PT1183385E

PT1183385E - Métodos e materiais para a síntese de produtos orgânicos

Info

Publication number: PT1183385E
Application number: PT00932649T
Authority: PT
Inventors: Jeffrey J Kolstad; Vineet Rajgarhia; Vassily Hatzimanikatis; Stacey Olson; Ting Liu Carlson; John N Starr; Aharon M Eyal
Original assignee: Cargill Dow Llc
Priority date: 1999-05-21
Filing date: 2000-05-19
Publication date: 2006-11-30
Also published as: DE60029440D1; NO20015688D0; EP1183385B1; AU5034400A; BR0010806A; HUP0201204A3; AU780135B2; PL352434A1; WO2000071738A1; DE60029440T2; CN100347308C; NO326775B1; CA2374482C; CA2374482A1; KR20020048910A; UA77386C2; CZ299320B6; BR0010806B1; US7700332B1; HUP0201204A2

Description

1 PE 1183385

DESCRIÇÃO "MÉTODOS E MATERIAIS PARA A SÍNTESE DE PRODUTOS ORGÂNICOS" 1. Campo Técnico 0 invento refere-se a métodos e materiais envolvidos na produção de produtos orgânicos. 2. Informação Antecedente

Produtos orgânicos tais como o ácido láctico têm muitas utilizações industriais importantes. Por exemplo, podem ser utilizados ácidos orgânicos para sintetizar materiais plásticos bem como outros produtos. Para satisfazer a necessidade crescente de produtos orgânicos, estão a ser desenvolvidos métodos de produção mais eficientes e com menores custos. Um desses métodos envolve a utilização de bactérias. Especificamente, certas bactérias podem produzir grandes quantidades de determinados produtos orgânicos sob certas condições de fermentação. A utilização de bactérias vivas como fábricas está, no entanto, limitada pela incapacidade das bactérias crescerem à medida que o produto orgânico se acumula no meio de crescimento. Para contornar tais limitações, têm sido empregues várias técnicas de purificação de produtos durante a sintese dos produtos. Adicionalmente, foi tentada a utilização de outros micror- 2 PE 1183385 ganismos que não bactérias. De facto, Saccharomyces cere-visiae, que se sabe ser tolerante a ácidos, foi geneticamente modificada numa tentativa de produzir ácido láctico. Especificamente, células de S. cerevisiae foram modificadas proporcionando às células um ADNc da lactato-desidrogenase bovina e destruindo os genes da piruvato-descarboxilase endógenos (PDC1, PDC5 e PDC6). Embora estas células de S. cerevisiae modificadas produzissem algum ácido láctico, o crescimento celular foi suprimido levando à conclusão de que tanto o crescimento celular como a produção de ácido láctico necessitavam de melhoramento. WO 97/16528 descreve uma estirpe mutante de E. coli que não tem capacidade de catabolizar piruvato. Os mutantes são seleccionados com base na sua capacidade para crescer em glicose num ambiente anaeróbico. A estirpe mutante é útil na produção de ácido succinico.

De acordo com EP 0370160A, é produzida uma estirpe tolerante à congelação de Kluyveromyces thermotolerans para utilizar como levedura de padeiro, através da cultura das células num meio contendo azoto e fósforo até serem produzidos 40-150 g/1 de células, adicionando depois até 200% em peso de melaço, com base no peso das células de levedura, e reduzindo o arejamento. Este método é referido como produzindo uma levedura de padeiro possuindo uma excelente capacidade de fermentação no processo de levedar.

Porro e colaboradores descreveram uma estirpe 3 PE 1183385 mutante de S. cerevisiae contendo um gene da lactato-desi-drogenase (LDH) exógeno e uma actividade de PDC reduzida. Ver WO 99/14335 e Biotech. Prog. 11: 294-298, 1995.

SUMÁRIO 0 presente invento refere-se geralmente a métodos e materiais para produção de produtos orgânicos. Especi-ficamente, o invento proporciona células de levedura, métodos para cultura de células de levedura, método para produção de células de levedura, construções de ácido nucleico, e métodos e materiais para produção de vários produtos orgânicos. 0 invento baseia-se na descoberta de que determinados microrganismos (p. ex., microrganismos bacterianos e fúngicos) podem ser geneticamente manipulados para que tenham a capacidade, sob condições de cultura especificas, de crescer, utilizar várias fontes de carbono para o crescimento bem como para a produção de produtos, e produzam um produto orgânico desejado para fins comerciais. Por exemplo, as células de levedura aqui proporcionadas podem crescer e produzir um produto orgânico quando cultivadas a pH baixo e temperatura elevada. Possuir a capacidade de crescer rapidamente e produzir eficientemente um produto orgânico sob, por exemplo, condições de pH baixo e temperatura elevada é particularmente vantajoso. Especificamente, a capacidade de um microrganismo para tolerar pH baixo obvia a necessidade de manter um ambiente com pH neutro, o que pode ser dificil e dispendioso durante processos de produção em grande escala. Adicionalmente, os 4 PE 1183385 métodos e materiais necessários para recuperar o produto orgânico desejado a partir de um caldo de pH baixo podem ser mais práticos e eficientes que os necessários para recuperar o mesmo produto orgânico a partir de um caldo possuindo um pH mais neutro. Por exemplo, certos produtos orgânicos podem precipitar da solução à medida que o pH cai abaixo do valor de pKa do produto, tornando a recuperação bastante simples. Mais, a capacidade de um microrganismo para tolerar temperaturas elevadas obvia a necessidade manter temperaturas baixas durante as fase de crescimento e de produção. Claramente, a redução da necessidade de baixar a temperatura num tanque de grande volume de caldo durante um processo de produção em grande escala torna todo o processo mais eficaz e menos dispendioso. Para além disso, a capacidade de um microrganismo para tolerar um pH baixo e uma temperatura elevada proporciona um método conveniente para prevenir contaminação por outros microrganismos menos tolerantes durante os processos de produção em grande escala. É importante observar que um aspecto critico relacionado com a capacidade de produzir um produto orgânico desejado para fins comerciais pode ser a produtividade especifica à qual é produzido o produto orgânico desejado. Por exemplo, o proporcionar uma produtividade especifica elevada utilizando os métodos e materiais daqui pode permitir que um microrganismo gere a energia necessária para a manutenção celular quando exposto a condições de cultura tais como pH baixo e temperatura elevada. Esta 5 PE 1183385 energia necessária pode ser gerada através de uma via de fermentação sob condições substancialmente anaeróbicas, em vez de assentar na geração de energia através da via respiratória. A obtenção de energia através de uma via de fermentação é particularmente vantajosa quando se produz um produto orgânico que não requer a via respiratória uma vez que essencialmente toda a fonte de carbono proporcionada pode ser utilizada para produzir o produto orgânico desej ado. 0 invento baseia-se também na descoberta de que a utilização de uma fonte de carbono por certos microrganismos geneticamente manipulados pode ser controlada e dirigida predominantemente em direcção à produção de biomassa ou de um produto orgânico desejado. Em termos gerais, o invento envolve dois tipos de processos de cultura. Um processo de cultura envolve a cultura de microrganismos sob condições de cultura especificas, dependendo do microrganismo e do resultado desejado, que promovam a produção de biomassa, enquanto que o outro envolve um conjunto diferente de condições de cultura, também dependentes do microrganismo e do resultado desejado, que promovam a produção de um produto orgânico desejado. Claramente, possuir a capacidade para manipular a utilização de uma fonte de carbono durante processos de produção em grande escala proporciona aos fabricantes maior flexibilidade e mais controlo do que seria possível de outro modo.

Adicionalmente, o invento baseia-se na descoberta 6 PE 1183385 de que certos microrganismos podem ser geneticamente manipulados para que a maior parte, se não toda, a fonte de carbono seja utilizada para a produção de biomassa ou de um produto orgânico desejado. Especificamente, o invento proporciona células de levedura que são modificadas para que as vias de biossíntese que desviam a utilização de uma fonte de carbono da produção de biomassa ou do produto orgânico desejado sejam inactivadas. A inactivação de tais vias de biossíntese proporciona microrganismos que podem crescer eficientemente e produzir o produto desejado.

Em geral, o invento apresenta uma célula de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena, com a molécula de ácido nucleico exógena a codificar um poli-péptido possuindo actividade enzimática dentro da célula. 0 ácido nucleico pode ser incorporado no genoma da célula. A actividade enzimática conduz à formação de um produto orgânico que, nalgumas concretizações, é secretado pela célula. A célula possui ainda um fenótipo negativo para Crabtree e produz o produto orgânico. A célula pode ser, por exemplo, do género Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon ou Yamadazyma. 0 produto orgânico pode ser, por exemplo, um produto de fermentação, um produto derivado de piruvato, um ácido orgânico ou um carbo-xilato tal como lactato. Numa concretização, o polipéptido pode ter actividade de lactato-desidrogenase. Por exemplo, o ácido nucleico exógeno pode codificar uma lactato-desidrogenase bacteriana ou uma lactato-desidrogenase fúngica tal como a lactato-desidrogenase fúngica de K. lactis. 7 PE 1183385

Noutra concretização, a célula contém quatro moléculas de ácido nucleico exógenas, cada uma das quatro moléculas de ácido nucleico exógenas codificando um polipéptido diferente. Por exemplo, a primeira das quatro moléculas de ácido nucleico exógenas pode codificar um primeiro polipéptido possuindo actividade de lactato-desidrogenase, a segunda pode codificar um segundo polipéptido possuindo actividade de CoA-transferase, a terceira pode codificar um terceiro polipéptido possuindo actividade de lactil-CoA-desidratase e a quarta pode codificar um quarto polipéptido possuindo actividade de acrilil-CoA-hidratase. Uma tal célula pode possuir acrilato como produto carboxilato. Alternativamente, a primeira das quatro moléculas de ácido nucleico exógenas pode codificar um primeiro polipéptido possuindo actividade de 2-desidro-3-desoxi-D-pentanoato-aldolase, a segunda pode codificar um segundo polipéptido possuindo actividade de xilonato-desidratase, a terceira pode codificar um terceiro polipéptido possuindo actividade de xilonolactonase e a quarta pode codificar um quarto polipéptido possuindo actividade de D-xilose-desidrogenase. Uma tal célula pode produzir um hidrato de carbono, tal como D-xilose, como produto orgânico.

Ainda noutra concretização, a célula contém seis moléculas de ácido nucleico exógenas, cada uma das seis moléculas de ácido nucleico exógenas codificando um polipéptido diferente. Por exemplo, a primeira das seis PE 1183385 moléculas de ácido nucleico exógenas pode codificar um primeiro polipéptido possuindo actividade de 2,5-dioxovalerato-desidrogenase, a segunda pode codificar um segundo polipéptido possuindo actividade de 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato-desidrogenase, a terceira pode codificar um terceiro polipéptido possuindo actividade de glucarato-desidratase, a quarta pode codificar um quarto polipéptido possuindo actividade de aldeido-desidrogenase, a quinta pode codificar um quinto polipéptido possuindo actividade de glucuronolactona-redutase e a sexta pode codificar um sexto polipéptido possuindo actividade de L-gulonolactona-oxidase. Uma tal célula pode possuir uma vitamina, por exemplo L-ascorbato, como produto orgânico. 0 produto orgânico pode conter mais de três átomos de carbono e pode ser, por exemplo, um aminoácido.

Noutra concretização, a célula é capaz de catabolizar um hidrato de carbono pentose tal como ribose, arabinose, xilose e lixose.

Noutra concretização a célula tem actividade de piruvato-descarboxilase reduzida ou actividade de álcool-desidrogenase reduzida. Por exemplo, a célula pode não ter nenhuma actividade de piruvato-descarboxilase. A actividade de piruvato-descarboxilase reduzida pode ser devida a um locus genético destruído, em que o locus tem normalmente a sequência de ácido nucleico que codifica a piruvato-descarboxilase. Alternativamente, a célula pode conter uma 9 PE 1183385 molécula anti-sentido, tal como uma ribozima, que corresponda a uma sequência de ácido nucleico endógena, em que a molécula anti-sentido reduz a actividade de piruvato-descarboxilase. A célula pode também conter uma molécula de ácido nucleico exógena adicional que funcione como plasmideo assassino.

Noutra concretização, a actividade enzimática do polipéptido codificado pelo ácido nucleico exógeno leva à formação do produto orgânico de um modo consumidor de NADH.

Noutra concretização, a célula produz pelo menos cerca de 60 gramas do produto orgânico por cada 100 gramas de glicose consumida quando a célula é cultivada sob condições óptimas para a produção do produto orgânico.

Noutro aspecto, o invento apresenta uma célula, p. ex., uma célula de levedura, que contém uma molécula de ácido nucleico exógena, onde a molécula de ácido nucleico exógena codifica um polipéptido que promove o catabolismo de um hidrato de carbono pentose pela célula. O polipéptido pode ser, por exemplo, xilose-redutase, xilitol- desidrogenase ou xilulocinase , e o hidrato de carbono pentose pode ser, por exemplo, ribose, arabinose, xilose e lixose. A célula pode ainda catabolizar um hidrato de carbono hexose e pode, se desejado, catabolizar simultaneamente o hidrato de carbono hexose e o hidrato de carbono pentose. O hidrato de carbono hexose pode ser, por exemplo, alose, altrose, glicose, manose, gulose, iodose, frutose, galactose e talose. 10 PE 1183385

Noutro aspecto, o invento apresenta uma célula de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena, em que a molécula de ácido nucleico exógena codifica um polipéptido que promove a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. O polipéptido pode ser um polipéptido que tem actividade de citrato-liase ou pode ser um polipéptido da membrana mitocondrial que promove a permeabilidade de acetil-CoA através da membrana mitocondrial. A célula pode ter actividade de piruvato-descarboxilase reduzida ou actividade de álcool-desidrogenase reduzida. Alternativamente, a célula de levedura pode não ter produção de etanol e pode ter uma taxa de crescimento sob condições de cultura sem etanol e acetato que é maior que a taxa de crescimento observada para uma célula de levedura comparável sem produção de etanol.

Noutro aspecto, o invento apresenta uma célula de levedura possuindo actividade reduzida de um polipéptido mitocondrial, em que a célula tem um fenótipo negativo para Crabtree. Uma tal célula pode ser, por exemplo, do género Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon ou Yamadazyma. A célula pode não ter de todo a actividade. A célula pode conter um locus destruído, em que o locus inclui normalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica o polipéptido mitocondrial. O polipéptido mitocondrial pode ser uma enzima do ciclo de Krebs. Mais, a célula pode acumular um produto do ciclo de Krebs. A célula 11 PE 1183385 pode incluir uma molécula de ácido nucleico exógena, em que a molécula de ácido nucleico exógena codifica um polipéptido possuindo actividade enzimática dentro da célula, com a actividade enzimática a levar à formação de um produto orgânico, para que a célula produza o produto orgânico. 0 produto orgânico pode ser, por exemplo, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato. 0 polipéptido pode ser um polipéptido que participe no catabolismo de lactato ou acetato.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para produzir um produto orgânico. 0 método inclui proporcionar células de levedura, em que as células incluem uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido possuindo actividade enzimática dentro das células, onde a actividade enzimática leva à formação do produto orgânico e onde as células têm um fenótipo negativo para Crabtree, e cultura das células com meio de cultura para que o produto orgânico seja produzido. As células de levedura podem ser do género Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon ou Yamadazyma. 0 produto orgânico pode ser um produto de fermentação, um produto derivado de piruvato, um produto orgânico contendo mais de três átomos de carbono, um carboxilato, um hidrato de carbono, um aminoácido, uma vitamina ou um produto lipí-dico. 0 produto orgânico pode ainda ser lactato, glicerol, acrilato, xilose, ascorbato, citrato, isocitrato, a-ceto-glutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato ou oxaloacetato. Nalgumas concretizações, o produto orgânico é 12 PE 1183385 secretado pelas células. O método pode resultar em células possuindo reduzida actividade de piruvato-descarboxilase ou reduzida actividade de álcool-desidrogenase. A actividade enzimática pode levar à formação do produto orgânico de um modo consumidor de NADH.

As células produzidas através destes métodos podem produzir pelo menos cerca de 60 gramas do produto orgânico por cada 100 gramas de glicose consumida quando o passo de cultura é óptimo para a produção do produto orgânico. O meio de cultura, que pode ser líquido, pode incluir um inibidor da respiração celular, tal como antimicina A, cianeto ou azida. O passo de cultura pode incluir o crescimento das células sob condições de crescimento aeróbicas seguido do contacto das referidas células com um inibidor da respiração celular.

Numa concretização alternativa, o passo de cultura inclui a incubação das células sob condições de cultura anaeróbicas. Noutra concretização alternativa, o passo de cultura inclui o crescimento das células sob condições de crescimento aeróbicas seguido de incubação das células sob condições de cultura anaeróbicas. O passo de cultura pode também incluir a cultura das células a uma temperatura superior a cerca de 35°C.

Numa concretização, o meio de cultura tem um valor de pH orgânico inferior a cerca de 3,0 e/ou um valor de pH inorgânico inferior a cerca de 3,0. Noutra concre- 13 PE 1183385 tização, o meio contém um hidrato de carbono pentose tal como ribose, arabinose, xilose ou lixose. 0 meio pode também incluir um hidrolisado de fibra de milho possuindo, por exemplo, um valor de pH entre cerca de 2,0 e cerca de 6, 5.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para produção de um produto orgânico, incluindo o método a) proporcionar células de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena codificando um polipéptido que promova o catabolismo de um hidrato de carbono pentose pela célula, em que a célula contém uma actividade enzimática que leva à formação do referido produto orgânico, e b) cultura das células com meio de cultura para que o produto orgânico seja produzido.

Ainda noutro aspecto, o invento apresenta um método para a produção de um produto orgânico, incluindo o método a) proporcionar células de levedura, em que as célula incluem uma molécula de ácido nucleico exógena codificando um polipéptido que promove a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula e em que a célula contém uma actividade enzimática que leva à formação do produto orgânico e b) cultura das células com meio de cultura para que o produto orgânico seja produzido.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para a produção de um produto orgânico, incluindo o método a) proporcionar células de levedura possuindo actividade 14 PE 1183385 reduzida de uma enzima mitocondrial, em que a redução da actividade leva à acumulação do produto orgânico, e b) cultura das referidas células com meio de cultura para que o referido produto orgânico seja produzido.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para cultura de células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, incluindo o método a cultura das células com meio de cultura, em que o meio de cultura tem um valor de pH orgânico inferior a cerca de 3,0 e/ou um valor de pH inorgânico inferior a cerca de 3,0. O passo de cultura pode incluir a cultura das células a uma temperatura superior a cerca de 35°C. O meio de cultura pode incluir um inibidor da respiração celular. O meio de cultura pode também incluir um hidrato de carbono pentose. Noutra concretização, o meio de cultura pode incluir um hidrolisado de fibra de milho.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para cultura de células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, incluindo o método a cultura das células com meio de cultura, em que o meio de cultura inclui um hidrolisado de fibra de milho.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para cultura de células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, incluindo o método a cultura das células com meio de cultura a uma temperatura superior a cerca de 35°C, com o meio de cultura possuindo um valor de pH inorgânico inferior a cerca de 3,0. 15 PE 1183385

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para cultura de células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, incluindo o método a cultura das células com meio de cultura a uma temperatura superior a cerca de 35°C, com o meio de cultura incluindo um hidrato de carbono pentose.

Noutro aspecto, o invento proporciona um método para cultura de células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, incluindo o método a cultura das células com meio de cultura a uma temperatura superior a cerca de 35°C, com o meio de cultura incluindo um hidrolisado de fibra de milho.

