BR112016029704B1 - Produção de xilitol a partir de glicose por uma cepa recombinante - Google Patents

Abstract

CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE COM CAPACIDADE DE PRODUZIR XILITOL, MÉTODO PARA PRODUZIR XILITOL, E USO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE. A presente invenção se refere a um hospedeiro microbiano recombinante para a produção de xilitol, em que o hospedeiro microbiano recombinante contém uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) que usa D- arabitol como substrato e que produz D-xilulose como produto, e uma sequência de ácido nucleico que codifica uma xilitol desidrogenase específica de NADPH que usa D-xilulose como substrato e que produz xilitol como produto.

Description

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a um método de uso de micro-organismos geneticamente modificados para a fabricação de xilitol, e um método de preparação de um micro-organismo geneticamente modificado que tem capacidade de converter em uma etapa fontes de carbono prontamente disponíveis, tal como D-glicose, em xilitol.

Antecedentes da Invenção

O xilitol é um poliálcool ou álcool de açúcar (alditol), de fórmula (CHOH)3(CH2OH)2, que tem aplicações em produtos e formulações de higiene e nutracêuticos.

O xilitol é usado como um adoçante diabético que é aproximadamente tão doce quanto sacarose com 33% a menos de calorias. Diferentemente de outros adoçantes naturais ou sintéticos, o xilitol é ativamente benéfico para saúde dental ao reduzir cáries para um terço em uso regular e útil para a remineralização.

O xilitol é naturalmente encontrado em baixas concentrações nas fibras de muitas frutas e vegetais, e pode ser extraído de várias bagas, aveias e cogumelos, bem como material fibroso tais como cascas de milho e bagaço de cana- de-açúcar, e bétula.

Entretanto, a produção industrial começa a partir de xilano (uma hemicelulose) extraído de madeiras de lei ou espigas de milho, que é hidrolisado formando xilose e cataliticamente hidrogenado formando xilitol.

A purificação de xilose e também xilitol apresenta, portanto, um problema significativo. Inúmeros processos desse tipo são conhecidos. As patentes U.S. 4.075.406 e U.S. 4.008.285 podem ser mencionadas como exemplos.

A redução de D-xilose formando xilitol também pode ser alcançada em um processo microbiológico que usa cepas de levedura isoladas da natureza (cepas do tipo selvagem) ou cepas criadas por engenharia genética.

Entretanto, a obtenção do substrato, D-xilose, em uma forma adequada para fermentação de levedura é um problema devido ao fato de que as fontes de xilose baratas, tais como licor de sulfito de polpa e processos de papel, contêm impurezas que inibem o crescimento de levedura.

Um método alternativo atraente para a fabricação de xilitol é obter o mesmo por fermentação de um substrato barato e prontamente disponível, tal como D-glicose.

No estado da técnica, existem alguns micro-organismos recombinantes descritos com capacidade de produzir xilitol em certas quantidades durante uma fermentação de uma etapa de quaisquer fontes de carbono comuns além de D-xilose e D-xilulose.

Esses micro-organismos recombinantes, especialmente, leveduras osmofílicas, são, por exemplo, Zygosaccharomyces rouxii, Candida polymorpha, e Torulopsis candida, inicialmente conhecidos como produtores de quantidades significativas de um xilitol bastante relacionado a pentitol, que é D-arabitol, de D-glicose (Lewis D.H. & Smith D.C., 1967, New Phytol. 66:143 a 184).

Dessa forma, o pedido de patente internacional WO 94/10325 fornece métodos para construir tais hospedeiros recombinantes que têm capacidade de produzir xilitol quando desenvolvidos em fontes de carbono diferentes de D-xilulose ou D-xilose, e diferentes de polímeros ou oligômeros ou misturas dos mesmos.

No presente pedido de patente, esse objetivo é alcançado através de modificação do metabolismo do micro-organismo desejado, de preferência, um micro-organismo de levedura de ocorrência natural, ao introduzir e expressar genes heterólogos desejados.

Esse objetivo é também alcançado por modificação adicional do metabolismo de tal micro-organismo desejado, com a finalidade de superexpressar e/ou inativar a atividade ou a expressão de certos genes homólogos a tal micro-organismo em seu estado nativo.

O método fornecido neste pedido de patente para a produção de xilitol utilizou uma via de biossíntese de D- arabitol alterada, sendo que tal via é notavelmente alterada ao estender a via de D-arabitol pré-existente pela introdução e pela superexpressão dos genes que codificam a D-arabitol desidrogenase formadora de D-xilulose (EC 1.1.1.11) e xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) em um micro-organismo que produz D-arabitol.

Entretanto, o rendimento de xilitol nos ensaios descritos no documento WO 94/10325 foi apenas aproximadamente 7,7 g/l após 48 horas de cultivação em um meio com extrato de levedura.

Para tentar otimizar esse primeiro resultado, foi adicionalmente proposta no documento WO 94/10325 a inativação, com o uso de mutagênese ou ruptura genética, dos genes que codificam para transquetolase (EC 2.2.1.1) e/ou do gene que codifica D-xiluloquinase (EC 2.7.1.17), e também a superexpressão dos genes que codificam as enzimas do ramal de oxidação da via de pentose-fosfato e, especificamente, do gene D-glicose-6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49) e/ou 6- fosfo-D-gluconato desidrogenase (EC 1.1.1.44) e/ou D- ribulose-5-fosfato epimerase (EC 5.1.3.1) em tais micro-organismos.

Porém, independentemente de qualquer combinação genética empregada, o titulador de xilitol nunca foi mais do que 9 g/l.

Portanto, há ainda uma necessidade não satisfeita por uma melhor manipulação genética de cepas que produzem xilitol a fim de otimizar sua produção e, dessa forma, tornar as mesmas comercialmente lucrativas.

Sumário da Invenção

A presente invenção se refere a uma célula hospedeira recombinante com capacidade de produzir xilitol, em que a dita célula hospedeira compreende: uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) que usa D-arabitol como substrato e que produz D-xilulose como produto; e, uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica uma xilitol desidrogenase específica de NADPH que usa D-xilulose como substrato e que produz xilitol como produto.

De preferência, a célula hospedeira não consome D- arabitol como uma única fonte de carbono. Com mais preferência, a célula hospedeira é selecionada a partir de bactérias, fungos e levedura. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é uma levedura osmofílica ou osmotolerante, em particular, Pichia ohmeri.

De preferência, a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) é de E. coli ou Ralstonia solanacearum. Com mais preferência, a D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 2 ou 43 ou uma sequência com 1 a 3 adições, substituições ou deleções de aminoácidos. Em uma modalidade preferencial, a sequência que codifica a D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 3 ou 42.

De preferência, a xilitol desidrogenase específica de NADPH é uma xilitol desidrogenase de Pichia stipitis ou Gluconobacter oxydans mutada para alterar a especificidade de cofator de NADH para NADPH. Com mais preferência, a xilitol desidrogenase específica de NADPH compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 5 ou 8 ou uma sequência com 1 a 3 adições, substituições ou deleções de aminoácidos. Em uma modalidade preferencial, a sequência que codifica o xilitol desidrogenase específica de NADPH compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 6 ou 9.

De preferência, a célula hospedeira tem capacidade de produzir um titulador de xilitol de pelo menos 15 g/l no sobrenadante após uma cultura de 48 h.

De preferência, a célula hospedeira é uma cepa selecionada a partir de cepas I-4982, I-4960 e I-4981 depositadas no CNCM.

De preferência, a célula hospedeira compreende várias cópias de uma sequência que codifica uma D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ e/ou várias cópias de uma sequência que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH.

A presente invenção também se refere a um método para produzir xilitol que compreende cultivar uma célula hospedeira recombinante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e recuperar xilitol.

Isso adicionalmente se refere a um ácido nucleico que compreende ou consiste em uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No 1, 3, 7 e 9, um cassete ou vetor de expressão que compreende o dito ácido nucleico.

Finalmente, a presente invenção se refere ao uso de células hospedeiras recombinantes, de acordo com a presente invenção, para produzir xilitol.

Descrição Detalhada da Invenção Definições

Conforme usado no presente documento, um "fonte de carbono diferente de D-xilose e D-xilulose" significa um substrato de carbono para produção de xilitol diferente de D- xilose e D-xilulose ou polímeros ou oligômeros ou misturas dos mesmos (tais como xilano e hemicelulose). A fonte de carbono inclui, de preferência, D-glicose e vários xaropes que contêm D-glicose e misturas de D-glicose com outros açúcares.

Conforme usado no presente documento, “gene” significa uma sequência de ácidos nucleicos que pode codificar uma proteína, em particular, uma sequência de DNA.

Conforme usado no presente documento, “vetor” significa um plasmídeo ou qualquer outra sequência de DNA que tem capacidade de portar informações genéticas, especificamente DNA, em uma célula hospedeira. O vetor pode conter, adicionalmente, um marcador ou repórter adequado para uso na identificação de células transformadas com o vetor e as origens de replicação que permitem a manutenção e a replicação do vetor em um ou mais hospedeiros procarióticos ou eucarióticos. Um "plasmídeo" é um vetor, em geral DNA circular, que é mantido e replica autonomamenteem pelo menos uma célula hospedeira.

Conforme usado no presente documento, “vetor de expressão” significa um vetor similar a um vetor, mas que suporta a expressão de um gene ou que codifica ácido nucleico que foi clonado formando o mesmo, após a transformação em um hospedeiro. O gene clonado ou que codifica ácido nucleico é usualmente colocado sob o controle (isto é, ligado de maneira operacional a) de certas sequências de controle tais como sequências promotoras, que podem ser fornecidas pelo vetor ou pela construção recombinante do gene clonado. As sequências de controle de expressão variarão dependendo de se o vetor é projetado para expressar o gene ligado de modo operacional em um hospedeiro procariótico ou eucariótico e podem conter adicionalmente elementos transcricionais tais como elementos acentuadores (sequências de ativação a montante) e sequências de terminação, e/ou sítios de terminação e iniciação de tradução.

Conforme usado no presente documento, “hospedeiro” significa uma célula, procariótica ou eucariótica, que é utilizada como o recipiente e o veículo de material recombinante.

Conforme usado no presente documento, “ramal de oxidação da via de pentose-fosfato” significa incluir a parte da derivação de pentose-fosfato que catalisa as reação oxidantes, tais como as reações catalisadas por D-glicose-6- fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49) gluconolactonase (EC 3.1.1.17) e 6-fosfo-D-gluconato desidrogenase (EC 1.1.1.44), e que utilizam substratos de hexose para formar pentose fosfatos. A parte "não oxidante" da via de pentose-fosfato (que também catalisa a formação líquida de ribose a partir de D-glicose) é caracterizada por isomerizações não oxidantes, tais como as reações catalisadas por transquetolase (EC 2.2.1.1), ribose-5-fosfato isomerase (EC 5.3.1.6), D- ribulose-5-fosfato-3-epimerase (EC 5.1.3.1) e transaldolase (EC 2.2.1.2). Consulte Biological Chemistry, H.R. Mahler & E.H.Cordes, Harper & Row, publishers, New York, EUA, 1966, páginas 448 a 454.

Conforme usado no presente documento, "ácido nucleico de codificação" significa uma molécula de ácido nucleico (de preferência, DNA). O ácido nucleico de codificação tem capacidade de codificar uma proteína e pode ser preparado a partir de uma variedade de fontes. Essas fontes incluem DNA genômico, cDNA, DNA sintético e combinações dos mesmos.

“Heterólogo”, conforme usado no presente documento, significa que um gene ou sequência de codificação foi introduzido na célula por engenharia genética. Isso pode estar presente em forma epissomal ou cromossômica. O gene ou sequência de codificação pode se originar de uma fonte diferente da célula hospedeira na qual é introduzido. Entretanto, isso também pode surgir da mesma espécie da célula hospedeira na qual é introduzido, mas é considerado heterólogo devido a seu ambiente que não é natural. Por exemplo, o gene ou sequência de codificação é chamado de heterólogo devido ao fato de que está sob o controle de um promotor que não é seu promotor natural e é introduzido em um local que difere de seu local natural. A célula hospedeira pode conter uma cópia endógena do gene antes da introdução do gene heterólogo ou pode não conter uma cópia endógena.

Objetivo da Invenção

De acordo com a invenção, as vias metabólicas nativas de um hospedeiro microbiano hospedeiro são manipuladas com a finalidade de diminuir ou eliminar a utilização de carbono nos propósitos diferentes de produção de xilitol.

Tal cepa hospedeira geneticamente modificada tem, dessa forma, capacidade de produzir xilitol em uma etapa de fermentação com uma produtividade alta. Por exemplo, o titulador de xilitol após 48 h de cultura no sobrenadante é mais que 15 g/l, de preferência, mais que 25 g/l, ainda com mais preferência mais que 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 g/l.

Na realização prática da invenção, o hospedeiro geneticamente modificado da invenção também é caracterizado por sua capacidade de sintetizar xilitol a partir de fontes de carbono estruturalmente não relacionadas tal como D- glicose, e não apenas a partir de D-xilose e/ou D-xilulose.

De preferência, o hospedeiro geneticamente modificado da invenção também tem capacidade de secretar o xilitol sintetizado no meio.

Especificamente, nas modalidades preferenciais e exemplificativas, o hospedeiro geneticamente modificado da invenção é caracterizado por um via na qual o arabitol é um intermediário na formação de xilitol.

Consequentemente, a cepa hospedeira recombinante da invenção é caracterizada pelas seguintes alterações genéticas: (1) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína que possui atividade de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (formadora de D-xilulose) foi introduzido na célula hospedeira - fornecendo, dessa forma, a conversão de D-arabitol em D-xilulose; e (2) um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína que possui atividade de xilitol desidrogenase específica de NADPH foi introduzido na célula hospedeira- fornecendo, dessa forma, a conversão de D-xilulose em xilitol.

A escolha do micro-organismo

Os micro-organismos ou cepas hospedeiras cepas para a presente invenção tem capacidade de produzir D-arabitol a partir de glicose. Mais particularmente, os mesmos têm capacidade de produzir quantidades significativas de D- arabitol a partir de glicose sob meio de pressão osmótica alta.

“Meio de pressão osmótica alta” se refere aqui a um meio que contém 10 a 60% de D-glicose, de preferência, cerca de 25% de D-glicose.

“Quantidades significativas de D-arabitol” significa pelo menos 100 g/l de D-arabitol. Em particular, um micro-organismo ou cepa hospedeira é considerado como producente de quantidades significativas de D-arabitol quando o micro-organismo ou a cepa hospedeira produz 100g/l de D- arabitol em um meio que contém 25% de D-glicose em condições de batelada.

Os exemplos de cepas hospedeiras com capacidade de produzir quantidades significativas de D-arabitol a partir de glicose incluem leveduras osmofílicas ou osmotolerantes, em particular, as pertencentes às espécies Pichia, Kodamaea,Candida, Zygoaccharomyces, Debaromyces, Metschnikowia e Hansenula; ou a D-arabitol que produz fungos, em particular, as pertencentes às espécies Dendryphiella e Schizophyllum, em particular, Dendryphiella salina e Schizophyllum commune.

