52 (1989). Obecně má zkušební činidlo délku nejméně asi 20 nukleotidových sekvencí. Například zkušební činidlo odpovídající 20 nukleotidovým sekvencím, které kóduje savčí citrát lyázu může být použito k identifikaci molekuly nukleové kyseliny, která kóduje houbový polypeptid vykazující aktivitu citrické lyázy. Navíc, může být použito zkušební činidlo delší nebo kratší než 20 nukleotidů.

K. zavedení molekuly exogenní nukleové kyseliny do buňky může být použit jakýkoliv způsob. Ve skutečnosti, je osobě znalé oboru dobře známo mnoho metod zavedení nukleové kyseliny do kvasinkových buněk. Například transformace, elektroporace, konjugace a fúze protoplastů jsou běžnými metodami zavedení nukleové kyseliny do kvasinkových buněk. Viz např. Ito a kol., J. Bacterol., 153, 163 až 168 (1983), Durrens a kol., Curr. Genet., 16, 7 až 12 (1990) a Becker a Guarente, Methods in Enzymology, 194, 182 až 187 (1991).

Je důležité si povšimnout, že molekula exogenní nukleové kyseliny, obsažená v kvasinkové buňce podle tohoto vynálezu, může být v buňce uchovávána v jakékoliv formě. Například může být molekula exogenní nukleové kyseliny integrována do genomu buňky nebo udržována v episomálním stavu. Jinými slovy může být buňka podle tohoto vynálezu stabilní nebo dočasným transformantem. Navíc zde popsané kvasinkové buňky mohou obsahovat jednu kopii nebo mnohočetné kopie (např. asi 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 nebo 150 kopií), specifické molekuly exogenní nukleové kyseliny, jak je popsáno výše.

Způsoby exprese sekvence aminokyseliny z molekuly exogenní nukleové kyseliny jsou dobře známé osobám znalým oboru. Takové způsoby zahrnují, bez omezení, konstruování nukleové kyseliny tak, že regulační prvek podporuje expresi sekvence nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid. Obvykle jsou regulačními prvky sekvence DNA, které v hladině transkripce regulují expresi jiných sekvencí DNA. Tak regulační prvky zahrnují, bez omezení, promotory, zesilovače transkripce a podobné. Mimoto způsoby exprese polypetidu z molekuly exogenní nukleové kyseliny v kvasince jsou dobře známé osobám znalým oboru. Například vytvořené struktury nukleové kyseliny, které jsou schopné exprese exogenního polypeptidu v Kluyveromyces jsou dobře známé. Viz např. patenty US 4 859 596 a US 4 943 529.

Jak je zde popsáno, obsahují v rámci tohoto vynálezu kvasinkové buňky molekulu exogenní nukleové kyseliny, která například kóduje polypeptid vykazující enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu. Způsoby identifikace buněk, které obsahují exogenní nukleovou kyselinu jsou dobře známé osobám kvalifikovaným v oboru. Takové způsoby zahrnují, bez omezení, PCR a techniky hybridizace nukleové kyseliny jako jsou northemová a Southemova analýza. V některých případech mohou být k určení, zda buňka obsahuje specifickou nukleovou kyselinu detekcí exprese kódovaného enzymatického polypeptidu, kódovaného pomocí této specifické molekuly nukleové kyseliny, použity imunohistochemické a biochemické techniky. Například protilátka vykazující specificitu pro kódovaný enzym může být použita k určení zdali specifická kvasinková buňka obsahuje nebo neobsahuje tento kódovaný enzym. Dále mohou být k stanovení, zda buňka obsahuje specifickou molekulu nukleové kyseliny kódující enzymatický polypeptid detekcí organického produktu, produkovaného jako výsledek exprese enzymatického polypeptidu, použity biochemické techniky. Například detekce laktátu po zavedení molekuly exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, vykazující aktivitu laktát dehydrogenázy, do kvasinkové buňky, která normálně nevykazuje expresi takového polypeptidu, může naznačovat, že tato kvasinková buňka neobsahuje pouze vnesenou molekulu exogenní nukleové kyseliny, ale také expresuje kódovaný enzymatický polypeptid z této vnesené molekuly exogenní nukleové kyseliny. Způsoby zjištění specifických enzymatických aktivit nebo přítomnosti specifických organických produktů jsou dobře známé osobám kvalifikovaným v oboru. Například přítomnost laktátu může být stanovena jak je popsáno jinde. Viz Witte a kol., J. Basic Microbiol., 29, 707 až 716(1989).

- 16CZ 299320 Β6

Tento vynález také poskytuje vytvořenou strukturu nukleové kyseliny obsahující rekombinační sekvence a vybrané sekvence. Výraz rekombinanční sekvence, jak je používán zde, se týká jakékoliv sekvence nukleové kyseliny, která odpovídá genomové sekvenci, která se nalézá v buňce. Rekombinační sekvence popsané zde mohou být použity k směrování rekombinačních jevů během generování posunutých organismů. Jinými slovy mohou být rekombinační sekvence použity k specifické divergenci místa obsahujícího sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje specifický enzym. Výraz vybraná sekvence, jak je používán zde, zahrnuje jakoukoliv sekvenci nukleové kyseliny. Obecně vybraná sekvence kóduje polypeptid, vykazující enzymatickou aktivitu, která vede k tvorbě organického produktu v buňce. Tak může být struktura nukleové kyseliny vytvořená podle tohoto vynálezu použita k zastavení endogenní enzymatické aktivity a přidání exogenní enzymatické aktivity v jednom kroku. Ve většině případů je vybraná sekvence v rámci rekombinanční sekvence tak, že vybraná sekvence je na každém konci orámována rekombinanční sekvencí.

5. Produkce organických produktů a způsoby kultivace

Tento vynález poskytuje způsoby pro produkci organických produktů použitím jakýchkoli organických buněk nebo jiných mikrobiálních buněk zde poskytovaných. Takové způsoby zahrnují získání kvasinkových buněk a kultivaci získaných kvasinkových buněk pomocí takového kultivačního prostředí, že je produkován organický produkt (např. glycerol, akrylát, xylóza, askorbát, laktát, citrát, isocitrát, α-ketoglutarát, sukcinyl-CoA, sukcinát, fumarát, malát a oxalacetát). Obecně kultivační prostředí a/nebo podmínky kultivace mohou být klasifikovány do jedné ze dvou kategorií: prostředí, která podporují buněčná respirace a/nebo produkci biomasy a prostředí, která redukují buněčná respirace. Obecně, jsou používány kultivační prostředí a/nebo podmínky kultivace, které podporují buněčnou respiraci v situacích, kde je potřeba rychlý růst nebo kde organický produkt, který má být produkován, nemůže být produkován bez buněčné respirace. Takové organické produkty mohou zahrnovat, bez omezení, produkty Krebsova cyklu. Na druhé straně jsou kultivační prostředí a/nebo podmínky kultivace, které redukují buněčnou respiraci používány v situacích, kde není potřeba nebo není žádoucí rychlý růst nebo kde organický produkt, která má být produkován, může být produkován bez buněčné respirace. Takové organické produkty zahrnují, bez omezení, laktát, akrylát a xylózu. Jak se používá zde, slovní spojení podporovat buněčnou respiraci nebo podporovat produkci biomasy když se hovoří o podmínkách kultivace znamená, že podmínky kultivace buňky se udržují takové, že zdroj uhlíku v kultivačním prostředí je přednostně metabolizován oxidační respiraci nebo k tvorbě biomasy. Jak se používá zde, týká se výraz biomasa suché hmotnosti organismu. Jak je používáno zde, slovní spojení přednostní metabolizace na produkci biomasy znamená, že je produkováno nejméně asi 0,3 gramů biomasy na spotřebovaný gram zdroje uhlíku (ve formě cukru) (např. nejméně asi 0,4, 0,45, 0,5 nebo 0,6 gramů biomasy). Obecně je na gram zdroje uhlíku produkováno mezi asi 0,3 a asi 0,6 gramy biomasy. Způsoby stanovení množství biomasy (suchá hmotnost buňky) v kultuře jsou známy a zahrnují, například způsoby popsané v pracích Postma a kol., Enzymatic analysis of the Crabtree effect in glucose-limited chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ. Microbiol., 53, 468 až 477 (1989) a Kiers a kol., Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359, Yeast, 14, 459 až 469 (1998). Způsoby stanovení množství spotřebovaného zdroje uhlíku jsou známé a zahrnují, například metodologie vysoce výkonné kapalné chromatografie.

Významné by mělo být, že účinnost využití zdroje uhlíku může záviset na zdroji uhlíku a organismu. Tudíž, zatímco může být použit komplex prostředí růstu, který zahrnuje jiné zdroje uhlíku než cukry, množství biomasy produkované na gram zdroje uhlíku se týká pouze množství biomasy produkované na spotřebovaný gram cukematého zdroje uhlíku.

Obecně prostředí kultivace obsahující inhibitor buněčné respirace (např. antimycin A, kyanid a azid) může snižovat buněčnou respiraci, zatímco nepřítomnost takových inhibitorů může buněčnou respiraci podporovat. Podobně anaerobní podmínka kultivace může buněčnou respiraci

- 17CZ 299320 B6 snižovat, zatímco aerobní podmínky kultivace mohou buněčnou respiraci podporovat. Aerobní podmínkou je jakákoliv podmínka, kde je přiváděn kyslík nebo se přírodně vyskytuje a slouží jako substrát pro respirační způsob. Obecně se výraz aerobní týká podmínky kultivace, při které je kultivační prostředí udržované pod tokem vzduchu nejméně 0,1 VVM (VVM znamená objem vzduchu/objem kapaliny/minuta, dále jen VVM) (např. vyšším než 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5 nebo 2.0 VVM). Jestliže je použit jiný plyn než vzduch, pak je nominální hodnota VVM upravena na vzduchový ekvivalent založený na obsahu kyslíku v plynu. Alternativně může být aerobní definováno jako prostředí kultivace, které má obsah rozpuštěného kyslíku nejméně 2 procenta (např. nejméně 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 nebo 80 procent) vztaženého na množství přítomné při podmínkách nasycení vzduchem při atmosférickém tlaku.

Anaerobní podmínkou je jakákoliv podmínka, kde je kyslík účelově nebo přírodně učiněn v podstatě nedostupným pro respirační způsob, vedoucí k, například, produkci redukovaného produktu, jako je ethanolu. Obecně podmínka, kde prostředí kultivace má obsah rozpuštěného kyslíku (DO) nižší než asi 2,0 % (např. nižší než asi 1,5, 1,0 nebo 0,5 %, nebo rovnající se asi 0%), je považována za anaerobní podmínku. Podobně podmínka, která má VVM (objem vzduchu/objem kapaliny/minuta) nižší než asi 0,1 (např. nižší než asi 0,05 nebo rovnající se asi 0) je považována za anaerobní podmínku. Obecně se výraz vzduch, tak jak je používán zde ve vztahu k VVM týká vzduchu jak se vyskytuje v atmosféře. Jiné podmínky kultivace, které mohou ovlivňovat buněčnou respiraci zahrnují, bez omezení, pH, teplotu a přítomnost specifických zdrojů uhlíku (např. glukózy). Je důležité si všimnout, že některé prostředí kultivace a/nebo podmínky kultivace, které podporují buněčnou respiraci u jednoho druhu kvasinek mohou redukovat buněčnou respiraci u druhého druhu. Například přítomnost glukózy v prostředí kultivace snižuje buněčnou respiraci u kvasinkových buněk, které obsahují Crabtree-positivní fenotyp kmene, zatímco má malý nebo žádný účinek na buněčnou respiraci u kvasinkových buněk, které obsahují Crabtreenegativní fenotyp kmene.