Noutro aspecto, o invento apresenta uma construção de ácido nucleico gue inclui uma seguência de recombinação e uma sequência seleccionada, com a sequência de recombinação correspondendo a uma sequência genómica de uma célula possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, com a sequência genómica codificando uma enzima expressa pela célula e com a sequência seleccionada codificando uma enzima que leva à formação de um produto orgânico dentro da célula. A sequência seleccionada pode estar dentro da sequência de recombinação para que a sequência seleccionada esteja flanqueada em cada extremidade pela sequência de recombinação.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método 16 PE 1183385 para a produção de uma célula de levedura recombinante, incluindo o proporcionar uma célula de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree, a selecção de um produto final, a identificação de que enzima ou enzimas exógenas é necessário adicionar à célula para produzir o produto final, a identificação de que enzima ou enzimas endógenas cuja actividade deve ser reduzida na referida célula para permitir a produção do referido produto final dentro da referida célula, a adição à célula de levedura proporcionada da enzima ou enzimas exógenas identificadas, e a redução da actividade da enzima ou enzimas endógenas identificadas na célula de levedura proporcionada para que a célula produza o produto final sob condições de cultura.

Noutro aspecto, o invento proporciona um hidro-lisado de fibra de milho, possuindo o hidrolisado um valor de pH entre cerca de 2,0 e cerca de 6,5. O hidrolisado pode incluir glicose, xilose e arabinose. O hidrolisado pode incluir cerca de 40 gramas/1 de glicose, cerca de 40 gramas/1 de xilose e cerca de 20 gramas/1 de arabinose. Alternativamente, o hidrolisado pode incluir cerca de 38,7 gramas/1 de glicose, cerca de 39,1 gramas/1 de xilose e cerca de 20,7 gramas/1 de arabinose, e cerca de 1,6 gramas/1 de furfural.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para produzir um produto orgânico, incluindo a) cultura de um microrganismo sob condições de cultura, em que o microrganismo possui uma actividade enzimática reduzida/ a 17 PE 1183385 actividade enzimática pode ser actividade de piruvato-descarboxilase, álcool-desidrogenase, aldeído-desidrogenase ou acetil-CoA-sintetase; o microrganismo exibe uma taxa de crescimento na ausência de etanol e acetato que é pelo menos cerca de 30 porcento da observada para um microrganismo correspondente que não possua a referida actividade enzimática reduzida e b) mudança das condições de cultura para promover a produção do produto orgânico.

Noutro aspecto, o invento apresenta um método para produzir um produto orgânico, incluindo a) cultura de um microrganismo sob condições de cultura que promovam a respiração celular, em que o microrganismo tem uma actividade enzimática reduzida; a actividade enzimática pode ser de piruvato-descarboxilase, álcool-desidrogenase, aldeido-desidrogenase ou acetil-CoA-sintetase; com o microrganismo exibindo uma taxa de crescimento na ausência de etanol e acetato que é pelo menos cerca de 30 porcento da observada para um microrganismo correspondente que não possua tal actividade enzimática reduzida e b) mudança das condições de cultura para reduzir a respiração celular, promovendo deste modo a produção do produto orgânico. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é vulgarmente entendido por um perito na técnica a que este invento se refere. Embora métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou em testes do presente 18 PE 1183385 invento, estão descritos abaixo métodos e materiais adequados. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas são incorporadas por referência na sua totalidade. Em caso de conflito, o presente fascículo, incluindo as definições, controlará. Adicionalmente, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos não se pretende que sejam limitantes.

Outras características e vantagens do invento serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e a partir das reivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama representando o plas-mídeo pHES. A Figura 2 é um diagrama representando o plas-mídeo pSEH. A Figura 3 é um diagrama representando a criação de plasmídeos pCRII contendo Lh-ldh ou Pa-ldh. A Figura 4 é um diagrama representando os plasmídeos ldh/pCRII. A Figura 5 é um diagrama representando a criação de plasmídeos pHES contendo Lh-ldh ou Pa-ldh. 19 PE 1183385 A Figura 6a é um diagrama representando a criação do fragmento "knock-out" da piruvato-descarboxilase (PDC). A Figura 6b é um diagrama representando o fragmento de 5,5 kpb que circunda PDC1 de 1,7 kpb de K. marxianus. A Figura 6c é um diagrama representando a deleção de 400 pb da região homóloga de PDC de 5,5 kpb e a inserção de um gene para resistência à canamicina. A Figura 6d é um diagrama representando a região de 4 kpb contendo o gene de resistência à canamicina e os 2,3 kpb circundantes do PDC1. A Figura 6e é um diagrama representando o PDC1 de 7,5 kpb de K. thermotolerans e a região circundante. A Figura 6f é um diagrama representando a deleção de 750 pb do gene de PDC1 de 1,7 kpb e a inserção do gene de resistência à canamicina. A Figura 7 é um gráfico do crescimento (densidade óptica; DO) versus tempo (horas) para Kluyveromyces marxianus cultivada sob condições de pH baixo (pH 2,5) e temperatura elevada (40°C). A Figura 8 é um gráfico do crescimento (DO) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivada com glicose, xilose ou arabinose a 30°C. 20 PE 1183385 A Figura 9 é um gráfico do crescimento (DO) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivada com um hidrolisado de fibra de milho a 30°C. A Figura 10 é um gráfico do crescimento (DO) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivada a 30°C e ao pH indicado. A Figura 11 é um gráfico do crescimento (DO) versus tempo (horas) para K. marxianus cultivada a 30°C e ao pH indicado na presença de 40 gramas de ácido láctico. A Figura 12 mostra três gráficos (A) da produção de biomassa; (B) do consumo de glicose; e (C) da produção de etanol de S. uvarum e de K. marxianus quando cultivadas em meio mineral com glicose a 2% sob condições aeróbicas. A Figura 13 mostra três gráficos (A) da produção de biomassa; (B) do consumo de glicose; e (C) da produção de etanol de S. uvarum e de K. marxianus quando cultivadas em meio mineral com glicose a 2% sob condições anaeróbicas. A Figura 14 é um mapa plasmidico do vector de promotor de PDC1.

DESCRIÇÃO DETALHADA O invento proporciona métodos e materiais relacionados com a produção de produtos orgânicos. Especi- 21 PE 1183385 ficamente, o invento proporciona células de levedura, métodos para cultura de células de levedura, métodos para produção de células de levedura, construções de ácido nucleico, e métodos e materiais para produção de vários produtos orgânicos.

As células de levedura aqui proporcionadas podem ser utilizadas para produzir produtos orgânicos. Tais produtos orgânicos podem ser utilizados numa ampla variedade de aplicações. Por exemplo, os produtos orgânicos produzidos pelas células de levedura aqui descritas podem ser utilizados como conservantes ou aditivos em produtos alimentares, farmacêuticos ou cosméticos, e podem ser utilizados para fazer plásticos bem como outros produtos.

Para os fins deste invento, um produto orgânico é qualquer composto contendo um átomo de carbono. Por exemplo, carboxilatos (p. ex., lactato, acrilato, citrato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato), hidratos de carbono (p. ex., D-xilose), alditóis (p. ex., xilitol, arabitol, ribitol), aminoácidos (p. ex., glicina, triptofano, glutamato), lipidos, ésteres, vitaminas (p. ex., L-ascorbato), polióis (p. ex., glicerol, 1,3-propanodiol, eritritol), aldeídos, alcenos, alcinos e cetonas são produtos orgânicos. Assim, um produto orgânico pode conter um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais átomos de carbono. Adicionalmente, os produtos orgânicos podem ter um peso molecular que seja inferior a cerca de 1000 (p. ex., menos de cerca de 900, 22 PE 1183385 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200 ou 100) . Por exemplo, D-xilose (C5H10O5) é um produto orgânico que tem um peso molecular de 150. Mais, os produtos orgânicos podem ser produtos de fermentação. O termo "produto de fermentação" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer composto orgânico que seja produzido através de um processo de fermentação. Em termos gerais, um processo de fermentação envolve a conversão enzimática anaeróbica de compostos orgânicos tais como hidratos de carbono em compostos tais como álcool etílico, resultando em energia na forma de adenosina-trifosfato (ATP). Assim, a fermentação difere da respiração celular por serem utilizados produtos orgânicos em vez de oxigénio molecular como aceitadores de electrões. Exemplos de produtos de fermentação incluem, sem limitação, acetato, etanol, butirato e lactato.

Os produtos orgânicos podem também ser produtos derivados de piruvato. O termo "produto derivado de piruvato" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer composto que seja sintetizado a partir de piruvato dentro de não mais de quinze passos enzimáticos. Um passo enzimático é qualquer reacção química ou série de reacções catalisadas por um polipéptido possuindo actividade enzimática. O termo "polipéptido possuindo actividade enzimática" tal como aqui se utiliza refere-se a qualquer polipéptido que catalize uma reacção química de outras substâncias sem que ele próprio seja destruído ou alterado após o termo da reacção ou reacções. Tipicamente, um polipéptido enzimático cataliza a formação de um ou mais 23 PE 1183385 produtos a partir de um ou mais substratos. Tais poli-péptidos podem ter qualquer tipo de actividade enzimática incluindo, sem limitação, a actividade enzimática associada a uma enzima tal como aconitase, isocitrato-desidrogenase, cetoglutarato-desidrogenase, succinato-tiocinase, succi-nato-desidrogenase, fumarase, malato-desidrogenase, citra-to-sintetase, 2,5-dioxovalerato-desidrogenase, 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato-desidrogenase, glucarato-desidratase, aldeído-desidrogenase, glucuronolactona-redutase, L-gulo-nolactona-oxidase, 2-desidro-3-desoxi-D-pentanoato-aldo-lase, xilonato-desidratase, xilonolactonase, D-xilose-desi-drogenase, lactato-desidrogenase, CoA-transferase, lactil-CoA-desidratase ou acrilil-CoA-hidratase. É importante observar que um polipéptido possuindo uma determinada actividade enzimática pode ser um polipéptido que seja de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Um polipéptido de ocorrência natural é qualquer polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos tal como verificada na natureza, incluindo polipéptidos de tipo selvagem e polimórficos. Tais polipéptidos de ocorrência natural podem ser obtidos a partir de quaisquer espécie incluindo, sem limitação, espécies de mamífero, fungos e bactérias. Um polipéptido de ocorrência não natural é qualquer polipéptido possuindo uma sequência de aminoácidos que não se verifica na natureza. Assim, um polipéptido de ocorrência não natural pode ser uma versão mutada de um polipéptido de ocorrência natural ou um polipéptido desenhado. Por exemplo, um polipéptido de 24 PE 1183385 ocorrência não natural possuindo actividade de citrato-sintetase pode ser uma versão mutada de um polipéptido de ocorrência natural possuindo actividade de citrato-sintetase que mantém pelo menos alguma actividade de citrato-sintetase. Um polipéptido pode ser mutado, por exemplo, através de adições, deleções e/ou substituições de sequências.

Um produto orgânico não é um produto derivado de piruvato se esse produto for sintetizado a partir de piruvato requerendo mais de quinze passos enzimáticos. Exemplos de produtos derivados de piruvato incluem, sem limitação, citrato, α-cetoglutarato, succinato, fumarato, malato, oxaloacetato, 2-desidro-3-desoxi-D-xilonato, D-xilonato, D-xilonolactona, D-xilose, acrilato, acetato, etanol, butirato e lactato.

Para os fins deste invento, os produtos carbo-xilato, que podem estar na forma de "ácido livre" ou "sal", serão referidos utilizando a nomenclatura da forma salina. Por exemplo, o ácido láctico será referido como lactato. Assim, neste caso, será apreciado que o termo "lactato" inclui ácido láctico bem como lactato. 0 termo "ácido nucleico" tal como aqui se utiliza engloba tanto ARN como ADN, incluindo ADNc, ADN genómico e ADN sintético (p. ex., quimicamente sintetizado). O ácido nucleico pode ser de cadeia dupla ou de cadeia simples. Quando de cadeia simples, o ácido nucleico pode ser a 25 PE 1183385 cadeia com sentido ou a cadeia anti-sentido. Adicionalmente, o ácido nucleico pode ser circular ou linear. 0 termo "exógeno" tal como aqui se utiliza em relação a uma molécula de ácido nucleico e uma determinada célula refere-se a qualquer molécula de ácido nucleico que não tenha origem nessa célula em particular tal como se verifica na natureza. Assim, todas as moléculas de ácido nucleico de ocorrência não natural são consideradas como exógenas a uma célula uma vez introduzidas na célula. É importante observar que as moléculas de ácido nucleico de ocorrência não natural podem conter sequências de ácido nucleico ou fragmentos de sequências de ácido nucleico que se verifiquem na natureza desde que a molécula de ácido nucleico como um todo não exista na natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico contendo uma sequência de ADN genómico dentro de um vector de expressão é considerada como uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural e é assim considerada como exógena a uma célula uma vez introduzida na célula, uma vez que a molécula de ácido nucleico como um todo (ADN genómico mais ADN do vector) não existe na natureza. Assim, qualquer vector, plasmideo de replicação autónoma, ou virus (p. ex., retrovirus, adenovirus ou herpesvirus) que como um todo não exista na natureza é considerado ser uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural. Segue-se que fragmentos de ADN genómico produzidos por PCR ou por tratamento com endonucleases de restrição bem como ADNc são considerados como moléculas de ácido nucleico de ocorrência não natural 26 PE 1183385 uma vez que existem como moléculas separadas que não se encontram na natureza. Seque-se também que qualquer molécula de ácido nucleico contendo uma sequência promotora e uma sequência codificando um polipéptido (p. ex., ADNc ou ADN qenómico) num arranjo não verificado na natureza é considerada como uma molécula de ácido nucleico de ocorrência não natural. 0 termo "endógeno" refere-se a material genómico que não é exógeno. Geralmente, o material genómico endógeno desenvolve-se dentro de um organismo, tecido ou célula e não é inserido nem modificado através de tecnologia recombinante. 0 material genómico endógeno inclui dentro do seu âmbito variações de ocorrência natural. É também importante observar que uma molécula de ácido nucleico que seja de ocorrência natural pode ser exógena para uma determinada célula. Por exemplo, um cromossoma inteiro isolado a partir de uma célula da pessoa X seria considerado uma molécula de ácido nucleico exógena em relação a uma célula da pessoa Y uma vez que o cromossoma é introduzido na célula de Y.

Tal como aqui se utiliza, a frase "geneticamente modificado" refere-se a um organismo cujo genoma foi modificado, por exemplo, através de adição, substituição ou deleção de material genético. Os métodos para adicionar ou suprimir material genético são conhecidos e incluem, mas não se limitam a, mutagénese aleatória, mutações pontuais, 27 PE 1183385 incluindo inserções, deleções e substituições, tecnologia de "knock-out" e transformação de um organismo com uma sequência de ácido nucleico utilizando tecnologia recom-binante, incluindo transformantes estáveis e transientes. As células de levedura podem também catabolizar amido, naturalmente ou devido a uma modificação genética, e podem mesmo ser geneticamente modificadas para catabolizar celulose através da adição, por exemplo, de celulases baseadas em fungos. 1. Células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree 0 invento proporciona uma variedade de células de levedura geneticamente manipuladas que possuem um fenótipo negativo para Crabtree. Tais células de levedura recombi-nantes podem ser utilizadas para produzir produtos orgânicos. Por exemplo, o invento proporciona uma célula de levedura que possui um fenótipo negativo para Crabtree e contém uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido possuindo actividade enzimática que leva à formação de um produto orgânico. Tais células de levedura estão dentro do âmbito do invento desde que produzam o produto orgânico. É de notar que o produto orgânico produzido pode ser secretado pela célula de levedura, eliminando a necessidade de romper a membrana celular para recuperar o produto orgânico. Tipicamente, as células de levedura do invento produzem o produto orgânico com um rendimento de pelo menos 40 gramas (p. ex., pelo menos 28 PE 1183385 cerca de 45, 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95 gramas) de produto orgânico por cada 100 gramas de glicose consumida quando cultivadas sob condições óptimas para a produção do produto. Quando se determina o rendimento da produção de produto orgânico para uma determinada célula de levedura, pode ser utilizado um método qualquer. Ver, p. ex., Kiers et ai., Yeast 14(5): 459-469, 1998. É também de notar que a actividade enzimática do polipéptido codificado pode levar à formação do produto orgânico de um modo consumidor de NADH. Por outras palavras, a produção do composto orgânico pode requerer NADH como fonte energética. O termo "NAD" refere-se aos co-factores que actuam como transportadores de electrões e hidrogénio em determinadas reacções de oxidação-redução, enquanto que o termo "NADH" se refere à forma reduzida de NAD. Exemplos de produtos orgânicos cuja sintese requer NADH incluem, sem limitação, lactato, etanol, acetato e acrilato. Tipicamente, as células de levedura dentro âmbito do invento catabolizam um hidrato de carbono hexose tal como glicose. No entanto, as células de levedura podem também catabolizar um hidrato de carbono pentose (p. ex., ribose, arabinose, xilose e lixose). Por outras palavras, uma célula de levedura dentro do âmbito do invento pode naturalmente utilizar um hidrato de carbono pentose ou pode ser modificada para utilizar um hidrato de carbono pentose. Por exemplo, pode ser dada a uma célula de levedura uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique xilose-redutase, xilitol-desidrogenase e/ou xilulocinase para que a xilose possa ser catabolizada. As células de levedura podem também 29 PE 1183385 catabolizar amido, naturalmente ou devido a uma modificação genética, e podem até ser geneticamente modificadas para catabolizar celulose através da adição, por exemplo, de celulases baseadas em fungos.

Uma célula de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree é qualquer célula de levedura que não exiba o efeito de Crabtree. 0 termo "negativo para Crabtree" refere-se tanto a organismos de ocorrência natural como geneticamente modificados. Resumidamente, o efeito de Crabtree é definido como a inibição do consumo de oxigénio por um microrganismo quando cultivado sob condições aeróbicas devido à presença de uma elevada concentração de glicose (p. ex., 50 gramas de glicose/1). Por outras palavras, uma célula de levedura possuindo um fenótipo positivo para Crabtree continua a fermentar independentemente da disponibilidade de oxigénio devido à presença de glicose, enquanto que uma célula de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree não exibe inibição mediada por glicose do consumo de oxigénio. Exemplos de células de levedura possuindo tipicamente um fenótipo negativo para Crabtree incluem, sem limitação, células de levedura dos seguintes géneros: Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon e Yamadazyma.

Tal como aqui descrito, o invento proporciona muitos tipos diferentes de células de levedura recombinantes capazes de produzir uma ampla variedade de diferentes 30 PE 1183385 produtos orgânicos. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido possuindo actividade de lactato-desidrogenase para que seja produzido lactato. Exemplos de um tal polipéptido incluem, sem limitação, a lactato-desidrogenase bovina, lactato-desidrogenase bacteriana e lactato-desidrogenase fúngica (p. ex., a lactato-desidrogenase fúngica de K. lactis ou K. thermotolerans). Novamente, os polipéptidos possuindo actividade enzimática tal como uma actividade de lactato-desidrogenase podem ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. É importante observar que as células de levedura aqui descritas podem conter uma única cópia ou múltiplas cópias (p. ex., cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ou 150 cópias) de uma determinada molécula de ácido nucleico exógena. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter cerca de 50 cópias da molécula de ácido nucleico exógena X. É também importante observar que as células de levedura aqui descritas podem conter mais de uma determinada molécula de ácido nucleico exógena. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter cerca de 50 cópias da molécula de ácido nucleico exógena X bem como cerca de 75 cópias da molécula de ácido nucleico exógena Y. Nestes casos, cada molécula de ácido nucleico diferente codifica um polipéptido diferente possuindo a sua própria actividade enzimática única. Por exemplo, uma célula de levedura pode conter quatro moléculas de ácido nucleico exógenas diferentes para que seja produzido acrilato. Neste exemplo, uma 31 PE 1183385 tal célula de levedura pode conter uma primeira molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido possuindo actividade de lactato-desidrogenase, uma segunda que codifica um polipéptido possuindo actividade de CoA-transferase, uma terceira que codifica um polipéptido possuindo actividade de lactil-CoA-desidratase e uma quarta que codifica um polipéptido possuindo actividade de acrilil-CoA-hidratase. Noutro exemplo, uma célula de levedura pode conter quatro moléculas de ácido nucleico exógenas diferentes para que seja produzida D-xilose. Especificamente, uma tal célula de levedura pode conter uma primeira molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma polipéptido possuindo actividade de 2-desidro-3-desoxi-D-pentanoato-aldolase, uma segunda que codifica um polipéptido possuindo actividade de xilonato-desidratase, uma terceira que codifica um polipéptido possuindo actividade de xilonolactonase e uma quarta que codifica um polipéptido possuindo actividade de D-xilose-desidrogenase. Ainda noutro exemplo, uma célula de levedura pode conter seis moléculas de ácido nucleico exógenas diferentes para que seja produzida a vitamina L-ascorbato. Especificamente, uma tal célula de levedura pode conter uma primeira molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido possuindo actividade de 2,5-dioxovalerato-desidrogenase, uma segunda que codifica um polipéptido possuindo actividade de 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato-desidrogenase, uma terceira que codifica um polipéptido possuindo actividade de glucarato-desidratase, uma quarta que codifica um polipéptido possuindo actividade de aldeido-desidrogenase, uma 32 PE 1183385 quinta que codifica um polipéptido possuindo actividade de glucuronolactona-redutase e uma sexta que codifica um polipéptido possuindo actividade de L-gulonolactona-oxidase. É importante observar que os polipéptidos enzi-máticos podem ser utilizados para que o produto orgânico desejado seja opticamente puro (p. ex., cerca de 90, 95, 99% puro) . Por exemplo, pode ser utilizado um polipéptido possuindo uma actividade de (L)-lactato-desidrogenase para produzir (L)-lactato.