Os exemplos dos micro-organismos dos gêneros Pichia incluem Pichia ohmeri, Pichia stipitis, Pichia farinosa, Pichia haplophila. Os exemplos dos micro-organismos do gênero Candida incluem Candida polymorpha e Candida tropicalis. Os exemplos dos micro-organismos do gênero Zygoaccharomyces incluem Zygoaccharomyces rouxii. Outros exemplos incluem Torulopsis candida e Torulaspora hansenii. Os exemplos dos micro-organismos do gênero Metschnikowia incluem Metschnikowia pulcherrima, Metschnikowia reukaufii, Metschnikowia bicuspidata, Metschnikowia lunata e Metschnikowia zobellii. Como cepas específicas, ATCC 18406 de Metschnikowia pulcherrima, ATCC 18407 de Metschnikowia reukaufii, ATCC 24179 de Metschnikowia bicuspidata, ATCC 22033 de Metschnikowia lunata, ATCC 22302 de Metschnikowia zobellii e FERM BP-7161 de Metschnikowia pulcherrima podem ser mencionadas. Essas cepas podem ser obtidas junto à American Type Culture Collection, Endereço: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Estados Unidos da América. A FERM BP-7161 de Metschnikowia pulcherrima foi originalmente depositada no National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (código postal: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão) em 16 de janeiro de 1998, sob o número de depósito de FERM P-16592 e transferida do depósito original para o depósito internacional com base no Tratado de Budapeste em 15 de maio de 2000, e foi depositada como número de depósito FERM BP-7161. Em um aspecto específico, o micro-organismo tem o número de acesso FERM BP-7161. Para mais informações, referir-se a EP1065276.

O micro-organismo pode ser geneticamente modificado a fim de aprimorar sua capacidade de produzir D-arabitol e/ou reduzir sua capacidade de usar D-arabitol para um objetivo distinto de produção de xilitol.

Para a invenção, a cepa hospedeira é vantajosamente escolhida por seus atributos metabólicos específicos: a mesma pode ser uma produtora de quantidades significativas de D-arabitol de glicose como detalhado acima, em particular, sob meio de pressão osmótica alta, por exemplo, meio que contém 10 a 60% de D-glicose e, de preferência, 25% de D-glicose (meio "Normal" contém usualmente apenas 2 a 3% de glicose.) a mesma pode não consumir D-arabitol como uma única fonte de carbono; seu equilíbrio de potencial de redução permite a geração dos cofatores necessários para a conversão de álcool de cetopentose/pentose correspondente.

Em uma modalidade da invenção, a levedura osmofílica Pichia ohmeri (e seus derivados mutagenizados) foi empregada como um modelo e como um hospedeiro preferencial. Pichia ohmeri foi inicialmente isolada de salmoura de pepino e comumente usada na indústria alimentícia para fermentação em picles, cascas e frutas.

É sabido por um elemento versado na técnica que as espécies de leveduras tais como Pichia, Zygosaccharomyces, Debaromyces e Hansenula têm capacidade de se desenvolver em ambientes de atividade com baixo teor de água, em oposição à Saccharomyces cerevisiae. Essas leveduras osmofílicas ou osmotolerantes acumulam soluto compatível como glicerol, D- arabitol, eritritol e manitol que protegem e estabilizam enzimas, permitindo por meio disso as funções celulares em condições osmóticas de desenvolvimento. Os polióis produzidos também desempenham um papel em equilíbrio de potencial de redução.

Em um aspecto preferencial, o micro-organismo é Pichia ohmeri. De fato, a característica principal da cepa hospedeira Pichia ohmeri é produzir apenas D-arabitol como soluto compatível, em contraste a Zygosaccharomyces rouxii que produz glicerol e D-arabitol. Além disso, a via metabólica de glicose para D-arabitol é bem conhecida em Pichia ohmeri.

Conforme descrito em Zygoaccharomyces rouxii (J.M.INGRAM e W.A.WOOD, 1965, Journal of Bacteriology, Vol.89, n° 5, 1186 a 1194), o fluxo de carbono em Pichia ohmeri atravessa a parte oxidante da via de Pentose-fosfato (PPP) para converter D-glicose em D-ribulose-5-P com a produção concomitante de duas moléculas de NADPH. D-ribulose-5-P é desfosforilada para D-ribulose e, então, reduzida para D- arabitol. Na cepa hospedeira de Pichia ohmeri, a via de Pentose fosfato (PPP) é muito ativa e foi determinada como superior a 50%.

Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é um mutante Pichia ohmeri depositado em 7 de março de 2012, junto à Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Microorganism Cultures] do Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS, França, Cedex 15, sob o número I-4605.

Enzimas e reações de potencial de redução

Os cofatores NADH e NADPH são essenciais para uma multitude de funções biológicas, que atuam nas denominadas reações de potencial de redução como veículos de elétrons de uma reação para outra. As células precisam manter o equilíbrio metabólico dos dois pares de potencial de redução NADH/NAD+ e NADPH/NADP+ sabendo que o par NADPH/NADP+ é mantido em um estado mais reduzido que o par NADH/NAD+ para fornecer uma força de acionamento termodinâmico. NADH, que é mais encontrado na forma oxidada NAD+, é o cofator principal em reações catabólicas onde está envolvido na liberação oxidante de energia de nutrientes. Em contraste a NADH, NADPH é reoxidado exclusivamente em reações anabólicas ou durante momentos de estresse oxidante.

Qualquer estratégia de engenharia metabólica que envolve as reações de potencial de redução precisa funcionar sob essas restrições celulares. Isso foi feito na cepa geneticamente modificada que é o objetivo da invenção.

Conforme concluído pelo inventor, notavelmente descrito na Tese de PhD intitulada “Contribution à l’étude du metabolisme des pentitols chez Pichia ohmeri” (Sophie Huchette, University of Sciences and Technics de Lille, França, 1992), foi demonstrado que as reações envolvidas na oxidorredução de cetopentoses são catalisadas por duas enzimas diferentes.

Dessa forma, a cepa hospedeira tem uma enzima definida como uma D-cetopentose-oxidorredutase específica de NADPH, que forma D-arabitol a partir de D-ribulose e que forma xilitol a partir de D-xilulose. A cepa hospedeira também possui uma D-cetopentose-oxidorredutase específica de NADH, que forma ribitol e xilitol respectivamente a partir de D-ribulose e D-xilulose. Essa enzima é fechada para a xilitol desidrogenase específica de NAD+E.C 1.1.1.9 de Pichia stipitis (XYL2) bem conhecida. Como apenas a D-ribulose intracelular está disponível em contraste à D-xilulose, a cepa hospedeira equilibra o par de potenciais de redução NADPH/NADP+ diretamente com a reoxidação de NADPH através de formação citosólica de D-arabitol a partir de D-ribulose. Então, a D-arabitol é secretada no caldo através de uma difusão passiva.

Os inventores concluíram que a falta de D-xilulose intracelular seria a razão principal para a não produção de xilitol pela cepa hospedeira mesmo se Pichia ohmeri possuir todas as ferramentas enzimáticas para produzir esse poliol através de D-cetopentose-oxidorredutase específica de NADH ou de NADPH.

De fato, foi escolhido clonar na cepa hospedeira do tipo selvagem de Pichia ohmeri um gene que codifica uma proteína que possui atividade de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (formadora de D-xilulose) (E.C.1.1.1.11) que permite que a D-arabitol citosólica seja convertida em D- xilulose e NADH.

Então, a D-xilulose intracelular se torna disponível na cepa geneticamente modificada e poderia ser reduzida pela D-cetopentose-oxidorredutase específica de NADH e de NADPH intrínseca. Entretanto, a cepa é desprovida das enzimas endógenas com capacidade de transformar eficientemente D-xilulose em xilitol. Portanto, é necessário modificar geneticamente a cepa a fim de introduzir uma xilitol desidrogenase heteróloga.

Na patente WO 94/10325, foi escolhido clonar a xilitol desidrogenase específica de NAD+ (E.C 1.1.1.9) de Pichia stipitis (XYL2) permitindo a produção de xilitol e equilibrando o par de potenciais de redução NADH/NAD+ com a oxidação de NADH produzida pela etapa metabólica anterior. Porém, conforme mencionado anteriormente, os resultados não são de fato convincentes.

Os inventores concluíram que, ao clonar um gene que codifica uma proteína mutada que possui xilitol desidrogenase específica de NADPH, a D-xilulose é convertida em xilitol para equilibrar o par de potenciais de redução de NADPH/NADP+ tal como feito pela produção intrínseca de D-arabitol a partir de D-ribulose.

Devido à baixa afinidade da D-cetopentose- oxidorredutase específica de NADPH para D-arabitol, a cepa hospedeira do tipo selvagem de Pichia ohmeri não consome o D-arabitol extracelular.

Devido à introdução de uma atividade de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (formadora de D-xilulose) na cepa geneticamente modificada, a D-arabitol produzida no caldo poderia ser bem consumida pela cepa modificada da mesma maneira que a D-arabitol citosólica.

Consequentemente, o xilitol é produzido no mesmo tempo de D-arabitol intracelular e extracelular.

Sua produção poderia ser aprimorada ao melhorar a eficiência da extensão de via de xilitol para evitar totalmente a exportação da D-arabitol intermediária.

Dessa forma, apenas xilitol seria produzida a partir de D-glicose com o mesmo efeito fisiológico que D- arabitol. Esse aprimoramento poderia ser o resultado das modificações genéticas, mas também da adaptação das condições de cultura.

Escolha das duas atividades enzimáticas a serem clonadas na cepa hospedeira

A escolha dessas duas atividades enzimáticas é suportada por sua especificidade de cofator, conforme descrito acima.

A primeira enzima oxidiza D-arabitol formando D- xilulose.

Dois tipos de D-arabitol desidrogenases são conhecidos: formadora de D-xilulose (EC 1.1.1.11) (D- arabinitol NAD+ 4-oxidorredutase) e formadora de D-ribulose (EC 1.1.1.250). Salvo se estabelecido de outro modo, é a arabitol desidrogenase formadora de D-xilulose que é pretendida pelo presente documento e referenciada no presente documento como arabitol desidrogenase. As desidrogenases formadoras de D-ribulose são encontradas em leveduras e fungos do tipo selvagem.

As arabitol desidrogenases formadoras de D-xilulose são principalmente conhecidas em bactérias. Por exemplo, as mesmas foram identificadas em Enterobacteriaceae, Em particular E. coli, Klebsiella aerogenes, e Aerobacter aerogenes cepa PRL-R3, em Gluconobacter oxydans, e adicionalmente também em Pichia stipitis. Em particular, várias enzimas são referenciadas na base de dados UniprotKB, tais como, Klebsiella pneumoniae (n° O52720), Ralstonia solanacearum (n° P58708), Yersinia pestis (n° P58709),

Aerobacter aerogenes (n°L8BEF0), E. coli (n° K3EX35, I2ZSJ5, W1BYD6, W1H8N7, E7U4R7).

Para os propósitos da presente invenção, Escherichia coli é a fonte preferencial do gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (formadora de D-xilulose). Mais especificamente, sua sequência de aminoácidos é revelada em SEQ ID No 2. Em particular, SEQ ID Nos 1 e 3 revelam ácidos nucleicos que codificam D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de Escherichia coli. A sequência de codificação foi otimizada para Pichia ohmeri ao considerar sua especificidade de códon.

Além disso, Ralstonia solanacearum é também uma fonte preferencial do gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (formadora de D-xilulose). Mais especificamente, sua sequência de aminoácidos é revelada em SEQ ID No 43. Em particular, SEQ ID No 42 revela ácidos nucleicos que codificam D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de Ralstonia solanacearum. A sequência de codificação foi otimizada para Pichia ohmeri ao considerar sua especificidade de códon.

A segunda enzima converte D-xilulose em xilitol.

Embora a maior parte de leveduras e fungos possua um gene de xilitol desidrogenase (EC 1.1.1.9) endógeno, a alteração de sua especificidade de cofator de NADH para NADPH é necessária para a implantação da presente invenção. De fato, um aspecto principal da presente invenção consiste em usar uma xilitol desidrogenase específica de NADPH. Além disso, essa enzima é, de preferência, superexpressada no hospedeiro.

Diversas xilitol desidrogenases são conhecidas e diversos artigos científicos ensinam como alterar a especificidade de cofator de NADH para NADPH. Watanabe et al (J; Biol. Chem., 2005, 280, 10.340 a 10.345) revelada xilitol desidrogenase mutada de Pichia stipitis com uma especificidade de cofator modificada, especialmente, o mutante triplo (D207A/I208R/F209S) e o mutante quádruplo (D207A/I208R/F209S/N211R). A sequência de aminoácidos do mutante quádruplo é revelado em SEQ ID No 5. Um mutante duplo de xilitol desidrogenase de Gluconobacter oxydans (D38S/M39R) com uma especificidade de cofator de NADPH é revelado em Ehrensberger et al (2006, Structure, 14, 567 a 575). A sequência de aminoácidos do mutante duplo é revelada em SEQ ID No 8.

A mutação e a clonagem da sequência de ácidos nucleicos de Pichia stipitis XYL2 que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH foram preparadas pelos inventores. Em particular, as SEQ ID Nos 4 e 6 revelam ácidos nucleicos que codificam xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis.

Alternativamente, os inventores também realizaram a mutação e a clonagem da sequência de ácidos nucleicos de Gluconobacter oxydans que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH. Em particular, as SEQ ID Nos 7 e 9 revelam ácidos nucleicos que codificam xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans. A sequência de codificação foi otimizada para Pichia ohmeri ao considerar sua especificidade de códon.

Cassete de expressão, vetor e célula hospedeira recombinante

Em um aspecto particular, a presente invenção se refere a um ácido nucleico que compreende uma sequência de codificação otimizada para Pichia ohmeri selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No 1, 3, 7, 9 e 42.

Isso se refere ainda a um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico que compreende uma sequência de codificação otimizada para Pichia ohmeri selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID No 1, 3, 7, 9 e 42.

Isso também se refere ao construto de ácido nucleico de SEQ ID No 4 e a um ácido nucleico que compreende o dito construto de ácido nucleico.

Além disso, se refere a um vetor recombinante, em particular, um vetor de expressão, que compreende o dito ácido nucleico ou o cassete de expressão. Em geral, um cassete de expressão compreende todos os elementos requeridos para transcrição e tradução genética em uma proteína. Em particular, compreende um promotor, opcionalmente, um acentuador, um terminador de transcrição e os elementos para tradução. Mais particularmente, o promotor usado para controlar a expressão da xilitol desidrogenase específica de NADPH é selecionado a fim de acionar uma forte expressão. De fato, essa enzima é de preferência superexpressada na célula hospedeira. Tais promotores são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o promotor poderia ser o promotor de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) ou a P. ohmeri fosfoglicerato quinase (poPGK1).

Isso se refere a um vetor recombinante, em particular, um vetor de expressão, que compreende um ácido nucleico que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ e um ácido nucleico que codifica xilitol desidrogenase específica de NADPH. Isso também se refere a um kit que compreende um vetor recombinante, em particular, um vetor de expressão, que compreende um ácido nucleico que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+, e um vetor recombinante, em particular, um vetor de expressão, que compreende um ácido nucleico que codifica xilitol desidrogenase específica de NADPH.

De preferência, a dita D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ e a xilitol desidrogenase específica de NADPH são selecionadas dentre as enzimas reveladas acima. Em particular, a dita D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No 2 ou 42 ou uma sequência com 1 a 3 adições, substituições ou deleções de aminoácidos. Em particular, a dita xilitol desidrogenase específica de NADPH compreende ou consiste em uma sequência de aminoácidos de SEQ ID No 5 ou 8 ou uma sequência com 1 a 3 adições, substituições ou deleções de aminoácidos.

Um vetor preferencial é um plasmídeo. Os plasmídeos adequados são bem conhecidos pelo elemento versado na técnica e podem ser, por exemplo, selecionados dentre aqueles especificamente revelados nos Exemplos.

O hospedeiro geneticamente modificado da invenção é primeiramente produzido por clonagem dos genes que codificam D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ e xilitol desidrogenase específica de NADPH sob controle de promotores adequados em um vetor recombinante e introduzidos nas células hospedeiras do organismo que produz D-arabitol por transformação.