Řízená manipulace s podmínkami kultivace během průmyslové výroby může být důležitým krokem při dosažení optimální úrovně požadovaných organických produktů, jak je zde popsáno. Obecně je kvasinková buňka v rámci tohoto vynálezu pěstována za podmínek kultivace, které podporují buněčnou respiraci, čímž se vytvoří významná hustota buněk. Například kvasinkové buňky mohou být umístěny do kultivační nádoby a může jim být poskytnut přebytek glukózy a kyslíku. Obecně za podmínek, které podporují buněčnou respiraci, čas zdvojnásobení pro mikroorganismy zde poskytované je nižší než asi 10 hodin (např. méně než asi 8, 5 nebo 3 hodiny). Jakmile buňky dosáhnou významné hustoty, mohou být podmínky pěstování změněny na podmínky, které snižují buněčnou respiraci tak, že je produkován organický produkt nevyžadující buněčnou respiraci. Například mohou být kvasinkové buňky převedeny do kultivační nádoby a může jim být poskytnut přebytek glukózy, ale ne kyslíku. V tomto případě, přímá manipulace s podmínkami kultivace tak, že jsou změněny z areobních na anaerobní může produkovat optimální úroveň organických produktů. Alternativně mohou být buňky v některých případech kultivovány samotné za podmínek, které podporují buněčnou respiraci tak, že je produkován organický produkt vyžadující buněčnou respiraci. Je významné, že buněčná hmota v produkční nádobě je obecně větší než 2 g/1 (např. větší než asi 4, 6 nebo 8 g/1).

Během kultivace může být teplota vyšší než asi 35 °C (např. vyšší než asi 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 nebo 45 °C). Navíc může být prostředí kultivace kapalné. Prostředí kultivace obvykle obsahují zdroj uhlíku. Obecně zdroj uhlíku zahrnuje cukry obsahující látky. Obvykle živná půda také obsahuje zdroj dusíku. Výhodně zdroj dusíku obsahuje kombinaci organických a anorganických dusíkatých sloučenin.

Při jednom způsobu provozu může být žádoucí naplnit velkou fermentační nádobu kultivačním prostředím obsahujícím všechny požadované živiny a všechny cukry, dostatečné jak pro produkci biomasy tak pro produkci požadovaného produktu. Nádoba může být provozována za takových podmínek, že je v počátku podporována produkce biomasy, například vytvořením aerobních podmínek a pak jsou pro produkci požadovaného produktu převedeny na anaerobní podmínky.

- 18CZ 299920 Β6

Při alternativním způsobu provozuje pro produkci biomasy používána menší nádoba, s vysokou hladinou živin a dostatkem cukrů pro produkci, například asi 100 g/1 biomasy. Obsah této nádoby může pak být převeden do větší nádoby, která obsahuje druhé kultivační prostředí, které obsahuje méně živin, například, pouze glukózu jako zdroj uhlíku nebo jiný cukerný zdroj uhlíku ve vodě. Tato nádoba může být pro produkci požadovaného organického produktu provozována za anaerobních podmínek. Růst biomasy je snížen díky snížené hladině živin a anaerobním podmínkám.

Ve výhodném provedení vynálezu je živné prostředí omezeno pouze na požadované látky, čímž se zjednoduší získání požadovaného produktu. Použití aerobního růstu může umožnit použití zjednodušeného prostředí, ve vztahu k prostředí potřebnému, když existuje potřeba růstu za anaerobních podmínek. Mnohé ze zde popsaných kvasinek mohou růst za aerobních podmínek na prostředí, které se skládá pouze z cukru, anorganického zdroje dusíku, stopových minerálů a určitých vitaminů.

Před přidáním organického produktu do prostředí kultivace jako výsledku fermentace nebo jiného procesu, má obecně kultivační prostředí pH mezi asi 5,0 a 7,0. Avšak jak jsou organické produkty, jako organické kyseliny, vylučovány do prostředí kultivace mikroorganismy, pH kultivačního prostředí jeví tendenci k snižování. Výraz organické pH, jak je používán zde, se týká pH kultivačního prostředí přisuzovaného organickým sloučeninám, jako jsou karboxyláty, například, kyselina mléčná, přítomným v prostředí. Výraz anorganické pH, jak je používán zde, se týká pH připisovanému anorganickým sloučeninám, jako jsou HC1 a H2SO4. Prostředí kultivace může mít hodnotu organického pH nižší než asi 3,0 (např. méně než asi 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 nebo 1,5), nebo hodnotu anorganického pH nižší než asi 3,0 (např. nižší než asi 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 nebo 1,5). Během procesu kultivace může být použit jakýkoliv zdroj uhlíku. Například může být použito prostředí obsahující pentózový uhlík (např. ribózový, arabinózový, xylózový a lyxózový). Navíc může být použito prostředí obsahující hydrolyzát kukuřičných vláken. Hydrolyzát kukuřičných vláken může mít hodnotu pH mezi asi 2,0 a 6,5. Obvykle obsahuje hydrolyzát kukuřičných vláken glukózu, xylózu a arabinózu. Například může hydrolyzát kukuřičných vláken obsahovat asi 40 g/1 glukózy, asi 40 g/1 xylózy a asi 20 g/1 arabinózy.

Pro procesy produkce ve velkém měřítku mohou být použity následující způsoby. Nejprve je velká nádrž (např. 189,25-litrová, 378,5-litrová, 757-litrová nebo více litrová nádrž) obsahující vhodné kultivační prostředí, například s hexózovými a/nebo pentózovými uhlíky, naočkován specifickým mikroorganismem. Po naočkování, mohou být měněny podmínky kultivace tak, že je zdroj uhlíku převážně využit k produkci biomasy. Například může být kultivační prostředí upravováno tak, že má hodnotu pH asi 7,0, teplotu asi 35 °C a obsahuje rozpuštěný kyslík, který v nádrži vytváří aerobní prostředí. Je významné, že požadovaný organický produkt může být produkován během této fáze produkce biomasy. Jakmile je dosaženo dostatečného množství biomasy, může být živná půda obsahující mikroorganismy převedena do druhé nádrže. Tato druhá nádrž může mít jakoukoliv velikost. Například může být druhá nádrž větší, menší nebo stejně velká jako první nádrž. Obvykle je druhá nádrž větší než první, takže do živné půdy z první nádrže musí být přidáno dodatečné kultivační prostředí. Navíc může být prostředí kultivace v druhé nádrži stejné nebo odlišné od prostředí používaného v první nádrži. Například může první nádrž obsahovat prostředí s xylózou a arabinózou, zatímco druhá nádrž obsahuje prostředí s glukózou.

Jakmile je uskutečněn převod, mohou být podmínky kultivace v druhé nádrži upraveny tak, že zdroj uhlíku je převážně využit k produkci organického produktu, ve kterém organický produkt zahrnuje, mezi jinými látkami, od pyruvátu odvozené produkty a oxid uhličitý (CO?), ale nezahrnuje biomasu (tj. hmotnost suché buňky). Jak se zde používá, slovní spojení převážně produkuje vybraný organický produkt nebo vybraný produkt odvozený od pyruvátu, když se hovoří o podmínkách kultivace, znamená že zdroj uhlíku je v kultivačním prostředí metabolizován, obvykle fermentačním procesem (ačkoliv nikoliv nezbytně), na formu nejméně 0,5 g organického

- 19CZ 299920 B6 produktu na gram spotřebovaného zdroje uhlíku (tj. nejméně 0,6, 0,75 nebo 0,8 g organického produktu). Způsoby stanovení množství vytvořeného organického produktu a/nebo spotřebovaného zdroje uhlíku jsou známy a zahrnují například vysocevýkonnou chromatografií v kapalné fázi.

Jak bylo popsáno dříve, účinnost využití zdroje uhlíku se může lišit v závislosti na substrátu a organismu. Tak, zatímco může být použit komplex prostředí růstu, který zahrnuje jiný zdroj uhlíku než jsou cukry (např. aminokyseliny), týká se množství organického produktu nebo od pyruvátu odvozeného produktu vyprodukovaného na gram cukerného zdroje uhlíku pouze množství organického produktu nebo od pyruvátu odvozeného produktu vyprodukovaného na gram spotřebovaného cukerného zdroje uhlíku. Výhodně je v této fázi produkováno ne více než 0,3 gramů biomasy na gram zdroje uhlíku (např. ne více než 0,2, 0,1 nebo 0,05 gramů biomasy).

Například může být prostředí kultivace upravováno tak, že má takový obsah rozpuštěného kyslíku, že v nádrži vytváří anaerobní prostředí, nebo že obsahuje inhibitor buněčné respirace. Navíc může být kultivační prostředí upravováno tak, že je udržována specifická hodnota pH (např. kyselá, neutrální nebo bazická hodnota pH). Alternativně může být pH kultury upravováno periodicky bez udržování jakékoliv specifické hodnoty pH. Obvykle, když je produkována organická kyselina je hodnota pH kultivačního prostředí udržována nad nejméně asi 1,5 (např. nejméně asi 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 5,5, 6,0 6,5 nebo 7,0). Dále jak mikroorganismus katabolizuje poskytovaný zdroj uhlíku, zvýší se teplota v nádrži. Tudíž může být prostředí kultivace upravováno tak, že je udržována specifická teplota. Alternativně může být teplota kultivačního prostředí upravována periodicky bez udržování jakékoliv specifické teploty. Obvykle, když se používají na teplo citlivé mikroorganismy, je udržována teplota nižší než asi 35 °C (např. méně než asi 34, 33, 32, 31 nebo 30 °C), zatímco je udržována teplota nižší než asi 45 °C (např. méně než asi 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 nebo 35 °C), když se používají mikroorganismy, které nejsou citlivé na teplo. Je významné, že během této fáze produkce organického produktu může být produkována biomasa. Navíc podmínky kultivace v druhé nádrži, mohou být změněny z podmínek, které podporují produkci produktu na podmínky, které podporují produkci biomasy a naopak, jednou nebo vícekrát. Například podmínky kultivace v druhé nádrži mohou být po většinu času anaerobní s krátkými pulsy rozpuštěného kyslíku, takže periodicky existují aerobní podmínky.

Při jiném způsobu mohou být anaerobní podmínky kultivace modifikovány ke zvýšení metabolické energie kultivovaných mikroorganismů, například přidáním konečného příjemce elektronů. Jak je používán zde, týká se výraz metabolická energie energie (v podmínkách ATP) získané organismem ze zdroje energie (jako je zdroj uhlíku). Za některých podmínek je množství metabolické energie získané organismem z metabolismu zdroje uhlíku větší než množství energie získané ze stejného zdroje uhlíku za odlišných podmínek.

Živé buňky jsou vysoce organizované a musí ktomu, aby přežily a rostly, samy o sobě vytvářet organizaci. K udržení organizace organizmu dochází v organizmu v jakémkoli časovém okamžiku k tisícům různých chemických reakcí. Například buňky potřebují energii pro reakce biosyntézy, jako jsou reakce DNA, RNA a polymerace proteinů a tvorbu metabolických produktů. Buňky také potřebují energii k vnesení substrátu do buňky, udržení metabolitů v buňce, udržení správného tlakového napětí a vnitřního pH, a pro udržení pohyblivosti.

Protože energie nemůže být vytvořena nebo zničena, vyžadují buňky k udržení vnitřní organizace přívod energie z prostředí. Energie je obecně z prostředí dodávána ve formě elektromagnetického záření nebo chemické energie. Energie obdržená z prostředí je využita buňkami za použití jednoho ze dvou obecných biochemických mechanismů: úrovní fosforylace substrátu a transportem elektronů.

Obecně za anaerobních podmínek, ATP (buněčná jednotka pro energii, dále jen ATP) je produkována úrovní fosforylace substrátu. Při úrovni fosforylace substrátu je energie uvolňována z chemických vazeb a je skladována hlavně ve formě ATP.

-20CZ 293J20 B6

Příkladem úrovně fosforylace substrátu je konverze glukózy na pyruvát prostřednictvím glykolýzy:

glukóza = 2 pyruvát + 2 ATP + 2 H₂

Pyruvát může být pak přeměněn na kyselinu mléčnou: pyruvát + 2 H₂ = laktát

Čistá energie produkovaná výše uvedenou přeměnou se rovná 2 ATP.