As células de levedura dentro do âmbito do invento podem também ter actividade enzimática reduzida tal como uma actividade de piruvato-descarboxilase e/ou álcool-desidrogenase reduzida. O termo "reduzida" tal como aqui se utiliza em relação a uma célula e a uma determinada actividade enzimática refere-se a um nivel de actividade enzimática inferior ao medido numa célula de levedura comparável da mesma espécie. Assim, uma célula de levedura sem actividade de piruvato-descarboxilase é considerada como tendo uma actividade de piruvato-descarboxilase reduzida uma vez que a maior parte, se não todas as células de levedura comparáveis têm pelo menos alguma actividade de piruvato-descarboxilase. Tais actividades enzimáticas reduzidas podem ser resultado de uma menor concentração da enzima, menor actividade especifica de uma enzima ou combinações destas. Muitos métodos diferentes podem ser utilizados para produzir uma célula de levedura possuindo uma actividade enzimática reduzida. Por exemplo, uma célula 33 PE 1183385 de levedura pode ser modificada para ter um locus codificando uma enzima destruido utilizando mutagénese vulgar ou tecnologia de "knock-out". Ver, p. ex., "Methods in Yeast Genetics" (edição de 1997), Adams, Gottschling, Kaiser e Sterns, Cold Spring Harbor Press (1998). Alternativamente, pode ser utilizada tecnologia anti-sentido para reduzir a actividade enzimática. Por exemplo, uma célula de levedura pode ser modificada para conter um ADNc que codifique uma molécula anti-sentido que impeça que a enzima seja produzida. 0 termo "molécula anti-sentido" tal como aqui se utiliza, engloba qualquer molécula de ácido nucleico que contenha sequências que correspondam à cadeia de codificação de um polipéptido endógeno. Uma molécula anti-sentido pode também ter sequências flanquea-doras (p. ex., sequências reguladoras). Assim, as moléculas anti-sentido podem ser ribozimas ou oligonucleótidos anti-sentido. Uma ribozima pode ter uma estrutura geral qualquer, incluindo sem limitação, estruturas em alfinete, cabeça de martelo ou cabeça de machado, desde que a molécula clive ARN.

As células de levedura possuindo uma actividade enzimática reduzida podem ser identificadas utilizando qualquer método. Por exemplo, uma célula de levedura possuindo uma actividade de piruvato-descarboxilase reduzida pode ser facilmente identificada utilizando métodos vulgares. Ver, p. ex., Ulbrich, Methods in Enzymology 18: 109-115, 1970. 34 PE 1183385 2. Células de levedura possuindo um fenótipo positivo para Crabtree ou negativo para Crabtree 0 invento proporciona também uma variedade de células de levedura geneticamente manipuladas que não necessitam de ter um fenótipo negativo para Crabtree, i.e., tais células podem ser positivas para Crabtree ou negativas para Crabtree. Tais células de levedura recombinantes podem ser utilizadas para produzir produtos orgânicos. Por exemplo, o invento proporciona uma célula de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido que promove o catabolismo de um hidrato de carbono pentose (p. ex., ribose, arabinose, xilose e lixose) pela célula. Especificamente, uma célula de levedura pode ter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica xilose-redutase, xilitol-desidrogenase e/ou xilulocinase de forma que a xilose possa ser catabolizada de um modo mais eficiente. Adicionalmente, as células de levedura capazes de catabolizar um hidrato de carbono pentose podem também ser capazes de catabolizar um hidrato de carbono hexose (p. ex., alose, altrose, glicose, manose, gulose, iodose, galactose e talose) sequencialmente ou simultaneamente. Por exemplo, uma célula de levedura pode ser modificada para que a xilose e a glicose sejam catabolizadas simultaneamente. Observa-se que as células de levedura possuindo uma capacidade aumentada para catabolizar um hidrato de carbono pentose possam ser utilizadas para modificar células de levedura que possam produzir produtos orgânicos a partir de fontes de carbono 35 PE 1183385 pentoses. Esta característica é particularmente vantajosa uma vez que as fontes de carbono pentoses tais como xilose são geralmente menos dispendiosas que as fontes de carbono hexoses tais como glicose. Outras fontes de carbono que podem ser catabolizadas incluem, sem limitação, melibiose, sacarose, frutose, rafinose, estaquiose, amido (p. ex., amido de milho e amido de trigo) e hidrolisado (p. ex., hidrolisado de fibra de milho e outros hidrolisados celulósicos).

Adicionalmente, o invento proporciona uma célula de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido que promove a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. Por exemplo, uma célula de levedura pode ter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido possuindo actividade de citrato-liase. Alternativamente, uma célula de levedura pode ter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido da membrana mitocondrial que promove a permeabilidade de acetil-CoA através da membrana mitocondrial. É de notar que muitas células de levedura sem a capacidade de produzir etanol não conseguem crescer na ausência de etanol e acetato. Tipicamente, uma célula de levedura não terá a capacidade de produzir etanol quando de algum modo faltar a actividade de piruvato-descarboxilase ou álcool-desidrogenase. Por exemplo, uma levedura positiva para Crabtree (p. ex., Saccharomyces) sem actividade de piruvato-descarboxilase cresce pouco na ausência de etanol e acetato. Assim, a manipulação de tal levedura positiva 36 PE 1183385 para Crabtree de um modo que reduza a produção de etanol para redireccionar a utilização de piruvato para outros produtos orgânicos (p. ex., lactato e acrilato) resulta em caracteristicas de fraco crescimento quando o etanol e o acetato estão ausentes, particularmente uma vez que a levedura positiva para Crabtree limita a respiração celular quando na presença de glicose. Tal como aqui descrito, as células de levedura que podem promover a acumulação de acetil-CoA citoplasmático de um modo qualquer que não o que se baseia na concentração de acetato citoplasmático e actividade de acetil-CoA-sintetase podem crescer na ausência de etanol e acetato mesmo quando são incapazes de produzir etanol. Observa-se que células de levedura possuindo a capacidade de crescer na ausência de etanol e acetato sem a capacidade de produzir etanol podem redireccionar a utilização de piruvato para produzir outros produtos orgânicos que não etanol.

Qualquer tipo de levedura pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido que promova a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. Por exemplo, uma célula de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree ou positivo para Crabtree pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido que promova a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula. Tipicamente, tais células de levedura podem ser identificadas através de (1) manipulação da célula que contém a molécula de ácido nucleico exógena de forma a que esta não tenha actividade 37 PE 1183385 de piruvato-descarboxilase ou álcool-desidrogenase, (2) determinação das características de crescimento da célula enquanto se cultiva a célula na presença de quantidades tituladoras de um inibidor respiratório (p. ex., antimicina A, cianeto ou azida), e (3) comparação dessas caracteris-ticas de crescimento com as observadas para uma célula de levedura comparável que não contenha a molécula de ácido nucleico exógena mas que no entanto foi também manipulada para não ter actividade de piruvato-descarboxilase ou álcool-desidrogenase. As células de levedura que se determinar terem caracteristicas de crescimento mais favoráveis devido à presença da molécula de ácido nucleico exógena através de uma tal comparação são consideradas como contendo uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido que promove a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula.

As células de levedura contendo uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido que promove a acumulação de acetil-CoA no citoplasma da célula podem também ter actividade enzimática reduzida, tal como actividade de piruvato-descarboxilase e/ou álcool-desidrogenase reduzida. Por exemplo, uma célula de levedura pode não ter a capacidade de produzir etanol. Tipicamente, tais células de levedura têm uma taxa de crescimento sob condições de cultura sem etanol e acetato que é superior (p. ex., cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100, 150, 200 porcento ou mais) à taxa de crescimento observada para células de levedura comparáveis (i.e., células de levedura sem a 38 PE 1183385 capacidade de produzir etanol) que não contêm o ácido nucleico exógeno, mas que foram cultivadas sob condições semelhantes (i.e., condições de cultura sem etanol nem acetato) . 0 invento proporciona também uma célula de levedura possuindo actividade reduzida de um polipéptido. Tais células de levedura podem ter um fenótipo positivo para Crabtree ou negativo para Crabtree. Por exemplo, uma célula de levedura dentro do âmbito do invento pode ter actividade reduzida de um polipéptido da membrana plas-mática (p. ex., um transportador da membrana plasmática), um polipéptido citoplasmático (p. ex., piruvato-descarbo-xilase) e/ou um polipéptido mitocondrial (p. ex., piruvato-desidrogenase). 0 termo "transportador da membrana plasmática" refere-se a polipéptidos que facilitam o movimento de produtos orgânicos através da membrana plasmática. Exemplos de um tal polipéptido incluem, sem limitação, transportadores de ácido carboxilico tais como JENl em S. cere-visiae (número de acesso Genbank U24155). 0 termo "polipéptido mitocondrial" refere-se a qualquer polipéptido que funcione dentro da mitocôndria incluindo, sem limitação, a piruvato-desidrogenase, polipéptidos que participam no catabolismo de lactato ou acetil-CoA (p. ex., polipéptidos do citocromo b2) e enzimas do ciclo de Krebs. As enzimas do ciclo de Krebs incluem aconitase, isocitrato-desidrogenase, cetoglutarato-desidrogenase, succinato-tiocinase, succina-to-desidrogenase, fumarase, malato-desidrogenase e citrato-sintetase. Tal como aqui descrito, uma célula de levedura 39 PE 1183385 possuindo uma actividade enzimática reduzida inclui uma célula de levedura que não tem de todo uma determinada actividade enzimática. É importante observar que o termo "reduzida" tal como aqui se utiliza em relação a uma célula de levedura e a uma actividade polipeptídica refere-se a um nivel de actividade inferior ao medido numa célula de levedura comparável da mesma espécie sob condições semelhantes. Assim, uma célula de levedura sem uma determinada actividade transportadora é considerada como tendo actividade transportadora reduzida se uma célula comparável tiver pelo menos alguma actividade transportadora. Tais activi-dades polipeptídicas reduzidas podem ser o resultado de uma concentração reduzida do polipéptido, menor actividade especifica do polipéptido ou combinações destas. Qualquer um de vários métodos pode ser utilizado para produzir uma célula de levedura possuindo uma actividade polipeptidica reduzida. Por exemplo, o locus possuindo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido mitocondrial pode ser tornado inactivo, por exemplo, através de mutagénese vulgar ou tecnologia de "knock-out".

Note-se que células de levedura possuindo actividade reduzida de uma enzima mitocondrial podem acumular produtos do ciclo de krebs (p. ex., citrato, isocitrato, a-cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato ou oxaloacetato). Por exemplo, células de levedura que possuam actividade de fumarase reduzida podem acumular fumarato. Adicionalmente, a célula de levedura pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um 40 PE 1183385 polipéptido possuindo actividade enzimática que leve à formação de um produto orgânico para que a célula produza o produto orgânico. É importante notar que alguns produtos do ciclo de Krebs não atravessam a membrana mitocondrial (p. ex., a-cetoglutarato e succinil-CoA). Assim, a redução da actividade de determinadas enzimas do ciclo de Krebs resultará na acumulação de certos produtos do ciclo de Krebs dentro do lúmen da mitocôndria. Nestes casos, células de levedura possuindo uma actividade reduzida de uma enzima do ciclo de Krebs podem ser modificadas para conterem uma ou mais moléculas de ácido nucleico exógenas diferentes, cada uma das quais codificando um polipéptido possuindo uma actividade enzimática diferente, para que o produto do ciclo de Krebs desejado se acumule dentro do citoplasma. Por exemplo, a redução da actividade de cetoglutarato-desidrogenase levará a uma acumulação de a-cetoglutarato, que por sua vez levará a uma acumulação de isocitrato. O a-cetoglutarato não pode atravessar a membrana mitocondrial, enquanto que o isocitrato pode atravessar a membrana mitocondrial. Assim, o isocitrato pode acumular-se dentro do citoplasma da célula. No entanto, células de levedura que contêm também uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica um polipéptido possuindo actividade de isocitrato-desidrogenase e expressam esse polipéptido funcional dentro do citoplasma podem produzir cx-ceto-glutarato citoplasmático. Assim, a redução da actividade de determinadas enzimas do ciclo de Krebs ao mesmo tempo que 41 PE 1183385 se proporcionam moléculas de ácido nucleico exógenas que codificam as mesmas (ou diferentes) enzimas do ciclo de Krebs para que sejam funcionais dentro do citoplasma pode levar à produção de vários produtos do ciclo de Krebs (ou produtos derivados dos produtos do ciclo de Krebs) dentro do citoplasma.

Mais, o invento proporciona uma célula de levedura possuindo actividade reduzida de uma enzima que desvia a utilização de uma fonte de carbono da produção de biomassa ou do produto orgânico desejado. Por exemplo, enzimas dentro da via do glicerol ou da acetoina podem ser destruídas para que a fonte de carbono dentro do meio de cultura seja utilizada predominantemente para a produção de biomassa ou do produto orgânico desejado. Exemplos de enzimas da via do glicerol incluem, sem limitação, a di-hidroxiacetona-fosfato-redutase. Exemplos de enzimas da via da acetoina incluem, sem limitação, a cx-acetolactato-sintetase e a α-acetolactato-descarboxilase. Novamente, pode ser utilizado qualquer método para reduzir a actividade de uma enzima.

Para além disso, qualquer uma das células de levedura aqui proporcionadas pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que funcione como plasmideo assassino. 0 termo "plasmideo assassino" tal como aqui se utiliza refere-se a uma molécula de ácido nucleico que proporciona a uma espécie de levedura a capacidade de matar outras espécies de leveduras. Por exemplo, células de 42 PE 1183385 levedura do género Kluyveromyces contendo um plasmídeo assassino podem impedir o crescimento de leveduras do género Saccharomyces. Assim, células de levedura possuindo um plasmideo assassino podem ser utilizadas para prevenir problemas de contaminação que surjam durante processos de produção em grande escala. Adicionalmente, pode ser dado a uma célula de levedura qualquer tipo de plasmideo assassino. Por exemplo, um plasmideo assassino isolado a partir de K. lactis pode ser dado a uma célula de levedura K. marxianus. As células de levedura contendo um plasmídeo assassino podem ser facilmente identificadas utilizando métodos vulgares. Ver p. ex., Gunge et al., J. Bacteriol. 145 (1) : 382-390, 1981; Gunge e Kitada, Eur. J. Epidemiol. 4: 409- 414, 1988; e Wesolowski-Louvei et al. , "Noncon- ventional yeasts in Biotechnology: Kluveromyces lactis", ed. Klaus Wolf, Springer Verlag, Berlim, pág. 138-201, 1996.

Do mesmo modo, qualquer uma das células de levedura aqui proporcionadas pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido possuindo uma actividade ATPásica modificada para que a célula de levedura se torne mais tolerante a ambientes de baixo pH. Por exemplo, pode ser dada a uma célula de levedura uma ATPase que mantenha eficazmente uma baixa concentração citoplasmática de protões quando a concentração extracelular de protões é elevada. Tais polipéptidos podem ser concebidos tal como descrito por Morsomme et al. (EMBO J. 15: 5513-5526, 1996). 43 PE 1183385 É importante observar que qualquer uma das células de levedura recombinantes aqui descritas pode conter qualquer combinação das manipulações genéticas descritas. Por exemplo, uma célula de levedura possuindo um fenótipo positivo para Crabtree pode conter uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido possuindo actividade de citrato-liase bem como uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido possuindo actividade enzimática que leve à formação de um produto orgânico. 3. Organismos Adequados

Uma variedade de organismos é adequada para utilizar de acordo com o invento. Para além de microrganismos leveduras negativos para Crabtree e positivos para Crabtree tais como Saccharomyces sp., incluindo S. cerevisiae e S. uvarum, Kluyveromyces, incluindo K. thermo-tolerans, K. lactis e K. marxianus, Pichia, Hansenula, incluindo H. polymorpha, Candida, Trichosporon, Yamadazyma, incluindo Y. stipitis ou Torulaspora pretoriensis, organismos de uma ampla variedade de espécies microbianas servem também como hospedeiros para a produção de ácido láctico. Por exemplo, um organismo tal como Rhizopus oryzae, um produtor natural de ácido láctico, pode ser geneticamente modificado para tolerância a ácido, melhoria do rendimento e ácido láctico opticamente puro. Sabe-se também que Aspergillus sps. produzem uma variedade de 44 PE 1183385 ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico, e toleram pH baixo. Estão disponíveis métodos para modificar geneticamente Aspergillus sps. para produzir ácido láctico. Para além disso, fungos tais como Rhizopus e Aspergillus sps. produzem enzimas que lhes permitem degradar o amido e outros polímeros de hidratos de carbono em hidratos de carbono monoméricos para utilizar como fonte de carbono.

Procariotas tais como Escherichia coli, Zymomonas mobilis e Bacillus sps. foram ou podem ser geneticamente modificados para produção de ácido láctico. Os microrganismos que foram identificados como Bacillus coagulans são também produtores naturais de ácido láctico que podem ser ainda geneticamente modificados para melhorar a produção de ácido láctico a pH baixo.

Adicionalmente, organismos extremófilos da família Archea podem tolerar pH extremamente baixo e temperaturas elevadas. A modificação genética de espécies seleccionadas desta família pode proporcionar uma estirpe produtora de ácido láctico. 4. Aspectos genéticos

Uma molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido possuindo actividade enzimática pode ser identificada e obtida através de qualquer método. Por exemplo, técnicas padrão de sequenciação de ácidos nucleicos e programas de suporte lógico que traduzem 45 PE 1183385 sequências de ácido nucleico em sequências de aminoácidos com base no código genético podem ser utilizados para determinar se um determinado ácido nucleico tem alguma homologia de sequência com polipéptidos enzimáticos conhecidos. Suporte lógico de alinhamento de sequências tal como MEGALIN® (DNASTAR, Madison, WI, 1997) pode ser utilizado para comparar várias sequências. Adicionalmente, moléculas de ácido nucleico codificando polipéptidos enzimáticos conhecidos podem ser mutadas utilizando técnicas vulgares de clonagem molecular (p. ex., mutagénese dirigida ao local). Mutações possíveis incluem, sem limitação, deleções, inserções e substituições de bases, bem como combinações de deleções, inserções e substituições de bases. Mais, bases de dados de ácidos nucleicos e de aminoácidos (p. ex., GenBank®) podem ser utilizadas para identificar uma sequência de ácido nucleico que codifique um polipéptido possuindo actividade enzimática. Resumidamente, qualquer sequência de aminoácidos possuindo alguma homologia com um polipéptido possuindo actividade enzimática ou qualquer sequência de ácido nucleico possuindo alguma homologia com uma sequência codificando um polipéptido possuindo actividade enzimática pode ser utilizada como consulta ("query") para pesquisar a GenBank®. Os polipéptidos identificados podem então ser analisados para determinar se exibem ou não actividade enzimática.