A presente invenção se refere a uma célula hospedeira recombinante ou geneticamente modificada que compreende uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) e uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que codifica uma xilitol desidrogenase específica de NADPH. A D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ usa D-arabitol como substrato e produz D-xilulose como produto. A xilitol desidrogenase específica de NADPH usa D-xilulose como substrato e produz xilitol. A sequência que codifica xilitol desidrogenase específica de NADPH e D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ pode ser epissomal ou pode ser integrada no cromossomo da célula hospedeira. De fato, os transformantes geneticamente estáveis são de preferência construídos através de sistemas de transformação que usam um vetor, através do que um DNA desejado é integrado no cromossomo hospedeiro. Tal integração ocorre de novo dentro da célula ou pode ser auxiliada por transformação com um vetor que se insere funcionalmente no cromossomo hospedeiro, com elementos de DNA que promovem a integração de sequências de DNA em cromossomos.

A célula hospedeira recombinante ou geneticamente modificada pode compreender várias cópias de uma sequência que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ e/ou várias cópias de uma sequência que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH, de preferência integrada na cromossomo de célula hospedeira. Em particular, a célula hospedeira recombinante ou geneticamente modificada pode compreender duas, três ou quatro sequências que codificam uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+e/ou duas, três ou quatro sequências que codificam a xilitol desidrogenase específica de NADPH. Por exemplo, a célula hospedeira pode compreender duas ou três D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+de E. coli e/ou uma ou duas D-arabitol 4-oxidorredutase específicas de NAD+ de R. solanacearum, mais especificamente, duas ou três D-arabitol 4-oxidorredutase específicas de NAD+de E. coli e/ou uma D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de R.

solanacearum. As D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+ podem ser do mesmo organismo ou de diferentes organismos. As xilitol desidrogenases específicas de NADPH podem ser do mesmo organismo ou de diferentes organismos. Por exemplo, a célula hospedeira pode compreender uma, duas ou três xilitol desidrogenases específicas de NADPH de P. stipitis e/ou uma, duas ou três xilitol desidrogenases específicas de NADPH de G. oxydans, mais especificamente, uma xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis e/ou três xilitol desidrogenases específicas de NADPH de G. oxydans.

Em um aspecto particular da invenção, a célula hospedeira recombinante ou geneticamente modificada é uma cepa de Pichia ohmeri que compreende:duas D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+ e duas xilitol desidrogenases específicas de NADPH; ou duas D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+de E. coli e duas xilitol desidrogenases específicas de NADPH, uma de P. stipitis e o outra de G. oxydans; ou duas D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+e três xilitol desidrogenases específicas de NADPH; ou duas D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+de E. coli e três xilitol desidrogenases específicas de NADPH, uma de P. stipitis e duas de G. oxydans; ou três D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+ e três xilitol desidrogenases específicas de NADPH; ou três D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+, duas de E. coli e uma de R. solanacearum, e três xilitol desidrogenases específicas de NADPH, uma de P. stipitis e duas de G. oxydans; ou quatro D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+e quatro xilitol desidrogenases específicas de NADPH; ou quatro D-arabitol 4-oxidorredutases específicas de NAD+, três de E. coli e uma de R. solanacearum, e quatro xilitol desidrogenases específicas de NADPH, uma deP. stipitis e três de G. oxydans.

A célula hospedeira é selecionada dentre os micro-organismos detalhados acima. Em uma modalidade preferencial, a célula hospedeira é Pichia ohmeri. A célula hospedeira inicial é, de preferência, o mutante Pichia ohmeri depositado no CNCM sob o número I-4605.

Em um aspecto particular da invenção, a célula hospedeira é uma cepa selecionada a partir de cepas I-4982, I-4960 e I-4981 depositadas no CNCM.

A presente invenção se refere a um método para produzir xilitol que compreende cultivar a célula hospedeira recombinante ou geneticamente modificada em um meio de cultura e recuperar o xilitol produzido. De preferência, o meio de cultura fornece ao micro-organismo a fonte de carbono conveniente. A fonte de carbono inclui, de preferência, D- glicose e vários xaropes que contêm D-glicose e misturas de D-glicose com outros açúcares. O método pode compreender, adicionalmente, uma etapa de purificação de xilitol.

A presente invenção se refere ao uso de uma célula hospedeira recombinante ou geneticamente modificada, conforme revelado no presente documento, para produção de xilitol.

O xilitol produzido por tais cepas geneticamente modificadas pode ser purificado a partir do meio dos hospedeiros da invenção de acordo com qualquer conjunto de procedimentos conhecido na técnica. Por exemplo, o documento US 5.081.026, incorporado no presente documento a título de referência, descreveu a separação cromatográfica de xilitol de culturas de levedura. Dessa forma, a partir da etapa de fermentação, o xilitol pode ser purificado a partir do meio de cultura com o uso de etapas cromatográficas conforme descrito no documento US 5.081.026, seguida por cristalização.

Outros recursos e vantagens característicos da invenção serão evidentes mediante a leitura dos Exemplos a seguir. Entretanto, os mesmos são fornecidos aqui apenas como uma ilustração e não são limitantes.

Figuras e sequências

Figura 1: 12 ABYWMP: Mapa de restrição da D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ sintetizada de E. coli flanqueada por sítios de restrição AscI e SphI.

Figura 2a: lig7.78: Mapa de restrição da xilitol desidrogenase específica de NADH de Pichia stipitis.

Figura 2b: 12AALQTP: Mapa de restrição da xilitol desidrogenase específica de NADPH sintetizada de Pichia stipitis flanqueada por sítios de restrição HindIII e SacII.

Figura 3: 13AAYSYP: Mapa de restrição da xilitol desidrogenase específica de NADPH sintetizada de Gluconobacter oxydans flanqueada por sítios de restrição AscI e SphI.

Figura 4: Construção de um cassete de expressão que consiste em um quadro de leitura aberta flanqueada por um promotor poRR e terminador que usa PCR de sobreposição.

Figura 5: 12 AAMCJP: Mapa de restrição da tagatose- 3-epimerase sintetizada de Pseudomonas cichorii flanqueada por sítios de restrição HindIII e SacII.

Figura 6: Construção de vetores shuttle de P. ohmeri com marcadores de seleção poLEU2 e poURA3.

Figura 7: pEVE2523: Mapa de restrição de vetor de expressão pEVE2523 de P. ohmeri poURA3, com um cassete de expressão clonado que contém o quadro de leitura aberta de tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii flanqueada por um promotor e um terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 8: pEVE2560: Mapa de restrição de vetor de expressão pEVE2560 de P. ohmeri poLEU2, com um cassete de expressão clonado que contém o quadro de leitura aberta de tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii flanqueada por um promotor e um terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 9: Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans .

Figura 10: pEVE3284: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE3284 , com um cassete de expressão clonado que contém a xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans flanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 11: Construção de vetores de P. ohmeri para superexpressão de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis .

Figura 12: pEVE2562/pEVE2564: Mapa de restrição dos vetores de expressão de P. ohmeri pEVE2562/pEVE2564 , com um cassete de expressão clonado que contém a xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis flanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri com um marcador de seleção poURA3 ou poLEU2, respectivamente.

Figura 13: Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de xilitol desidrogenase específica de NADH de Pichia stipitis .

Figura 14: pEVE2563: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE2563 , com um cassete de expressão clonado que contém a xilitol desidrogenase específica de NADH de Pichia stipitis flanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 15: Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli sob o controle do promotor e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) com o uso de um marcador de seleção poURA3.

Figura 16: pEVE2839: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE2839 , com um cassete de expressão clonado que contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli flanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 17: Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri com o uso de um marcador de seleção poURA3 .

Figura 18: pEVE3102: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE3102 , com um cassete de expressão clonado que contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e um terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 19: pEVE3123: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE3123 , com um cassete de expressão clonado que contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e um terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri e um marcador de seleção poURA3.

Figura 20: Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri com o uso de um marcador de seleção poLEU2.

Figura 21: pEVE3157: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE3157 , com um cassete de expressão clonado que contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e um terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri e um marcador de seleção poLEU2.

Figura 22: Construção de um vetor de P. ohmeri loxP com um marcador de seleção poLEU2.

Figura 23: pEVE2787: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE2787 , com um marcador de seleção de P. ohmeri LEU2 clonado sob o controle do promotor e do terminador endógenos, flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 24: 12ABTV4P: Mapa de restrição do gene natl sintetizado a partir de Streptomyces noursei flanqueada por sítios de restrição AscI e SphI.

Figura 25: pEVE2798: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE2798 , com um marcador natl clonado sob o controle de um promotor de ribulose redutase (poRR) e um terminador de orotidina-5'-fosfato decarboxilase (poURA3).

Figura 26: Construção de um vetor de P. ohmeri loxP com um marcador de seleção natl.

Figura 27: pEVE2852: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE2852 , com um marcador natl clonado sob o controle de um promotor de ribulose redutase (poRR) e um terminador de orotidina-5'-fosfato decarboxilase (poURA3), flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 28: pEVE2855: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE2855 , com um fragmento clonado homólogo à região 5’ a montante do quadro de leitura aberta LEU2 e um marcador de seleção natl flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 29: Construção de um vetor de P. ohmeri loxP para a deleção do quadro de leitura aberta LEU2.

Figura 30: pEVE2864: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE2864 , com um fragmento clonado homólogo à região 5’ a montante do quadro de leitura aberta LEU2 e fragmento homólogo à região 3’ a jusante do quadro de leitura aberta LEU2, e um marcador de seleção natl flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 31: Construção de um plasmídeo de expressão dupla que compreende a xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli.

Figura 32: pEVE3318: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE3318 , que contém o construto de expressão dupla da xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis e da D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli.

Figura 33: pEVE2862: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE2862 , que contém o marcador de P. ohmeri LEU2 flanqueado por um promotor de ribulose redutase (poRR) e um terminador de orotidina-5'-fosfato decarboxilase (poURA3) de P. ohmeri.

Figura 34: Construção de um vetor de integração para a expressão genômica do gene de D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli e do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis em P. ohmeri.

Figura 35: pEVE2865: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE2865 , que contém o marcador de P. ohmeri LEU2 flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 36: pEVE3387: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE3387 , que contém o construto de expressão duplo do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis e de D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli com um marcador de seleção de P. ohmeri LEU2 flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 37: Construção de plasmídeos de expressão dupla/tripla que compreendem a xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e a D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+de E. coli.

Figura 38: pEVE3322/pEVE3324: Mapa de restrição dos vetores de expressão de P. ohmeri pEVE3322/pEVE3324 , que contêm o construto de expressão dupla da xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e da D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli ou o construto de expressão tripla de dois genes de xylitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli.

Figura 39: Construção de um vetor de integração para a expressão genômica do gene de D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli e do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans em P. ohmeri.

Figura 40: pEVE3390/pEVE3392: Mapa de restrição dos vetores de integração de P. ohmeri pEVE3390/pEVE3392 , que contêm o construto de expressão dupla da xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e da D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli ou o construto de expressão tripla de dois genes de xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e uma D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli com um marcador de seleção de P. ohmeri LEU2 flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 41: Construção de um vetor de integração para a expressão genômica do gene de D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli e do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans em P. ohmeri.

Figura 42: pEVE4390: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE4390 , que contém o construto de expressão dupla da D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli e do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans com um marcador de seleção de P. ohmeri LEU2 flanqueado por dois sítios loxP.

Figura 43: 13AB2EGF: Mapa de restrição da D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ sintetizada a partir de R. solanacearum flanqueada por sítios de restrição AscI e SphI.

Figura 44: Construção de um vetor de integração para a expressão genômica do gene de D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+ de R. solanacearum e do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans em P. ohmeri.

Figura 45: pEVE3898: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE3898 , com um cassete de expressão clonado que contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de Ralstonia solanacearumflanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri.

Figura 46: pEVE4077: Mapa de restrição do vetor de expressão de P. ohmeri pEVE4077 , com um construto de expressão dupla da xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e da D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de R. solanacearum.

Figura 47: pEVE4377: Mapa de restrição do vetor de integração de P. ohmeri pEVE4377 , com um construto de expressão dupla da xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans e da D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de R. solanacearum e do marcador de seleção poLEU2 flanqueado por dois sítios loxP.LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

EXEMPLOS Exemplo 1. Escolha de um cepa de Pichia ohmeri como hospedeiro preferencial para engenharia genética

Como cepa hospedeira de escolha, Pichia ohmeri: é um produtor de quantidades significativas de arabitol de glicose sob meio de pressão osmótica alta, por exemplo, meio que contém 10 a 60% de D-glicose e, de preferência, 25% de D-glicose (meio "Normal" contém usualmente apenas 2 a 3% de glicose.) tem um equilíbrio de potencial de redução que permite a geração dos cofatores necessários.

Como uma ilustração de seus desempenhos, as seguintes tabelas indicam as atividades enzimáticas envolvidas na via metabólica de arabitol de Pichia ohmeri (Sophie HUCHETTE Thesis, 1992)

A Via de Monofosfato de Hexose: de Glicose-6-P para D-Ribulose-5-P e D-Xilulose-5-P

A parte oxidante da PPP, também chamada de Via de Monofosfato de Hexose (HMP), é uma via que produz NADPH. As duas enzimas dependentes de NADP+ que são glicose-6-P desidrogenase (E.C.1.1.1.49) e 6-P-gluconato desidrogenase (E.C.1.1.1.44) participam na oxidação de 1 mol de glicose-6-P em 1 mol de D-ribulose-5-P e geram 2 mols de NADPH.Tabela 1

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como o consumo de 1 μmol de NAD(P)H ou NAD(P)+ por minuto por ml de extrato bruto. Uma unidade de atividade específica foi definida como uma unidade de atividade enzimática por mg de proteínas em extrato bruto.

Os parâmetros cinéticos das seguintes enzimas foram determinados: D-ribulose-5-P 3-epimerase (E.C 5.1.3.1), D-ribose-5-P ceto-isomerase (E.C.5.3.1.6), transquetolase (E.C.2.2.1.1) e fosfatases ácidas (E.C. 3.1.3.2).Tabela 2

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como o consumo de 1 μmol de NAD(P)H ou NAD(P)+ por minuto por ml de extrato bruto. Uma unidade de atividade específica foi definida como uma unidade de atividade enzimática por mg de proteínas em extrato bruto.Tabela 3

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como o consumo de 1 μmol de NAD(P)H ou NAD(P)+ por minuto por ml de extrato bruto. Uma unidade de atividade específica foi definida como uma unidade de atividade enzimática por mg de proteínas em extrato bruto.

In vivo, D-xilulose-5-P, sintetizada a partir da epimerização de D-ribulose-5-P, entra eficientemente na parte não oxidante do PPP através da transcetolização. Consequentemente, D-xilulose-5-P não está disponível para sua desafosforilação em D-xilulose.

D-cetopentose-oxidorredutases específicas de NADH e NADPH

D-Ribulose e D-xilulose são produzidas por defosforilização de D-Ribulose-5-P e D-xilulose-5-P.

As constantes de Michaelis-Menten destacam as afinidades das D-cetopentose-oxidorredutases de NADH e NADPH para cada substrato e as velocidades máximas correspondentes. Tabela 4

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como o consumo de 1 μmol de NAD(P)H ou NAD(P)+ por minuto por ml de extrato bruto. Uma unidade de atividade específica foi definida como uma unidade de atividade enzimática por mg de proteínas em extrato bruto.