Pyruvát může být dále zpracován cyklem kyseliny trikarboxylové (TCA) a vytvoří dodatečnou energii a atomy vodíku:

pyruvát + 3 H₂O = 3 CO₂ + ATP + 5 H₂

Skutečná reakce pro glukózovou respiraci:

glukóza + 6 H?O = 6 CO₂ + 4 ATP + 12 H₂

Tudíž úroveň fosforylace substrátu, úplná respirace glukózy na CO₂ poskytuje skutečnou energii rovnající se 4 ATP a 24 atomům vodíku.

Při transportu elektronů oxidačně redukční potenciály sloučenin, které tvoří členy řetězce transportu elektronů jsou udržovány v rovnováze tak, že každý člen může být redukován redukovanou formou předchozího člena. Tudíž redukční síla, jako elektrony, může protékat řetězcem molekul nosičů do konečného příjemce elektronů, jako jsou kyslík (O₂), nitrát (NO₃‘) a fumarát. Přídavek konečného příjemce elektronů jako jsou kyslík, nitrát nebo fumarát do prostředí kultivace může poskytnout mikroorganismus se zvýšenou metabolickou energií (např. zvýšenou produkcí ATP na stejné množství spotřebovaného zdroje uhlíku). Kyslík je nejvýhodnějším konečným příjemcem elektronů.

Například, jestliže je jako konečný příjemce elektronů použit kyslík, může být vodík zpracován prostřednictvím řetězce transportu elektronů a poskytuje buňku s dalšími 1,5 ATP na atom vodíku a 3 ATP na atom kyslíku. Obecně může být množství metabolické energie stanoveno měřením poměru množství spotřebovaného kyslíku k množství spotřebované glukózy. Tabulka 1 uvádí očekávaná maximální a minimální zlepšení výtěžku energie ( moly ATP na moly glukózy), když je během produkce přidán kyslík, jako funkci výtěžku produktu, který se snižuje z důvodu ztrát pyruvátu do TCA cyklu (a následně do dýchání). Maximální % zlepšení bylo počítáno za předpokladu poměru P/O rovnajícího se 3, zatímco minimální % zlepšení za předpokladu poměru P/O rovnajícího se 0,5. Tabulka 2 uvádí odhadnuté maximální množství kyslíku spotřebovaného na molekulu spotřebované glukózy. Přídavek kyslíku může podporovat minimální růst, který maskuje úbytek uhlíku do biosyntézy a který ponechává malé množství uhlíku dostupného pro respiraci (a tudíž, využití kyslíku).

Tabulka 1

Výtěžek produktu (g-laktátu/g-glukózy)	Maximální % zlepšení ve výtěžku energie (%)	Maximální % zlepšení ve výtěžku energie (%)
1,0	0	0
0,9	160	35
0,8	320	70
0,7	480	105
0,6	640	140
0,5	800	175

-21 CZ 299320 B6

Tabulka 1 - pokračování

0,4	960	210
0,3	1120	245
0,2	1280	280
0,1	1440	315
0,0	1600	350

Tabulka 2

Výtěžek produktu (g-laktátu/g-glukózy)	Mol kyslíku na mol glukózy
1,0	0,0
0,9	0,6
0,8	1,1
0,7	1,6
0,6	2,1
0,5	2,6
0,4	3,1
0,3	3,6
0,2	4,1
0,1	4,6
0,0	5,1

Pro zlepšení metabolické energie mikroorganismů v buněčné kultuře může být tedy k buněčné kultuře přidán kyslík jako konečný příjemce elektronů. Zatímco maximální molámí výtěžek kyseliny mléčné z glukózy je 2 moly na mol glukózy a molámí výtěžek ATP z glukózy je 2 moly ATP na mol glukózy, přídavek kyslíku jako konečného příjemce elektronů umožňuje některým pyruvátům, aby byly převedeny do cyklu kyseliny citrónové (TCA), kde jsou přeměněny na CO₂ a energii. Tak dodávání konečného příjemce elektronů zvyšuje metabolickou energii mikroorganismu.

Převedení pyruvátu do TCA cyklu vykazuje tendenci k snížení množství produkce jiných od pyruvátu odvozených produktů (jako je kyselina mléčná). Například 10% snížení výtěžku může mít za výsledek tvorbu 2,6-krát více metabolické energie pro mikroorganismy, 20% snížení výtěžku může mít za výsledek tvorbu 4,2-krát více metabolické energie pro mikroorganismy a 50% snížení výtěžku může mít za výsledek tvorbu 9-krát více metabolické energie pro mikroorganismy.

Předpokládá se, že v pozdějších stadiích procesu, kdy jsou přítomny vysoké hladiny metabolických produktů, jako je kyselina mléčná, může buňka vyžadovat k udržení své funkce více metabolické energie.

Tudíž by mělo být žádoucí vystavit mikroorganismus v anaerobním kultivačním prostředí krátkým pulzům rozpuštěného kyslíku. Výhodně krátké pulzy rozpuštěného kyslíku mají za následek prostředí kultivace, které nemá koncentraci rozpuštěného kyslíku větší než 0,5 procenta, výhodně mezi asi 0,1 a 0,5 procenty. Alternativně rychlost růstu nebo buněčné udržování mikroorganismu během anaerobní fermentace může být zvýšeno přidáním jiných konečných příjemců elektronů, jako jsou nitrát nebo fumarát. Kyslík je přidáván v úrovni právě dostatečné k zvýšení metabolické energie mikroorganismu, při udržování produktivity na požadované úrovni. Aby se původci vyhnuli nadměrným ztrátám výtěžku museli vynaložit péči. Tato technika může být také použita jako pomoc při spotřebě zbytkových cukrů a tím k dalšímu zjednodušení procesu získávání.

- 22 CZ 293320 Β6

6. Způsoby čištění organického produktu

Jakmile je požadovaný produkt vytvořen, může být kjeho izolaci použito jakéhokoli způsobu. Například, mohou být použity běžné techniky separace k odstranění biomasy z živné půdy a k získání organických produktů z živné půdy prosté mikroorganismů mohou být použity běžné postupy izolace (např. postupy extrakce, destilace a iontové výměny). Viz např. patent US 4 275 234, patent US 5 510 526, patent US 5 831 122, patent US 5 641 406 a dokument WO 93/00440. Navíc požadovaný organický produkt může být izolován, zatímco je produkován nebo může být izolován z živné půdy poté, co je fáze tvorby produktu ukončena. Je důležité si povšimnout, že podmínky kultivace v druhé nádrži mohou být upravovány tak, že je zlepšen proces izolace. Například pH a teplota v druhé nádrži může být upravována tak, že se požadovaný organický produkt z roztoku vysráží nebo je ve formě přístupnější izolaci. Zvláště hodnota pH organických kyselin může vysrážet roztok, když je hodnota pH živné půdy nižší, než hodnota pKa pro organické kyseliny. Například podmínky kultivace při produkci kyseliny glutamové mohou být takové, že je pH nižší než 2,19, což je hodnotou pKa pro kyselinu glutamovou. Tudíž manipulace s pH, teplotou a obsahem živné půdy může usnadnit izolaci organického produktu. Navíc mohou být vybrány zvláště geneticky upravené kvasinky a/nebo mohou být upravovány specifické podmínky kultivace tak, že jakékoliv vedlejší produkty v živné půdě jsou takové, že neruší získání požadovaného organického produktu.

Způsoby a látky zde popsané mohou být upraveny a používány při jakémkoliv typu kultivačního procesu včetně, bez omezení, procesů obecně označovaných jako procesy kontinuální fermentace a šaržové fermentace. Navíc mohou být regenerovány mikroorganismy použité během jednoho produkčního procesu a znovu použity v následujícím produkčním procesu. Například může být mikroorganismus mnohokrát znovu použit k produkci požadovaného organického produktu. Dále může být použit jakýkoliv zdroj uhlíku. Například mohou být jako zdroj uhlíku pro produkci buď biomasy nebo požadovaného organického produktu použity allóza, altróza, glukóza, manóza, gulóza, jodóza, galaktóza, talóza, melibióza, sacharóza, fruktóza, rafinóza, stachyóza, ribóza, arabinóza, xylóza, lyxóza, škroby, jako jsou kukuřičný a pšeničný škrob, a hydrolyzáty, jako jsou hydrolyzát kukuřičných vláken a jiné celulózové hydrolyzáty. Mimoto může být použito jakékoliv prostředí. Například standardní prostředí kultivace (např. kvasinkové minimální prostředí a prostředí YP (kvasinkový extrakt 10g/l, peptonový bujón 20 g/l))stejně jako prostředí, jako jsou kukuřice smáčená vodou a kukuřice smáčená provozním roztokem, může být použito.

Významnou výhodou tohoto vynálezu je, že výhodné mikroorganismy, zvláště když jsou pěstovány za aerobních podmínek, mohou využít minimální prostředí. Anaerobní produkce obvykle nevyžaduje dodatečné živiny a tak může být konečný produkt izolován z relativně Čistého fermentačního bujónu při použití jakékoliv z širokého spektra separačních technik. Extrakce kapalina-kapalina je dobře známou technikou separace organických kyselin z fermentačních bujónů a má za následek značné čištění. S pomocí předkládaného vynálezu se věří, že jednodušší, méně nákladné, méně na spotřebu energie náročné systémy mohou být také užitečné.

V jednom ztělesnění používá předkládaný vynález geneticky modifikovanou kvasinku obsahující Crabtree-negativní fenotyp kmene v procesu vlakového typu, který vyvolává přepnutí v metabolické cestě poté, co je dosažena kritická hustota buněk a přičemž v tomto čase je žádoucí pozoruhodné zvýšení specifické produktivity požadovaného organického produktu. Typickým způsobem pro vyvolání přepnutí způsobu metabolismu je převod biomasy z vysoce provzdušňované nádoby do v podstatě anaerobní nádoby, působící kyslíkové hladovění. Je významné, že běžné cukry (např. glukóza nebo xylóza) mohou být použity jako zdroj uhlíku během jak fáze růstu tak fáze produkce. Použití geneticky modifikované kvasinkové buňky, která má Crabtreenegativní fenotyp kmene, může být pro úspěch kritické. Výraz specifická produktivita, jak je používán zde, odráží množství vyprodukovaného produktu a je uváděn jako počet gramů vyprodukovaného organického produktu na gram biomasy (suchá hmotnost) za hodinu, tj. g/(g*h).

Obvykle je specifická produktivita pro organické produkty, jako jsou laktát a akrylát, větší než asi 0,1 g/(g*h), například větší než asi 0,2 g/(g*h), nebo větší než asi 0,5 g/(g*h). Získáním vysoké specifické produktivity, jak je popsáno zde, může být energie požadovaná pro zachování buňky získána prostřednictvím fermentačního způsobu produkce za v podstatě anaerobních podmínek, spíše než spoléháním na provzdušnění k vytvoření velkého množství energie prostřednictvím respiračního způsobu. Je významné, že v podstatě anaerobní nádoby jsou provzdušňovány rychlostí nižší než asi 0,1 VVM. Za jistých produkčních situací nebude provzdušňování použito. Navíc, výtěžek (tj. g organického produktu/ g spotřebovaného zdroje uhlíku) v tomto ztělesnění je obvykle větší než asi 70 % hmotnostních aje vytvářen bez přídavku zdroje uhlíku, jako jsou ethanol a acetát. V některých případech k dosažení specifické produktivity požadované k tvorbě požadované energie pro zachování buňky, může být potřeba zvýšit přechod z glukózy na pyruvát, jako příspěvku k získání nezbytných enzymů pro produkci požadovaného produktu.