As moléculas de ácido nucleico que codificam um polipéptido possuindo actividade enzimática podem ser identificadas e obtidas utilizando procedimentos e técnicas 46 PE 1183385 vulgares de clonagem molecular ou síntese química de ácidos nucleicos, incluindo PCR. PCR refere-se a um procedimento ou técnica no qual o ácido nucleico alvo é amplificado de um modo semelhante ao descrito na Patente U.S. N° 4683195 e subsequentes modificações do procedimento aqui descritas. Geralmente, a informação da sequência das extremidades da região de interesse ou para além destas é utilizada para desenhar iniciadores oligonucleotídicos que são idênticos ou semelhantes na sequência às cadeias opostas de um potencial molde a amplificar. Utilizando PCR, uma sequência de ácido nucleico pode ser amplificada a partir de ARN ou ADN. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser isolada através de amplificação por PCR a partir de ARN celular total, ADN genómico total e ADNc bem como de sequências de bacteriófagos, sequências plasmídicas, sequências virais e semelhantes. Quando se utiliza ARN como fonte do molde, pode ser utilizada a transcritase reversa para sintetizar cadeias de ADN complementares.

Mais, podem ser utilizadas técnicas de hibridação de ácidos nucleicos para identificar e obter uma molécula de ácido nucleico que codifique um polipéptido possuindo actividade enzimática. Resumidamente, qualquer molécula de ácido nucleico que codifique um polipéptido enzimático conhecido ou um fragmento deste pode ser utilizada como sonda para identificar moléculas de ácido nucleico semelhantes através de hibridação sob condições de rigor moderado a elevado. Tais moléculas de ácido nucleico semelhantes podem então ser isoladas, sequenciadas e 47 PE 1183385 analisadas para determinar se o polipéptido codificado tem actividade enzimática. A hibridação pode ser feita através de análise de "Southern" ou "Northern" para identificar uma sequência de ADN ou ARN, respectivamente, que hibride com uma sonda. A sonda pode ser marcada com um radioisótopo tal como P, uma enzima, digoxigenina ou através de biotinilaçao. 0 ADN ou ARN a analisar pode ser separado electroforeticamente num gel de agarose ou poliacrilamida, transferido para nitrocelulose, nylon ou outra membrana adequada e hibridado com a sonda utilizando técnicas padrão bem conhecidas na técnica tais como as descritas nas secções 7.39-7.52 de Sambrook et al., "Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor, Plainview, NY (1989). Tipicamente, uma sonda tem pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento. Por exemplo, uma sonda correspondente a uma sequência de 20 nucleótidos que codifique uma citrato-liase de mamífero pode ser utilizada para identificar uma molécula de ácido nucleico que codifique um polipéptido fúngico possuindo actividade liase cítrica. Adicionalmente, podem ser utilizadas sondas mais longas ou mais curtas que 20 nucleótidos.

Pode ser utilizado qualquer método para introduzir uma molécula de ácido nucleico exógena numa célula. De facto, muitos métodos para introdução de ácidos nucleicos em células de levedura são bem conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, transformação, electropo- 48 PE 1183385 ração, conjugação e fusão de protoplastos são métodos vulgares para introdução de ácido nucleico em células de levedura. Ver, p. ex., Ito et al., J. Bacteriol. 153: 163-168, 1983; Durrens et al., Curr. Genet. 18: 7-12, 1990; e

Becker e Guarente, Methods in Enzymology 194: 182-187, 1991. É importante observar que a molécula de ácido nucleico exógena contida dentro de uma célula de levedura do invento pode ser mantida dentro dessa célula em qualquer forma. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico exógenas podem ser integradas no genoma da célula ou mantidas num estado epissómico. Por outras palavras, uma célula do invento pode ser um transformante estável ou transiente. Adicionalmente, as células de levedura aqui descritas podem conter uma única cópia ou múltiplas cópias (p. ex., cerca de 5, 10, 20, 35, 50, 75, 100 ou 150 cópias) de uma determinada molécula de ácido nucleico exógena tal como descrito acima. os elementos reguladores

Os métodos para expressar uma sequência de aminoácidos a partir de uma molécula de ácido nucleico exógena são bem conhecidos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, a construção de um ácido nucleico para que um elemento regulador promova a expressão de uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido. Tipicamente, os elementos reguladores são sequências de ADN que regulam a expressão de outras sequências de ADN ao nivel da transcrição. Assim, 49 PE 1183385 incluem, sem limitação, promotores, estimuladores e semelhantes. Para além disso, os métodos para expressão de um polipéptido a partir de uma molécula de ácido nucleico exógena em levedura são bem conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, as construções de ácido nucleico que são capazes de expressar polipéptidos exógenos em Kluyveromyces são bem conhecidas. Ver, p. ex., as Patentes U.S. Nos 4859596 e 4943529.

Tal como aqui descrito, as células de levedura dentro do âmbito do invento contêm uma molécula de ácido nucleico exógena que, por exemplo, codifica um polipéptido possuindo actividade enzimática que leva à formação de um produto orgânico. Os métodos de identificação de células que contêm ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos dos peritos na técnica. Tais métodos incluem, sem limitação, PCR e técnicas de hibridação de ácidos nucleicos tais como análise de "Northern" e "Southern". Nalguns casos, podem ser utilizadas técnicas de imunohistoquímica e bioquímicas para determinar se uma célula contém um determinado ácido nucleico através da detecção da expressão do polipéptido enzimático codificado por essa molécula de ácido nucleico em particular. Por exemplo, pode ser utilizado um anticorpo possuindo especificidade para uma enzima codificada para determinar se uma determinada célula de levedura contém ou não essa enzima codificada. Mais, podem ser utilizadas técnicas bioquímicas para determinar se uma célula contém uma determinada molécula de ácido nucleico codificando um polipéptido enzimático através da detecção de um produto 50 PE 1183385 orgânico produzido em resultado da expressão do polipéptido enzimático. Por exemplo, a detecção de lactato após a introdução de uma molécula de ácido nucleico exógena que codifique um polipéptido possuindo actividade de lactato-desidrogenase numa célula de levedura que normalmente não expressa um tal polipéptido pode indicar que essa célula de levedura não só contém a molécula de ácido nucleico exógena introduzida como também expressa o polipéptido enzimático codificado a partir dessa molécula de ácido nucleico exógena introduzida. Os métodos para detecção de acti-vidades enzimáticas especificas ou da presença de determinados produtos orgânicos são bem conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, a presença de lactato pode ser determinada tal como descrito noutro sitio. Ver, Witte et al. , J. Basic Microbiol. 29: 707-716, 1989. O invento proporciona também uma construção de ácido nucleico contendo uma sequência de recombinação e uma sequência seleccionada. O termo "sequência de recombinação" tal como aqui se utiliza, refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico que corresponda a uma sequência genómica que se encontre dentro da célula. As sequências de recombinação aqui descritas podem ser utilizadas para dirigir acontecimentos de recombinação durante a criação de organismos "knock-out". Por outras palavras, uma sequência de recombinação pode ser utilizada para destruir especi-ficamente um locus contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma determinada enzima. O termo "sequência seleccionada" tal como aqui se utiliza inclui qualquer 51 PE 1183385 sequência de ácido nucleico. Tipicamente, uma sequência seleccionada codifica um polipéptido possuindo actividade enzimática que leva à formação de um produto orgânico dentro de uma célula. Assim, as construções de ácido nucleico do invento podem ser utilizadas para suprimir uma actividade enzimática endógena e adicionar uma actividade enzimática exógena num único passo. Na maioria dos casos, a sequência seleccionada está dentro da sequência de recom-binação para que a sequência seleccionada esteja flanqueada em cada extremidade pela sequência de recombinação. 5. Produção de produtos orgânicos e métodos de cultura O invento proporciona métodos para produção de produtos orgânicos utilizando qualquer uma das células de levedura ou outras células microbianas aqui proporcionadas. Tais métodos envolvem proporcionar células de levedura e cultivar as células de levedura proporcionadas com meio de cultura para que seja produzido um produto orgânico (p. ex., glicerol, acrilato, xilose, ascorbato, lactato, citrato, isocitrato, α-cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato e oxaloacetato). Em termos gerais, os meios de cultura e/ou as condições de cultura podem ser classificados numa de duas categorias: os que promovem a respiração celular e/ou a produção de biomassa e os que reduzem a respiração celular. Tipicamente, os meios de cultura e/ou as condições de cultura que promovem a respiração celular são utilizados em situações onde é 52 PE 1183385 necessário um crescimento rápido ou onde o produto orgânico a produzir não pode ser produzido sem respiração celular.

Tais produtos orgânicos podem incluir, sem limitação, produtos do ciclo de Krebs. Por outro lado, o meio de cultura e/ou as condições de cultura que reduzem a respiração celular são utilizados em situações onde não é necessário ou não é desejado um crescimento rápido ou onde o produto orgânico a produzir pode ser produzido sem respiração celular. Tais produtos orgânicos incluem, sem limitação, lactato, acrilato e xilose. Tal como aqui se utiliza, a frase "promove a respiração celular" ou "promove a produção de biomassa" quando se refere a condições de cultura, significa que as condições de cultura celular são mantidas para que a fonte de carbono dentro do meio de cultura seja predominantemente metabolizada através de respiração oxidativa ou para produzir biomassa. Tal como aqui se utiliza, o termo "biomassa" refere-se ao peso seco do organismo. Tal como aqui se utiliza, a frase "predominantemente metabolizada para produzir biomassa" significa que são produzidos pelo menos cerca de 0,3 gramas de biomassa por grama de fonte de carbono (na forma de hidrato de carbono) consumida (p. ex., pelo menos cerca de 0,4, 0,45, 0,5 ou 0,6 gramas de biomassa). Geralmente, são produzidos entre cerca de 0,3 a cerca de 0,6 gramas de biomassa por grama de fonte de carbono. Os métodos para determinação da quantidade de biomassa (peso seco celular) numa cultura são conhecidos e incluem, por exemplo, os métodos descritos por Postma et al., "Enzymic analysis of the Crabtree effect in glicose-limited chemostat cultures 53 PE 1183385 of Saccharomyces cerevisiae", Appl. Environ. Microbiol. 53: 468-477, 1989/ e Kiers et al., "Regulation of alcoholic fermentation in batch and chemostat cultures of Kluyveromyces lactis CBS 2359", Yeast 14: 459-469, 1998. Os métodos para determinação da quantidade de fonte de carbono consumida são conhecidos e incluem, por exemplo, metodologias de HPLC.

Deve observar-se que a eficiência da utilização da fonte de carbono pode depender da fonte de carbono e do organismo. Assim, embora possa ser utilizado um meio de crescimento complexo que inclui outras fontes de carbono que não hidratos de carbono, a quantidade de biomassa produzida por grama de fonte de carbono refere-se apenas à quantidade de biomassa produzida por grama de fonte de carbono de hidrato de carbono consumida.

Em geral, o meio de cultura contendo um inibidor da respiração celular (p. ex., antimicina A, cianeto e azida) pode reduzir a respiração celular, enquanto que a ausência de tais inibidores pode promover a respiração celular. Do mesmo modo, condições de cultura anaeróbicas podem reduzir a respiração celular, enquanto que condições de cultura aeróbicas podem promover a respiração celular. Uma condição aeróbica é qualquer condição onde o oxigénio é introduzido ou ocorre naturalmente e serve como substrato para a via de respiratória. Geralmente, o termo "aeróbica" refere-se a uma condição de cultura na qual o meio de cultura é mantido sob um fluxo de ar de pelo menos 0,1 VVM 54 PE 1183385 (volume de ar/volume de líquido/minuto) (p. ex., superior a 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5 ou 2,0 VVM). Se for utilizado outro gás que não ar então o VVM nominal é ajustado a um equivalente do ar com base no teor de oxigénio do gás. Alternativamente, "aeróbica" pode ser definida como um meio de cultura que tem um teor de oxigénio dissolvido de pelo menos 2 porcento (p. ex., pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75 ou 80 porcento) relativamente à quantidade presente a condições saturadas com ar à pressão atmosférica.

Uma condição anaeróbica é qualquer condição onde o oxigénio é propositadamente ou naturalmente tornado essencialmente indisponível para a via respiratória, levando, por exemplo, à produção de um produto reduzido tal como um etanol. Geralmente, uma condição onde o meio de cultura tem um teor de oxigénio dissolvido (OD) inferior a cerca de 2,0% (p. ex., inferior a cerca de 1,5, 1,0 ou 0,5%, ou igual a cerca de 0%) é considerada uma condição anaeróbica. Do mesmo modo, uma condição possuindo um VVM (volume de ar/volume de líquido/minuto) inferior a cerca de 0,1 (p. ex., inferior a cerca de 0,05 ou igual a cerca de 0) é considerada uma condição anaeróbica. Tipicamente, o termo "ar" tal como aqui se utiliza em relação ao VVM refere-se ao ar tal como existe na atmosfera. Outras condições de cultura que podem influenciar a respiração incluem, sem limitação, pH, temperatura e a presença de determinadas fontes de carbono (p. ex., glicose) . É importante notar que alguns meios de cultura e/ou condições de cultura que promovem a respiração celular numa espécie 55 PE 1183385 de levedura podem reduzir a respiração celular noutra espécie. Por exemplo, a presença de glicose num meio de cultura reduz a respiração celular em células de levedura possuindo um fenótipo positivo para Crabtree tendo pouco ou nenhum efeito na respiração celular em células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree. A manipulação dirigida das condições de cultura durante uma produção comercial pode ser um passo importante no alcance dos niveis óptimos de um produto orgânico desejado tal como aqui descrito. Tipicamente, uma célula de levedura dentro do âmbito do invento é criada sob condições de cultura que promovem a respiração celular para produzir uma densidade celular significativa. Por exemplo, as células de levedura podem ser colocadas num vaso de cultura e ser-lhes dado glicose e oxigénio em abundância. Tipicamente, sob condições que promovem a respiração celular, o tempo de duplicação para os microrganismos aqui proporcionados é inferior a cerca de 10 horas (p. ex., menos de cerca de 8, 5 ou 3 horas) . Assim que as células atingem uma densidade significativa, as condições de cultura podem ser mudadas para condições que reduzam a respiração celular para que seja produzido um produto orgânico que não necessite respiração celular. Por exemplo, as células de levedura podem ser transferidas para um vaso de cultura e ser-lhes dada glicose em abundância, mas nenhum oxigénio. Neste caso, a manipulação directa das condições de cultura para que elas mudem de aeróbicas para anaeróbicas pode produzir niveis óptimos de um produto 56 PE 1183385 orgânico desejado. Alternativamente, nalguns casos, as células podem ser cultivadas sob condições que promovem a respiração celular para que seja produzido um produto orgânico que necessite respiração celular. Observa-se que a massa celular no vaso de produção é tipicamente superior a cerca de 2 g/1 (p. ex., superior a cerca de 4, 6 ou 8 g/1).

Durante a cultura, a temperatura pode ser superior a cerca de 35°C (p. ex., superior a cerca de 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45°C) . Adicionalmente, o meio de cultura pode ser líquido. Os meios de cultura contêm tipicamente uma fonte de carbono. Geralmente, a fonte de carbono inclui hidratos de carbono contendo matérias-primas. Tipicamente, os meios nutrientes contêm também uma fonte de azoto. De preferência a fonte de azoto inclui uma combinação de compostos azotados orgânicos e inorgânicos.

Num modo de operação, pode ser desejado encher um grande vaso de fermentação com um meio de cultura incluindo todos os nutrientes necessários e todos hidratos de carbono, suficientes tanto para a produção de biomassa como para a produção do produto desejado. O vaso pode ser operado sob condições tais de forma que a produção de biomassa seja promovida inicialmente, por exemplo, proporcionando condições aeróbicas, e depois mudada para condições anaeróbicas para a produção do produto desejado. 57 PE 1183385

Num modo de operação alternado, é utilizado um vaso mais pequeno para produção de biomassa, com um elevado nível de nutrientes e hidratos de carbono suficientes para produzir, por exemplo, cerca de 100 g/1 de biomassa. Os conteúdos deste vaso podem então ser transferidos para um vaso maior, contendo um segundo meio de cultura que contém menos nutrientes, por exemplo, apenas glicose como fonte de carbono ou outra fonte de carbono hidrato de carbono em água. Este vaso pode ser operado sob condições anaeróbicas para a produção do produto orgânico desejado. O crescimento da biomassa é reduzido devido ao reduzido nível de nutrientes e às condições anaeróbicas.

Numa concretização preferida, o meio nutriente é mantido apenas nos materiais necessários para simplificar a recuperação do produto desejado. A utilização de crescimento aeróbico pode permitir que seja utilizado um meio simplificado, relativamente ao necessário, se fosse necessário crescimento sob condições anaeróbicas. Muitas das leveduras aqui descritas podem crescer, sob condições anaeróbicas, num meio consistindo apenas em açúcar, uma fonte de azoto inorgânico, minerais vestigiais e algumas vitaminas.

Antes da adição do produto orgânico ao meio de cultura como resultado de fermentação ou de outros processos, o meio de cultura tem geralmente um pH entre cerca de 5,0 e 7,0. No entanto, uma vez que produtos 58 PE 1183385 orgânicos tais como ácidos orgânicos são secretados para o meio pelo microrganismo, o pH do meio de cultura tende a diminuir. 0 termo "pH orgânico" tal como aqui se utiliza refere-se ao pH do meio de cultura atribuído a compostos orgânicos presentes no meio tais como carboxilatos, por exemplo, ácido láctico. O termo "pH inorgânico" tal como aqui se utiliza refere-se ao pH atribuído a compostos inorgânicos tais como HC1 e H2S04. 0 meio de cultura pode ter um valor de pH orgânico inferior a acerca de 3,0 (p. ex., inferior a cerca de 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ou 1,5) ou um valor de pH inorgânico inferior a cerca de 3,0 (p. ex., inferior a cerca de 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1, 2,0, 1,9, 1,8, 1,7, 1,6 ou 1,5). Pode ser utilizada qualquer fonte de carbono durante o procedimento de cultura. Por exemplo, pode ser utilizado meio contendo um hidrato de carbono pentose (p. ex., ribose, arabinose, xilose e lixose). Adicionalmente, pode ser utilizado meio contendo hidrolisado de fibra de milho. Um hidrolisado de fibra de milho pode ter um valor de pH entre 2,0 e 6,5. Tipicamente, um hidrolisado de fibra de milho contém glicose, xilose e arabinose. Por exemplo, um hidrolisado de fibra de milho pode conter cerca de 40 gramas/1 de glicose, cerca de 40 gramas/1 de xilose e cerca de 20 gramas/1 de arabinose.

Para processos de produção em grande escala, podem ser utilizados os seguintes métodos. Primeiro, um tanque grande (p. ex., um tanque de 190, 380, 760 litros 59 PE 1183385 (50, 100, 200 galões) ou mais) contendo meio de cultura apropriado com, por exemplo, hidratos de carbono hexose e/ou pentose é inoculado com um determinado microrganismo. Após a inoculação, as condições de cultura podem ser manipuladas de forma a que a fonte de carbono seja utilizada predominantemente para produzir biomassa. Por exemplo, o meio de cultura pode ser manipulado para ter um valor de pH de cerca de 7,0, uma temperatura de cerca de 35°C e um teor de oxigénio dissolvido que crie um ambiente aeróbico ao longo do tanque. Observa-se que o produto orgânico desejado pode ser produzido durante esta fase de produção de biomassa. Uma vez alcançada uma biomassa suficiente, o caldo contendo os microrganismos pode ser transferido para um segundo tanque. Este segundo tanque pode ser de qualquer tamanho. Por exemplo, o segundo tanque pode ser maior, menor ou do mesmo tamanho que o primeiro tanque. Tipicamente, 0 segundo tanque é maior que o primeiro de forma a que possa ser adicionado meio de cultura adicional ao caldo do primeiro tanque. Adicionalmente, o meio de cultura dentro deste segundo tanque pode ser o mesmo ou diferente do utilizado no primeiro tanque. Por exemplo, o primeiro tanque pode conter meio com xilose e arabinose, enquanto que o segundo tanque pode conter meio com glicose.