A D-cetopentose-oxidorredutase específica de NADH, que forma ribitol e xilitol respectivamente a partir de D- ribulose e D-xilulose mostra uma afinidade superior para D- xilulose do que D-ribulose. A reação inversa mostra uma boa afinidade para xilitol e ribitol que explica o bom crescimento da cepa hospedeira nesses dois polióis.Tabela 5

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como o consumo de 1 μmol de NAD(P)H ou NAD(P)+ por minuto por ml de extrato bruto. Uma unidade de atividade específica foi definida como uma unidade de atividade enzimática por mg de proteínas em extrato bruto.

A D-cetopentose-oxidorredutase específica de NADPH, que forma D-arabitol a partir de D-ribulose e que forma xilitol a partir de D-xilulose mostra uma afinidade superior para D-ribulose do que D-xilulose. A reação inversa mostra uma afinidade muito baixa para D-arabitol que explica o não crescimento da cepa hospedeira nesse poliol.

As duas cetopentose-oxidorredutases da cepa hospedeira foram caracterizadas como diferentes das enzimas anteriores descritas em Saccharomyces rouxii de Ingram e Wood, 1965 (Journal of Bacteriology, vol. 89, n° 5, 1.186 a 1.194). De fato, em Saccharomyces rouxii, nenhuma reação progressiva foi detectada em D-ribulose e NADH e uma reação regressiva foi detectada em D-arabitol com NADPH.

As relações de Haldane preveem comportamentos cinéticos de enzima in vivo.Tabela 6

As duas enzimas favorecem a reação progressiva (oxidação de D-cetopentose) em comparação com a reação regressiva (redução de pentitol).

A PPP na cepa hospedeira é extremamente eficiente e 2 mols de NADPH são gerados a partir de 1 mol de glicose consumido. Consequentemente, o NADPH estaria disponível em excesso tanto para reações anabólicas quanto para reações de manutenção. A cepa hospedeira precisa produzir D-arabitol a partir de D-ribulose ou xilitol a partir de D-xilulose para equilibrar o par de potenciais de redução de NADPH/NADP+.

O efeito inibitório de NADP+ em D-cetopentose- oxidorredutase específica de NADPH foi determinado in vitro. A atividade é 80% menor quando NADP+ é adicionado em excesso. Mesmo se essa concentração não for compatível com a concentração de NADP+ intracelular, esse resultado dá alguma visão geral do papel da D-cetopentose oxidorredutase específica de NADPH no equilíbrio do par de potenciais de redução de NADPH/NADP+.

A cepa hospedeira produz apenas D-arabitol a partir de D-ribulose, visto que a D-xilulose não está disponível, devido à entrada de D-xilulose-5-P na parte não oxidante do PPP.

A ligação entre a produção de D-arabitol e o equilíbrio de potencial de redução de NADPH/NADP+ foi demonstrada na cepa hospedeira ao avaliar o impacto da superexpressão de glicose-6-P desidrogenase sobre a produção de D-arabitol. Então, a cepa obtida abriga uma atividade de G6PDH 1,5 vezes maior e produz 10% a mais de D-arabitol em comparação com a cepa hospedeira (FR2772788).

Exemplo 2. Uso de códon de Pichia ohmeri

O uso de códon de P. ohmeri foi determinado a partir do DNA disponível e da sequência de aminoácidos correspondente de cinco genes de P. ohmeri: transquetolase, glicose-6-fosfato desidrogenase (FR 2772788), ribulose redutase, beta-isopropilmalato desidrogenase - LEU2 (Piredda e Gaillardin, Yeast, vol.10: 1.601 a 1.612 (1994) e orotidina-5'-fosfato descarboxilase - URA3 (Piredda e Gaillardin, 1994, supra).

Cada gene individual foi dividido em tripletos de nucleotídeo que codifica um único aminoácido. Os cinco genes consistiram em um total de 2091 códons.

Para cada aminoácido, o número de cada códon presente nos cinco genes foi contabilizado, dividido por 2.091 e multiplicado por 1.000. Desse modo, a frequência de um códon específico em 1.000 códons foi estimada.

O uso de códon preliminar de P. ohmeri é apresentado na Tabela 7.

Todos os genes heterólogos expressados em P. ohmeri, exceto o xilitol desidrogenase de P. stipitis, foram otimizados em códon com o uso dessa tabela e o programa Optimizer obtido junto à http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

A sequência obtida foi enviada para síntese de gene após a adição manual de sítio de reconhecimento para enzimas de restrição nas respectivas extremidades 5’ e 3’ da sequência que codifica a enzima.Tabela 7. Tabela de uso de códon de P. ohmeri derivada de 5 sequências de codificação (CDS)

Exemplo 3. Clonagem de gene de D-arabitol oxidorredutase específica de (formadora de D-xilulose) de NAD+bacteriana de E. coli

Um fragmento de DNA que codifica o altD de D- arabitol 4-oxidorredutase específico para NAD+ de E. Coli foi sintetizado quimicamente por Síntese de Gene GeneArt® (Life Technologies, Regensburg, Alemanha) de acordo com a sequência submetida de sequência SEQ ID: 1.

Os nucleotídeos 1441 a 2808 de sequência AF378082.1 (obtida a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AF378082) que codifica o gene altD foram usados como modelo e submetidos à otimização de códon para uso em ATCC 20209 de P. ohmeri, de acordo com a Tabela 7 do exemplo 2 com o uso do programa Optimizer obtido a partir de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

Nas extremidades 5’ e 3’ da sequência resultante, os nucleotídeos que codificam os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição AscI (GGCGCGCC) e SphI (GCATGC), respectivamente, foram adicionados a fim de facilitar adicionalmente a clonagem.

Adicionalmente, um tripleto de adenosina foi incluído em frente ao ATG inicial para representar uma adenosina na posição -3 na sequência do tipo Kozak de leveduras.

A sequência final (SEQ ID NO: 1) foi, então, submetida para síntese (GeneArt, Regensburg, Alemanha).

O fragmento de DNA sintetizado que codifica a D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli foi entregue como 5 μg de DNA de plasmídeo liofilizado em um vetor derivado de pMK-RQ (12ABYWMP, Figura 1).

Para subclonagem adicional, o gene foi liberado por corte com restrição com as enzimas AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA).

Exemplo 4. Mutagênese e clonagem da xilitol desidrogenase específica de NADH e NADPH de Pichia stipitis Clonagem do gene de xilitol desidrogenase específica de NADH de Pichia stipitis

A sequência de nucleotídeos conhecida do gene de levedura (Pichia stipitis) XYL2, que codifica xilitol desidrogenase (Kotter et al., Curr. Genet. 18:493 a 500 (1990)) foi clonada no vetor plasmídico lig 7.78 após o ensinamento de FR 2 765 589 (consulte exemplo 4 e Figura 7 desta patente). O mapa de restrição do vetor é apresentado na Figura 2a.

Mutagênese e clonagem do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis

Um fragmento de DNA que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH XYL2 de Pichia stipitis foi quimicamente sintetizado (GeneArt® Gene Synthesis, Life Technologies, Regensburg, Alemanha) de acordo com a sequência de SEQ ID NO: 4.

Os nucleotídeos 319 a 1410 da sequência X55392.1 (obtidos junto à http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/X55392.1) que codifica o gene XYL2 foram usados como modelo.

De acordo com o documento de Watanabe et al. (J; Biol. Chem., 2005, 280, 10.340 a 10.345), a preferência de cofator da xilitol desidrogenase poderia ser alterada de NADH para NADPH ao introduzir quatro mutações de aminoácido publicadas: D207A/I208R/F209S/N211R (numeração baseada na sequência de proteína P22144 obtida junto à http://www.uniprot.org/uniprot/P22144).

Consequentemente, os códons que codificam D207, I208, F209 e N211 foram manualmente substituídos por GCT, AGA, TCA e AGA na sequência correspondente, respectivamente.

Adicionalmente, os nucleotídeos que codificam o sítio de reconhecimento das enzimas de restrição HindIII (AAGCTT) e SacII (CCGCGG) foram manualmente incluídos nas respectivas extremidades 5’ e 3’, a fim de facilitar adicionalmente a clonagem.

Adicionalmente, um tripleto de adenosina foi incluído na frente do ATG inicial para representar uma adenosina na posição -3 na sequência semelhante a Kozak de leveduras. A sequência final (SEQ ID NO: 4) foi submetida para síntese (GeneArt, Regensburg, Alemanha).

O fragmento de DNA sintetizado que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis foi entregue como 5 μg de DNA de plasmídeo liofilizado em um vetor derivado de pMA-T (12AALQTP, Figura 2b).

Exemplo 5. Mutagênese e clonagem do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans

Um fragmento de DNA que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH Xdh de Gluconobacter oxydans foi quimicamente sintetizado (GeneArt® Gene Synthesis,

Life Technologies, Regensburg, Alemanha) de acordo com a sequência submetida de SEQ ID NO: 7.

Os nucleotídeos 1063 a 1851 de sequência AB091690.1 (obtida a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB091690.1) que codifica o gene Xdh foram usados como modelo e submetidos à otimização de códon para uso em ATCC 20209 de P. ohmeri, de acordo com a Tabela 7 (Exemplo 2) com o uso do programa Optimizer obtido a partir de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

Com base na publicação de Ehrensberger et al. (Structure, 2006, 14, 567 a 575), a especificidade de cofator da enzima poderia ser alterada de NADH para NADPH ao introduzir duas mutações de aminoácido publicadas: D38S/M39R (numeração baseada na sequência de proteína Q8GR61 obtida junto à http://www.uniprot.org/uniprot/Q8GR61).

Dessa forma, os códons que codificam D38 e M39 foram manualmente substituídos por TCT e AGA na sequência correspondente, respectivamente. Adicionalmente, os nucleotídeos que codificam os sítio de reconhecimento das enzimas de restrição AscI (GGCGCGCC) e SphI (GCATGC) foram manualmente incluídos nas respectivas extremidades 5’ e 3’, a fim de permitir adicionalmente a clonagem.

Adicionalmente, um tripleto de adenosina foi incluído na frente do ATG inicial para representar uma adenosina na posição -3 na sequência semelhante a Kozak de leveduras. A sequência final (SEQ ID NO: 7) foi submetida para síntese (GeneArt, Regensburg, Alemanha).

O fragmento de DNA sintetizado que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans foi entregue como 5 μg de DNA de plasmídeo liofilizado em um vetor derivado de pMA-T (13AAYSYP, Figura 3). Para subclonagem adicional, o gene foi liberado por corte com restrição com as enzimas AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA).

Exemplo 6. Construção de um vetor de P. ohmeri para expressão gênica heteróloga com o uso do marcador de seleção de poURA3

A clonagem de um vetor com substituível: promotor, quadro de leitura aberta, e elementos terminadores foi realizada por duas PCRs de sobreposição sucessivas de três fragmentos individuais (Figura 4).

O vetor foi originalmente planejado como um modelo de expressão, para testar a clonagem e a superexpressão do gene tagatose 3-epimerase na cepa de Pichia ohmeri recombinante.

Conforme será descrito abaixo, o gene tagatose 3- epimerase foi clonado em cassete de sítios de restrição Asc I - SphI específicos, o que permite a clonagem de qualquer gene de interesse ao usar esses mesmos sítios de inserção.

A clonagem foi concebida da seguinte maneira.

Em uma primeira PCR (PCR1), um fragmento de promotor de ribulose redutase com 490 bp de comprimento de P. ohmeri flanqueada por sítios SpeI e AscI (sublinhados em sequência de iniciador) foi amplificado com o uso de: iniciador EV2960: GAACTAGTGGATCCGTAGAAATCTTG (SEQ ID No 12) e iniciador EV2961: CTTTGTTCATTTTGGCGCGCCTTTTAGTTTAATAAGGGTCCGTG (SEQ ID No 13)

Adicionalmente, na extremidade 5’ do iniciador reverso EV2961, um fragmento com 13 nucleotídeos de comprimento que representa a extremidade 5’ do gene tagatose- 3-epimerase foi adicionado.

Esse fragmento junto com os 8 nucleotídeos do sítio AscI e os 10 nucleotídeos seguintes da extremidade 3’ do promotor de ribulose redutase foram necessários como sobreposição para fusão do fragmento de PCR1 com o fragmento de PCR2 descrito abaixo. O DNA genômico de P. ohmeri ATCC 20209 foi usado como modelo.

Para esse propósito, uma colônia de P. ohmeri recém-aplicada por esfregaço foi ressuspensa em 30 μl de 0,2% de SDS e aquecida por 4 min. a 95°C. Após a centrifugação de velocidade total, 0,5 μl do sobrenadante foi usado para PCR.

O modelo foi amplificado em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 25 ciclos com 10 s a 98 °C / 20 s a 50°C / 15 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

Em uma segunda PCR (PCR2), um fragmento com 911 bp de comprimento do tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii ST24 flanqueada por sítios AscI e SphI (sublinhados em sequência de iniciador) foi amplificado com o uso de: iniciador EV2962: AAACTAAAAGGCGCGCCAAAATGAACAAAGTTGGCATG (SEQ ID No 14) e iniciador EV2963: TTCTCTTCGAGAGCATGCTCAGGCCAGCTTGTCACG (SEQ ID No 15).

A extremidade 5’ do iniciador EV2962 contém um fragmento com 9 nucleotídeos de comprimento que representam a 3’ do promotor de ribulose redutase.

Esse fragmento juntamente com os 8 nucleotídeos do sítio AscI e os 12 nucleotídeos a seguir da quadro de leitura aberta de tagatose-3-epimerase, é usada para o PCR de sobreposição para fundir o produto de PCR2 com o produto PCR1 anteriormente descrito.

Adicionalmente, a extremidade 5’ do iniciador reverso EV2963 contém um fragmento com 12 nucleotídeo de comprimento que representa a extremidade 5’ do terminador de ribulose redutase of P. ohmeri.

Esse fragmento, juntamente com os 6 nucleotídeos do sitio SphI e os 12 nucleotídeos a seguir da extremidade 3’ do quadro de leitura aberta de tagatose-3-epimerase, é necessário como sobreposição para fundir PCR2 com o fragmento de PCR de PCR3 descrito abaixo.

Como modelo de 25 ng de vetor 12AAMCJP (Figura 5) (GeneArt, Regensburg, Alemanha) que contém uma cópia sintetizada do gene tagatose-3-epimarease de Pseudomonas cichorii ST24 foi usada (nucleotídeo 719 a 1591 de AB000361.1, a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AB000361) - SEQ ID No: 11.

O modelo foi amplificado em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProof™ (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguido de 25 ciclos com 10 s a 98 °C/20 s a 48°C/30 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C.

Em uma terceira PCR (PCR3), um fragmento com 380 bp de comprimento do terminador de ribulose redutase de P. ohmeri flanqueada por sítios SphI e SacII (sublinhados em sequência de iniciador) foi amplificada com o uso de: iniciador EV2964 AAGCTGGCCTGAGCATGCTCTCGAAGAGAATCTAG (SEQ ID No 16) e iniciador EV2965 GTTCCGCGGAGAATGACACGGCCGAC (SEQ ID No 17)

A extremidade 5’ de iniciador EV2964 contém um fragmento com 12 nucleotídeos de comprimento da extremidade 3’ do quadro de leitura aberta de tagatose-3-epimerase que, juntamente com os 6 nucleotídeos do sítio SphI e os 12 nucleotídeos a seguir do terminador de ribulose redutase de P. ohmeri é usada para a fusão de PCR3 com o PCR2 anteriormente descrito.

O DNA genômico de P. ohmeri ATCC 20209 foi usado como modelo. Após a centrifugação de velocidade total, 0,5 μl do sobrenadante foi usado em PCR. Para esse propósito, uma colônia de P. ohmeri recém-aplicada por esfregaço foi ressuspensa em 3 0 μl de 0,2% de SDS e aquecida por 4 min. a 95°C.