V jiném provedení může být proces vlakového typu navržen tak, že pouze vysoce provzdušňovaná růstová nádoba je vybavena sterilizační schopností. Anaerobní produkční nádoba je obvykle provozována při teplotách vyšších než asi 35 °C (např. vyšších než asi 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 nebo 45 °C). Při takových teplotách bude málo kvasinek divokého typu schopno přežít a soupeřit s geneticky modifikovanou kvasinkou, jelikož pH během produkčního procesu poklesne, zvláště když nebudou mít zvýšenou fementaci, která může vytvořit energii pro zachování buňky. Navíc kvasinka může být technicky upravena tak, aby obsahovala plazmid zabíječ, jak je popsán zde, který může zabránit kvasince jiného druhu přežít.

Tento vynález rovněž poskytuje různé způsoby kultivace kvasinkových buněk. Například kvasinková buňka, která obsahuje Crabtree-negativní fenotyp kmene, může být kultivována pomocí prostředí kultivace, které buď má hodnotu organického pH nižší než asi 3,0, nebo obsahuje hydrolyzát kukuřičných vláken. Jiné způsoby kultivace kvasinkových buněk zahrnují, bez omezení, pěstování kvasinkových buněk obsahujících Crabtree-negativní fenotyp kmene při teplotě vyšší než asi 35 °C pomocí prostředí kultivace, které buď má hodnotu anorganického pH nižší než asi 3,0, nebo které obsahuje pentózový uhlík nebo hydrolyzát kukuřičných vláken.

Dále tento vynález poskytuje proces přípravy organického produktu. Tento proces zahrnuje kultivaci mikroorganismu za podmínek kultivace a změnu podmínek kultivace k podpoře produkce organického produktu. V tomto procesu má mikroorganismus sníženou pyruvát dekarboxylázovou, alkohol dehydrogenázovou, aldehyd dehydrogenázovou a/nebo acetyl-CoA syntázovou aktivitu a vykazuje za nepřítomnosti ethanolu a acetátu rychlost růstu, která je nejméně 30 procent (např. asi 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200 % nebo více) rychlosti pozorované u odpovídajícího mikroorganismu, který nemá sníženou pyruvát dekarboxylázovou, alkohol dehydrogenázovou, aldehyd dehydrogenázovou a/nebo acetyl-CoA syntázovou aktivitu. Obvykle jsou používány podmínky kultivace, které podporují buněčnou respiraci, kde je potřeba rychlý růst nebo kde organický produkt, který má být produkován, nemůže být produkován bez buněčné respirace, zatímco podmínky kultivace, které snižují buněčnou respiraci jsou používány v situacích, kde není potřeba rychlý růst, nebo kde organický produkt, který má být produkován, může být produkován bez buněčné respirace.

Tento vynález bude dále popisován na následujících příkladech, které neomezují rozsah tohoto vynálezu popsaný v patentových nárocích.

Příklad 1

Rekombinantní plasmid pHES/pSEH

0,5 pg plasmidu pGAD424 popsaného Chienem a kol., Proč. Nat i Acad, Sci., 88 (21), 9578 až 9582 (1991) se digeruje s restrikčním enzymem HindlII. Digerovaná směs se separuje gelovou elektroforézou na 0,8% agarovém gelu při použití TBE pufru. 5,9 kbp fragment se pak čistí od

-24CZ 299320 B6 gelu, jak je popsáno v Sambrook a kok, Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview,NY (1980). Vytvoří se komplementární pár 92 bp syntetických oligomerů s mnohočetnými rozeznávacími místy restrikčního enzymu. Jako první se vytvoří fwd hes oligo a obsahuje následující sekvence:

'-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATCTACTAGTGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3' (sekvence identifikační číslo: 1).

Jako druhý se vytvoří comp hes oligo a obsahuje následující sekvence:

5-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTACCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3' (sekvence identifikační číslo: 2). 500 nmol dvou komplementárních oligomerů se navzájem kondenzuje varem po deset minut a postupným ochlazováním na teplotu místnosti. Dvouřetězcová 92 bp DNA se digeruje pomocí HindlII a liguje se k HindlII digerovanému 5,9 kbp pGAD424. Ligační směs se používá k transformaci E. coli DH10B (buňky s maximálním elektrickým nábojem, Life Technologies, Rockville, MD) elektroporací, jak je popsána v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989). Rekombinantní E. coli se umístí na plotny s živnou půdou Luria-Bertani a buňky obsahující plasmid se vyberou použitím 100 pg/ml antibiotika ampicilinu. Plasmid DNA z klonů E. coli resistentní vůči ampicilinu se pro získání dvou plasmidů pHES a pSEH třídí (obr.l a 2). Tyto dva plasmidy se liší v orientaci syntetických oligomerů vůči promotoru alkohol dehydrogenáza - ADH1 na vektoru.

Příklad 2

PCR amplifikace nukleové kyseliny kódující laktát dehydrogenázu z Lactobacillus helveticus a Pediococcus acidilactici

Z kultur Lactobacillus helveticus (ATCC 10797) a Pediococcus acidilactici (ATCC 25741) ponechaných přes noc se izoluje genomová DNA použitím přípravku PUREGENE® pro izolaci genomové DNA (Gentra systems, Minneapolis, MN). Primery PCR se projektují tak, aby izolovaly laktát dehydrogenázu kódující nukleovou kyselinu z genomové DNA L. helveticus (Ihldh oligos) aP. acidilactici (pa-ldh oligos). Tyto primery se projektují tak, aby byly založeny na genových sekvencích laktát dehydrogenázy dostupných v databázích genové banky a obsahují následující sekvence:

5'lh-ldh, 5'-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3' (sekvence identifikační číslo: 3); 3-lh-ldh, 5 -CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3' (sekvence identifikační číslo: 4); 5'pa-ldh, 5 -CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATCAAAAAG-3' (sekvence identifikační číslo: 5); a 3-pa-ldh, 5-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTTCAGCAAG-3' (sekvence identifikační číslo: 6). Primery se optimalizují použitím software Primer Designér získaného od Sci-ed software (Durham, NC). Jeden pmol genomové DNA se použije společně se 100 nmol primerů. Pfu DNA polymeráza (New England Biolabs) se používá pro PCR amplifikaci laktát dehydrogenázy (LDH) nukleové kyseliny, jak jsou popsány v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989).

Podobná strategie je použita k izolaci L-laktát dehydrogenázy kódující nukleovou kyselinu z genomové DNA z mikroorganismů jako jsou Bacillus sp., například Bacillus megaterium (ATCC 6458) nebo Rhizopus oryzae (ATCC 76275) nebo z jiných laktát produkujících organismů (zahrnujících mikroorganismy, jako jsou houby a bakterie a mnohobuněčné organismy takových savců) nebo z tkáně z laktát produkujících organismů. Genomová DNA se izoluje z rostoucí kultury organismu použitím přípravku pro izolaci genomové DNA PEREGENE® (Gentra systems, Minneapolis, MN). Vhodné PCR primery se projektují pro izolaci laktát dehydrogenázy kódující nukleovou kyselinu založenou na sekvencích genu LDH z těchto druhů dostupných z genové banky. Obecně je použit jeden pmol genomové DNA společně se 100 nmol vhodných primerů. K. amplifikaci laktát dehydrogenázy (LDH) nukleové kyseliny z příslušné genomové DNA se používá Pfu DNA polymeráza (New England Biolabs) nebo jakákoliv jiná

-25 CZ 293320 Β6 vhodná DNA polymeráza při použití PCR technologie, například, jak se popisuje v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989).

Alternativně se laktát dehydrogenáza kódující nukleovou kyselinu izoluje z Kluyveromyces thermotolerans ATCC 52709, Trichoderma Reesei ATCC 13631, Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 nebo jakékoliv jiného laktát dehydrogenázu produkujícího organismu za použití jakékoliv z následujících metodologií.

1) Knihovna genomové cDNA z jednoho z těchto organismů je klonována do standardního vektoru exprese E. coli, jako je pUC19, použitím standardních technik (Sambrook a kol., Molecular cloning: a laboratory manual, druhé vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y., 1989). Mutantní kmen NZN111 E. coli (ldh pfl) (Bunch a kol., The IdhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escheria coli, Microbiology, 143. 187 až 195 (1997), je pomocí této knihovny transformován a buňky jsou pěstovány za anaerobních podmínek v prostředí M9 doplněném kasaminovou kyselinou. Jakákoliv E. coli, která je pěstována za těchto podmínek kóduje buď laktát dehydrogenázu nebo je revertantem v ldh nebo pfl. Pozitivní kolonie (kolonie, které se tvoří za anaerobních podmínek růstu) se třídí z hlediska LDH aktivity použitím kolorimetrické zkoušky přelití kyseliny mléčné specifickým měkkým agarem (LASSO), která je schopná rozlišování mezi (L)-LDH a (D)-LDH (Witte a kol.,

J. Basic Microbiol., 29, 707 až 716 (1989). Pak se z klonů podezřívaných z exprese L-laktát dehydrogenázy izoluje a sekvencuje plasmid DNA.

2) K thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 1361 a Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 jsou všechny eukaryoty, které produkují kyselinu L-mléčnou, když jsou kultivovány za anaerobních podmínek (Witte a kol., J. Basic Microbiol., 29, 707 až 716 (1989). Tak podle této metody, je nejméně jeden z těchto kmenů pěstován za anaerobních podmínek pro vyvolání enzymatické aktivity laktát dehydrogenázy. Buněk prosté extrakty se pak získají použitím standardních metod a vystavením enzymu laktát dehydrogenázy známým strategiím čištění proteinů pro izolaci. Způsoby čištění laktát dehydrogenázy jsou známé (Kelly a kol., Affinity chromatography of bacterial lactate dehydrogenases, Biochem J., 171 (3), 543 až 547 (1978). Poté co je protein vyčištěn, je pro určení sekvence aminokyseliny částečně štěpen a sekvencován. Tato sekvence aminokyseliny se pak použije k projektování degenerovaných primerů pro izolaci genu, kódujícího laktát dehydrogenázu z genomové DNA.

Eukaryotické LDH, jako je LDH izolovaná z K thermotolerans nebo Trichoderma reseei nebo Torulaspora pretoriensis, mohou, ve srovnání s LDH z bateriálního zdroje, jako jsou Bacillus nebo Lactobacillus, lépe fungovat (v pojmech účinnosti transkripce, účinnosti translace a/nebo aktivity proteinu) v kvasince K marxianus.

3) Použitím známých sekvencí genu eukaryotické laktát dehydrogenázy dostupných z genové banky, se degenerační primery projektují k izolaci genu laktát dehydrogenázy z genomové DNA

K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 nebo Torulaspora pretoriensis ATCC 36245. K projektování degeneračních primerů se používají konzervovaná vazebná místa NAD+ a vazebná místa pyruvátu mezi sekvencemi genu LDH. Společně se 100 nmol primerů se použije jeden pmol genomové DNA. K amplifikaci fragmentů L+ laktát dehydrogenázy (LDH) nukleové kyseliny se podle známých metod PCR použije Pfu DNA polymeráza (New England Biolabs) nebo jakákoliv jiná vhodná DNA polymeráza, například polymerázy popsané v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989).

Příklad 3

Klonování L. helveticus a P. acidilactici do vektoru pCRII

Produkty LDH DNA amplifikované PCR se ligují pomocí vektorů pCRII (obr. 3 a 4) při použití klonovacího přípravku TA získaného z Invitrogen (Carlsbad, CA). Ligační směs se pak použije

-26CZ 299320 Β6 k transformaci E. coli DH10B při použití metod popsaných v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989). Vektory pCRll dodané pomocí přípravku umožňují podle pokynů výrobce rychlé klonování produktů PCR. Vektory pCRII s geny LDH z L. helveticus a P. acidilactici jsou zobrazeny na obr. 4.