Uma vez transferida, as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser manipuladas para que a fonte de carbono seja utilizada predominantemente para 60 PE 1183385 produzir produto orgânico em que o "produto orgânico" inclui, entre outras coisas, produtos derivados de piruvato e dióxido de carbono (C02) mas não inclui biomassa (i.e., peso seco celular) . Tal como aqui se utiliza, a frase "predominantemente para produzir um produto orgânico seleccionado" ou um "produto derivado de piruvato selec-cionado" quando se refere a condições de cultura significa que a fonte de carbono dentro do meio de cultura é metabolizada, tipicamente através de um processo de fermentação (embora não necessariamente), para formar pelo menos 0,5 gramas de produto orgânico por grama de fonte de carbono consumida (p. ex., pelo menos cerca de 0,6, 0,75 ou 0,8 gramas de produto orgânico). Os métodos para determinação da quantidade de produto orgânico produzida e/ou de fonte de carbono consumida são conhecidos e incluem, por exemplo, HPLC.

Tal como descrito anteriormente, a eficiência da utilização da fonte de carbono pode variar dependendo do substrato e do organismo. Assim, embora possam ser utilizados meios de crescimento complexos que incluam outras fontes de carbono que não hidratos de carbono (p. ex., aminoácidos) , a quantidade de produto orgânico ou de produto derivado de piruvato produzida por grama de fonte de carbono refere-se apenas à quantidade de produto orgânico ou de produto derivado de piruvato produzida por grama de fonte de carbono hidrato de carbono consumida. De preferência, neste estádio, não são produzidos mais de 0,3 61 PE 1183385 gramas de biomassa por grama de fonte de carbono (p. ex., não mais de 0,2, 0,1 ou 0,05 gramas de biomassa).

Por exemplo, o meio de cultura pode ser manipulado para ter um teor de oxigénio dissolvido que crie um ambiente anaeróbico ao longo do tanque, ou para conter um inibidor da respiração celular. Adicionalmente, o meio de cultura pode ser manipulado de forma a ser mantido um determinado valor de pH (p. ex., um valor de pH acídico, neutro ou básico). Alternativamente, o pH da cultura pode ser ajustado periodicamente sem se manter qualquer valor de pH em particular. Tipicamente, quando se produz um ácido orgânico, o valor de pH do meio de cultura é mantido acima de pelo menos cerca de 1,5 (p. ex., pelo menos cerca de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 ou 7,0).

Mais, à medida que o microrganismo cataboliza as fontes de carbono proporcionadas, a temperatura dentro do tanque aumenta. Assim, o meio de cultura pode ser manipulado para que seja mantida uma determinada temperatura. Alternativamente, a temperatura do meio de cultura pode ser ajustada periodicamente sem se manter qualquer temperatura em particular. Tipicamente, é mantida uma temperatura inferior a cerca de 35°C (p. ex., inferior a cerca de 34, 33, 32, 31 ou 30°C) quando se utilizam microrganismos sensíveis ao calor, enquanto que é mantida uma temperatura inferior a cerca de 45°C (p. ex., inferior a cerca de 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36 ou 35°C) quando se utilizam micror ganismos insensíveis ao calor. Observa-se que a biomassa 62 PE 1183385 pode ser produzida durante esta fase de produção de produto orgânico. Adicionalmente, as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser mudadas das que promovem a produção de produto para as que promovem a produção de biomassa e vice-versa, uma ou mais vezes. Por exemplo, as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser anaeróbicas a maior parte do tempo com breves pulsos de oxigénio dissolvido para que as condições aeróbicas existam periodicamente.

Noutro método, as condições de cultura anaeróbicas podem ser modificadas para aumentar a energia metabólica do microrganismo cultivado, por exemplo, através da adição de um aceitador final de electrões. Tal como aqui se utiliza, o termo "energia metabólica" refere-se à energia (em termos de ATP) derivada pelo organismo a partir de uma fonte de energia (tal como uma fonte de carbono) . Sob algumas condições, a quantidade de energia metabólica obtida pelo organismo a partir do metabolismo de uma fonte de carbono é superior à quantidade de energia obtida a partir da mesma fonte de carbono sob condições diferentes.

As células vivas são altamente ordenadas e têm de criar ordem dentro delas próprias para sobreviverem e crescerem. Para manter a ordem dentro do organismo, ocorrem milhares de reacções químicas diferentes dentro do organismo em qualquer instante no tempo. Por exemplo, as células necessitam de energia para reacções biossintéticas 63 PE 1183385 tais como reacções de polimerização de ADN, ARN e proteínas e formação de produtos metabólicos. As células necessitam também de energia para trazer substratos para dentro da célula, manter metabolitos dentro da célula, manter uma pressão de turgescência e um pH interno correctos, e para a mobilidade.

Como a energia não pode ser criada ou destruida, a célula necessita de uma entrada de energia a partir do ambiente para manter a ordem. A energia é geralmente fornecida a partir do ambiente na forma de radiação electromagnética ou de energia quimica. A energia obtida a partir do ambiente é aproveitada pela célula e utilizada por um de dois mecanismos bioquímicos gerais: fosforilação ao nível do substrato e transporte de electrões.

Geralmente, sob condições anaeróbicas, o ATP (a "moeda celular" para a energia) é produzido através de fosforilação ao nível do substrato. Na fosforilação ao nível do substrato a energia é libertada de ligações químicas e armazenada principalmente na forma de ATP.

Um exemplo de formação ao nível do substrato é a conversão de glicose em piruvato através da glicólise:

Glicose = 2 Piruvato + 2 ATP + 2 H2 0 piruvato pode então ser convertido em ácido láctico: 64 PE 1183385

Piruvato + 2 H2 = Lactato A energia líquida produzida através da transformação de cima é equivalente a 2 ATP. O piruvato pode ainda ser processado no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e gerar mais energia e átomos de hidrogénio:

Piruvato + 3 H20 = 3 C02 + ATP + 5 H2 A reacção líquida para a respiração da glicose:

Glicose + 6 H20 = 6 C02 + 4 ATP + 12 H2

Assim, através de fosforilação ao nível do substrato, a respiração completa da glicose em C02 proporcionará uma energia líquida equivalente a 4 ATP e 24 átomos de hidrogénio.

No "transporte de electrões", os potenciais de oxidação-reacção dos compostos que constituem os membros de uma "cadeia de transporte de electrões" são ponderados para que cada membro possa ser reduzido pela forma reduzida do membro anterior. Assim, o poder redutor, como electrões, pode fluir ao longo da cadeia de moléculas transportadoras até um aceitador final de electrões tal como oxigénio (02) , nitrato (N03“) e fumarato. A adição de um aceitador final 65 PE 1183385 de electrões tal como oxigénio, nitrato ou fumarato a um meio de cultura pode proporcionar ao microrganismo maior energia metabólica (p. ex., maior produção de ATP para a mesma quantidade de fonte de carbono consumida). 0 oxigénio é o aceitador final de electrões mais preferido.

Por exemplo, se for utilizado oxigénio como aceitador final de electrões, o hidrogénio pode ser processado através da cadeia de transporte de electrões e proporcionar à célula mais 1,5 ATP por átomo de hidrogénio e 3 ATP por átomo de oxigénio. Geralmente, a quantidade de energia metabólica pode ser determinada através da medição da razão entre a quantidade de oxigénio consumida e a quantidade de glicose consumida. A Tabela 1 apresenta as melhorias máxima e minima esperadas no rendimento energético (moles de ATP por moles de glicose) quando o oxigénio é adicionado durante a produção em função do rendimento de produto que diminui devido à perda de piruvato para o ciclo do TCA (e, consequentemente para a respiração). A % máxima de melhoria foi calculada assumindo uma razão P/O de 3 enquanto que a % minima de melhoria assumiu uma razão P/0 de 0,5. A Tabela 2 apresenta a quantidade máxima estimada de oxigénio consumido por mole de glicose consumida. A adição de oxigénio pode promover um crescimento minimo que sequestrará carbono para a biossintese deixando uma pequena quantidade de carbono disponível para a respiração (e, portanto, a utilização de oxigénio). 66 PE 1183385

Tabela 1

Rendimento de Produto (g-lactato/ g-glicose) % Máxima de Melhoria no rendimento energético % Minima de Melhoria no rendimento energético 1,0 0% 0% 0,9 160% 35% 0,8 320% 70% 0,7 480% 105% 0,6 640% 140% 0,5 800% 175% 0,4 960% 210% 0,3 1120% 245% 0,2 1280% 280% 0,1 1440% 315% O o 1600% 350%

Tabela 2

Rendimento de Produto (g-lactato/ g-glicose) moles de oxigénio por mole de glicose 1,0 0,0 0,9 0,6 0,8 1,1 0,7 1,6 0,6 2,1 0,5 2,6 0,4 3,1 0,3 3, 6 0,2 4,1 0,1 4,6 0,0 5,1 67 PE 1183385

Assim, para melhorar a energia metabólica dos microrganismos na cultura celular, pode ser adicionado à cultura celular oxigénio como aceitador final de electrões. Enquanto que o rendimento molar máximo de ácido láctico a partir da glicose é de 2 moles de lactato por mole de glicose e o rendimento molar de ATP a partir da glicose é de 2 moles de ATP por mole de glicose, a adição de oxigénio como aceitador final de electrões permite que algum do piruvato seja canalizado para o ciclo do ácido citrico (TCA) onde este é convertido em CCç e energia. Assim, o fornecimento de um aceitador final de electrões "aumenta a energia metabólica" do microrganismo.

Desviando o piruvato para o ciclo do TCA tenderá a reduzir a quantidade de outros produtos derivados do piruvato (tais como ácido láctico) produzidos. Por exemplo, uma redução de 10% no rendimento pode resultar na geração de 2,6 vezes mais energia metabólica para o microrganismo, uma redução de 20% no rendimento pode resultar na geração de 4,2 vezes mais energia metabólica para o microrganismo e uma redução de 50% no rendimento pode resultar na geração de 9 vezes mais energia metabólica para o microrganismo.

Antecipa-se que em estádios mais tardios de um processo, quando estiverem presentes elevados niveis de produtos metabólicos tais como ácido láctico, a célula possa necessitar de mais energia metabólica para manter a sua função. 68 PE 1183385

Assim, pode ser desejável expor os microrganismos dentro de um meio de cultura anaeróbico a breves pulsos de

oxigénio dissolvido. De preferência, o "breve pulso de oxigénio dissolvido" resulta no meio de cultura ter uma concentração de oxigénio dissolvido não superior a LO O porcento, de preferência entre cerca de 0,1 e 0,5 porcento. Alternativamente, a taxa de crescimento ou de manutenção celular dos microrganismos durante a fermentação anaeróbica pode ser aumentada através da adição de outros aceitadores finais de electrões tais como nitrato ou fumarato. O oxigénio é adicionado a um nivel apenas suficiente para aumentar a energia metabólica do microrganismo enquanto mantém ao mesmo tempo a produtividade a um nível desejado. Deve-se ter cuidado para evitar perda excessiva de rendimento. Esta técnica pode também ser utilizada para ajudar a consumir açúcares residuais e deste modo simplificar mais o processo de recuperação. 6. Métodos de Purificação de Produtos Orgânicos

Uma vez produzido, pode ser utilizado qualquer método para isolar o produto desejado. Por exemplo, podem ser utilizadas técnicas de separação vulgares para remover a biomassa do caldo e podem ser utilizados procedimentos de isolamento vulgares (p. ex., extracção, destilação e procedimentos de permuta iónica) para obter o produto orgânico a partir do caldo livre do microrganismo. Ver, p. ex., Patente U.S. Número 4275234; Patente U.S. Número 5510526; Patente U.S. Número 5831122; Patente U.S. Número 5641406; e 69 PE 1183385

Pedido Internacional de Patente Número WO 93/00440. Adicionalmente, o produto orgânico desejado pode ser isolado ao mesmo tempo que é produzido ou pode ser isolado a partir do caldo após a fase de produção do produto ter terminado. É importante observar que as condições de cultura dentro do segundo tanque podem ser manipuladas de forma a melhorar o processo de isolamento. Por exemplo, o pH e a temperatura dentro do segundo tanque podem ser manipulados para que o produto orgânico desejado precipite da solução ou fique numa forma mais passível de isolamento. Especificamente, os ácidos orgânicos podem precipitar da solução quando o pH do caldo é inferior ao valor de pKa para o ácido orgânico. Por exemplo, as condições de cultura durante a produção de ácido glutâmico podem ser tais que o pH seja inferior a 2,19, que é o valor de pKa para o ácido glutâmico. Assim, a manipulação do pH, temperatura e teor do caldo pode facilitar o isolamento do produto orgânico. Adicionalmente, pode ser seleccionada uma determinada levedura geneticamente manipulada e/ou podem ser manipuladas condições de cultura específicas para que quaisquer subprodutos dentro do caldo sejam tais que não interfiram com a recuperação do produto orgânico desejado.

Será apreciado que os métodos e materiais aqui descritos podem ser adaptados e utilizados em qualquer tipo de processo de cultura incluindo, sem limitação, os processos vulgarmente referidos como processos de "fermentação continua" e "fermentação em fornadas". Adicionalmente, os microrganismos utilizados durante um 70 PE 1183385 processo de produção podem ser recuperados e reutilizados em processos de produção subsequentes. Por exemplo, os microrganismos podem ser reutilizados múltiplas vezes para produzir um produto orgânico desejado. Mais, pode ser utilizada qualquer fonte de carbono. Por exemplo, pode ser utilizada alose, altrose, glicose, manose, gulose, iodose, galactose, talose, melibiose, sacarose, frutose, rafinose, estaquiose, ribose, arabinose, xilose, lixose, amidos tais como amido de milho e amido de trigo, e hidrolisados tais como hidrolisado de fibra de milho e outros hidrolisados celulósicos como fonte de carbono para a produção de biomassa ou do produto orgânico desejado. Para além disso, pode ser utilizado um qualquer meio. Por exemplo, podem ser utilizados os meios de cultura padrão (p. ex., meio minimo de levedura e meio YP (extracto de levedura 10 g/1, caldo de peptona 2 0 g/1)) bem como meios tais como água de maceração de milho e licor de maceração de milho.

Uma vantagem significativa do presente invento é que os microrganismos preferidos, especialmente quando criados sob condições aeróbicas, podem utilizar meios minimos. A produção anaeróbica tipicamente não requererá nutrientes adicionais, de forma que o produto final pode ser isolado a partir de um caldo de fermentação relativamente limpo utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas de separação. A extracção líquido-líquido é uma técnica bem conhecida para a separação de ácidos orgânicos a partir de caldos de fermentação, e resulta numa purificação considerável. Com o presente invento crê-se que 71 PE 1183385 possam também ser úteis sistemas mais simples, menos dispendiosos e menos consumidores de energia.

Numa concretização, o presente invento utiliza levedura geneticamente modificada possuindo um fenótipo negativo para Crabtree num processo tipo comboio que induz um "desvio" na via metabólica após ter sido alcançada uma densidade celular critica e no momento em que é desejado aumentar dramaticamente a produtividade especifica do produto orgânico desejado. Um método típico para induzir o desvio da via metabólica é através da mudança da biomassa de um vaso altamente arejado para um vaso substancialmente anaeróbico, causando uma privação de oxigénio. Observa-se que pode ser utilizado um hidrato de carbono vulgar (p. ex., glicose ou xilose) como fonte de carbono tanto durante a fase de crescimento como durante a fase de produção. A utilização de uma célula de levedura geneticamente modificada possuindo um fenótipo negativo para Crabtree pode ser crítica para o sucesso desta concretização. Adicionalmente, a produtividade específica do produto orgânico desejado pode ser crítica para o sucesso. 0 termo "produtividade específica" tal como aqui se utiliza reflecte a quantidade de produto produzida e é representada como o número de gramas de produto orgânico produzido por grama de biomassa (peso seco) por hora, i.e., g/(gxhora). Tipicamente, a produtividade específica para produtos orgânicos tais como lactato e acrilato é superior a cerca de 0,1 g/(gxhora), por exemplo, superior a cerca de 0,2 g g/(gxhora) ou superior a cerca de 0,5 g/(gxhora). Ao proporcionar uma 72 PE 1183385 produtividade especifica elevada tal como aqui descrito, a energia necessária para a manutenção da célula pode ser obtida através da via de produtos fermentativos sob condições substancialmente anaeróbicas, em vez de assentar no arejamento para gerar elevadas quantidades de energia através da via respiratória. Observa-se que os vasos substancialmente anaeróbicos são arejados a uma taxa de menos de cerca de 0,1 VVM. Sob certas situações de produção, não será utilizado qualquer arejamento. Adicionalmente, o rendimento (i.e., g de produto orgânico/g de fonte de carbono consumida) nesta concretização é tipicamente superior a cerca de 70% (p) e é produzido sem a adição de fontes de carbono tais como etanol e acetato. Nalguns casos, para alcançar a produtividade especifica requerida para gerar a energia necessária para a manutenção da célula, pode ser necessário estimular a via da glicose a piruvato para além de proporcionar as enzimas necessárias para produzir o produto desejado.

Noutra concretização o processo tipo comboio pode ser desenhado de forma a que apenas o vaso de crescimento altamente arejado seja equipado com capacidade de esterilização. O vaso de produção anaeróbico opera tipicamente a temperaturas superiores a cerca de 35°C (p. ex., superiores a cerca de 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45°C) . Poucas leveduras de tipo selvagem serão capazes de sobreviver e competir com a levedura geneticamente modificada a tais temperaturas à medida que o pH cai durante a produção do produto, especialmente porque não 73 PE 1183385 terão uma via de fermentação estimulada que possa gerar energia para a manutenção da célula. Adicionalmente, a levedura pode ser modificada para conter "plasmídeos assassinos" tal como aqui descrito, o que pode prevenir que leveduras de outras espécies sobrevivam. 0 invento proporciona também vários métodos para cultura de células de levedura. Por exemplo, uma célula de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree pode ser cultivada com meio de cultura possuindo um valor de pH orgânico inferior a cerca de 3,0 ou contendo um hidrolisado de fibra de milho. Outros métodos para cultura de células de levedura incluem, sem limitação, cultura de células de levedura possuindo um fenótipo negativo para Crabtree a uma temperatura superior a cerca de 35°C com o meio de cultura possuindo um valor de pH inorgânico inferior a cerca de 3,0 ou contendo um hidrato de carbono pentose ou um hidrolisado de fibra de milho.