O modelo foi amplificado em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP, 0,5 μM de cada iniciador e 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 25 ciclos com 10 s a 98 °C / 20 s a 50°C / 15 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

A fusão dos três fragmentos de PCR individuais foi realizada conforme a seguir: 50 ng de cada produto purificado por gel de PCR1 e PCR2 foi usado como modelo em uma reação de PCR com EV2960 e EV2963.

Um segmento homólogo com 30 nucleotídeos de comprimento nos dois fragmentos, que resulta do projeto de iniciador descrito acima, foi usado como sobreposição na reação de fusão.

Dessa maneira, um fragmento de 1,4 kb de comprimento, que consiste em um promotor de ribulose redutase de P. ohmeri flanqueada por sítios SpeI e AscI foi fundido com o quadro de leitura aberta do tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii ST24.

Os modelos foram amplificados em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP, 0,5 μM de cada iniciador e 0,02 U/μl de iProof™ polímeroase (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 20 s a 62°C / 45 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O fragmento purificado foi fundido em uma segunda PCR de sobreposição com o produto de PCR3. 40 ng de cada fragmento foi usado como modelo e amplificado com EV2960 e EV2965.

Um segmento homólogo com 30 nucleotídeos de comprimento nos dois fragmentos, que resulta do projeto de iniciador descrito acima, foi usado como sobreposição na fusão.

Dessa maneira, um fragmento com 1,8 kb de comprimento, que consiste em um promotor de ribulose redutase de P. ohmeri flanqueado por SpeI e AscI e o quadro de leitura aberta do tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii ST24 flanqueado por sítios AscI e SphI foi fundido com o terminador de ribulose redutase de P. ohmeri.

Os modelos foram amplificados em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP, 0,5 μM de cada iniciador e 0,02 U/μl de iProofTM polímeroase (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 20 s a 65°C / 55 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O produto PCR final que consiste em um fragmento com 1,7 kb de comprimento do tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii ST24 flanqueada por um promotor de ribulose redutase e terminador foi digerido com as enzimas de restrição SpeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, Estados Unidos), gel purificado e ligado de um dia para outro a 16°C com um fragmento SpeI/SacII isolado de 9,8 kb com fragmento de uma cadeia principal de vetor de lig7.78 com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, Estados Unidos) (Figura 6).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O DNA de plasmídeo purificado foi usado para a caracterização adicional pela restrição de digestão e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo de expressão recentemente clonado pEVE2523 (Figura 7) é um vetor E. coli - P. ohmeri de lançadeira que consiste em uma origem bacteriana (E. coli) de replicação e um gene de resistência a ampicilina, a sequência de replicação autônoma de levedura (P. ohmeri), e o gene poURA3 (P. ohmeri) para seleção na levedura.

Ademais, o mesmo contém um elemento de promotor de ribulose redutase de P. ohmeri permutável (através da restrição SpeI e AscI) e elemento de terminador (através de SphI e SacII) que flanqueia um quadro de leitura aberta do tagatose-3-epimerase de Pseudomonas cichorii (permutável através da restrição AscI e SphI).

Exemplo 7. Construção de um vetor de P. ohmeri para expressão gênica heteróloga com o uso do marcador de seleção de poLEU2

Para a construção de um segundo vetor de expressão P. ohmeri, o cassete de expressão de plasmídeo pEVE2523 (Figura 7) anteriormente descrito no Exemplo 6 foi clonado em um vetor que contém o marcador de seleção P. ohmeri poLEU2 (Figura 6).

Um fragmento embolotado de 1,7 kb de vetor pEVE2523 (Figura 7) cortado com SpeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, Estados Unidos) foi usado como inserto. O corte foi realizado com a Mistura de Enzima de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 minutos a temperatura ambiente, seguido por ativação por calor das enzimas por 10 minutos a 70°C.

A cadeia principal de vetor foi obtida junto à um vetor poARS (plig3 - FR 2772788) linearizado com Sal I (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), cortado e desfosforilado por 1 hora a 37°C com o uso de fosfatase de antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). O inserto purificado por gel e cadeia principal de vetor com o uso de Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) foram ligados por 1 hora a RT com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e usado para a caracterização adicional por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

Os novos plasmídeos de expressão clonado pEVE2560 (Figura 8) são um vetor E. coli - P. ohmeri de lançadeira que contém em uma origem bacteriana (E. coli) de replicação e um gene de resistência a ampicilina, a sequência de replicação autônoma de levedura (P. ohmeri), e o gene poLEU2 (P. ohmeri) para seleção na levedura.

Ademais, o quadro de leitura aberta do tagatose-3- epimerase de Pseudomonas cichorii flanqueada por um promotor de ribulose redutase P. ohmeri e terminador é permutável através da restrição AscI e SphI.

Exemplo 8. Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans

Um vetor de P. ohmeri para superexpressão de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans foi construído.

Para clonagem no vetor de expressão, o fragmento de DNA que codifica o Gluconobacter oxydans xilitol desidrogenase específica de NADPH foi liberado a partir do vetor 13AAYSYP (Figura 3) pelo corte com enzimas de restrição AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

O fragmento 803 bb foi purificado em gel com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor purificada em gel e digerida por AscI/SphI a 9.8 kb de pEVE2523 (Figura 7) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 9).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo pEVE3284 resultante (Figura 10) contém o xilitol desidrogenase específica de NADPH otimizada por códon de Gluconobacter oxydans flanqueada por um promotor de ribulose redutase e terminador de P. ohmeri e o marcador de seleção poURA3 .

Exemplo 9. Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis

Para subclonagem no vetor de expressão, o fragmento de DNA que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH a partir de Pichia stipitis teve que ser flanqueado com sítios de restrição AscI e SphI. Para esse propósito: iniciador EV3101 AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC (SEQ ID No 18) contendo um sítio AscI (sublinhado) e iniciador EV3102 GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG (SEQ ID No 19) contendo um SphI (sublinhado) foram usados em uma reação PCR com 30 ng de vetor 12AALQTP (Figura 2b) como modelo.

O modelo foi amplificado em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProof™ (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguido de 25 ciclos com 10 s a 98 °C/20 s a 55 °C/30 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C.

O produto de PCR de 1,1 kb foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído, purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e digerido por restrição com AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Após a purificação de coluna com o kit DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia, EUA), foi ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor purificada em gel e digerida por AscI/SphI a 10,6 kb de pEVE2523 (Figura 7) e a cadeia principal com 11,8 kb digerida por AscI/SphI e vetor purificado por gel de pEVE2560 (Figura 8) respectivamente, com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA) (Figura 11).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, o DNA de plasmídeo foi isolado e adicionalmente caracterizado por digestão de restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

Os plasmídeos pEVE2562 e pEVE2564 resultantes (Figura 12) contêm a xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis com códon otimizado flanqueada por um promotor e um terminador de ribulose redutase de P. ohmeri e o marcador de seleção poURA3 ou poLEU2 , respectivamente.

Exemplo 10. Construção de um vetor de P. ohmeri para superexpressão de tipite desidrogenase específica de NADH de Pichia tipites

Para subclonagem no vetor de expressão, o tipites de DNA que codifica a tipite desidrogenase específica de NADH a partir de Pichia tipites teve que ser flanqueado com sítios de restrição AscI e SphI.

Para esse propósito: EV3101 (AAGGCGCGCCAAA ATGACTGCTAACCCTTCC) (SEQ ID No 18) tipite um sítio AscI (sublinhado) e EV3102 (GAGCATGCTTACTCAGGGCCGTCAATG) (SEQ ID No 19) tipite um SphI (sublinhado) foram usados tipit reação PCR com 30 ng de vetor lig7.78 (Figura 2a) como modelo.

O modelo foi amplificado tipit mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de tipites r iProof™ (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguido de 25 ciclos com 10 s a 98 °C/20 s a 55 °C/30 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 10 minutos a 72 °C.

O produto de PCR de 1,1 kb foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído, purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e digerido por restrição com AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Após a purificação de coluna com o kit DNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia, EUA), foi ligado durante 2 h à tipites re ambiente à cadeia principal de vetor purificada em gel e digerida por AscI/SphI a 10,5 kb de pEVE2560 (Figura 8) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 13).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, o DNA de plasmídeo foi isolado e adicionalmente caracterizado por digestão de restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2563 (Figura 14) contém a tipite desidrogenase específica de NADH otimizada por tipi de Pichia tipites flanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri e o marcador de seleção poLEU2 .

Exemplo 11. Construção de vetores de P. ohmeri para superexpressão de D-arabitol 4-oxidorredutase específica deE. coli NAD+

Um vetor de P. ohmeri para superexpressão de D- arabitol 4-oxidorredutase específica deE. coli NAD+ foi construído.

Para clonagem novetor de expressão, o fragmento de DNA que codifica a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de E. coli NAD+otimizada por códon foi liberado a partir do vetor 12ABYWMP (Figura 1) por meio do corte com enzimas de restrição AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

O fragmento 1,4 kb foi purificado em gel com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor purificada em gel e digerida por AscI/SphI a 9.8 kb de pEVE2523 (Figura 7) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 15).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2839 (Figura 16) contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica deE. coli NAD+otimizada por códon flanqueada por um promotor e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri e o marcador de seleção poURA3 .

Adicionalmente ao promotor de ribulose redutase de P. ohmeri, a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ a partir de E. coli foi também clonada sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e terminador de transquetolase (poTKL).

A clonagem foi realizada em duas etapas consecutivas, primeiramente substituindo o promotor de ribulose redutase pelo promotor poPGK1, seguido de uma troca do terminador de ribulose redutase pelo terminador poTKL.

Um fragmento com 611 bp de comprimento do promotor poPGK1 de P. ohmeri foi amplificado a partir do DNA genômico de P. ohmeri com o uso de: - iniciador EV3177 (GAAGACTAGTTCACGTGATCTC) (SEQ ID No 20) contendo um sítio SpeI (sublinhado) e - iniciador EV3178 (CACTGGCGCGCCTTTTGTGTGGTGGTGTCC) (SEQ ID No 21), contendo um sítio AscI (sublinhado).

O modelo de DNA genômico foi preparado por meio da ressuspensão de uma colônia de P. ohmeri recém aplicada por esfregaço em 30 μl de SDS a 0,2% e do aquecimento durante 4 min. a 95 °C. Após a centrifugação de velocidade total, 0.5 μl do sobrenadante foi usado para PCR.

A amplificação foi realizada em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de iProofTM polimerase (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 2 min. a 96 °C seguido de 25 ciclos com 10 s a 96 °C/10 s a 58 °C/30 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 2 minutos a 72 °C.

O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O fragmento de promotor poPGK1 com 610 bp de comprimento foi digerido por restrição com SpeI e AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor purificada em gel e digerida por SpeI/AscI a 11,5 kb de pEVE2839 (Figura 16) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 17).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE3102 (Figura 18) contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de E. coli NAD+otimizada por códon flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri e o marcador de seleção poURA3 .

Na próxima etapa, o terminador de ribulose redutase de pEVE3102 foi trocado pelo terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri.

Um fragmento com 213 bp de comprimento do terminador poTKL de P. ohmeri foi amplificado a partir do DNA genômico de P. ohmeri com o uso de: iniciador EV3817 (TAGCAGCATGCATAGGTTAGTGAATGAGGTATG) (SEQ ID No 22) contendo um sítio SphI (sublinhado) e iniciador EV3818 (TAGGTCCGCGGGAGCTTCGTTAAAGGGC) (SEQ ID No 23) contendo um sítio SacII (sublinhado).

O modelo de DNA genômico foi preparado conforme descrito acima.

A amplificação foi realizada em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de iProofTM polimerase (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado.

A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 2 min. a 96 °C seguido de 25 ciclos com 10 s a 96 °C/10 s a 57 °C/30 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 2 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O fragmento de terminador poTKL com 213 bp de comprimento foi digerido por restrição com SphI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor purificada em gel e digerida por SphI e SacII a 11,5 kb de pEVE3102 (Figura 18) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 17).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE3123 (Figura 19) contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de E. coli NAD+otimizada por códon flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e um terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri e o marcador de seleção poURA3 .

Com a finalidade de ter capacidade para expressar a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli a partir de um plasmídeo com o uso de uma outra seleção, o marcador poURA3 de pEVE3123 foi trocado pelo marcador poLEU2 .

Para esse propósito, o marcador poURA3 foi liberado a partir do vetor pEVE3123 (Figura 19) por meio de digestão de restrição com PsiI e AfeI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

A cadeia principal de vetor de 9,1 kb foi purificada em gel com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia), cortada com o kit Blunting Enzyme Mix (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) durante 15 min. à temperatura ambiente, seguido da inativação por calor das enzimas durante 10 min. a 70 °C e desfosforilada durante 1 h a 37 °C com o uso de fosfatase antártica (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Como inserto, um fragmento purificado em gel e cortado a 3 kb do marcador poLEU2 liberado a partir do vetor pEVE2560 (Figura 8) por meio de digestão de restrição por AseI e AfeI foi usado. A ligação de fragmentos foi realizada durante 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 20).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE3157 (Figura 21) contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica de E. coli NAD+otimizada por códon flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK1) e um terminador de transquetolase (poTKL) de P. ohmeri e o marcador de seleção poLEU2 .

Exemplo 12 .Expressão da D-arabitol 4- oxidorredutase específica de E. coli NAD+plasmídica edo gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Pichia stipitis na cepa ATCC 20209 de Pichia ohmeri

Para a conversão biossintética de arabitol em xilitol, é necessária a expressão simultânea da D-arabitol 4- oxidorredutase de NAD+de E. coli e a xilitol desidrogenase específica de NADP de P. stipitis .

A primeira enzima leva à formação de xilulose e as segundas convertem xilulose em xilitol.

A cepa SRLU de P. ohmeri (MATh- leu2 ura3) derivada de ATCC 20209 e auxotrófica para leucina e uracila (Piredda e Gaillardin, 1994, supra) foi usada como hospedeiro para a construção de cepas de levedura que secretam xilitol por meio da transformação com plasmídeos: pEVE2839 (D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli) e pEVE2564 (xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis) levando à cepa EYS2755

Adicionalmente, como um controle (seguindo-se as instruções do documento sob o no WO 94/10325) uma cepa que expressa a xilitol desidrogenase do tipo selvagem específica de NADH de P. stipitis foi também construída por meio da transformação com plasmídeos: pEVE2839 (D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli) e pEVE2563 (xilitol desidrogenase específica de NADH de P. stipitis) no hospedeiro SRLU, levando à cepa EYS2962.

Como controle, as cepas transformadas com os plasmídeos simples: pEVE2839 (D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+de E. coli), pEVE2563 (xilitol desidrogenase específica de NADH de P. stipitis), e pEVE2564 (xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis) levando a EYS2943, EYS2696 e EYS2697, respectivamente, foram também gerados.

A transformação de levedura foi realizada essencialmente por meio do método de formação de esferoplastos de Green et al. (Green E.D., Hieter, P., e Spencer F. A., capítulo 5 em Genome Analysis: A Laboratory Manual, Vol. 3, Cloning Systems, Birren et al. (eds.), Cold Spring Harbor Press, New York, 1999) com as seguintes modificações: Em vez de Lyticase, Zymolyase 100T foi usado para a geração de esferoplastos e a inoculação com a enzima foi realizada a 37 °C até que a OD da suspensão de células alcançasse 20 a 30% da OD original antes do tratamento de Zymolyase.