Příklad 4

Rekombinantní plasmid pLh ldh-HES/pPa ldh-HES, který ve vektoru pHES obsahuje LDH geny

L. helveticus a P. acidilactici

Vektory pCRII obsahující LDH geny z Z. helveticus a P. acidilactici se digerují pomocí vhodné restrikční endonukleázy. Vektor pHES se podobně digeruje pomocí stejné restrikční endonukleázy. 1 kbp inzert obsahující LDH z vektorů pCRII se pak ligují do 6,0 kbp vektoru pHES za použití T4 DNA ligázy, jak se popisuje v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring harbor, Plainview, NY (1989). Ligační směs se používá k transformaci E. coli DH10B (buňky s maximálním elektrickým nábojem, Life Technologies, Rockville, MD) a z hiediska amipicilinové resistence se vyberou rekombinantní klony. DNA izolovaná z rekombinantních klonů se analyzuje na potvrzení vektorů pLh ldh-HES a pPa ldh-HES (obr 5). Tyto vektory obsahují geny kódující LDH z Z. helveticus a P. acidilactici ve vektoru pHES za kontroly promotoru alkohol dehydrogenázy kvasinek (ADH1).

Příklad 5

Klonování LDH genu Bacillus sp., Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei nebo Torulaspora pretoriensis pro expresi použitím genového promotoru Saccharomyces PDC 1.

Ačkoliv je možné použít promotor laktát dehydrogenázy, který se vyskytuje v Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei nebo Torulaspora pretoriensis, ke kontrole exprese genu laktát dehydrogenázy klonovaného v K. marxianus, ke kontrole exprese izolovaného genu laktát dehydrogenázy se může využít promotor PDC1 ze Saccharomyces cerevisiae. K expresi genů v kmenech Kluyveromyces se úspěšně používají glykolitické promotory Saccharomyces cerevisiae, Gellissen and Hollenberg, Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis-a review, Gene, 190(1), 87 až 97 (1997).

Podle toho se promotor PDC1 ze Saccharomyces cerevisiae získá tím, že se vytvoří vhodné oligomemí primery za použití genomových sekvencí Saccharomyces cerevisiae, dostupných v genové bance. Genové sekvence PDC1 a 1 kb oblasti obklopující gen PDC1 se amplifikují pomocí PCR technologií. Výsledné 4 kb fragmenty DNA obsahují jak promotory tak terminátory, které regulují expresi genu PDC1. Mezi promotory a terminátory jsou obsažena mnohoěetná místa restrikce enzymu, která regulují expresi genu PDC1 tak, že může být za regulace PDC1 promotory a terminátory vložena řada genů LDH. Do vhodného vektoru, jako je na člunkovém vektoru Saccharomyces cerevisiae nebo E. coli založený pUC19, se může vložit 4 kb fragment DNA. Gen LDH se potom vloží do vektoru v jednom z mnohých klonovacích míst za regulace promotory a terminátory tak, že gen exprese laktát dehydrogenázy je regulován pomocí promtorů a terminátorů PDC1 (obr 14). Alternativně se mohou podobně, k expresi genu LDH klonovaného v K. marxianus, použít jiné glykolitické promotory Saccharomyces, jako jsou ty, které regulují expresi glycerylaldehyd-3-fosfát dehydrogenázy Saccharomyces cerevisiae nebo genů fosfoglycerátkinázy.

-27CZ 293820 Β6

Příklad 6

Amplifikace lineárních fragmentů homologické DNA pro genovou divergenci pyruvát dekarboxylázy bp oligomemi primer (5'kmPDClKo) se vytváří tak, že obsahuje 51 bp pyruvát dekarboxylázy (PDC) zK. marxianus identický do konce 5' a 30 bp promotor ADH1 z vektoru pHES identický do 5'konce. Sekvence 5'K.mPDClK.o je následující:

5-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTGCAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3' (sekvence identifikační číslo: 7). Sekvence pro geny PDC z kvasinek (K. marxianus nebo Y. stipitis nebo H polymorpha) se získají z předložené sekvence genové banky. Podobně reverzní 79 bp oligomer (3'kmPDClKo) se získá tak, že 54 bp je z PDC genu identického do 3 konce a 22 bp je z terminátoru ADH1 identického do 3 konce. Sekvence 3'K.mPDClKo je následující: 5'-TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCCTCTCTAC ATGCCGGTAGAGGTGTGGTC A-3' (sekvence identifikační číslo: 8). Primery se vytváří tak, aby amplifikovaly fragment lineární DNA z plasmidů pLhldh-HES a pPaldh-EIES tak, že fragment obsahuje celý gen laktát dehydrogenázy společně s promotorem a terminátorem ADH1 (obr. 6). Produkt amplifikovaný PCR také obsahuje zakončení, která jsou homologická k sekvencím buď z PDC1 K. marxianus nebo z PDC1 a PDC2 Yamadazyma stipitis a z PDC1 a PDC2 Hansenula polymorpha. Amplifikační reakce se provádí za použití polymerázy Pfu DNA (New England Biolabs, Beverly, MA). 100 ng pLhldhHES nebo pPaldh-HES se používá při reakci společně s 5-ti jednotkami polymerázy a 100 nmol oligomerů. Reakce se provádí podle předpisu popsaného v Sambrook a kol., Molecular Cloning, druhé vydání, laboratoře Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989). Obr.6 zobrazuje konečný lineární produkt s popsanými homologiemi.

Střídavé technicky vytvořené struktury se připraví pro zlepšení pravděpodobnosti získání negativního pdc místa K. marxianus. Pro přípravu takové struktury se izoluje 5,5 kbp fragment, obklopující 1,7 kbp PDC1 gen K. marxianus (obr. 6b), při použití PCR a genomových krokových technik (Clonetech). Při použití standardních metod se pak klonuje 5,5 kbp fragment do klonovacího vektoru pCRJI TA (Invitrogen). Část o přibližně 370 bp poblíž středu 1,7 kbp kódující oblasti PDC1 se vyjmou z 5,5 kbp fragmentu K. marxianus restrikčními digeracemi (Sambrook). Vyjmuté fragmenty obsahují následující sekvence:

CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACTACATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAGTTCGTCTTGCAAAAGTTGTTGACCAAGGTCAAGGATGCTGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTCCAGTTCCTCACGCTCCAAGAGACAACAAGCCAGTTGCTGACTCTACTCCATTGAAGCAAGAATGGGTCTGGACTCAAGTCGGTATTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCAAGTCTTGTGGGGTTCCATTGGTTTCA (sekvence identifikační číslo 10).

Pak se z vektoru pPIC9K (Invitrogen) za použití standardní restrikční technologie (viz Sambrook a kol.) izolují gen kanamyacinové resistence a jeho promotor a klonují se do místa v 5,5 kbp z kterého se vyjme výše popsaný fragment. Gen kanamyacinové resistence pPIC9K (invitrogen) ajeho promotor se vloží tak, že sekvence vložené oblasti je následující:

GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAA-28CZ 299920 B6

CAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGC-CCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (sekvence identifi-kační číslo: 9).

Výsledná struktura obsahuje resistenční gen G418 obklopený, jak ukazuje obr.óc, přibližně 5 kbp oblasti pdc. Připraví se podobná struktura DNA, která obsahuje vnitřní gen G418 obklopený, jak ukazuje obr.ód, 2,3 kbp PDC1 z K. marxianus ve vektoru pCRlI

Příklad 7

Použití fragmentu lineární DNA k divergenci endogenní sekvence kódující PDC a současnému vložení kódující sekvence LDH

Fragment lineární DNA vytvořený pomocí PCR popsaný v příkladu 5 se použije k transformaci K. marxianus, Yamadazyma stipitis nebo Hansenula polymorpha. Předpis používaný pro transformaci popisují Weselowski-Louvel a kol., Nonconventional yeasts in Biotechnology: Kluyveromyces lactis, vyd. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlín, 138 až 201 (1996). Stručně se 5 ml kultury ponechané stát přes noc prudce rozvíří a promyje elektroforézním pufrem (10 nM tris-HCl, 270 nM sacharózy, lnM MgCl₂, pH 7,5). Promyté buňky se potom po 30 minut inkubují při 30 °C v inkubačním pufru (kvasinkový extrakt 5 g/1, peptonový bujón 10 g/1, glukóza 10 g/1, 25 nM DSTT, 20 nM HEPES, pH 8,). Na konci této periody se buňky znovu promyjí a resuspendují v 400 μΐ inkubačního pufru. K těmto buňkám se přidá 200 ng DNA a buňky se pulzují v 0,4 cm kyvetě při použití přístroje Bio-Rad Gene Pulser při 1800 voltech, 1000Ω a 25 pF.

Buňky se plotnují na regulární YPD plotny ( kvasinkový extrakt 10 g/1, peptonový bujón 20 g/1, glukóza 20 g/1, agar 15 %) a kolonie se nechají regenerovat po 72 hodin. Každá z ploten s koloniemi je v kopii plotnována na čerstvou YPD plotnu a inkubuje se po 48 hodin. Kolonie se pak překryjí 6,5% měkkým agarem (0,5 % agaru v 300 mM tris-HCl, 187 mM glutamátu, pH 8,3). K překrytým plotnám se přidá barvicí směs (3,2 ml 1% agar, 1,6 ml 120 mM tris, 75 mM glutamát, pH 8,3, 0,4 ml mg/ml fenazinmethosulfát, 7 jednotek glutamát pyruvát transminázy a 7 jednotek L(+)-laktát dehygrogenázy ze svalu prasete). Tento způsob se podobá způsobu, který navrhl Subdgen a kol., Canadian J. Microbiol., 28, 707 až 716 (1989). Provede se selekce kolonií a DNA izolovaná z kolonií se testuje pomocí PCR analýzy a sekvencuje se pro detekci divergovaného genu pyruvát dekarboxylázy.

-29CZ 299020 B6

V jiném ztělesnění se klony popsané výše v příkladu 6 a zobrazené na obr.6c a 6d digerují pomocí dvou restrikčních enzymů (viz Sambrook a kol.) čímž se získá výtěžek přibližně 3 mikrogramy framentu DNA, který obsahuje homologní oblast PDC, která zahrnuje střední sekvenci vloženého genu kanamyacinové resistence. K. marxianus se transformuje pomocí fragmentu při použití známých technik k divergenci pdc K. marxianus, jako je elektroporace.

Obecně se elektroporace provádí podle následujícího:

a) růst kultury v YPAD přes noc (~ 15 h) v objemu 20 ml;

b) převod 500 μΐ z kultury do mikroodstředivkové zkumavky, otáčky 4000, 4 min., odstranění kapaliny nad sedlinou;

c) promytí pelet 1 ml chladného EB (EB = elektroforézní pufr, 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 270 mM sacharózy, 1 mM MgCl?);

d) resuspendování v 1 ml IB (IB = inkubační pufr, YPD, 25 mM DTT, 20 mM Hepes, pH 8,0);

e) protřepání při 800 otáčkách/min, 30 °C po 30 minut v Eppendorf Thermomixer;

f) odstředění, jednou promytí EB, resuspendace v 400 μΐ EB;

g) přidání tří mikrogramů fragmentu DNA (ve vodě 10 mM tris-HCl, pH 8,5), inkubace na ledu 30 min;

h) převod do 0,4cm elektroforézní kyvety, nastavení přístroje Bio-Rad Gene Pulser: 1000 V, 1000 Ω, 50 pF, časová konstanta po pulzu: ~20 msec;

i) převod do 3ml zkumavky s Mortonovým závěrem, inkubace bez protřepávání při 30 °C po 1 h, přidání 400 μΐ kapalného prostředí YPAD (YPAD: 10 g kvasinkového extraktu, 20 g peptonu, 20 g glukózy, 100 mg adenin hemisulfátu, objem = l 1, bez úpravy PH), protřepání při 800 otáčkám/min, 30 °C po 1 h v přístroji Eppendorf Thermomixer, přidání 400 μΐ kapalného YPAD a regenerace 4 až 6 hodin;

j) odstředění v mikroodstředivkové zkumavce při 4000 otáčkách, 4 min, odstranění kapaliny nad sedlinou, resuspendace v 400 μΐ 1M sorbitolu;

k) plotnování na 200 pg/ml selektivní plotny G418; a

l) inkubování při 30 °C po 3 až 5 dní.