Mais, o invento proporciona um processo para produzir um produto orgânico. Este processo inclui a cultura de um microrganismo sob condições de cultura e a mudança das condições de cultura para promover a produção do produto orgânico. Neste processo, o microrganismo possui uma actividade de piruvato-descarboxilase, álcool-desidro-genase, aldeido-desidrogenase e/ou acetil-CoA-sintetase reduzida e exibe uma taxa de crescimento na ausência de etanol e acetato que é de pelo menos cerca de 30 porcento (p. ex., cerca de 35, 40, 50, 75, 100, 150, 200 porcento ou 74 PE 1183385 mais) da observada num microrganismo correspondente que não possua actividade de piruvato-descarboxilase, álcool-desidrogenase, aldeído-desidrogenase e/ou acetil-CoA-sintetase reduzida. Tipicamente, condições de cultura que promovam a respiração celular são utilizadas em situações onde é necessário um rápido crescimento celular ou onde o produto orgânico a produzir não pode ser produzido sem respiração celular, enquanto que condições de cultura que reduzam a respiração celular são utilizadas em situações onde não é necessário um crescimento rápido ou onde o produto orgânico a produzir pode ser produzido sem respiração celular. 0 invento será ainda descrito nos seguintes exemplos, que não limitam o âmbito do invento descrito nas reivindicações.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Plasmídeo recombinante pHES/pSEH 0,5 μρ do plasmideo pGAD424 descrito por Chien et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88(21): 9578-9582, 1991)

foram digeridos com a enzima de restrição HindiII. A mistura digerida foi separada através de electroforese em gel num gel de agarose a 0,8% utilizando tampão TBE. Um fragmento de 5, 9 kpb foi então purificado do gel tal como descrito em Sambrook et al. ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY 75 PE 1183385 (1989)). Foi desenhado um par de oligómeros sintéticos de 92 pb complementares com múltiplos locais de reconhecimento por enzimas de restrição. 0 primeiro foi designado oligo fwd hes e tem a seguinte sequência: 5'-CCCAAGCTTGAATTCCCCGGGGGATCCCTGCAGGGTACCACGCGTAGATCTACTAG TGCGGCCGCCTCGAGTCTAGAGGGCCCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO: 1). 0 segundo foi designado oligo comp hes e tem a seguinte sequência: 5'-CCAAGCTTGGGCCCTCTAGACTCGAGGCGGCCGCACTAGTAGATCTACGCGTGGTA CCCTGCAGGGATCCCCCGGGGAATTCAAGCTTGGG-3' (SEQ ID NO: 2). 500 nmoles dos dois oligómeros complementares foram ligados um ao outro fervendo durante dez minutos e arrefecendo gradualmente até à temperatura ambiente. O ADN de cadeia dupla de 92 pb foi digerido com HindIII e ligado no pGAD424 de 5,9 kpb digerido com HindIII. A mistura de ligação foi utilizada para transformar E. coli DH10B (células electromax, Life Technologies, Rockville, MD) através de electroporação tal como descrito em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). A E. coli recombinante foi plaqueada sobre placas de caldo de Luria-Bertani e as células contendo plasmideo foram seleccionadas utilizando 100 μρ/ιηΐ do antibiótico ampicilina. O ADN plasmídico dos clones de E. coli resistentes a ampicilina foi pesquisado para obter os dois plasmídeos pHES e pSEH (Figuras 1 e 2). Os dois plasmídeos diferem na orientação do oligómero sintético em relação ao promotor da álcool-desidrogenase - ADH1 no vector. 76 PE 1183385

Exemplo 2 - Amplificação por PCR do ácido nuclei-co que codifica a lactato-desidrogenase de Lactobacillus helveticus e Pediococcus acidilactici ADN genómico foi isolado a partir de culturas de um dia para o outro de Lactobacillus helveticus (ATCC 10797) e Pediococcus acidilactici (ATCC 25741) utilizando o estojo de isolamento de ADN genómico PUREGENE® (Gentra Systems, Minneapolis, MN). Foram desenhados iniciadores de PCR para isolar o ácido nucleico codificando a lactato-desidrogenase a partir do ADN genómico de L. helveticus (oligos lh-ldh) e de P. acidilactici (oligos pa-ldh). Estes iniciadores foram desenhados com base nas sequências génicas disponíveis para as lactato-desidrogenases nas bases de dados de Genbank e possuem as seguintes sequências: 5' lh-ldh, 5'-CCGGGATCCATGGCAAGAGAGGAAAAACCTC-3' (SEQ ID NO: 3); 3' lh-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTGACGAACCTTAACGCCAG-3' (SEQ ID NO: 4); 5' pa-ldh, 5'-CCGGGATCCATGTCTAATATTCAAAATCATCAAAAAG-3' (SEQ ID NO: 5); e 3' pa-ldh, 5'-CCAAGATCTTTATTTGTCTTGTTTTT-CAGCAAG-3' (SEQ ID NO: 6). Os iniciadores foram optimizados utilizando o suporte lógico Primer Designer obtido em Sci-ed software (Durham, NC) . Foi utilizada 1 (imole do ADN genómico juntamente com 100 nmoles de iniciadores. Foi utilizada a ADN-polimerase Pfu (New England Biolabs) para amplificar por PCR o ácido nucleico da lactato-desidrogenase (LDH) tal como descrito em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). 77 PE 1183385 É empregue uma estratégia semelhante para isolar o ácido nucleico que codifica a L-lactato-desidrogenase a partir do ADN genómico de microrganismos tais como Bacillus sp., por exemplo, Bacillus megaterium (ATCC 6458) ou Rhizopus oryzae (ATCC 76275) ou qualquer organismo produtor de lactato (incluindo microrganismos tais como fungos e bactérias e organismos multicelulares tais como mamíferos) ou a partir de tecido de um organismo produtor de lactato. 0 ADN genómico é isolado a partir de uma cultura em crescimento do organismo utilizando o estojo de isolamento de ADN genómico PUREGENE® (Gentra Systems, Minneapolis, MN). Iniciadores de PCR adequados são desenhados para isolar o ácido nucleico que codifica a lactato-desidrogenase com base nas sequências génicas da LDH para estas espécies disponíveis em Genbank. Geralmente, é utilizada 1 μιηοίε de ADN genómico juntamente com 100 nmoles dos iniciadores apropriados. É utilizada a ADN-polimerase Pfu (New England Biolabs) ou qualquer outra ADN-polimerase adequada para amplificar o ácido nucleico da lactato-desidrogenase (LDH) a partir do ADN genómico respectivo utilizando tecnologia de PCR, por exemplo, tal como descrito em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989) ) .

Alternativamente, o ácido nucleico codificando a lactato-desidrogenase é isolado a partir de Kluyveromyces thermotolerans ATCC 52709, Trichoderma reesei ATCC 13631, Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 ou qualquer outro 78 PE 1183385 organismo produtor de lactato-desidrogenase utilizando qualquer uma das seguintes metodologias: 1) Uma biblioteca de ADNc genómico de um destes organismos é clonada num vector de expressão padrão de E. coli tal como pUC19 utilizando técnicas padrão (Sambrook et al., "Molecular Cloning: a laboratory manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Uma estirpe mutante de E. coli (ldh~ pfl“) NZN111 (Bunch et al., "The ldhA gene encoding the fermentative lactate dehydrogenase of Escherichia coli", Microbiology 143: 187-95, 1997) é transformada com esta biblioteca e as células são criadas sob condições anaeróbicas em meio M9 suplementado com casaminoácidos. Qualquer E. coli que cresça sob estas condições codifica uma lactato-desidrogenase ou é um revertente em ldh ou pfl. Os positivos (colónias que se formam sob as condições de crescimento anaeróbicas) são pesquisados quanto à actividade LDH utilizando um ensaio colorimétrico de camada mole de agar especifica de ácido láctico (LASSO) que é capaz de diferenciar entre (L) -LDH e (D)-LDH (Witte et al., (J.

Basic Microbiol. 29: 707-716, 1989)). O ADN plasmidico dos clones suspeitos de expressarem L-lactato-desidrogenase são então isolados e sequenciados. 2) K. thermotolerans ATCC 52709, T. reesei ATCC 13631 e Torulaspora pretoriensis ATCC 36245 são todos eucariotas que produzem ácido L-láctico quando cultivados sob condições anaeróbicas (Witte et al., (J. Basic Microbiol. 29: 707-716, 1989)). Assim, de acordo com este método, pelo menos uma destas estirpes é criada sob 79 PE 1183385 condições anaeróbicas para induzir actividade da enzima lactato-desidrogenase. Um extracto livre de células é então obtido utilizando métodos padrão e sujeito a estratégias de purificação de proteinas conhecidas para isolar a enzima lactato-desidrogenase. Os métodos para purificação de lactato-desidrogenase são conhecidos (Kelly et ai., "Affinity chromatography of bacterial lactate dehydro-genases", Biochem. J. 171(3): 543-7, 1978). Após a proteína ser purificada, é parcialmente clivada e sequenciada para determinar a sequência de aminoácidos. Esta sequência de aminoácidos é então utilizada para desenhar iniciadores degenerados para isolar o gene que codifica a lactato-desidrogenase a partir do ADN genómico.

Uma LDH eucariótica, tal como a isolada a partir de K. thermotolerans ou Trichoderma reesei ou Torulaspora pretoriensis, pode funcionar melhor (em termos de eficiência da transcrição, eficiência da tradução e/ou actividade da proteína) na levedura K. marxianus em comparação com uma LDH de fontes bacterianas tais como Bacillus ou Lactobacillus. 3) Utilizando as sequências génicas de lactato-desidrogenase eucariótica conhecidas disponíveis em Genbank, são desenhados iniciadores degenerados para isolar o gene para a lactato-desidrogenase de ADN genómico de K. thermotolerans ATCC 52709, Γ. reesei ATCC 13631 ou Torulaspora pretoriensis ATCC 36245. O local de ligação a 80 PE 1183385 NAD+ conservado e o local de ligação a piruvato entre as sequências génicas de LDH são utilizados para desenhar iniciadores degenerados. É utilizado 1 μιηοΐθ de ADN genómico juntamente com 100 nmoles dos iniciadores. É utilizada a ADN-polimerase Pfu (New England Biolabs) ou qualquer outra ADN-polimerase adequada para amplificar fragmentos do ácido nucleico da L ( + )-lactato-desidrogenase (LDH) de acordo com métodos de PCR conhecidos, por exemplo, os descritos em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)).

Exemplo 3 - Clonagem de L. helveticus e P. acidi-lactici no vector pCRII

Os produtos de ADN de LDH amplificados por PCR foram ligados com vectores pCRII (Figuras 3 e 4) utilizando o estojo de clonagem TA obtido em Invitrogen (Carlsbad, CA). A mistura de ligação foi então utilizada para transformar E. coli DH10B utilizando métodos descritos em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). Os vectores pCRII fornecidos com o estojo permitiram a clonagem rápida dos produtos de PCR de acordo com as instruções do fabricante. Os vectores pCRII com os genes de LDH de L. helveticus e P. acidilactici estão representados na Figura 4. 81 PE 1183385

Exemplo 4 - Plasmídeo recombinante pLh ldh-HES/pPa ldh-HES possuindo os genes de LDH de L. helveticus e P. acidilactici no vector pHES

Os vectores pCRII contendo o gene de LDH de L. helveticus e P. acidilactici foram digeridos com as endonu-cleases de restrição apropriadas. O vector pHES foi semelhantemente digerido com as mesmas endonucleases de restrição. Uma inserção de 1 kpb contendo os vectores pCRII de LDH foi então ligada ao vector pHES de 6,0 kpb utilizando a ADN-ligase T4 tal como descrito em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). A mistura de ligação foi utilizada para transformar E. coli DH10B (células electromax, Life Technologies, Rockville, MD) e os clones recombinantes foram seleccionados pela resistência a ampicilina. O ADN isolado a partir dos clones recombinantes foi analisado para confirmar os vectores pLh ldh-HES e pPa ldh-HES (Figura 5) . Estes vectores contêm os genes codificando a LDH de L. helveticus e P. acidilactici no vector pHES sob o controlo do promotor da álcool-desidrogenase de levedura (ADH1).

Exemplo 5 - Clonagem do gene de LDH de Bacillus sp., Rhizopus oryzae, K. thermotolerans, Trichoderma reseei ou Torulaspora pretoriensis para expressão utilizando o promotor do gene de PDCl de Saccharomyces

Embora seja possível utilizar o promotor da lactato-desidrogenase gue se encontra em Rhizopus oryzae, 82 PE 1183385 K. thermotolerans, Trichoderma reseei ou Torulaspora pretoriensis para controlar a expressão de um gene de lactato-desidrogenase clonado em K. marxianus, o promotor de PDC1 de Saccharomyces cerevisiae pode ser utilizado para controlar a expressão do gene da lactato-desidrogenase isolado. Promotores glicoliticos de Saccharomyces cerevisiae foram utilizados com sucesso para expressar genes em estirpes de Kluyveromyces (Gellissen e Hollenberg, "Application of yeasts in gene expression studies: a comparison of Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha and Kluyveromyces lactis: a review", Gene 190(1): 87-97, 1997).

Concordantemente, o promotor de PDC1 de Saccharomyces cerevisiae é obtido através do desenho de iniciadores oligoméricos adequados utilizando a sequência genómica de Saccharomyces cerevisiae, disponível em Genbank. A sequência do gene de PDC1 e das regiões de 1 kpb que rodeiam o gene de PDC1 são amplificadas através de tecnologias de PCR. O fragmento de ADN de 4 kpb resultante contém o promotor e os terminadores que controlam a expressão do gene de PDC1. Múltiplos locais de enzimas de restrição são incluídos entre o promotor e os terminadores que controlam a expressão do gene de PDCl para que uma variedade de genes de LDH possa ser inserida sob o controlo do promotor e dos terminadores de PDCl. O fragmento de ADN de 4 kpb é inserido num vector adequado, tal como um pUC19 baseado em Saccharomyces cerevisiae ou um vector vaivém ("shuttle") de E. coli. O gene de LDH é então introduzido no vector num dos múltiplos locais de clonagem sob o 83 PE 1183385 controlo do promotor e dos terminadores para que a expressão do gene da lactato-desidrogenase seja controlada pelo promotor e pelos terminadores de PDC1 (Fig. 14) . Alternativamente, outros promotores glicoliticos de Saccharomyces tais como os que controlam a expressão dos genes da gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase ou da fosfo-glicerato-cinase de Saccharomyces cerevisiae podem ser utilizados de forma semelhante para expressar o gene de LDH clonado em K. marxianus.

Exemplo 6 - Amplificação de fragmentos lineares de ADN homólogo para destruição do gene da piruvato-descarboxilase

Um iniciador oligomérico de 82 pb (5'kmPDClKo) foi desenhado para que contivesse 51 pb idênticos à extremidade 5' da piruvato-descarboxilase (PDC) de K. marxianus e 30 pb idênticos à extremidade 5' do promotor de ADH1 de vectores pHES. A sequência de 5'kmPDClKo é como se segue: 5'-TAAACAGTACAATCGCAAAGAAAAGCTCCACACCCAAACCAAATAATTG CAATGCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTTTTCT-3' (SEQ ID NO: 7). A sequência para os genes de PDC de leveduras (K. marxianus ou Y. stipitis ou H. polymorpha) foi obtida a partir da sequência submetida ao Genbank. Semelhantemente, foi desenhado um oligómero de 79 pb inverso (3'kmPDClKo) para que 54 pb fossem idênticos à extremidade 3' do gene de PDC e 22 pb fossem idênticos à extremidade 3' do terminador de ADH1. A sequência de 3' kmPDClKo é como se segue: 5'-

TTATAAAATCATTAAAATCCAAAATCGTAATTTATCTCTTTATCCTCTCCCTCTCTACA 84 PE 1183385 TGCCGGTAGAGGTGTGGTCA-3' (SEQ ID NO: 8). Os iniciadores foram desenhados para amplificar um fragmento de ADN linear a partir dos plasmídeos pLhldh-HES e pPaldh-HES para que o fragmento contivesse o gene inteiro da lactato-desidro-genase juntamente com o promotor e o terminador de ADH1 (Figura 6) . O produto de PCR amplificado contém também extremidades que eram homólogas às sequências de PDC1 de K. marxianus, PDC1 e PDC2 de Yamadazyma stipitis e PDCl e PDC2 de Hansenula polymorpha. A reacção de amplificação foi efectuada utilizando ADN-polimerase Pfu (New England Biolabs; Beverly, MA) . Foram utilizados na reacção 100 ng de pLhldh-HES ou pPaldh-HES juntamente com 5 unidades de polimerase e 100 nmoles dos oligómeros. A reacção foi realizada de acordo com protocolos descritos em Sambrook et al., ("Molecular Cloning", segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY (1989)). A Figura 6 representa o produto linear final com as homologias descritas.

Foram preparadas construções alternativas para melhorar a probabilidade de obter uma estirpe negativa para pdc de K. marxianus. Para preparar estas construções, foi isolado um fragmento de 5,5 kpb à volta do gene de PDCl de 1,7 kpb de K. marxianus (Figura 6b) utilizando técnicas de PCR e de caminhar no genoma (Clonetech). O fragmento de 5,5 kpb foi então clonado no vector de clonagem pCRII TA (Invitrogen) utilizando métodos padrão. Uma porção de aproximadamente 370 pb próxima do meio da região de codificação de 1,7 kpb de PDCl foi removida do fragmento de 85 PE 1183385 5,5 kpb de K. marxianus através de digestões de restrição (Sambrook). O fragmento removido tem a seguinte sequência: CCGGTTCTTTCTCTTACTCTTACAAGACCAAGAACATTGTCGAATTCCACTCCGACTAC ATCAAGGTCAGAAACGCCACTTTCCCAGGTGTCCAAATGAAGTTCGTCTTGCAAAAGTT GTTGACCAAGGTCAAGGATGCTGCTAAGGGTTACAAGCCAGTTCCAGTTCCTCACGCTC CAAGAGACAACAAGCCAGT T GC T GACTCTACTCCATTGAAGCAAGAATGGGTCTGGACT CAAGTCGGTAAGTTCCTACAAGAAGGTGATGTTGTTCTAACTGAAACCGGTACCTCCGC TTTCGGTATCAACCAAACCCACTTCCCAAATGACACCTACGGTATCTCCCAAGTCTTGT GGGGTTCCATTGGTTTCA (SEQ ID NO: 10).

Um gene de resistência à canamicina e o seu promotor foram então isolados a partir de um vector pPIC9K (Invitrogen) utilizando tecnologia de restrição padrão (ver Sambrook et al.), e clonados no local nos 5,5 kpb dos quais foi removido o fragmento acima identificado. O gene de resistência à canamicina de pPIC9K (Invitrogen) e o seu promotor foram inseridos para que a sequência da região inserida fosse como se segue:

GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACT CAAC T T GC AC AT T AAC T T GAAGC T C AGT C GAT T GAGTGAAC T T GAT C AGGT T GT GC AGC TGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTC TGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAG TGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAG ATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCT GCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCC AGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATT TTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATC

CTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGT 86 PE 1183385 AATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCA TCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGC CGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTG GTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGT CAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAAT GGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTC ATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGAC GAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGC AGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATAC CTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTAC GGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACC ATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGG CGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGC GAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAG CAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGC AGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGAT TTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACA GGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCA CTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGG GACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (SEQ ID NO: 9). A construção resultante contém um gene de resistência a G418 rodeado por aproximadamente 5 kpb da região pdc tal como mostrado na Figura 6c. Foi feita uma construção de ADN semelhante que continha o gene de G418 interno rodeado por PDC1 de K. marxianus de 2,3 kpb no vector pCRII tal como mostrado na Figura 6d. 87 PE 1183385

Exemplo 7 - Utilização de um fragmento linear de ADN para destruir a sequência de codificação endógena de PDC e simultaneamente inserir uma sequência de codificação de LDH 0 fragmento de ADN linear gerado por PCR descrito no Exemplo 5 é utilizado para transformar K. marxianus, Yamadazyma stipitis ou Hansenula polymorpha. 0 protocolo utilizado para transformação é tal como descrito por Wesolowski-Louvel et al. ("Nonconventional yeasts in Bio-technology: Kluyveromyces lactis", ed. Klaus Wolf, Springer verlag, Berlim, pág. 138-201, 1996)). Resumidamente, 5 ml de uma cultura de um dia para o outro são centrifugados e lavados com tampão de electroporação (Tris-HCl 10 nM, sacarose 270 nM, MgCl2 1 nM, pH 7,5) . As células lavadas são então incubadas durante 30 minutos a 30°C em tampão de incubação (5 g/1 de extracto de levedura, 10 g/1 de caldo de peptona, 10 g/1 de glicose, DTT 25 nM, HEPES 20 nM, pH 8,0). No final deste período, as células são novamente lavadas e ressuspensas em 400 μΐ de tampão de incubação. São adicionados 200 ng de ADN a estas células e as células são pulsadas utilizando o Bio-Rad Gene Pulser a 1800 volts, 1000 Q e 25 μΕ numa cuvete de 0,4 cm.