Brevemente, as células P. ohmeri foram cultivadas de um dia para o outro a 30 °C em meio YPD (extrato de levedura 1% (p/v), Peptona a 2% (p/v), Dextrose a 2% (p/v)) a uma OD600 final de 3 a 5. 200 unidades de OD600 foram coletadas por centrifugação, lavadas uma vez com água e 1 M de sorbitol, e ressuspensas em tampão SCE (1 M de sorbitol, 100 mM de di- hidrato de sal trissódico de ácido cítrico, 10 mM de EDTA) a uma concentração final de 70 ODs/ml.DTT e Zymolase (LuBio Science, Luzern, Suíça) foram adicionados a uma concentração final de 10 mM e 0,5 U/OD, respectivamente, e a mistura incubada a 37 °C com agitação lenta.

A digestão de parede celular foi seguida da medição da densidade óptica da solução diluída em água. Quando esse valor diminuiu para 80% do original, a digestão foi terminada por centrifugação cuidadosa e lavagem com 1 M de sorbitol e tampão STC (0,98 M de sorbitol, 10 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de CaCl2).

Os esferoplastos foram cuidadosamente ressuspensos em tampão STC contendo 50 μg/ml de DNA de timo de bezerro (Calbiochem/VWR, Dietikon, Suíça) a uma concentração final de 200 OD/ml. As alíquotas de 100 μl foram misturadas com 100 a 200 ng de DNA de plasmídeo e incubadas durante 10 min. à temperatura ambiente.

A solução de 1 ml de PEG (PEG 8000 a 19,6% p/v, 10 mM de Tris pH 7,5, 10 mM de CaCl2) foi adicionada à suspensão, incubada durante 10 minutos e peletizada. Os esferoblastos foram regenerados a 30 °C durante 1 a 2 h em 1 ml de uma solução de 1 M de sorbitol contendo YPD a 25% e 7 mM de CaCl2.

Às células regeneradas, adicionou-se 7 ml de ágar de topo aquecido a 50 °C (0,67% de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 0,13% de pó reduzido sem leucina/uracila/histidina/triptofano/metionina, 0,086% de aminoácido perdido exigido, 2% de glicose, 1 M de sorbitol, pH 5,8 e 2,5% de ágar Noble) e a mistura foi derramada uniformemente sobre placas seletivas contendo sorbitol pré- aquecidas (0,67% de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 0,13% de pó reduzido sem leucina/uracila/histidina/triptofano/metionina, 0,086% de aminoácido perdido exigido, 2% de glicose, 1 M de sorbitol, pH 5,8).

As placas foram incubadas durante 3 a 5 dias a 30 °C. Os transformantes foram novamente selecionados nas placas seletivas adequadas.

Cada cepa gerada foi testada em triplicatas para produção de arabitol, xilitol e ribitol.

Para esse propósito, os clones foram primeiramente cultivados a 30 °C de um dia para o outro em meio original (0,67% de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos; 0,13% de pó reduzido sem leucina/uracila/histidina/triptofano/metionina; 0,086% de aminoácido perdido exigido; 5% de glicose; pH 5,7).

Desta cultura de um dia para o outro, uma cultura principal em meio de produção (0,67% de base de nitrogênio de levedura sem aminoácidos, 0,13% de pó reduzido sem leucina/uracila/histidina/triptofano/metionina, 0,086% de aminoácido perdido exigido; 15% de glicose; pH 5,7) em uma OD600 inicial de 0,2 foi inoculada.

Essa cultura foi cultivada a 37 °C durante 48 horas e as concentrações de arabitol, xilitol e ribitol dos sobrenadantes foram determinadas por HPLC/MS com o uso de uma coluna Aminex® HPX-87 (Bio-Rad, Hercules, Califórnia) e um detector Waters® TQ (Acquity® UPLC ligada a um detector quadrupolo triplo, Waters, Milford, Massachusetts) e condições isocráticas com 100% de água como fase móvel.

Os tituladores de poliol de todas as cepas testadas são representados na Tabela 8.Tabela 8

O uso da xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis leva a um aumento significativo em tituladores de xilitol, em comparação com a enzima específica de NADH do tipo selvagem.

Exemplo 13. Expressão do gene de xilitol desidrogenase específica de NADPH de Gluconobacter oxydans plasmídica em Pichia ohmeri

Adicionalmente a uma cepa de produção de xilitol, com o uso da xilitol desidrogenase específica de NADP de P. stipitis , uma segunda cepa que expressa a xilitol desidrogenase específica de NADP de G. oxydans foi manipulada.

A cepa SRLU de P. ohmeri (MATh- leu2 ura3) derivada de ATCC 20209 e auxotrófica para leucina e uracila (Piredda e Gaillardin, 1994, supra) foi usada como hospedeiro para a construção de cepas de levedura que secretam xilitol por meio da transformação com plasmídeos pEVE3157 (D-arabitol 4- oxidorredutase específica de NAD+de E. coli) e pEVE3284 (xilitol desidrogenase específica de NADPH de G. oxydans) levando à cepa EYS3324.

Como controle, as cepas transformadas com os plasmídeos simples: pEVE3157 (D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli) e pEVE3284 (xilitol desidrogenase específica de NADH de G. oxydans), levando a EYS3067 e EYS3323, respectivamente, também foram gerados.

A D-arabitol 4-oxidorredutase de E. coli usada para a construção das cepas acima é controlada pelo promotor poPGK1 em contraste com o promotor poRR usado em cepas que expressam a xilitol desidrogenase de P. stipitis.

Entretanto, para excluir uma influência do promotor e, portanto, para poder comparar os níveis de poliol em cepas que expressam a xilitol desidrogenase a partir de G. oxydans com aquelas que expressam a enzima correspondente a partir de P. stipitis, uma cepa adicional foi gerada.

Essa cepa EYS2963 foi obtida por meio da transformação do hospedeiro SRLU com pEVE3123 (D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ de E. coli) e pEVE2564 (xilitol desidrogenase específica de NADPH de P. stipitis).

A transformação de levedura foi realizada conforme descrito no Exemplo 12. Cada cepa gerada foi testada em triplicatas acerca da produção de arabitol, xilitol e ribitol, conforme descrito no Exemplo 12.

Os tituladores de poliol de todas as cepas testadas são representados na Tabela 9.Tabela 9

Os tituladores de xilitol em cepas que expressam a xilitol desidrogenase específica de NADPH a partir de G. oxydans (EYS3324) são similares àqueles de cepas que expressam a enzima correspondente a partir de P. stipites (EYS2963). Entretanto, a enzima de G. oxydans leva a tituladores de ribitol muito menores, mostrando, assim, uma especificidade de substrato maior em direção à xilulose.

Exemplo 14. Geração de uma cepa de P. ohmeri mutante com secreção de arabitol aumentada

Um mutante produtor de arabitol superior foi selecionado a partir de uma suspensão irradiada por UV de ATCC 20209 de P. ohmeri .

O sistema de irradiação de UV (Vilber Lourmat, França) foi equipado com um radiômetro RMX-3 W controlado por microprocessador. P.ohmeri foi cultivado em ágar YPD (Dextrose a 20 g/l) a 37 °C de um dia para o outro.

Uma suspensão foi preparada para alcançar 106 cfu/ml (OD620=0,4) e 5 ml foram colocados em uma placa de Petri estéril. A suspensão foi irradiada após a remoção da cobertura da placa. O comprimento de onda de UV foi de 254 nm e a energia de irradiação foi de 1,8 10-2 J/cm2. 90% da mortalidade das células de levedura foram obtidas. Após parar a irradiação e recolocar a tampa na placa, a suspensão foi transferida para um tubo estéril situado em um banho gelado.2 0 ml de meio líquido YPD foram inoculados com a suspensão mutante e foram incubados durante 12 horas a 37 °C, 250 rpm.

Após a incubação, a cultura mutante foi diluída com glicerol a 40% estéril (v/v). As alíquotas foram distribuídas em frascos de 5 ml e congeladas a -80 °C.

A triagem foi baseada na propriedade osmofílica de Pichia ohmeri que tem capacidade para se desenvolver em concentrações muito altas de dextrose (até 600 g/l).

O objetivo foi selecionar mutantes com capacidade para se desenvolver mais rápido do que a cepa-mãe em ágar YPD contendo dextrose a 600 g/l ou 700 g/l.

As alíquotas descongeladas foram espalhadas em YPD600 e YPD700 e as primeiras colônias que apareceram foram selecionadas e testadas acerca da produção de arabitol em frascos de agitação.

O meio de subcultura e produção foram feitos com glicose a 50 g/l ou 100 g/l, respectivamente, extrato de levedura a 3 g/l, MgSO4 a 1 g/l e KH2PO4 a 2 g/l, pH 5,7. A subcultura (10 ml em um frasco de 100 ml) foi incubada durante 24 h a 37 °C, 250 rpm. A produção (40 ml em um frasco de 500 ml) foi inoculada por durante 64 horas a 37 °C, 250 5 ml de subcultura e incubada rpm.

A cepa de P. ohmeri mutante foi selecionada acerca de seu consumo mais rápido de glicose e sua produção maior de arabitol e foi depositada na França em 7 de março de 2012, com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [National Collection of Microorganism Cultures] do Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, sob o número I-4605.

Exemplo 15. Construção de um plasmídeo de deleção LEU2

Com a finalidade de ter capacidade para usar a cepa CNCM I-4605 recém-gerada para a seleção de plasmídeo e integrações de gene, um plasmídeo para a deleção do quadro de leitura aberta de LEU2 foi construído.

Em uma primeira etapa, um vetor de integração geral que pode ser usado em P. ohmeri foi adaptado a partir do sistema CRE/loxP de S. cerevisiae. A cadeia principal de vetor foi isolada a partir de pUG73 (Gueldener et al., 2002, Nucleic Acid Res, 30, e23) por meio do corte de restrição com enzimas PstI e EcoRV (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Um inserto atendeu um fragmento de PCR contendo um marcador de seleção LEU2 de P. ohmeri flanqueado por sítios loxP, gerado com o par de iniciadores: EV3043 (CACTGGCGCGCCCACTGCATGCGTCGACAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGTATGCT ATACGAAGTTATTAGGTCTAGACACATCGTGGATCCAAGCTATCAACGAGAGAGTC) (SEQ ID No 24) e EV3044 (AGTGGCTAGCAGTGCCATGGCCTAATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATAT TAAGGGTTCTCGAGACGCGTCATCTAGCATCTCATCTACCAACTC) (SEQ ID No 25) e poARS (plig3 - FR 2772788 - consulte Figura 6) como modelo. O iniciador direto EV3043 contém um sítio AscI (sublinhado) que precede um sítio SphI (sublinhado), seguido de um fragmento loxP de 48 bp de comprimento (em negrito) e um sítio DraIII (sublinhado). A extremidade 3’ de EV3043 contém um fragmento adicional de 25 bp de comprimento para a amplificação do gene de P. ohmeri LEU2. O iniciador inverso EV3044, por outro lado, contém um sítio NheI (sublinhado) que precede um sítio NcoI (sublinhado), seguido de um fragmento loxP de 48 bp de comprimento (em negrito) e um sítio MluI (sublinhado). A extremidade 3’ de EV3044 contém um fragmento adicional de 25 bp de comprimento para a amplificação do gene de P. ohmeri LEU2. O modelo foi amplificado em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C, seguido de 30 ciclos com 10 s a 98 °C/10 s a 65 °C/50 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 7 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O fragmento amplificado foi flanqueado por um sítio PstI e EcoRV em uma segunda reação PCR para a subclonagem adicional. A amplificação foi realizada com: iniciador EV3056 (CACTCTGCAGCACTGGCGCGCCCACTGCAT) (SEQ ID No 26) contendo o sítio PstI (sublinhado) e iniciador EV3057 (CACTGATATCAGTGGCTAGCAGTGCCATGG) (SEQ ID No 27) contendo o sítio EcoRV (sublinhado)

Em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1 X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C, seguido de 30 ciclos com 10 s a 98 °C/45 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 7 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O marcador LEU2 a 2,5 kb amplificado foi digerido por restrição com as enzimas PstI e EcoRV (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), purificado em gel com o kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research

Corporation, Irvine, Califórnia) e ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal PstI/EcoRV a 2,4 kb (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), purificada em gel (kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) do vetor pUG73 (Gueldener et al., 2002 Nucleic Acid Res, 30, e23) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) - (Figura 22). Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2787 (Figura 23) contém o marcador de seleção P. ohmeri LEU2 sob o controle do promotor e terminador endógeno, flanqueado por dois sítios loxP. Adicionalmente, um sítio AscI e SphI foi introduzido a montante do primeiro loxP e um sítio NheI e NcoI a jusante do segundo loxP, para auxiliar na clonagem de regiões homólogas aos sítios de integração no genoma.

O marcador LEU2 do vetor de integração foi, então, substituído pelo gene de resistência nat1 de Streptomyces noursei, em uma segunda etapa de clonagem, um vez que uma deleção do quadro de leitura aberta de LEU2 endógeno foi pretendida.

Um fragmento de DNA que codifica o gene nat1 de Streptomyces noursei foi quimicamente sintetizado por síntese de gene GeneArt® (Life Technologies, Regensburg, Alemanha) de acordo com a sequência apresentada de SEQ ID No 28.

Os nucleotídeos 204 a 776 de sequência S60706.1 (obtida a partir de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/S60706.1) que codifica o gene nat1 foram usados como modelo e submetidos à otimização de códon para uso em ATCC 20209 de P. ohmeri de acordo com a Tabela 7 (acima), com o uso do programa Optimizer obtido a partir de http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/.

Nas extremidades 5’ e 3’ da sequência resultante, os nucleotídeos que codificam os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição AscI (GGCGCGCC) e SphI (GCATGC), respectivamente, foram adicionados manualmente no arquivo de texto, a fim de facilitar a clonagem adicional. Adicionalmente, um tripleto de adenosina foi incluído em frente ao ATG inicial para representar uma adenosina na posição -3 na sequência do tipo Kozak de leveduras.

A sequência final (SEQ ID No 28) foi, então, apresentada para síntese para GeneArt (Regensburg, Alemanha). O fragmento de DNA sintetizado que codifica o gene nat1 foi entregue como 5 μg de DNA de plasmídeo liofilizado em um vetor derivado de pMA-T (12ABTV4P, Figura 24).

Para o clonagem do gene nat1 , foi usado um vetor que contém um promotor e terminador de ribulose redutase (poRR). O terminador foi trocado por um terminador de orotidina-5'-fosfato decarboxilase (poURA3) e o gene nat1 foi introduzido entre as sequências de promotor e terminador.

Para esse propósito, o terminador de orotidina-5'- fosfato decarboxilase (poURA3) foi gerado por PCR com: iniciador EV3393 (CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG) (SEQ ID No 29) contendo um sítio SphI (sublinhado) e iniciador EV3394 (GGACCGCGGAAAGGTGAGGAAGTATATGAAC) (SEQ ID No 30) contendo um sítio SacII (sublinhado) e pEVE2523 (Figura 7) como modelo.

A amplificação foi realizada em uma mistura de reação que consistiu em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 59°C / 10 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O terminador poURA3 de 239 bp foi digerido por restrição com as enzimas SphI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado durante 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor de 11 kb de pEVE2681 linearizado com as enzimas de restrição SphI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificado em gel com o kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

Em uma segunda etapa de clonagem, o gene nat1 foi liberado a partir de 12ABTV4P (Figura 24) por meio do corte de restrição com enzimas SphI e AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Adicionalmente, um corte do sítio SphI com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C foi realizado entre a digestão de SphI e AscI. O fragmento purificado em gel de 587 bp (kit de recuperação de DNA em gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) foi, então, ligado à cadeia principal de vetor a 10,5 kb purificada em gel do vetor descrito acima cortado com enzimas de restrição SphI e AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Além disso, o sítio SphI do vetor foi cortado por 15 min à temperatura ambiente com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), seguido por uma etapa de inativação térmica de 10 min a 70 °C antes da digestão com AscI ter sido realizada. Adicionalmente, o vetor foi desfosforilado por 1 h a 37 °C com o uso de fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). A ligação foi realizada durante 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2798 (Figura 25) contém o marcador de resistência a fármacos nat1 flanqueado por um promotor de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri e um terminador de orotidina-5'-fosfato decarboxilase (poURA3).