Kolonie se třídí nejprve pomocí druhého nanesení skvrn na 300 pg/ml G418. Genomová DNA se izoluje ze sekundární kvasinkové skvrny standardními genomickými přípravky (Sambrook). Tyto DNA se pak třídí přes PCR pokud jde o:

1) přítomnost kanamyac i nového fragmentu při použití vhodných primerů a podmínek (Sambrook); a

2) nepřítomnost divergované oblasti pdc při použití vhodných primerů a podmínek PCR.

Kolonie pozitivní pro selekční signální znak a negativní pro oblast divergence pdc se pak kultivují a analyzují pomocí vysoce výkonné chromatografie v kapalné fázi pro fyziologické účely. Genomová DNA z těchto kmenů se dále analyzuje Southemovou hybridizační analýzou.

Příklad 8

Růstové vlastnosti buněk

1. Nízké pH/vysoká teplota

Kultury K. marxianus ponechané přes noc se naočkují do 50 ml minimálního prostředí pro kultivaci kvasinek podle Kiers a kol., Yeast, J_4 (5), 459 až 469 (1998). Jako zdroj uhlíku se použije

-30CZ 299120 B6

100 g/1 glukózy. Kultury ponechané přes noc se udržují na 40 °C a očkují se do prostředí, které se také udržuje na 40 °C. Přídavek inokulátu změní pH prostředí z 5,5 na 2,5. V průběhu pokusu zůstává pH na 2,5. Koncentrace glukózy se měří pomocí membrány YSI a optická hustota (OD) se měří spektrometrem.

Glukóza se spotřebuje v 72 hodinách, což naznačuje, že během tohoto časového úseku se za nízkého pH a vysoké teploty vyskytuje metabolická aktivita (obr.7). Navíc se během časového úseku 48 až 72 hodin mírně snižuje obsah biomasy, což naznačuje, že buněčný katabolizmus převyšuje anabolismus (obr.7).

2. Zdroje pentózového uhlíku

Kultury K. marxianus ponechané přes noc se očkují do tří 50ml baněk, které obsahují minimální prostředí podle Kierse a kol., Yeast, 14 (5), 459 až 469 (1998). Každá ze tří baněk obsahuje různý zdroj uhlíku. První obsahuje 10 % glukózy, druhá obsahuje 10 % D-xylózy a třetí obsahuje 10 % L-arabinózy. Baňky se inkubují při 30 °C a periodicky se provádí měření optické hustoty (OD).

Po 48 hodinách je výtěžek biomasy vypěstovaný pomocí glukózy nebo xylózy podobný, zatímco výtěžek biomasy vypěstovaný pomocí arabinózy je nižší (obr.8). Porovnání růstu kvasinek pěstovaných pomocí glukózy k růstu kvasinek pěstovaných pomocí xylózy nebo arabinózy odhaluje při růstu počáteční Časovou prodlevu. Kvasinky pěstované s arabinózou vykazují počáteční časovou prodlevu několika hodin, zatímco časová prodleva kvasinek pěstovaných pomocí xylózy je mnohem výraznější (obr.8). Výskyt těchto časových prodlev naznačuje, že buňky kvasinek potřebují čas k adaptaci na xylózové a arabinózové zdroje uhlíku. Pravděpodobně je tento čas potřeba k vyvolání syntézy polypetidů, které se normálně neexpresují.

3. Hydrolyzát kukuřičných vláken při nízkém pH

Kultury K. marxianus ponechané přes noc se naočkují do baněk, které obsahují minimální prostředí podle Kierse a kol., Yeast, 14 (5), 459 až 469 (1998). Každá baňka obsahuje jako zdroj uhlíku 30 % hydrolyzátu kukuřičných vláken. Stručně se hydrolyzát kukuřičných vláken připraví pomocí reakce kukuřičných vláken s 1,2% kyselinou sírovou při 145 °C po 25 minut. Během této reakce se hemicelulóza rozloží na monomemí produkty arabinózu, xylózu a glukózu. Z důvodu vysoké teploty v průběhu reakce degraduje určitá část arabinózy a xylózy na furfural, zatímco určitá část glukózy degraduje na hydroxymethylfurfural. Analýza hydrolyzátu pomocí vysocevýkonné chromatografie v kapalné fázi ukáže přítomnost 38,7 g/1 glukózy, 39,1 g/1 xylózy, 20,7 g/1 arabinózy a 1,6 g/1 furfuralu. Navíc má hydrolyzát pH 1,51. Před pěstováním kvasinek se pH hydrolyzátu kukuřičných vláken upraví na 3,0. Během kultivačního pokusu se periodicky provádí měření optické hustoty (OD).

Když se pěstují za pomoci hydrolyzátu kukuřičných vláken jsou buňky kvasinek schopné vytvářet biomasu (obr.9).

4. Podmínky s různým pH

Kultury K. marxianus nechané přes noc se naočkují do čtyř baněk, které obsahují 50 ml prostředí YPD (kvasinkový extrakt 10 g/1, peptonový bujón 20 g/1, glukóza 20 g/1). Každá baňka má různé pH, které se upravuje použitím HCI. Během kultivačního pokusu se teplota udržuje na 30 °C a periodicky se provádí měření optické hustoty (OD). V každé baňce se pozoruje růst (obr. 10).

5. Podmínky s různým pH/kyselina mléčná

Kultury K. marxianus ponechané přes noc se naočkují do čtyř baněk, které obsahují 50 ml prostředí pro pěstování kvasinek YPD (kvasinkový extrakt 10 g/1, peptonový bujón 20 g/1, glukóza 20 g/1) stejně jako 40 g/1 kyseliny mléčné. Přídavek kyseliny mléčné má za následek hodnotu pH

-31 CZ 299320 Β6

2,8. Tudíž se pH ve třech baňkách upraví na naznačené pH použitím NaOH. Během kultivačního experimentu se teplota udržuje na 30 °C a periodicky se provádí měření OD. V každé baňce se pozoruje růst (obr. 11).

Příklad 9

Rekombinantní buňky schopné produkce akrylyl-CoA

Organismus neschopný využít akrylát jako zdroj uhlíku (např. E. coli) se transformuje pomocí knihovny genů DNA Clostridium propionicum. Knihovna genů C. propionicum se vytvoří použitím plasmidu pHES tak, že se expresují 10 kbp fragmenty genomu C. propionicum. Transformované E. coli se plotnují na selekční prostředí obsahující jako zdroj uhlíku pouze kyselinu akrylovou. Rostou pouze ty buňky, které mají schopnost asimilovat akrylát. Akrylát se normálně asimiluje pomocí své konverze na laktát zprostředkované enzymem. Střídavě se může laktát konvertovat na pyruvát a využít buňkami prostřednictvím Krebsova cyklu.

Jakmile se provede selekce transformované E. coli, izoluje se plasmid DNA z knihovny genů a sekvencuje se vložený fragment. Jakmile je sekvencování ukončeno, zkoumá se fragment pokud jde o otevření čtecích rámců pro stanovení kódující sekvence enzymů zapojených do konverze mezi laktátem a akrylátem (např. laktoyl-CoA dehydrogenázy a CoA transferáz).

Izolované klony, které obsahují kódující sekvenci těchto enzymů se vloží do buněk kvasinek popsaných v příkladu 6, které obsahují laktát dehydrogenázu a postrádají aktivitu pyruvát dekarboxylázy. Selekce rekombinantních buněk kvasinek, které obsahují vloženou nukleovou kyselinu se provádí za použití G418 (300 g/1). Jakmile se izolují, pěstují se rekombinantní buňky kvasinek aerobicky na glukóze a pak se převedou do anaerobních podmínek. Pak se zachytí živná půda a testuje se na akrylát při použití standardních metod vysoce výkonné chromatografie v kapalné fázi, jak popisuje Danner a kol., Biotechnological production of acrylic acid from biomass, v Applied Biochemisrty and Biotechnology, sv. 70 až 72 (1998).

Příklad 10

Rekombinantní buňky schopné produkovat askorbát

Exprese vektorů se technicky provádí tak, že se expresují následující polypeptidy: 2,5-dioxovalerát dehydrogenáza, 5-dehydro-4-deoxy-D-glukarát dehydratáza, glukarát dehydratáza, aldehyd dehydratáza, glukoronolakton reduktáza a L-glukoronolakton oxidáza. Sekvence nukleové kyseliny, které kódují tyto polypeptidy se izolují z různých mikroorganismů. Jakmile se vytvoří, transformují se vektory exprese do kvasinkových buněk pomocí elektroforézy. Jakmile se přetransformují, analyzují se buňky kvasinek pro stanovení zda produkují nebo neprodukují L-askorbát.

Příklad 11

Rekombinantní buňky schopné produkovat D-xylózu

Vektory exprese se technicky připraví tak, že se expresují následující polypeptidy: 2-dehydro-3deoxy-D-pentanoát aldoláza, xylonát dehydratáza, xylonol laktonáza a D-xylózo dehydrogenáza. Sekvence nukleové kyseliny, které kódují tyto polypeptidy se izolují z Pseudomonos sp. Jakmile se vytvoří, transformují se vektory exprese do kvasinkových buněk pomocí elektroporace. Jakmile se přetransformují analyzují se buňky kvasinek pro stanovení zda produkují nebo neprodukují D-xylózu nebo jinou sloučeninu s pentózovým uhlíkem.

- 32 CZ 299320 B6

Příklad 12

Rekombinantní buňky schopné produkovat citrát

PCR primery se vytvoří na základě sekvence nukleové kyseliny akotinázy 5. cerevisiae (ACO1, genová banka číslo příspěvku M33131). Tyto primery se používají ke klonování akotinázy kódující nukleovou kyselinu z druhů Kluyveromyces, Yamadazyma nebo Hansenula. Jakmile se provede sekvencování, připraví se lineární struktury podle popisu z příkladu 5 a použijí se k divergenci akotinázy, která v buňkách kvasinek kóduje nukleovou kyselinu. Používaným selekčním signálním znakem je místo produkce laktátu antibiotický G418 podle popisu z příkladu 5. Nukleová kyselina, která poskytuje resistenci proti antibiotickému G418 je neomycin/kanamyacinový gen. Tento gen se získá z vektoru PIC9K (InVitrogen) a vloží se do vektoru pHES. Buňky kvasinek se transformují pomocí PCR vytvořených lineárních fragmentů, které se technicky vytvoří tak, že mají zakončení homologická s ACO1, jak se popisuje výše. Lineární fragment se vytvoří tak, že kóduje gen resistence vůči G418. Pouze buňky, které obsahují integrované lineární fragmenty v místě, kde akotináza kóduje nukleovou kyseliny jsou resistentní vůči antibiotiku. Tyto buňky se analyzují pokud jde o správnou integraci za použití PCR. Kvasinkové buňky, které se získají tímto způsobem mají částečně funkční TCA cyklus a tak mohou nadprodukovat citrát. Citrát se transportuje přes mitochondrální membránu a do živné půdy. Navíc tyto kvasinkové buňky obsahují molekulu exogenní nukleové kyseliny, která kóduje enzym, jako je ATP-citrát lyáza tak, že může katalyzovat konverzi akumulovaného citrátu na oxalacetát ( viz příklad 13).