As células são plaqueadas em placas de YPD normal (10 g/1 de extracto de levedura, 20 g/1 de caldo de peptona, 20 g/1 de glicose, agar a 15%) e as colónias são deixadas a regenerar ao longo de 72 horas. Cada uma das placas com colónias é replicada em placas de YPD fresco e 88 PE 1183385 incubada durante 48 horas. As colónias são então cobertas com agar mole a 6,5% (agar a 0,5% em Tris-HCl 300 mM, glutamato 187 mM, pH 8,3). É então adicionada uma mistura de coloração (3,2 ml de agar a 1%, 1,6 ml de Tris 120 mM, glutamato 75 mM, pH 8,3, 0,4 ml de metossulfato de fenazina a 2 mg/ml, 7 unidades de glutamato-piruvato-transaminase e 7 unidades de L(+)-lactato-desidrogenase de músculo de porco) às placas cobertas. As estirpes de levedura com L(+) elevada formam halos azuis ao fim de 10-120 minutos. Este método é semelhante ao método sugerido por Subden et al. (Canadian J. Microbiol. 28: 883-886, 1982)) e modificado por Witte et al. (J. Basic. Microbiol. 29: 707-716, 1989)). As colónias são seleccionadas e o ADN isolado a partir das colónias é testado através de análise de PCR e sequenciado para detectar o gene da piruvato-descarboxilase destruído.

Noutra concretização, os clones descritos no Exemplo 6 acima e representados nas Figuras 6c e 6d são digeridos com duas enzimas de restrição (ver, Sambrook et al.) para produzir aproximadamente 3 microgramas de fragmentos de ADN contendo a região homóloga de PDC que inclui o gene de resistência à canamicina inserido de sequência média. K. marxianus é transformada com o fragmento utilizando técnicas conhecidas, tais como electroporação, para destruir o pdc de K. marxianus.

Geralmente, a electroporação é efectuada como se segue: a) cria-se uma cultura do microrganismo em YPAD de um dia para o outro («15 h) num volume de 20 ml; b) 89 PE 1183385 transferem-se 500 μΐ da cultura para um tubo de centrífuga, centrifuga-se a 4K, 4 min, descarta-se o sobrenadante; c) lava-se o sedimento com 1 ml de TE frio (TE = Tampão de Electroporação: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; Sacarose 270 mM, MgCl2 1 mM) ; d) ressuspende-se em 1 ml de TI (TI = Tampão de Incubação: YPD; DTT 25 mM, Hepes 20 mM, pH 8,0); e) agita-se a 800 rpm, 30°C durante 30 min num Eppendorf Thermomixer; f) centrifuga-se, lava-se uma vez com TE, ressuspende-se em 400 μΐ de TE; g) adicionam-se três microgramas de fragmentos de ADN (Tris-Cl 10 mM em água, pH 8,5), incuba-se em gelo 30 min; h) transfere-se para uma cuvete de electroporação de 0,4 cm. Definições do Bio-Rad Gene Pulser: 1000 V, 1000 Q, 50 μΕ. Constante de tempo após pulso: »20 ms; i) transfere-se um tubo Morton Closure de 3 ml, incuba-se sem agitação a 30°C durante 1 hora.

Adicionam-se 400 μΐ de meio YPAD líquido (YPAD: 10 g de Extracto de Levedura; 20 g de Peptona; 20 g de Glicose; 100 mg de Hemissulfato de Adenina, Volume =11. Sem ajuste do pH), agita-se a 800 rpm, 30°C durante 1 hora num Eppendorf Thermomixer. Adicionam-se 400 μΐ de meio YPAD líquido e deixa-se recuperar 4-6 horas; j) centrifuga-se em tubo de centrífuga a 4K, 4 min, descarta-se o sobrenadante, ressupende-se em 400 μΐ de Sorbitol 1 M; k) plaqueia-se sobre placas selectivas com 200 μρ/ιηΐ de G418; e 1) incuba-se a 30°C durante três a cinco dias.

As colónias são primeiro pesquisadas através de um segundo plaqueamento sobre G418 a 300 μg/ml. O ADN genómico é isolado a partir do plaqueamento de levedura 90 PE 1183385 secundário através de preparações genómicas padrão (Sam-brook). Estas são então pesquisadas por PCR quanto 1) à presença do fragmento de canamicina utilizando iniciadores e condições adequados (Sambrook) e 2) à ausência da região pdc destruida utilizando iniciadores e condições de PCR adequados. As colónias positivas para o marcador de selec-ção e negativas para a região de destruição de pdc foram então postas a crescer e analisadas através de HPLC quanto à fisiologia. O ADN genómico destas estirpes foi ainda analisado através de análise de hibridação "Southern".

Exemplo 8 - Caracteristicas de crescimento das células 1. pH baixo/temperatura elevada

Culturas de um dia para o outro de K. marxianus foram inoculadas em 50 ml de meio minimo de levedura de acordo com Kiers et al. (Yeast 14(5): 459-469, 1998). Foi utilizada glicose a 100 g/1 como fonte de carbono. As culturas de um dia para o outro foram mantidas a 40°C e inoculadas em meio que foi também mantido a 40°C. A adição do inoculante mudou o pH do meio de 5,5 para 2,5. Durante a experiência, o pH permaneceu a 2,5. A concentração de gi icose foi medida através de membrana YSI e a densidade óptica (DO) foi medida utilizando um espectrofotómetro. A glicose foi utilizada em 72 horas, indicando que a actividade metabólica ocorre sob condições de cultura 91 PE 1183385 de pH baixo e temperatura elevada durante esse período de tempo (Figura 7). Adicionalmente, a biomassa diminuiu ligeiramente durante o período de tempo das 48 às 72, indicando que o catabolismo celular supera o anabolismo (Figura 7). 2. Fontes de carbono pentoses

Culturas de um dia para o outro de K. marxianus foram inoculadas em três balões de 50 ml contendo meio mínimo de levedura de acordo com Kiers et al. (Yeast 14(5): 459-469, 1998). Cada um dos três balões continha uma fonte de carbono diferente. O primeiro continha glicose a 10 porcento, o segundo continha D-xilose a 10 porcento e o terceiro continha L-arabinose a 10 porcento. Os balões foram incubados a 30°C e as medições da DO foram feitas periodicamente.

Após 40 horas, o rendimento de biomassa para a levedura cultivada com glicose ou xilose era semelhante, enquanto que o rendimento de biomassa para a levedura cultivada com arabinose era inferior (Figura 8) . A comparação do crescimento da levedura cultivada com glicose com o das cultivadas com xilose ou arabinose revelou um tempo de atraso inicial no crescimento. A levedura cultivada com arabinose exibiu um tempo de atraso de poucas horas, enquanto que o tempo de atraso para a levedura cultivada com xilose foi muito mais pronunciado (Figura 8). A presença deste tempo de atraso indica que as células de levedura necessitam de tempo para se adaptarem às fontes de 92 PE 1183385 carbono xilose e arabinose. Presumivelmente, este tempo é necessário para induzir a síntese de polipéptidos normalmente não expressos. 3. Hidrolisado de fibra de milho a pH baixo

Culturas de um dia para o outro de K. marxianus foram inoculadas em três balões contendo meio mínimo de levedura de acordo com Kiers et al. (Yeast 14(5): 459-469, 1998). Cada balão continha hidrolisado de fibra de milho a 30% como fonte de carbono. Resumidamente, o hidrolisado de fibra de milho foi produzido através da reacção de fibra de milho com ácido sulfúrico a 1,2% a 145°C durante 25 minutos. Durante a reacção, a hemicelulose foi quebrada nos produtos monoméricos arabinose, xilose e glicose. Devido à elevada temperatura durante a reacção, alguma arabinose e xilose foi degradada em furfural, enquanto que alguma glicose foi degradada em hidroximetilfurfural. A análise de HPLC revelou a presença de 38,7 gramas/1 de glicose, 39,1 gramas/1 de xilose, 20,7 gramas/1 de arabinose e 1,6 gramas/1 de furfural. Adicionalmente, o hidrolisado tinha um pH de 1,51. Antes da cultura da levedura o pH do hidrolisado de fibra de milho foi ajustado até 3,0. Durante a experiência de cultura, medições da DO foram feitas periodicamente.

As células de levedura foram capazes de gerar biomassa quando cultivadas com hidrolisado de fibra de milho (Figura 9). 93 PE 1183385

4. Várias condições de pH

Culturas de um dia para o outro de K. marxianus foram inoculadas em quatro balões contendo 50 ml de meio YPD (10 g/1 de extracto de levedura, 20 g/1 de caldo de

peptona, 20 g/1 de glicose). Cada um dos balões tinha um pH diferente, que foi ajustado utilizando HC1. Durante a experiência de cultura, a temperatura foi mantida a 30°C e medições da DO foram feitas periodicamente. O crescimento foi observado em cada balão (Figura 10). 5. Várias condições de pH/Ácido láctico

Culturas de um dia para o outro de K. marxianus foram inoculadas em quatro balões contendo 50 ml de meio YPD (10 g/1 de extracto de levedura, 20 g/1 de caldo de peptona, 20 g/1 de glicose) bem como 40 g/1 de ácido láctico. A adição do ácido láctico resultou num pH de 2,8. Assim, o pH dentro de três balões foi ajustado até ao pH indicado utilizando NaOH. Durante a experiência de cultura, a temperatura foi mantida a 30 °C e medições da DO foram feitas periodicamente. O crescimento foi observado em cada balão (Figura 11).

Exemplo 9 - Células recombinantes capazes de

produzir acrilil-CoA

Um organismo incapaz de utilizar acrilato como fonte de carbono (p. ex., E. coli) é transformado com uma 94 PE 1183385 biblioteca genómica de Clostridium propionicum. A biblioteca genómica de C. propionicum é gerada utilizando o plasmídeo pHES para que este expresse fragmentos de 10 kpb do genoma de C. propionicum. A E. coli transformada é plaqueada em meio de selecção com apenas ácido acrílico como fonte de carbono. Apenas as células que têm capacidade para assimilar acrilato crescerão. O acrilato é normalmente assimilado através da sua conversão em lactato mediada por enzimas. Por sua vez, o lactato pode ser convertido em piruvato e utilizado pelas células através do ciclo de Krebs.

Uma vez seleccionada uma E. coli transformada, o plasmídeo de ADN da biblioteca genómica é isolado e o fragmento inserido é sequenciado. Uma vez sequenciado, o fragmento é pesquisado quanto a enquadramentos de leitura abertos para determinar a sequência de codificação para enzimas envolvidas na conversão entre lactato e acrilato (p. ex., lactoil-CoA-desidrogenase e CoA-transferases).

Os clones isolados contendo a sequência de codificação para estas enzimas são introduzidos nas células de levedura descritas no Exemplo 6, que contêm actividade de lactato-desidrogenase mas não de piruvato-descarbo-xilase. A selecção de células de levedura recombinantes que contêm o ácido nucleico introduzido é efectuada utilizando G418 (300 g/1). Uma vez isoladas, as células de levedura recombinantes são criadas aerobicamente em glicose e depois mudadas para condições anaeróbicas. O caldo é então 95 PE 1183385 recolhido e ensaiado para acrilato utilizando métodos de HPLC padrão tal como descrito por Danner et al. ("Bio-technological production of acrylic acid from biomass", Em: "Applied Biochemistry and Biotechnology", Vol. 70-72, 1998).

Exemplo 10 - Células recombinantes capazes de produzir ascorbato

Os vectores de expressão são modificados para que os seguintes polipéptidos sejam expressos: 2,5-dioxo-valerato-desidrogenase, 5-desidro-4-desoxi-D-glucarato- desidrogenase, glucarato-desidratase, aldeido-desidrogena-se, glucuronolactona-redutase e L-gluonolactona-oxidase. As sequências de ácido nucleico que codificam estes polipéptidos são isoladas a partir de vários microrganismos. Uma vez modificados, os vectores de expressão são transformados em células de levedura através de electroporação. Uma vez transformadas, as células de levedura são analisadas para determinar se produzem ou não L-ascorbato.

Exemplo 11 - Células recombinantes capazes de produzir D-xilose

Os vectores de expressão são modificados para que os seguintes polipéptidos sejam expressos: 2-desidro-3-desoxi-D-pentanoato-aldolase, xilonato-desidratase, xilo-nolactonase e D-xilose-desidrogenase. As sequências de ácido nucleico codificando estes polipéptidos são isoladas 96 PE 1183385 a partir de Pseudomonas sp. Uma vez modificados, os vectores de expressão são transformados em células de levedura através de electroporação. Uma vez transformadas, as células de levedura são analisadas para determinar se produzem ou não D-xilose ou outros compostos de carbono pentoses.

Exemplo 12 - Células recombinantes capazes de produzir citrato

Iniciadores de PCR são desenhados com base na sequência de ácido nucleico da aconitase de S. cerevisiae (AC01, número de acesso Genbank M33131). Estes iniciadores são utilizados para clonar o ácido nucleico que codifica a aconitase a partir de uma espécie de Kluyveromyces, Yama-dazyma ou Hansenula. Uma vez sequenciadas, são feitas construções lineares tal como descrito no Exemplo 5 e utilizadas para destruir o ácido nucleico que codifica a aconitase dentro das células de levedura. 0 marcador de selecção utilizado é o antibiótico G418 em vez da produção de lactato tal como descrito no Exemplo 5. 0 ácido nucleico que proporciona resistência ao antibiótico G418 é o gene da neomicina/canamicina. Este gene é obtido a partir do vector pPIC9K (Invitrogen) e inserido no vector pHES. As células de levedura são transformadas com fragmentos lineares gerados por PCR que são concebidos para ter extremidades homólogas às de ACOl tal como descrito acima. 0 fragmento linear é concebido para codificar o gene de resistência a G418. Apenas as células que integraram o fragmento linear 97 PE 1183385 no local do ácido nucleico que codifica a aconitase são resistentes ao antibiótico. Essas células são analisadas quanto a integração apropriada utilizando PCR. As células de levedura obtidas através deste método têm um ciclo de TCA parcialmente funcional e podem assim sobreproduzir citrato. 0 citrato é transportado através da membrana mitocondrial e para o caldo. Adicionalmente, é dada a estas células de levedura uma molécula de ácido nucleico exógena que codifica uma enzima tal como a ATP-citrato-liase para que possam catalizar a conversão do citrato acumulado em oxaloacetato (ver Exemplo 13).

Exemplo 13 - Células recombinantes capazes de expressar citrato-liase no citosol

Uma célula de levedura positiva para Crabtree é transformada com o plasmideo pHES contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido possuindo actividade de ATP-citrato-liase. Este ácido nucleico é isolado a partir de E. coli, Klebsiella pneumoniae (número de acesso Genbank X79817) ou outras fontes publicadas. Uma vez transformadas, as células de levedura são analisadas para determinar se podem ou não utilizar açúcares para produzir grandes quantidades de acumulação de lipidos. Adicionalmente, as células de levedura são analisadas para determinar se exibem ou não actividade de ATP-citrato-liase tal como descrito por Holdsworth et al. (J. Gen. Microbiol. 134: 2907-2915, 1998). As células de levedura possuindo actividade de ATP-citrato-liase são capazes de proporcionar 98 PE 1183385 acetato citosólico sob condições aeróbicas através de uma via diferente da da quebra de aldeido em acetato através da aldeido-desidrogenase. Adicionalmente, quando tal levedura não tem actividade de piruvato-descarboxilase ou de aldeido-desidrogenase, deve ser capaz de proporcionar acetato para biossintese através do ciclo de Krebs.

Exemplo 14 - Células recombinantes incapazes de utilizar lactato como fonte de carbono

As células de levedura são modificadas para que a actividade de um transportador de ácido carboxilico semelhante ao polipéptido JEN1 de S. cerevisiae seja reduzida. Tais células de levedura terão uma capacidade reduzida para transportar lactato e utilizam assim o lactato com menos eficiência. A actividade do transportador de ácido carboxilico dentro das células de levedura é reduzida através da destruição do locus contendo a sequência de codificação para este polipéptido. Primeiro, o homólogo do polipéptido JEN1 é isolado a partir de uma célula hospedeira utilizando iniciadores degenerados desenhados com base na sequência disponível para JENl (número de acesso Genbank U24155). Uma vez isolado o ácido nucleico da célula hospedeira, este é sequenciado. A destruição da sequência de codificação para este polipéptido é feita utilizando os procedimentos descritos no Exemplo 11. São gerados fragmentos lineares codificando regiões homólogas às da sequência JENl bem como o gene inteiro de resistência a G418. Este fragmento linear é integrado na sequência genómica de JENl causando a destruição da actividade. As 99 PE 1183385 células sem actividade transportadora de ácido carboxílico são identificadas pela sua incapacidade para transportar ácido carboxilico e assim pela sua incapacidade para crescer quando cultivadas em lactato.

Adicionalmente, são modificadas células para que a actividade de um equivalente funcional do polipéptido do citocromo b2 de S. cerevisiae seja reduzida. 0 polipéptido do citocromo b2 permite que as células de S. cerevisiae metabolizem lactato dentro das mitocôndrias. Primeiro, são desenhados iniciadores degenerados a partir da sequência do citocromo b2 de Saccharomyces (número de acesso Genbank Z46729). Uma vez isolado, o clone é sequenciado. A destruição do homólogo do citocromo b2 da levedura hospedeira é feita utilizando métodos descritos em "Methods in Yeast Genetics" (Eds. Alison et ai., Cold Spring Harbor Press, 1997). Esta célula de levedura recombinante será incapaz de utilizar lactato como fonte de carbono.

Exemplo 15 - Produção de lactato em grande escala Múltiplas variantes de células de K. marxianus possuindo actividade de PDC reduzida são produzidas e isoladas. Cada variante é modificada para conter um número de cópias diferente de uma molécula de ácido nucleico exógena codificando o polipéptido possuindo actividade de LDH. 0 polipéptido LDH é de múltiplas fontes diferentes. Tais células variantes têm diferente produtividade especifica para o ácido láctico a 40°C. 100 PE 1183385

Cada variante é criada num vaso sob condições aeróbicas com um fluxo de ar de 1,5 VVM e um teor de oxigénio dissolvido de 30% para alcançar uma densidade celular de cerca 60 g/1, com base no peso seco. Uma vez que a densidade seja suficiente, o fluxo de ar é desligado e as condições dentro do vaso são mudadas para condições anae-róbicas. Não é adicionada nenhuma base. Pode-se verificar que as variantes com a produtividade especifica mais elevada durante a fase anaeróbica não só produzem ácido láctico mais rapidamente como também alcançam uma concentração mais elevada a um pH inferior que as variantes com produtividade especifica inferior. O rendimento de produto em glicose durante a fase de produção pode exceder os 90%.

Certas variantes são seleccionadas e sujeitas aos mesmos métodos de cultura excepto que o fluxo de ar é reduzido para 0,1 VVM, em vez de ser completamente desligado. Sob tais condições, o pH final dentro do vaso pode ser inferior, e a concentração de lactato pode ser superior à das condições sem fluxo de ar. O rendimento de produto em glicose pode ser reduzido mas pode manter-se a cerca de 90%. Quando o teste é repetido, mas com um fluxo de ar de 0,5 VVM, o rendimento de produto em glicose pode ser reduzido para menos de 80%.