O cassete de expressão nat1 foi usado para substituir o marcador de seleção P. ohmeri LEU2 no vetor de integração. Com a finalidade de facilitar, adicionalmente, a clonagem, o cassete nat1 teve que ser flanqueado com sítios XbaI (sublinhado em iniciador EV3643) e MluI (sublinhado em iniciador EV3644) por PCR com:iniciador EV3643 (CACTTCTAGACACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG) (SEQ ID No 31) e iniciador EV3644 (CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG) (SEQ ID No 32).

O iniciador EV3643 contém um sítio ClaI adicional (linha pontilhada) após o sítio XbaI. pEVE2798 serviu como modelo (Figura 25).A amplificação foi realizada em uma mistura de reação que consistiu em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 54 °C / 25 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O cassete de expressão nat1 de 1,3 kb foi digerido por restrição com as enzimas MluI e XbaI (New

England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado por 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor de 2,6 kb de pEVE2787 (Figura 23) linearizada com as enzimas MluI e XbaI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificado em gel com o Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 26).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2852 (Figura 27) contém o marcador de seleção nat1 sob o controle do promotor de ribulose redutase (poRR) e o terminador de orotidina-5'- fosfato descarboxilase (poURA3) e flanqueado por dois sítios loxP.

O plasmídeo de integração não contém quaisquer fragmentos homólogos de P. ohmeri necessários para a integração específica de sítio no genoma, até o momento. Esses sítios foram fixados nas etapas seguintes.

A região homóloga em 5’ a montante do quadro de leitura aberto LEU2 foi amplificada a partir do vetor poARS de 50 ng (Figura 6) com:iniciador EV3548 (CACTCTGCAGGATCCAAGCTATCAACGAGA) (SEQ ID No 33) contendo um sítio PstI (sublinhado) e iniciador EV3549 (CACTGCATGCGTTGCGGAAAAAACAGCC) (SEQ ID No 34) contendo um sítio SphI (sublinhado).

A PCR foi realizada em uma mistura de reação que consistiu em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A amplificação foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 61 °C / 15 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O fragmento de 567 bp foi digerido por restrição com as enzimas PstI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado por 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor de 3,9 kb de pEVE2852 (Figura 27) linearizada com as enzimas de restrição PstI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificado em gel com o Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 29).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2855 (Figura 28) contém um fragmento homólogo à região 5’ a montante do quadro de leitura aberto LEU2 e um marcador nat1 flanqueado por dois sítios loxP.

A região homóloga em 3’ a jusante do quadro de leitura aberto LEU2 foi amplificada a partir do vetor poARS de 50 ng (Figura 6) com: iniciador EV3550 (CACT CCATGG AGTAGGTATATAAAAATATAAGAG) (SEQ ID No 35) contendo um sítio NcoI (sublinhado) e iniciador EV3551 (CACTGCTAGCGTCGACAACAGCAACTAG) (SEQ ID No 36) contendo um sítio NheI (sublinhado).

A PCR foi realizada em uma mistura de reação que consistiu em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A amplificação foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 51°C / 25 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O fragmento de 1,3 kb foi digerido por restrição com as enzimas NcoI e NheI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado por 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor de 4,4 kb de pEVE2855 (Figura 28) linearizada com as enzimas de restrição NcoI e Nhe (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificado em gel com o Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 29).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo de deleção LEU2 final resultante pEVE2864 (Figura 30) contém um fragmento homólogo à região 5’ a montante e um fragmento homólogo à região 3’ a jusante do quadro de leitura aberto LEU2 e um marcador nat1 flanqueado por dois sítios loxP.

Exemplo 16. Geração de uma cepa de P. ohmeri mutante auxotrófica para leucina

Como a cepa CNCM I-4605 de P. ohmeri gerada não exibiu qualquer auxotrofia até o momento, uma deleção de quadro de leitura aberto LEU2 foi realizada de modo a ter capacidade de usar o marcador de seleção LEU2 para integrações de gene.

Para esse propósito, o plasmídeo pEVE2864 (Figura 30) foi digerido por restrição com as enzimas EcoRV e PstI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 2,5 h a 37 °C, e a mistura foi usada para transformar a cepa Mut165 de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12.

Para as células regeneradas, 7 ml de ágar superior amornado a 50 °C (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose, 1 M de sorbitol, pH 5,8 e 2,5% de ágar Noble) com 25 μg/ml de natamicina foram adicionados, e a mistura foi vertida uniformemente em placas de seleção contendo sorbitol pré-amornadas (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de glicose, 1 M de sorbitol, pH 5,8 e 2% de ágar) com 25 μg/ml de natamicina. As placas foram incubadas por 4 dias a 30 °C. A deleção do quadro de leitura aberto LEU2 foi verificada por nenhum crescimento em placas seletivas sem leucina e confirmada por PCR de colônia com o uso de: iniciador EV3393 (CAAGCATGCGGGAATGATAAGAGACTTTG) (SEQ ID No 29) e iniciador EV3795 (CAAGTCGTGGAGATTCTGC) (SEQ ID No 37).

O fragmento de 1,6 kb foi amplificado com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 51 °C / 25 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C.

A cepa resultante contém a deleção de quadro de leitura aberto completa do gene LEU2 em uma base genética I4605 de CNCM e foi depositada na França em 5 de fevereiro de 2015, com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Coleção Nacional de Culturas de Microorganismos] do Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS cedex 15, sob o número I-4955.

Exemplo 17. Construção de um plasmídeo de expressão duplo que compreende a desidrogenase específica para NADPH de P. stipitis e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli

A fim de possibilitar a expressão da xilitoldesidrogenase específica para NADPH de P. stipitis e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli na cepa mutante de P. ohmeri apenas auxotrófica para leucina, a construção de um plasmídeo de expressão duplo foi necessária.

O cassete de expressão contendo a xilitoldesidrogenase específica para NADPH de P. stipitis foi liberado a partir de pEVE2562 (Figura 12) por corte por restrição com as enzimas SpeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). O fragmento de1,9 kb foi purificado em gel com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e cortado com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C. O inserto foi, então, ligado por 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de pEVE3157 de 12,1 kb, linearizada em SpeI, cortada, desfosforilada (1 h a 37 °C com o uso de fosfatase Antarctic - New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificada em gel (Figura 21) contendo a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 31).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE3318 (Figura 32) contém o construto de expressão duplo da xilitol desidrogenase específica para NADPH de P. stipitis flanqueado por um promotor e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e o terminador de ribulose redutase (poRR) e o marcador de seleção poLEU2.

Exemplo 18. Construção de vetores integrativos para a expressão do gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli e o gene de xilitol desidrogenase específica para NADPH de P. stipitis em P. ohmeri

O gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específico para NAD+ de E. coli e o gene de xilitol desidrogenase específico para NADPH de P. stipitis deve, em por fim, se tornar uma parte integrante do genoma de P. ohmeri. Portanto, um vetor integrativo com um marcador de seleção LEU2 teve que ser construído, substituindo-se o marcador de seleção nat1 de pEVE2852 e incorporando-se o construto de expressão duplo de arabitol oxidorredutase e xilitol desidrogenase.

Para esse propósito, o quadro de leitura aberto de LEU2 de P. ohmeri, flanqueado por um sítio AscI e SphI, foi gerado por PCR com: - iniciador EV3645 (CAAGGCGCGCCAAAATGTCTACCAAAACCATTAC) (SEQ ID No 38) e - iniciador EV3646 (GGAGCATGCCTACTTTCCCTCAGCCAAG) (SEQ ID No 39).

A amplificação foi realizada com 50 ng de modelo de poARS (Figura 6) em uma mistura de reação que consistiu em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de polimerase iProofTM (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 57 °C / 20 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O quadro de leitura aberto de LEU2 amplificado foi subsequentemente digerido por restrição com as enzimas AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Adicionalmente, um corte do sítio SphI com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C foi realizado entre a digestão de SphI e AscI. O fragmento purificado por gel de 1,1 kb foi ligado à cadeia principal de vetor de 11 kb purificado em gel de pEVE2811 cortada com as enzimas de restrição SphI e AscI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). Além disso, o sítio SphI do vetor foi cortado por 15 min à temperatura ambiente com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), seguido por uma etapa de inativação térmica de 10 min a 70 °C antes da digestão com AscI ter sido realizada. Adicionalmente, o vetor foi desfosforilado por 1 h a 37 °C com o uso de fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). A ligação do quadro de leitura aberto de LEU2 e da cadeia principal de vetor foi realizada por 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2862 (Figura 33) contém o marcador LEU2 de P. ohmeri flanqueado por um promotor de ribulose redutase (poRR) de P. ohmeri e um terminador de orotidina-5'-fosfato descarboxilase (poURA3).

Subsequentemente, o marcador LEU2 foi amplificado por PCR com o uso de: - iniciador EV3643 (CACTATCGATGGATCCGTAGAAATCTTG) (SEQ ID No 31) contendo um sítio ClaI e - iniciador EV3644 (CACTACGCGTAAAGGTGAGGAAGTATATG) (SEQ ID No 32) contendo um sítio MluI (sublinhado) e pEVE2862 (Figure 33) como modelo.

A amplificação foi realizada em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de iProof™ polimerase (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 54°C / 30 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O fragmento de LEU2 de 1,8 kg de comprimento amplificado foi digerido por restrição com as enzimas ClaI e MluI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado por 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de 2,6 kb de vetor purificado em gel e digerido por restrição por ClaI e MluI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) de pEVE2852 (Figura 27) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 34).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE2865 (Figura 35) contém o marcador LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dois sítios loxP.

Para clonagem do vetor de integração, pEVE2865 foi digerido por restrição com a enzima SalI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), cortado com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C e desfosforilado por 1 h a 37 °C com o uso de fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

O fragmento purificado em gel de 4,5 kb da cadeia principal de vetor foi usado para ligação. Serviu como inserto um construto de expressão duplo dos genes de xilitol desidrogenase específicos para NADPH de P.stipitis e a D- arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli liberada de pEVE3318 (Figura 32) por corte por restrição com as enzimas NdeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

O fragmento de 4,4 kb foi purificado em gel com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e cortado com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C, seguida por uma purificação em gel adicional. A cadeia principal de vetor de pEVE2865 e o inserto de pEVE3318 foram ligados por 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 34).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE3387 (Figura 36) contém o construto de expressão duplo do gene de xilitol desidrogenase específica para NADPH de P. stipitis flanqueado por um promotor e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e o terminador de transcetolase (poTKL). Serve como um marcador de seleção um gene LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dois sítios loxP.

Exemplo 19. Construção de uma cepa de P. ohmeri integrativa de primeira geração que secreta xilitol no meio

O vetor descrito anteriormente foi usado para integrar aleatoriamente o gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específico para NAD+de E. coli e o gene de xilitol desidrogenase específico para NADPH de P. stipitis no genoma de P. ohmeri.

Para esse propósito, a cepa CNCM I-4955 (Exemplo 16) auxotrófica para leucina foi transformada com pEVE3387 (Figura 36) digerido por restrição com NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 3 h a 37 °C de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12. Os transformantes foram selecionados em placas de sorbitol sem qualquer leucina.

A cepa resultante contém o gene de D-arabitol 4- oxidorredutase gene específico para NAD+ de E. coli e o gene de xilitol desidrogenase específico para NADPH de P. stipitis integrado aleatoriamente no genoma de P. ohmeri e foi depositada na França em 20 de maio de 2015, com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Coleção Nacional de Culturas de Micro-organismos] do Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 Cedex 15, sob o número I-4982.

Exemplo 20. Construção de um plasmídeo de expressão duplo/triplo que compreende a desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli

A fim de possibilitar a expressão da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e a D- arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli na cepa mutante de P. ohmeri apenas auxotrófica para leucina, a construção de um plasmídeo de expressão duplo foi necessária.

O cassete de expressão contendo a xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans foi liberado a partir de pEVE3284 (Figura 10) por corte por restrição com as enzimas SpeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). O fragmento de 1,6 kb foi purificado em gel com do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e cortado com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C. A cadeia principal de vetor usada consistiu na cadeia principal de 12,1 kb de pEVE3157 linearizada por SpeI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificada em gel (Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) (Figura 21) contendo a D- arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli.

A cadeia principal foi adicionalmente cortada por 15 min à temperatura ambiente com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C e desfosforilada por 1 h a 37°C com o uso de fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). A ligação foi realizada por 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 37).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

Os plasmídeos resultantes pEVE3322 e pEVE3324 (Figura 38) contêm o construto de expressão duplo da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans flanqueado por um promotor e um terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e do terminador de transcetolase (poTKL) ou o construto de expressão triplo de dois genes de xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans flanqueados por um promotor e um terminador de ribulose de redutase de P. ohmeri (poRR) e a D-arabitol 4- oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e do terminador de transcetolase (poTKL) e o marcador de seleção poLEU2.

Exemplo 21. Construção de vetores integrativos para a expressão do gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli e o gene de xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans em P. ohmeri

Além do vetor integrativo contendo a xilitol desidrogenase específica para NADPH de P. stipitis e o gene de D-arabitol 4-oxidorredutase específico para NAD+ de E. coli, também plasmídeos contendo a xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans foram gerados.

Para esse propósito, os cassetes de expressão duplos e triplos contendo uma ou duas xilitol desidrogenases específicas para NADPH de G. oxydans e a D-arabitol 4- oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli foram liberados a partir de pEVE3322 e pEVE3324 (Figura 38) respectivamente, por corte por restrição com as enzimas NdeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts).

Os fragmentos de 4,1 kb e 5,7 kb foram purificados em gel com do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e cortados com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C. Serviu como vetor o pEVE2865 linearizado por SalI de 5,7 kb purificado em gel (Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) (Figura 35).

A cadeia principal de vetor foi adicionalmente cortada por 15 min à temperatura ambiente com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C e desfosforilação por 1 h a 37°C com o uso de fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). A ligação de vetor e inserto foi realizada por 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 39).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

Os plasmídeos resultantes pEVE3390 e pEVE3392 (Figura 40) contêm os construtos de expressão duplos ou triplos de um ou dois genes de xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans flanqueado por um promotor e terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) e a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e o terminador de transcetolase (poTKL). Serve como um marcador de seleção um gene LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dois sítios loxP.

Exemplo 22. Construção de cepas integrativas de segunda geração com capacidade de secretar mais de 100 g/l de xilitol

A cepa de primeira geração CNCM I-4982 contendo uma cópia integrada aleatoriamente do gene de D-arabitol 4- oxidorredutase específico para NAD+ de E. coli e o gene de xilitol desidrogenase específica para NADPH de P. stipitis foi usada para integrar, ainda, cópias adicionais das duas enzimas heterólogas.

Entretanto, a fim de possibilitar a integração dos construtos acima o marcador de seleção LEU2 teve que ser removido. Para esse propósito, a cepa de primeira geração CNCM I-4982 foi transformada com o vetor pEVE3163 de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12. O vetor pEVE3163 contém a CRE recombinase de bacteriófago P1 (otimizado em códon de acordo com a Tabela 7) flanqueado por um promotor e um terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR). A remoção do marcador de seleção LEU2 foi confirmada pelo não crescimento de clones nas placas sem leucina.