Příklad 13

Rekombinantní buňky schopné exprese citrát lyázy v cytosolu

Kvasinková buňka Crabtree-pozitivní se transformuje pomocí plasmidu pHES, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje ATP-citrát lyázovou aktivitu. Tato nukleová kyselina se izoluje z E. coli, Klebsiella pneumoniae (číslo příspěvku genové banky X79817) z jiných známých zdrojů. Jakmile se přetransformují, analyzují se kvasinkové buňky z pohledu stanovení zda mohou nebo nemohou využít cukry k vytvoření akumulace lipidů velkého rozsahu. Navíc se buňky kvasinek analyzují z pohledu určení zda mohou nebo nemohou vykazovat aktivitu ATP-citrát lyázy, jak se popisuje v Holdsworth a kol., J. Gen. Microbiol., 134, 2907 až 2915 (1998). Buňky kvasinek, které vykazují aktivitu ATP-citrát lyázy jsou schopné za aerobních podmínek poskytnout cytosolický acetát jiným způsobem, než je rozštěpení aldehydu na acetát prostřednictvím aldehyd dehydrogenázy. Navíc, kde takové kvasinky postrádají pyruvát dekarboxylázovou nebo aldehyd dehydrogenázovou aktivitu, jsou schopné z pohledu biosyntézy poskytnout přes Krebsův cyklus acetát.

Příklad 14

Rekombinantní buňky, které nejsou schopné využít laktát, jako zdroj uhlíku

Buňky kvasinek se technicky vytvoří tak, že se sníží aktivita transportéru karboxylové kyseliny podobná aktivitě polypeptidu JEN1 S. cervisiae. Takové kvasinkové buňky mají sníženou schopnost transportovat laktát a tudíž využívají laktát méně účinně. Aktivita transportéru karboxylové kyseliny v kvasinkových buňkách se sníží divergencí řetězce, který obsahuje kódující sekvenci tohoto polypeptidu. Nejprve se použitím degeneračních primerů, vytvořených tak, že jsou založeny na dostupnosti sekvence pro JEN1 (číslo příspěvku genové banky U24155), izoluje z hostitelské buňky homolog polypeptidu JENE Jakmile se z hostitelské buňky izoluje nukleová kyselina, sekvencuje se. Divergence této kódující sekvence se pro tento polypetid uskuteční při použití postupů popsaných v příkladu 11. Lineární fragmenty se vytvářejí zakódováním homologických oblastí do sekvence JEN1 stejně jako celkový resistenční gen G418. Tento lineární fragment se integruje do genomové sekvence JEN1, která působí divergenci aktivity. Buňky, kterým chybí

-33 CZ 299320 Β6 aktivita transportéru karboxylových kyselin se identifikují pomocí jejich neschopnosti transportovat karboxylovou kyselinu a tudíž pomocí jejich neschopnosti růst, když se pěstují na laktátu.

Navíc se buňky modifikují tak, že se sníží funkční ekvivalent cytochromového polypeptidů b2 S. cerevisiae. Cytochromový polypeptid b2 umožňuje buňkám S. cerevisiae metabolizovat laktát v mitochondrii. Nejprve se z cytochromové sekvence b2 Saccharomyces vytvoří degenerační primery (číslo příspěvku genové banky Z467229). Jakmile se izoluje, klon se sekvencuje. Divergence kvasinky hostící homolog cytochromu b2 se provádí při použití metod popsaných v práci autorů Alison a kol.,Methods in Yeast Genetics, Cold Harbor Press, 1997. Tato rekombinantní kvasinková buňka není schopná využít laktát, jako zdroj uhlíku.

Příklad 15

Produkce laktátu ve velkém měřítku

Vyrábí se a izoluje se mnoho variant buněk K. marxianus, které mají sníženou PDC aktivitu. Každá varianta se technicky připraví tak, že obsahuje různý počet kopií molekuly exogenní nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid, který vykazuje LDH aktivitu. LDH polypeptid pochází z mnoha různých zdrojů. Takové varianty buněk mohou mít při 40 °C pro kyselinu mléčnou různou specifickou produktivitu.

Aby se dosáhlo hustoty buněk asi 60 g/1, suchý základ, pěstuje se každá z variant v nádobě za aerobních podmínek s průtokem vzduchu 1,5 VVM a obsahem rozpuštěného kyslíku 30%. Jakmile se dosáhne dostatečná hustota, přeruší se průtok vzduchu a podmínky v nádobě se změní na anaerobní podmínky. Nepřidává se žádná báze. Během anaerobní fáze se může zjistit, že varianty s nejvyšší specifickou produktivitou nejen produkují kyselinu mléčnou rychleji, ale také při nižším pH dosahují vyšší koncentrace kyseliny mléčné, než varianty s nižší specifickou produktivitou. Výtěžek produktu během výrobní fáze může vztaženo na glukózu přesáhnout 90 %.

Kromě toho, že se průtok vzduchu sníží, raději na 0,1 VVM, než by se úplně přerušil, se vybírají určité varianty a podrobují se stejným metodám kultivace. Za takových podmínek může být konečné pH v nádobě nižší a koncentrace laktátu vyšší než při podmínkách bez průtoku vzduchu. Produkt výtěžku vztažený na glukózu se může snížit, ale může se udržet na asi 90 %. Když se zkouška opakuje, ale s průtokem vzduchu 0,5 VVM, může se výtěžek produktu vztažený na glukózu snížit na méně než 80 %.

Příklad 16

Produkce laktátu při použití řady šaržových fermentací

Kultura K. marxianus, která postrádá PDC aktivitu a která vykazuje LDH aktivitu, se v sérii šaržových fermentací používá jako inokulum. Každá fermentace se provádí v progresivně se zvětšujících nádobách, z nichž každá se sterilizuje bezprostředně před použitím. Navíc je každá nádoba opatřena průtokem vzduchu 1,5 VVM a mícháním dostatečným k udržení obsahu rozpuštěného kyslíku nad 10 %. Poslední nádoba má objem 6000 1. Nádoby se také udržují na teplotě 45 °C čímž se zvětší přežití geneticky modifikovaných buněk K. marxianus proti divokému typu kvasinek a jiných mikroorganismů. Každá nádoba se pro optimální růst naplní standardním prostředím kultivace.

Obsahy poslední nádoby s buněčnou hustotou 100 g buněk/1, suchý základ, se převedou do krátce předtím vypářené produkční nádoby, která má objem 300 000 1. Popřípadě se přidají dodatečné buňky získané z filtrace předcházejících produčních procesů. Buněčná hustota v produkční nádobě je 6 g buněk /1, suchý základ. Přidá se glukóza až do úrovně 80 g/1. Podmínky v nádobě jsou anaerobní s teplotou 42 °C po dobu 25 hodin. Specifická produktivita je větší než 0,5 g

-34CZ 299320 B6 laktátu/ g biomasy * hodina) až téměř do konce procesu, kdy produktivita zaěíná klesat. Jakmile začíná produktivita klesat, buňky se odstraní a uchovají se pro opětovné použití. Závěrečná koncentrace laktátu může být 75 g/1 při pH 2,8. Po odstranění biomasy se roztok koncentruje odpařováním na koncentraci 50 % laktátu. Volná kyselina (asi 86 % celkového množství laktátu) se extrahuje pomocí extrakce v kapalné fázi do organické fáze a zpětně se při vysoké teplotě extrahuje do vody. Rafinát, který obsahuje sůl laktátu se buď čistí nebo jako pufr recykluje do kultivační nádoby nebo se okyselí pomocí například kyseliny sírové a ěistí se.

Příklad 17

Srovnání aerobní produkce podle Crabtree-negativního organismu (K. marxianus) a podle Crabtree-pozitivního organismu (5. uvarutri)

Crabtree-neativní (K. marxianus) a Crabtree-pozitivní (5. uvarutri) organismy, se každý pěstují v aerobních a anaerobních šaržových fermentátorech. Šaržová kultivace se provádí při 30 °C v laboratorních fermentátorech s pracovním objemem 1,5 l. pH se udržuje na 5,0 ± 0,1 pomocí automatizovaného přidávání 2 mol*!'¹ hydroxidu draselného (KOH). Fermentátory se promývají vzduchem (aerobní kultury) nebo plynným dusíkem (anaerobní kultury) při rychlosti průtoku 0,8 l*min’' a míchají se míchají se s frekvencí otáček 800 za minutu. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se průběžně sleduje pomocí kyslíkové elektrody (Ingold, typ 34 100 3002). V aerobních kulturách se udržuje koncentrace rozpuštěného kyslíku nad 60 %. Pro stanovení hmotnosti v suchém stavu a koncentrace metabolitů se v příslušných intervalech odeberou lOml vzorky. K anaerobním kulturám se přidají Tween-80 a ergosterol, čímž se dodají sloučeniny potřebné pro syntézu mastných kyselin.

Během exponenciálního růstu se v příslušných intervalech stanoví, jak suchá hmotnost tak optická hustota 660 (OD660) kvasinkových kultur a koncentrace glukózy a ethanolu v kapalině nad usazeninou. Specifická rychlost produkce ethanolu (q_ethanoi, mmoHg·¹*^¹) se počítá pomocí následující rovnice při použití lineární regresní analýzy:

^ethanol dE

-* Pmax dC_x dE/dt (rychlost zvyšování koncentrace ethanolu v kultuře, mmol * T¹ * h'¹) a dCx/dt (rychlost zvyšování koncentrace biomasy, g * Γ¹ * h'¹) se vypočítají při použití diagramů derivace koncentrace ethanolu a koncentrace biomasy proti času * pmax (h¹). Maximální specifická rychlost růstu na glukóze se odhaduje z exponenciální části diagramu C_x proti času. Aby se vypočítala specifická rychlost spotřeby glukózy (q_giukóza, mmol * g'¹ * h¹), nahradí se dE dG (množství glukózy spotřebované za hodinu).

V aerobních kulturách šarží, vykazují kmeny Kluyveromyces a Saccharomyces maximální specifickou rychlost růstu na glukóze 0,4 h'¹ a 0,28 h'¹ respektive. Vysoká koncentrace glukózy a z toho pocházející vysoká specifická rychlost růstu kultury Saccharomyces má za následek vysokou rychlost aerobní alkoholové fermentace (tabulka 3, obr. 1). Specifická rychlost spotřeby glukózy je z důvodu živé alkoholové fermentace, ve srovnání, asi 2-krát vyšší u kmene Saccharomyces než u kmene Kluyveromyces. Z energetického hlediska je alkoholová fermentace pro buňky méně účinným způsobem tvorby ATP. Výtěžek biomasy vztažený na glukózu je pro Kluyveromyces 0,38 g/g a pro Saccharomyces 0,14 g/g. Výtěžek ethanolu vztažený na glukózu je nulový pro Crabtree-negativní fenotyp kmene Kluyveromyces a 1,83 mmol/mmol pro kulturu kmene Saccharomyces s Crabtree-pozitivním fenotypem.

-35CZ 299320 B6

Tabulka 3: Maximální specifická rychlost růstu, specifické rychlosti (q, mmol[g biomasy]'¹ h'¹) produkce ethanolu a spotřeba glukózy, výtěžek biomasy (g/g), výtěžek produktu (mmol/mmol) a využití uhlíku (v %, počítané pouze pro anaerobní kultury) během exponeciálního růstu v kulturách šarží Saccharomyces uvarum a Kluyveromyces marxianus v nerostném prostředí, které obsahuje 2 % (hmotnost/objem) glukózy.

	K. marxianus	X uvarum
Aerobní	Anaerobní	Aerobní	Anaerobní
M-max (h )	0,38	0,09	0,28	0,12
Aulukóza	5,8	7,6	10,9	7,2
Oethanol	0	9,9	20	9,7
Yp/S	0	1,30	1,83	1,35
Yx/S	0,38	0,07	0,14	0,09
C-rec	-	84,6	-	73,3

V anaerobních kulturách, je pro oba kmeny specifická rychlost růstu a výtěžek biomasy velmi nízký ve vztahu hodnotám zjištěným při aerobních podmínkách (tabulka 3, obr. 1 a 2) Výtěžek biomasy pro kmeny Kluyveromyces a Saccharomyces je. 0,07 a 0,09 g/g respektive. Pokud jde o specifickou rychlost alkoholové fermentace za anaerobních podmínek působí oba kmeny stejně dobře. To se potvrdí při využití údajů o tvorbě CO₂.