Exemplo 16 - Produção de lactato em grande escala utilizando uma série de fermentações em fornadas

Uma cultura de K. marxianus sem actividade de PDC e possuindo actividade de LDH é utilizada como inoculo numa 101 PE 1183385 série de fermentações em fornadas. Cada fermentação é realizada em vasos progressivamente maiores, cada um dos quais é esterilizado imediatamente antes da sua utilização. Adicionalmente, é proporcionado a cada vaso um fluxo de ar de 1,5 VVM e agitação suficiente para manter um teor de oxigénio dissolvido acima dos 10%. O vaso final possui um volume de 6000 1. Os vasos são mantidos a uma temperatura de 45°C para aumentar a sobrevivência das células de K-marxianus geneticamente modificadas em relação à levedura de tipo selvagem e outros microrganismos. Cada vaso é enchido com meio de cultura padrão para um crescimento óptimo. O conteúdo do vaso final, com uma densidade celular de 100 gramas de células/1, com base no peso seco, é transferido para um vaso de produção recentemente sujeito a vapor possuindo um volume de 300000 1. Opcionalmente, são adicionadas mais células obtidas a partir da filtração de um processo de produção anterior. A densidade celular no vaso de produção é de 6 gramas de células/1, com base no peso seco. A glicose é adicionada a um nivel de 80 g/1. As condições dentro do vaso são anaeróbicas sendo a temperatura de 42°C durante um periodo de 25 horas. A produtividade especifica é superior a 0,5 gramas de lactato/(grama de biomassa*hora) até próximo do final do processo, momento ao qual a produtividade começa a cair. Assim que a produtividade comece a cair, as células são removidas e guardadas para reutilização. A concentração final de lactato pode ser de 75 g/1 sendo o pH de 2,8. Após remoção da biomassa, a solução é concentrada através de 102 PE 1183385 evaporação até uma concentração de lactato de 50%. O ácido livre (cerca de 86% do lactato total) é extraido através de extracção liquida para um orgânico e extraido novamente a uma temperatura superior para água. O refinado contendo o sal lactato é limpo e reciclado como tampão no vaso de crescimento ou acidificado com, por exemplo, ácido sulfúrico e purificado.

Exemplo 17 - Comparação da produção aeróbica de um organismo negativo para Crabtree (K. marxianus) e um positivo para Crabtree (S. uvarum)

Um organismo negativo para Crabtree (K. marxianus) e um positivo para Crabtree (S. uvarum) foram criados cada um em fermentadores de fornadas aeróbicos e anaeróbicos. A cultura de fornadas foi efectuada a 30°C em fermentadores laboratoriais com um volume de trabalho de 1,5 1. O pH foi mantido a 5,0 ± 0,1 através da adição automática de hidróxido de potássio (KOH) a 2 mol.l"1. O fermentador foi sujeito a uma corrente de ar (culturas aeróbicas) ou de azoto gasoso (culturas anaeróbicas) a um caudal de 0,8 l.min"1 e agitado a 800 rpm. A concentração de oxigénio dissolvido foi continuamente monitorizada com um eléctrodo de oxigénio (Ingold, tipo 341003002). Nas culturas aeróbicas, a concentração de oxigénio dissolvido foi mantida acima dos 60%. Foram retiradas amostras de 10 ml a intervalos apropriados para determinação do peso seco e das concentrações de metabolitos. Foram adicionados Tween 80® e ergosterol às culturas anaeróbicas para fornecer os compostos necessários para a síntese de ácidos gordos. 103 PE 1183385

Durante o crescimento exponencial, tanto o peso seco como a ϋΟεεο das culturas de levedura, e a concentração de glicose e de etanol no sobrenadante foram determinados a intervalos apropriados. A taxa especifica de produção de etanol (qetanoi mmol'g-1'h_1) foi calculada através da seguinte equação utilizando análise de regressão linear: q e tan ol dE dCx • μ max dE/dt (a taxa de aumento da concentração de etanol na cultura, mmol'l_1'h_1) e dCx/dt (a taxa de aumento da concentração de biomassa; g'l_1'h_1) foram calculadas utilizando diferenciação dos gráficos da concentração de etanol e da concentração de biomassa versus tempo, qmax(h_:L). A taxa máxima de crescimento especifica em glicose foi estimada a partir da parte exponencial de um gráfico de Cx versus tempo. Para calcular a taxa de consumo especifico de glicose (qgiicose^ mmol'g_1'h_1) , dE foi substituída por dG (quantidade de glicose consumida por hora).

Nas culturas em fornadas aeróbicas, as estirpes de Kluyveromyces e de Saccharomyces exibiram uma taxa máxima de crescimento específica em glicose de 0,4 h_1 e 0,28 h"1, respectivamente. A elevada concentração de glicose e a resultante elevada taxa de crescimento específica da cultura de Saccharomyces resultou em taxas elevadas de fermentação alcoólica aeróbica (Tabela 3, Fig. 12) . A taxa específica de consumo de glicose foi cerca de 2 104 PE 1183385 vezes superior na estirpe de Saccharomyces em comparação com a estirpe de Kluyveromyces devido à vigorosa fermentação alcoólica. De um ponto de vista energético, a fermentação alcoólica é uma via menos eficiente para a célula produzir ATP. O rendimento de biomassa em glicose foi de 0,38 g/g para Kluyveromyces e de 0,14 g/g para Saccharomyces uvarum. O rendimento de etanol em glicose foi zero para a estirpe de Kluyveromyces de fenótipo negativo para Crabtree e de 1,83 mmol/mmol para a cultura de Saccharomyces, o fenótipo positivo para Crabtree.

Tabela 13. Taxa de crescimento máxima especifica, taxas específicas (q, mmol [g de biomassa] “1h"1) de produção de etanol e de consumo de glicose, o rendimento de biomassa (g/g), rendimento de produto (mmol/mmol) e recuperação de carbono (em %; calculada apenas para culturas anaeróbicas) durante o crescimento exponencial em culturas de fornadas de Saccharomyces uvarum e Kluyveromyces marxlanus em meio mineral contendo glicose a 2% (p/v). K. marxlanus 5. uvarum aeróbicas anaeróbicas aeróbicas anaeróbicas

Mmáx (h ) 0,38 0,09 0,28 0, 12 ^glicose 5, 8 7, 6 10, 9 7,2 Metanol 0 9, 9 20 9,7 Y p/s 0 1,30 1,83 1,35 Y x/s 0,38 0,07 0,14 0,09 C-rec - 84, 6 - 73,3 105 PE 1183385

Em culturas de fornadas anaeróbicas, a taxa de crescimento específica e o rendimento de biomassa para ambas as estirpes foram muito baixos em comparação com os verificados sob condições aeróbicas (Tabela 3, Fig. 12). Para as estirpes de Kluyveromyces e de Saccharomyces, o rendimento de biomassa foi de 0,07 e 0,09 g/g, respectivamente. Ambas as estirpes têm um desempenho igualmente bom em relação à taxa específica de fermentação alcoólica sob condições anaeróbicas. Isto foi confirmado utilizando dados da produção de CO2.

Geralmente, este Exemplo demonstra gue a produção aeróbica de biomassa é muito mais rápida que a anaeróbica, e que o rendimento de biomassa sob condições aeróbicas é superior para organismos negativos para Crabtree (porque, em organismos positivos para Crabtree, ocorre alguma fermentação alcoólica, utilizando glicose) . Este Exemplo demonstra também que o produto de fermentação (etanol, neste caso) é produzido à mesma taxa tanto para organismos positivos como para negativos para Crabtree sob condições anaeróbicas. Assim, um estádio de crescimento anaeróbico proporciona o rendimento elevado de biomassa e um subsequente estádio de fermentação anaeróbico canaliza energia metabólica para a formação de produto (em vez de mais crescimento). Globalmente, um processo em que a produção é separada do crescimento proporciona uma grande flexibilidade de processo e um melhor controlo do rendimento global do processo. 106 PE 1183385

Exemplo 18: Produção melhorada de lactato numa estirpe hospedeira que produz naturalmente ácido L-láctico: amplificação de fragmentos lineares de ADN homólogo para destruições de genes de piruvato-descarboxilase A levedura Kluyveromyces thermotolerans (K. thermotolerans) é um produtor natural de ácido L-láctico (Kurtzman e Fell, "The Yeast, A Taxonomic Study", págs. 240-241; Elsevier Science B.V.; 1998; Amesterdão, Holanda). K. thermotolerans possui um gene de lactato-desidrogenase de ocorrência natural (ldh) que permite a produção de ácido L-láctico. A quantidade de ácido láctico produzida sob condições anaeróbicas é de aproximadamente 4% g/g da glicose utilizada, enquanto que o restante da glicose é essencialmente convertido em etanol (42,5% g/g de glicose consumida), glicerol (3% g/g da glicose consumida) e acetato (0,3% g/g de glicose consumida).

Tabela 4. Resultados de fermentação anaeróbica utilizando K. thermotolerans, partindo com 100 g/1 de glicose em meio YPAD (meio rico).

Tempo Glicose láctico acetato glicerol etanol láctico YSI 0 92,937 0 0 0 0,025 0,06 12 79, 603 0,476 0 0,41 3,345 0, 6 36 38,618 2,135 0 2,011 25,642 2,08 54 11,662 3,525 0,2 2,789 41,522 3,34 78 1,539 4,322 0,209 3,213 42,5 3,88 98 0,286 4,365 0,307 3,24 42,5 3,74 107 PE 1183385

Uma região de 600 pb da PDC1 foi isolada a partir de K. thermotolerans utilizando iniciadores de consenso construídos a partir de uma sequência derivada da comparação da sequência do gene de PDC1 de K. marxianus com K. lactis. O fragmento de PDCl foi então sequenciado (Sanger) e utilizado para isolar um fragmento de 7,5 kpb circundando o pdcl de K. thermotolerans (Figura 6e) utilizando PCR e técnicas de caminhada no genoma ("genome walking") (Clontech) . O fragmento de 7,5 kpb foi então clonado no vector de clonagem pCRII TA (Invitrogen). Uma porção de aproximadamente 730 pb próximo do meio da região de codificação de PDC1 foi removida do fragmento de 7,5 kpb de K. thermotolerans. A porção de pdcl de K. thermotolerans removida através de digestões de restrição (Sambrook) continha a seguinte sequência:

TTACCACTGTCTTCGGTCTGCCAGGTGACTTCAATCTGCGTCTGTTGGACGAGATCTAC

GACGTCGAGGGTATGAGATGGGCCGGTAACTGTAACGAGTTGAACGCTTCTTACGCTGC

CGACGCTTACGCCAGAATCAAGGGTATGTCCTGTTTGATCACCACCTTCGGTGTCGGTG

AGTTGTCCGCTTTGAACGGTATCGCCGGTTCTTACGCTGAGCACGTCGGTGTCTTGCAC

ATTGTCGGTGTCCCATCCGTCTCCGCCCAGGCCAAGCAGCTATTGTTGCACCACACCTT

GGGTAACGGTGACTTCACTGTCTTCCACAGAATGTCCGCCAACATCTCTGAGACCACTG

CTATGATCACTGATCTAGCTACCGCCCCATCTGAGATCGACAGATGTATCAGAACCACC

TACATTAGACAGAGACCTGTCTACTTGGGTTTGCCATCTAACTTCGTTGACCAGATGGT

CCCAGCCTCTCTATTGGACACCCCAATTGACTTGGCCTTGAAGCCAAACGACCAGCAGG

CTGAGGAGGAGGTCATCTCTACTTTGTTGGAGATGATCAAGGACGCTAAGAACCCAGTC

ATCTTGGCTGACGCTTGCGCTTCCAGACACGATGTCAAGGCTGAGACCAAGAAGTTGAT

TGACATCACTCAGTTCCCATCTTTCGTTACCCCAATGGGTAAGGGTTCCATTGACGAGA 108 PE 1183385

AGCACCCAAGATTCGGTGGTGTCTACGTCGGTACCTTGT (SEQ ID NO: XX). Um gene codificando resistência à canamicina, incluindo o seu promotor, foi então isolado a partir do vector pPIC19K

(Invitrogen) através de digestões de restrição (Sambrook) e clonado no local nos 7,5 kpb, aqueles dos quais foi removido o fragmento de 730 pb. A sequência do gene de resistência à canamicina e do seu promotor de pPIC9K (Invitrogen) foi como se segue:

GTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACT CAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGC TGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTC TGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAG TGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAG ATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGACCTGCAGGGGGGGGGGGGGCGCTGAGGTCT GCCTCGTGAAGAAGGTGTTGCTGACTCATACCAGGCCTGAATCGCCCCATCATCCAGCC AGAAAGTGAGGGAGCCACGGTTGATGAGAGCTTTGTTGTAGGTGGACCAGTTGGTGATT TTGAACTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTGCGTTGTCGGGAAGATGCGTGATCTGATC CTTCAACTCAGCAAAAGTTCGATTTATTCAACAAAGCCGCCGTCCCGTCAAGTCAGCGT AATGCTCTGCCAGTGTTACAACCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCA TC AAAT GAAAC T GC AAT T T AT T C AT AT CAGGAT T ATCAAT ACCAT AT T T TTGAAAAAGC CGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTG GTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGT CAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAAT GGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTC ATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGAC GAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGC AGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATAC

CTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTAC 109 PE 1183385 GGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACC ATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGG CGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGC GAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTCGAG CAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGC AGACAGTTTTATTGTTCATGATGATATATTTTTATCTTGTGCAATGTAACATCAGAGAT TTTGAGACACAACGTGGCTTTCCCCCCCCCCCCTGCAGGTCGGCATCACCGGCGCCACA GGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCA CTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGG GACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATG (SEQ ID NO: 9). A construção resultante inclui o gene de resistência à canamicina (G418) rodeado por aproximadamente 6, 8 kpb da região de PDC tal como mostrado na Figura 6f. A construção representada na Figura 6f é digerida com duas enzimas de restrição (Sambrook) para render aproximadamente 3 microgramas de fragmentos de ADN contendo a região de PDC homóloga e o gene de resistência à canamicina inserido na sequência média. K. thermotolerans é transformada com o fragmento utilizando técnicas de transformação conhecidas, tais como electroporação, para destruir o PDC de K. thermotolerans. O método de electroporação é como se segue: a) cria-se uma cultura em YPAD de um dia para o outro (r *15 h) num volume de 20 ml; b) transferem-se 500 μΐ da cultura para um tubo de micro- centrífuga, centrifuga-se a 4K, 4 min, descarta-se o sobrenadante; c) lava-se com 1 ml de TE frio (TE = Tampão de Electroporação: Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; Sacarose 270 mM, 110 PE 1183385

MgCl2 1 mM) ; d) ressuspende-se em 1 ml de TI (TI = Tampão de Incubação; YPD; DTT 25 mM, Hepes 20 mM, pH 8,0); e) agita-se a 800 rpm, 30°C durante 30 min num Eppendorf Thermomixer; f) centrifuga-se, lava-se uma vez com TE, ressuspende-se em 400 μΐ de TE; g) adicionam-se três microgramas de fragmentos de ADN (Tris-Cl 10 mM em água, pH 8,5), incuba-se em gelo 30 min; h) transfere-se para uma cuvete de electroporação de 0,4 cm. Definições do Bio-Rad Gene Pulser: 1000 V, 1000 Q, 50 μΕ. Constante de tempo após o pulso: »20 ms; i) transfere-se para tubos Morton Closure de 3 ml, incuba-se sem agitação a 30°C durante 1 hora. j) adicionam-se 400 μΐ de meio YPAD liquido (YPAD: 10 g de Extracto de Levedura; 20 g de Peptona; 20 g de Glicose; 100 mg de Hemissulfato de Adenina, Volume =11. Sem ajuste do pH), agita-se a 800 rpm, 30°C durante 1 hora num Eppendorf Thermomixer; k) adicionam-se 400 μΐ de YPAD liquido e deixa-se a recuperar 4-6 horas; 1) centrifuga-se em tubo de microcentrifuga a 4K, 4 min, descarta-se o sobrenadante, ressupende-se em 400 μΐ de Sorbitol 1 M e plaqueia-se sobre placas selectivas com G418 a 100 μρ/ιηΐ; e m) incuba-se a 30°C durante três a cinco dias.

As colónias são primeiro pesquisadas através de um segundo plaqueamento numa placa de cultura contendo G418 a 200 μρ/ιηΐ. O ADN genómico é isolado a partir do plaqueamento de levedura secundário utilizando preparações genómicas padrão (Sambrook). O ADN genómico é então pesquisado por PCR quanto 1) à presença do fragmento de cana- 111 PE 1183385 micina utilizando iniciadores e condições adequados (Sam-brook) ; e 2) à ausência da região de PDC destruída utilizando iniciadores e condições de PCR adequados. As colónias positivas para o marcador de selecção e negativas para a região de destruição de PDC são então postas a crescer para mais estudos, por exemplo, o ADN genómico destas estirpes foi ainda analisado através de análise de hibridação "Southern".

Lisboa, 29 de Setembro de 2006

Claims

PE 1183385 1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para produzir um produto orgânico seleccionado, compreendendo o referido método: a) proporcionar um microrganismo exibindo um fenótipo negativo para Crabtree; b) cultura do microrganismo negativo para Crabtree num primeiro meio de cultura que inclui uma fonte de carbono sob um primeiro conjunto de condições de cultura que promovem a respiração celular; e c) cultura de um microrganismo negativo para Crabtree num meio de cultura que inclui uma fonte de carbono sob um segundo conjunto de condições de cultura que promovem a produção do produto orgânico seleccionado, em que são produzidos não mais de 0,3 gramas de biomassa por grama de fonte de carbono consumida sob o segundo conjunto de condições de cultura.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microrganismo negativo para Crabtree é geneticamente modificado.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o produto orgânico seleccionado compreende um produto derivado de piruvato.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o microrganismo negativo para Crabtree é geneticamente 2 PE 1183385 modificado para incluir um gene de lactato-desidrogenase exógeno e o produto derivado de piruvato é lactato.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o gene de lactato-desidrogenase é seleccionado de entre o grupo que consiste em lactato-desidrogenase bovina, lactato-desidrogenase bacteriana e lactato-desidrogenase fúngica.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a fonte de carbono no primeiro meio de cultura compreende glicose.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a fonte de carbono no segundo meio de cultura compreende glicose.
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o primeiro conjunto de condições de cultura compreende condições aeróbicas.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o segundo conjunto de condições de cultura compreende condições anaeróbicas.
10. Método de acordo com a reivindicação 3 para produção de um produto derivado de piruvato seleccionado, compreendendo ainda: 3 PE 1183385 d) cultura do microrganismo sob um terceiro conjunto de condições de cultura que compreende um meio de cultura que inclui um agente que aumenta a energia metabólica do microrganismo.
11. Método de acordo com a reivindicação 10 em que o primeiro conjunto de condições de cultura compreende condições aeróbicas e o segundo conjunto de condições de cultura compreende condições anaeróbicas.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 em que o primeiro, segundo e terceiro conjuntos de condições de cultura incluem um meio de cultura que inclui glicose.
13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o agente que aumenta a energia metabólica do microrganismo compreende oxigénio.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microrganismo é uma levedura seleccionada de entre o grupo que consiste em Kluyveromyces, Pichia, Hansenula, Candida, Trichosporon e Yamadazyma.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o microrganismo negativo para Crabtree é geneticamente modificado para incluir um gene de lactato-desidrogenase exógeno, o produto derivado de piruvato é lactato, a fonte de carbono no primeiro e segundo meios de cultura inclui glicose, o primeiro conjunto de condições de cultura com- 4 PE 1183385 preende condições aeróbicas e o segundo conjunto de condições de cultura compreende condições anaeróbicas.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o microrganismo é uma levedura do género Kluyveromyces.
17. Utilização de um microrganismo geneticamente modificado, exibindo um fenótipo negativo para Crabtree, num processo para a produção de ácido láctico, em que o referido processo compreende uma fase aeróbica e uma fase anaeróbica.
18. Estirpe de levedura de K. thermotolerans sem capacidade de produção de etanol ou possuindo uma capacidade de produção de etanol reduzida em relação à levedura de tipo selvagem da mesma estirpe e possuindo um gene de lactato-desidrogenase endógeno. Lisboa, 29 de Setembro de 2006