A cepa resultante EYS3842 foi transformada com pEVE3390 ou pEVE3392 (Figura 40) digerido por restrição com NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 3 h a 37 °C de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12. Os transformantes foram selecionados em placas de sorbitol sem qualquer leucina.

A cepa de segunda geração resultante EYS3929 contém dois genes de D-arabitol 4-oxidorredutase específicos para NAD+ de E. coli e dois genes de xilitol desidrogenase específicos para NADPH, um de G. oxydans e um segundo de P. stipitis integrados aleatoriamente no genoma. A cepa EYS3930, por outro lado, contém um gene de xilitol desidrogenase específico para NADPH adicional de G. oxydans.

Exemplo 23. Construção de um vetor adicional usado para integração de cópias de gene adicionais da D-arabitol 4- oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli e da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans

A fim de construir um vetor de integração adicional, um cassete de expressão duplo na D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli e na xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans foi amplificado por PCR com o uso de: - iniciador EV4904 (ATATCCCGGGCACCGTCATCACCGAAACGC) (SEQ ID No 40) contendo um sítio SmaI e - iniciador EV4905 (ATATCCCGGGCACGACCACGCTGATGAGC) (SEQ ID No 41) contendo um sítio SmaI (sublinhado) e pEVE3321 como modelo.

A amplificação foi realizada em uma mistura de reação que consiste em 200 μM de cada dNTP e 0,5 μM de cada iniciador com 0,02 U/μl de iProofTM polimerase (BIO-RAD, Hercules, Califórnia) no tampão 1X adequado. A PCR foi realizada com uma etapa de desnaturação inicial de 30 s a 98 °C seguida por 30 ciclos com 10 s a 98 °C / 10 s a 68°C / 75 s a 72 °C, e uma etapa de extensão final de 5 minutos a 72 °C. O produto de PCR foi separado em um gel de agarose a 1%, extraído e purificado com o uso do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia).

O fragmento com 3,9 kb de comprimento amplificado foi digerido por restrição com SmaI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e ligado por 2 h à temperatura ambiente à cadeia principal de vetor de 4,4 kb linearizada por PvuII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), desfosforilada por fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificada em gel de pEVE2865 (Figura 35) com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 41).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold(Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

Os plasmídeos resultantes pEVE4390 (Figura 42) contêm o construto de expressão duplo da D-arabitol 4- oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli sob o controle do promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK1) e terminador de transcetolase (poTKL) e do gene de xilitol desidrogenase específico para NADPH de G. oxydans flanqueado por um promotor e um terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR). Serve como um marcador de seleção um gene LEU2 de P. ohmeri flanqueado por dois sítios loxP.

Exemplo 24. Construção de um vetor usado para a integração da desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e da D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de R. solanacearum

Um vetor integrativo adicional para a expressão da desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e da D- arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de R. solanacearum foi construído conforme segue: Em uma primeira etapa, um vetor de expressão duplo contendo os dois genes acima foi gerado. Esse cassete de expressão duplo foi clonado em um vetor loxP integrativo.

Um fragmento de DNA que codifica o gene de D- arabitol 4-oxidorredutase específico para NAD+ de Ralstonia solanacearum foi sintetizado quimicamente por Síntese de Gene GeneArt® (Life Technologies, Regensburg, Alemanha) de acordo com a sequência submetida de sequência SEQ ID No 42.

Os nucleotídeos 2310548 a 2309151 da sequência AL646052.1 (obtidos a partir do endereço http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL646052) que codificam o gene dalD foram usados como modelo e submetidos à otimização de códon para uso em ATCC 20209 de P. ohmeri de acordo com a Tabela 7 (acima), com o uso do programa Optimizer obtido a partir do endereço http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/. Nas extremidades 5’ e 3’ da sequência resultante, os nucleotídeos que codificam os sítios de reconhecimento das enzimas de restrição AscI (GGCGCGCC) e SphI (GCATGC), respectivamente, foram adicionados manualmente no arquivo de texto, a fim de facilitar a clonagem adicional. Adicionalmente, um tripleto de adenosina foi incluído em frente ao ATG inicial para representar uma adenosina na posição -3 na sequência do tipo Kozak de leveduras.

A sequência final (SEQ ID No 42) foi, então, submetida para síntese a GeneArt (Regensburg, Alemanha). O fragmento de DNA sintetizado que codifica o gene dalD foi entregue como 5 μg de DNA plasmídeo liofilizado em um vetor derivado de pMA-RQ (13AB2EGP, Figura 43).

O fragmento de 1,4 kb da D-arabitol 4- oxidorredutase de R. solanacearum foi liberado do vetor 13AB2EGP (Figura 43) por restrição digerido com AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificado em gel com o Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). O inserto foi, então, ligado com a cadeia principal de 11,8 kb de pEVE2560 (Figura 8) linearizada com AscI e SphI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) e purificado em gel com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 44).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE3898 (Figura 45) contém a D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de R. solanacearum otimizada em códon flanqueada por um promotor e um terminador de ribulose redutase de P. ohmeri e o marcador de seleção poLEU2.

Em uma etapa seguinte, o cassete de expressão contendo a xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase (poPGK) e um terminador de ribulose redutase (poRR) foi liberado de pEVE3960 por digestão por restrição com SpeI e SacII (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). O fragmento de 1,8 kb foi purificado em gel com do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e cortado com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C. Serviu como vetor o pEVE3898 linearizado por SalI de 13,2 kb purificado em gel (Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia). A cadeia principal de vetor foi adicionalmente cortada por 15 min à temperatura ambiente com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts), seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C e desfosforilação por 1 h a 37°C com o uso de fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). A ligação de vetor e inserto foi realizada por 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 44).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE4077 (Figura 46) contém o construto de expressão duplo da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans flanqueada por um promotor de fosfoglicerato quinase de P. ohmeri (poPGK) e um terminador de ribulose redutase (poRR) e da D-arabitol 4- oxidorredutase específica para NAD+ de R. solanacearum sob o controle do promotor e do terminador de ribulose redutase de P. ohmeri (poRR) e o marcador de seleção poLEU2.

Finalmente, o cassete de expressão duplo da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e da D- arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de R. solanacearum foi liberado de pEVE4077 (Figura 46) por corte por restrição com SapI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). O fragmento de 5,9 kb foi purificado em gel com do Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e cortado com o kit de Mistura de Enzimas de Corte (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 15 min à temperatura ambiente, seguido por inativação térmica das enzimas por 10 min a 70 °C. Serviu como vetor o pEVE2865 linearizado por EcoRV de 4,4 kb purificado em gel (Kit de Recuperação de DNA em Gel ZymocleanTM - Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) (Figura 35), desfosforilado por 1 h a 37 °C com fosfatase Antarctic (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts). A ligação de vetor e inserto foi realizada por 2 h à temperatura ambiente com o uso de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) (Figura 44).

Após a transformação de células ultracompetentes XL10 Gold (Agilent Technologies, Santa Clara, Califórnia) com a mistura de ligação, DNA plasmídeo foi isolado com o uso do Kit ZyppyTM Plasmid Miniprep (Zymo Research Corporation, Irvine, Califórnia) e adicionalmente caracterizado por digestão por restrição e sequenciamento (Microsynth, Balgach, Suíça).

O plasmídeo resultante pEVE4377 (Figura 47) contém o construto de expressão duplo da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e da D-arabitol 4- oxidorredutase específica para NAD+ de R. solanacearum e o marcador de seleção poLEU2 flanqueado por dois sítios loxP.

Exemplo 25. Construção de cepas integrativas de terceira geração com produtividade aumentada de xilitol

O marcador LEU2 de cepas de segunda geração EYS3929 e EYS3930 (Exemplo 22) recebeu lox conforme descrito no Exemplo 18 com o uso do vetor pEVE3163. As cepas resultantes EYS4118 e EYS4119 foram transformadas com pEVE4377 (Figura 47) e pEVE4390 (Figura 42), respectivamente. Os vetores foram digeridos por restrição com NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 3 h a 37 °C de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12. Os transformantes foram selecionados em placas de sorbitol sem qualquer leucina.

A cepa de terceira geração resultante EYS4353 contém três genes de D-arabitol 4-oxidorredutase específicos para NAD+, dois de E. coli e um de R. solanacearum e três genes de xilitol desidrogenase específicos para NADPH, dois de G. oxydans e um de P. stipitis integrados aleatoriamente no genoma.

A segunda cepa de terceira geração, por outro lado, contém três cópias da D-arabitol 4-oxidorredutase específica para NAD+ de E. coli, três cópias da xilitol desidrogenase específica para NADPH de G. oxydans e uma cópia de P. stipitis, base genética, e foi depositada na França em 5 de março de 2015, com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Coleção Nacional de Culturas de Micro-organismos] do Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, sob o número I-4960.

Exemplo 26. Construção de cepas integrativas de quarta geração

O marcador LEU2 de cepas de terceira geração CNCM I-4960 (Exemplo 25) recebeu lox conforme descrito no Exemplo 18 com o uso do vetor pEVE3163. A cepa resultante EYS4955 foi transformada com pEVE4377 (Figura 47) digerido por restrição com NotI (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts) por 3 h a 37 °C de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 12. Os transformantes foram selecionados em placas de sorbitol sem qualquer leucina.

A cepa de quarta geração resultante contém quatro genes de D-arabitol 4-oxidorredutase específicos para NAD+, três de E. coli e um de R. solanacearum e quatro genes de xilitol desidrogenase específicos para NADPH, três de G. oxydans e um de P. stipitis integrados aleatoriamente no genoma e foi depositada na França em 20 de maio de 2015, com a Collection Nationale de Cultures de Microorganismes [Coleção Nacional de Culturas de Micro-organismos] do Institut Pasteur (CNCM), 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS Cedex 15, sob o número I-4981.

Exemplo 27. Produção de poliol com cepas de Pichia ohmeri (meio sintético)

As cepas de levedura CNCM I-4605, CNCM I-4982, CNCM I-4960 e CNCM I-4981, construídas conforme descrito acima, foram fermentadas de acordo com o seguinte protocolo.

O processo de fermentação é executado sob limitação de nitrogênio e pode ser separado em uma fase de crescimento e uma fase de produção. Durante a fase de crescimento, a amônia no meio é completamente consumida para produzir biomassa, uma vez que a formação de biomassa cesse, a fase de produção de se inicia e os níveis de poliol aumentam. A plataforma usada para o processo de fermentação descrito foi um Multifors 2 da INFORS HT, com o uso de recipientes com um volume de trabalho de 1 l. Os fermentadores foram equipados com duas turbinas de disco com seis pás Rushton. Ar foi usado para pulverizar os fermentadores.

Temperatura, pH, agitação e taxa de aeração foram controladas por todo o cultivo. A temperatura foi mantida a 36 °C. O pH foi mantido a 3 por adição automática de 5 M de KOH.

A taxa de aeração foi mantida a 1,0 vvm, e a velocidade inicial do agitador foi ajustada em 300 rpm. A fim de impedir que o oxigênio dissolvido (DO) caia abaixo de 20%, uma cascata de agitação automática foi empregada. As condições de operação usadas no processo de fermentação são sumarizadas na Tabela 10.Tabela 10: Condições de operação para as fermentações de produção de poliol

Para inoculação dos fermentadores, uma cultura de propagação em 1 estágio foi usada. A composição do meio de cultura de propagação usado é descrita na tabela 11. As culturas de propagação foram preparadas inoculando-se 100 ml de meio em um frasco de agitação de 500 ml com 4 chicanas (entalhe). Os frascos de agitação foram incubados e uma mesa de agitação a 30 °C e 150 rpm. As células foram cultivadas por aproximadamente 24 horas em fase exponencial média.Tabela 11: Composição de meio de cultura de propagação.

Antes da inoculação, uma quantidade do meio no fermentador equivalente à quantidade de inóculo foi removida e uma alíquota da cultura de propagação foi usada para inoculação do fermentador até um volume final de 1 l e um OD600inicial de aproximadamente 0,2 (CDW aproximadamente 0,03 g/l). A composição do meio usado no fermentador é descrita na tabela 12.Tabela 12: Composição de meio de fermentação.

As amostras foram removidas em intervalos regulares,e o caldo de fermentação total foi analisado quanto ao consumo de glicose e formação de poliol extracelular (Xilitol, Arabitol e Ribitol). Além disso, os metabólitos de fermentação comuns (Glicerol, Acetato, Etanol, Piruvato, Malato, Fumarato e Succinato) foram determinados. O aumento em biomassa foi, por um lado, seguido por OD600 e, por outro lado, por determinação de peso seco celular (CDW). As medições mencionadas acima foram usadas para determinar a produção de Poliol, rendimento e produtividade de Arabitol ou Xilitol; os resultados são mostrados na tabela 13.Tabela 13: Produção de poliol com cepas de Pichia ohmeri (meio sintético).

CNCM I-4605 c le Pichia ohmeri prod luz apenas arabitol.

CNCM I-4982 de Pichia ohmeri produz arabitol, xilitol e ribitol. Nessa cepa, uma cópia de gene de D- arabitol 4-oxidorredutase para NAD+ e uma cópia de gene de xilitol desidrogenase específico para NADPH foram integradas. A cepa modificada tem agora capacidade de consumir arabitol. Consequentemente, após o consumo total de glicose, arabitol e ribitol são consumidos novamente por CNCM I-4982 para produzir mais xilitol.

CNCM I-4960 de Pichia ohmeri (terceira geração) e CNCM I-4981 (quarta geração) produzem xilitol e ribitol, mas não mais arabitol. A conversão intracelular de arabitol em xilulose e xilitol é eficaz o suficiente para evitar a excreção de arabitol no caldo.

Quanto mais cópias dos genes que codificam a D- arabitol oxidorredutase específica para NAD+ e a xilitol desidrogenase específica para NADPH forem introduzidas em P. ohmeri, mais altos são o titulador, o rendimento e a produtividade de xilitol.

Claims (9)

1. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE COM CAPACIDADE DE PRODUZIR XILITOL, em que a dita célula hospedeira é selecionada a partir de bactérias, fungos e levedura, é caracterizada por compreender: uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 3 ou SEQ ID No 42, que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) que usa D-arabitol como substrato e que produz D-xilulose como produto, em que a D- arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ (EC 1.1.1.11) compreende ou consiste na sequência SEQ ID No 2 ou 43; e, uma sequência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 6 ou 9, que codifica uma xilitol desidrogenase específica de NADPH que usa D-xilulose como substrato e que produz xilitol como produto, em que a xilitol desidrogenase específica de NADPH compreende ou consiste na sequência de SEQ ID No 5 ou 8, e em que a célula hospedeira produz D-arabitol a partir de D-glicose, e não consome D-arabitol como única fonte de carbono.

2. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela célula hospedeira produzir D-arabitol a partir de D-glicose sob meio de pressão osmótica alta.

3. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela célula hospedeira ser uma levedura osmofílica ou osmotolerante.

4. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela célula hospedeira ser Pichia ohmeri.

5. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela célula hospedeira ter capacidade de produzir um titulador de xilitol de pelo menos 15 g/l no sobrenadante após uma cultura de 48 h.

6. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pela célula hospedeira ser uma cepa selecionada a partir de cepas I-4982, I-4960 e I-4981 depositadas no CNCM.

7. CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pela célula hospedeira compreender várias cópias de uma sequência que codifica uma D-arabitol 4-oxidorredutase específica de NAD+ e/ou várias cópias de uma sequência que codifica a xilitol desidrogenase específica de NADPH.

8. MÉTODO PARA PRODUZIR XILITOL, caracterizado por compreender cultivar uma célula hospedeira recombinante, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e recuperar xilitol.

9. USO DE UMA CÉLULA HOSPEDEIRA RECOMBINANTE, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por ser para produção de xilitol.