Obecně tento příklad ukazuje, že aerobní produkce biomasy je mnohem rychlejší než anaerobní a že výtěžek biomasy za aerobních podmínek je vyšší pro organismus s Crabtree-negativním fenotypem (protože v organismu s Crabtree-pozitivním fenotypem probíhá určitá alkoholová fermentace, která spotřebovává glukózu). Tento příklad také ukazuje, že produkt fermentace (v tomto případě ethanol) se za anaerobních podmínek vytváří stejnou rychlostí jak pro organismus s Crabtree-pozitivním, tak s Crabtree-negativním fenotypem. Tudíž fáze aerobního růstu poskytuje vysoký výtěžek biomasy a následná anaerobní fermentace směruje metabolickou energii do tvorby produktu (spíše než do zvýšení růstu). Celkově proces s produkcí oddělenou od růstu poskytuje větší flexibilitu procesu a lepší možnost řízení celkového výtěžku z procesu.

Příklad 18

Zlepšená produkce laktátu v hostitelském kmeni, který přirozeně vytváří kyselinu L-mléčnou: amplifikace lineárních fragmentů homologické DNA pokud jde o divergenci pyruvát dekarboxylázy

Kvasinka Kluyveromyces thermotolerans (K thermotolerans) je přírodní producent kyseliny L-mléčné (Kurtzman a Fell, The Yeasts, A Taxonomie Study, Elsevier Science B.V., Amsterodam, Holandsko, 240 až 241 (1998). K. thermotolerans obsahuje přírodně se vyskytující gen laktát dehydrogenázy (ldh), který umožňuje produkci kyseliny L-mléčné. Množství kyseliny mléčné produkované za anaerobních podmínek je přibližně 4 % g/g spotřebované glukózy, zatímco zůstatek glukózy je hlavně přeměněn na ethanol (42,5 % g/g spotřebované glukózy), glycerol (3 % g/g spotřebované glukózy) a acetát (0,3 g/g spotřebované glukózy).

Tabulka 4. Výsledky anaerobní fermentace při použití K. thermotolerans, zahájené se 100 g/1 glukózy v prostředí YPAD (bohaté prostředí)

Čas	Glukóza	Laktát	Acetát	Gylcerol	Ethanol	Mléčný YS1
0	92,937	0	0	0	0,025	0,06
12	79,603	0,476	0	0,41	3,345	0,6
36	38,618	2,135	0	2,011	25,642	2,08
54	11,662	3,525	0,2	2,789	41,522	3,34
78	1,539	4,322	0,209	3,213	42,5	3,88
98	0,286	4,365	0,307	3,24	42,5	3,74

- 36 CZ 299320 B6

Oblast PDC1 o 600 bp se izoluje zK. thermotolerans za použití souhlasných primerů vytvořených ze sekvence odvozené pomocí komparace sekvence genu PDC1 z K. marxianus a K. lactis. Fragment PDC1 se potom sekvencuje (Sanger) a použije se k izolaci 7,5 kbp fragmentu obklopujícího PDC1 K. thermotolerans (obr.6e) při použití PCR a krokové genomové techniky (Clonetech). 7,5 kbp fragment se pak klonuje do klonujícího vektoru pCRII TA (Invitrogen). Část přibližně 730 bp blízko středu kódující oblasti PDC1 se z 7,5 kbp fragmentu K. thermotolerans vyjme. Část PDC1 K. thermotolerans vyjmutá pomocí restrikěních digerací (Sambrook) obsahuje následující sekvence:

TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGACGAGATCTACGAGGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGTTGAACGCTTCTTACGCTGCCGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCCCTGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTGAGTTGTCCGCTTTGAACGGTATCGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCACATTGTCGGTGTCCCATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTTGGGTAACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGACCACTGCTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGATGTATCAGAACCACCTACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCATCTAACTTCGTTGACCAGATGGTCCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAATTGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGGCTGAGGAGGAGGTCATCTCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTCATCTTGGCTGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTGATTGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTCCATTGACGAGAAGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT (sekvence identifikační číslo XX).

Pak se z vektoru pPIC9K (Invitrogen) pomocí restrikční digerace izoluje gen kódující kanamyacinovou resitenci včetně svého promotoru a klonuje se do toho místa v 7,5kbp fragmentu, z kterého se vyjmul 730bp fragment. Sekvence genu kanamyacinové resitence a jeho promotoru z pPIC9K (invitrogen) je následující:

GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCCAGAAAGGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATTTTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGTAATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTG-37CZ 299820 B6

TATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (sekvence identifikační číslo 9). Jak je vidět na obr.óf, zahrnuje výsledná struktura gen kanamyacinové resistence (g418), obklopený přibližně 6,8kbp oblastí z PDC.

Struktura zobrazená na obr.óf se digeruje pomocí dvou restrikčních enzymů (Sambrook), čímž se získá výtěžek přibližně 3 mikrogramů fragmentu DNA, který obsahuje homologickou oblast PDC a do středu sekvence vložený gen kanamyacinové resistence. K. thermotolerans se transformuje pomocí fragmentu za použití známých tranformačních technik k divergenci PDC z K. thermotolerans, jako je elektroporace. Metoda elektroporace je následující:

a) pěstování kultury v YPAD přes noc (~15 h) v objemu 20 ml;

b) převod 500 pl kultury do mikroodstředivkové zkumavky, frekvence otáček 4000, 4 min., odstranění kapaliny nad sedlinou;

c) promytí pomocí 1 ml studeného EB (EB = elektroforézní pufr: 10 mM tris-HCl, pH 7,5, 270 mM sacharózy, 1 mM MgCl₂);

d) resuspendování v 1 ml IB (IB = inkubační pufr: YPD, 25 mM DTT, 20 mM Hepes, pH 8,0);

e) protřepání při frekvenci 800 otáček za minutu, 30 °C po 30 minut v přístroji Ependorf Thermomixer;

f) ostředění, jednou promytí EB, resuspendování v 400 μΐ EB;

g) přidání fragmentu DNA tří mikroorganismů (ve vodné 10 mM tris-HCl, pH 8,5), inkubace na ledu po 30 minut;

h) převod do 0,4cm elektroforézní kyvety. Nastavení přístroje Bio-Rad Gene Pulser: 1000 V, 1000 Ω, 50 pF. Časová konstatnta po pulsu: ~20 msec;

i) převod do 3ml zkumavky s Mortonovým uzávěrem, inkubace bez protřepání při 30 °C po 1 hodinu;

j) přidání 400 μΐ kapalného prostředí YPAD (YPAD: 10 g kva-sinkového extraktu, 20 g peptonu, 20 g glukózy, 100 mg adenin hemisulfát. Objem = 1 1. pH se neupravuje), protřepání při frekvenci 800 otáček za minutu, 1 h v přístroji Eppendorf Thermomixer při 30 °C;

k) přidání 400 μΐ kapalného YPAD a odpočinek 4 až 6 hodin;

l) odstředění v mikroodstředivkové zkumavce při frekvenci 4000 otáček, po 4 min, odstranění kapaliny nad sedlinou, resuspendování v 400 μΐ 1M Sorbitolu a plotnování na 100 pg/ml selektivní plotny G418; a

m) inkubace při 30 °C od tří do pěti dnů.

Kolonie se nejprve třídí pomocí druhého nanášení do kultivačních misek, které obsahují 200 pg/ml G418. Genomová DNA se izoluje ze sekundární vrstvy kvasinek za použití standardních genomových přípravků (Sambrook). Izolovaná genomová DNA se pak třídí prostřednictvím PCR pokud jde o

1) přítomnost kanamyacinového fragmentu za použití vhodných primerů a podmínek (Sambrook); a

2) nepřítomnost divegované oblasti PDC za použití vhodných primerů a podmínek PCR. Kolonie pozitivní na selekční signální znak a negativní pokud jde o oblast divergence PDC se pak pěstují pro další studium, například genomová DNA z těchto kmenů se dále analyzuje Southemovou hybridizační analýzou.

-38CZ 299920 B6

Průmyslová využitelnost

Vynález je využitelný pro přípravu látek, týkajících se produkce organických produktů, např. poskytuje různé rekombinantní kvasinkové buňky, způsoby kultivování kvasinkových buněk, způsoby přípravy kvasinkových buněk, vytvořené struktury nukleové kyseliny a způsoby a látky pro produkci různých organických produktů.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy vybraných organických produktů, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   a) získání mikroorganismu, vykazujícího Crabtree-negativní fenotyp kmene;

   b) kultivaci mikroorganismu s Crabtree-negativním fenotypem kmene v prvním kultivačním prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku za prvního souboru podmínek kultivace, které podporují buněčnou respiraci; a

   c) kultivaci mikroorganismu s Crabtree-negativním fenotypem kmene v druhém kultivačním prostředí, které obsahuje zdroj uhlíku za druhého souboru podmínek kultivace, které podporují produkci vybraného organického produktu, kde se produkuje ne více než 0,3 gramu biomasy na gram zdroje uhlíku, spotřebovaného za druhého souboru podmínek kultivace.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Crabtree-negativní mikroorganismus je geneticky modifikovaný.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že vybraný organický produkt zahrnuje od pyruvátu odvozený produkt.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že Crabtree-negativní mikroorganismus je geneticky modifikovaný tak, že obsahuje gen exogenní laktát dehydrogenázy a od pyruvátu odvozený produkt zahrnuje laktát.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že gen exogenní laktát dehydrogenázy je vybrán ze skupiny, zahrnující hovězí laktát dehygrogenázy, bakteriální laktát dehydrogenázy a kvasinkový laktát dehydrogenázy.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zdroj uhlíku v prvním kultivačním prostředí obsahuje glukózu.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zdroj uhlíku v druhém kultivačním prostředí obsahuje glukózu.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že první soubor podmínek kultivace zahrnuje aerobní podmínky.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že druhý soubor podmínek kultivace zahrnuje anaerobní podmínky.

   -39CZ 299920 B6
10. 10. Způsob podle nároku 3 pro vytváření vybraného od pyruvátu odvozeného produktu, který dále zahrnuje:

    d) kultivaci mikroorganismu za třetího souboru podmínek kultivace, které zahrnují kultivační prostředí, které obsahuje činidlo, které zvyšuje metabolickou energii mikroorganismu.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že první soubor podmínek kultivace zahrnuje aerobní podmínky a druhý soubor podmínek kultivace zahrnuje anaerobní podmínky.
12. 12. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že první, druhý a třetí soubor podmínek kultivace zahrnují kultivační prostředí, které obsahuje glukózu.
13. 13. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že činidlo, které zvyšuje metabolickou energii mikroorganismu, zahrnuje kyslík.
14. 14. Způsob podle nároku 1, vyznačující vybraná ze skupiny, zahrnující Kluyveromyces, Yamadazyma.

    se t í m , že mikroorganismem je kvasinka, Pichia, Hansenula, Candida, Trichsporon a
15. 15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Crabtree-negativní mikroorganismus je geneticky modifikovaný tak, že obsahuje gen exogenní laktát dehydrogenázy, od pyruvátu odvozený produkt zahrnuje laktát, zdroj uhlíku v prvním a druhém kultivačním prostředí zahrnuje glukózu, první soubor podmínek kultivace zahrnuje aerobní podmínky a druhý soubor podmínek kultivace zahrnuje anaerobní podmínky.
16. 16. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že mikroorganismem je kvasinka druhu Kluyveromyces.
17. 17. Použití geneticky modifikovaného mikroorganismu, vykazujícího Crabtree-negativní fenotyp kmene, v procesu produkce kyseliny mléčné, kde uvedený proces zahrnuje aerobní fázi a anaerobní fázi.
18. 18. Kmen kvasinek K. thermotolerans, který postrádá schopnost produkovat ethanol nebo má sníženou schopnost produkce ethanolu vzhledem k divokému typu kvasinek stejných kmenů a který obsahuje gen endogenní laktát dehydrogenázy.