CN103194496A - 发酵法生产α-酮戊二酸的残糖控制方法 - Google Patents
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Abstract
一种发酵法生产α-酮戊二酸的残糖控制方法。该方法以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047（保藏编号为CGMCC NO.5481）为生产菌株，利用发酵控制策略，流加质量浓度为90%～70%的口服葡萄糖溶液,使其在发酵液中大量积累α-酮戊二酸。长菌阶段，菌体利用过量的葡萄糖合成自身生长所需物质；产酸阶段，控制发酵液中的残糖浓度，使其质量浓度维持在3%～2%，同时限制发酵培养基氮源的供应，发酵时间35～40h，α-酮戊二酸产量为42.5g/L。本发明与国内其它发酵生产α-酮戊二酸的方法（需要发酵6天）相比，具有发酵周期短的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及发酵过程控制，特别是一种发酵工程中残糖的控制策略，应用于α-酮戊二酸的发酵法生产。
背景技术
α-酮戊二酸(α-ketoglutarate，α-KG)，也称2-氧代戊二酸或α-羰基戊二酸，是分子式为C5H6O5、相对分子质量为146.1的白色或微黄色的结晶，其化学结构式如下：
α-酮戊二酸化学结构式。
作为三羧酸循环(TCA)和氨基酸代谢的重要中间产物之一，α-酮戊二酸参与生物体内氨基酸、维生素和有机酸的合成及能量代谢。迄今为止，α-酮戊二酸已被广泛应用于化工、食品、医药、日化等领域，由此可见，该化合物在营养食品，医药，化工等领域具有非常重要的应用前景。现在，α-酮戊二酸主要被应用于：作为杂环化合物化学合成的反应骨架；食品营养改善物；医药制品的组成成分，生化试剂和检测肝功能的配套试剂以及伤口愈合添加物；α-酮戊二酸与5-羟甲基糠醛一起作用能够增强人或者动物抗氧化能力；此外，Barrett和Yousaf等人描述的α-酮戊二酸与1,2,4-丁三醇或1,2,6-己三醇的热缩聚产物(triol-α-ketoglutarate)具有很好的弹性，其在机械和化学领域有很广泛的应用，该性能可能使其在生物医药拥有新的应用的潜能，例如在组织工程和药物传送方面等；有研究表明，α-酮戊二酸作为氮素运载体，能够结合细胞中形成的氮素，阻止细胞中氮素的过度累积。
随着α-酮戊二酸应用范围的不断扩大，其市场需求也在不断增长，而目前市场上α-酮戊二酸的生产主要是通过化学合成的。主要以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等为原料，合成α-酮戊二酸，具有收率高、副产物少、反应条件温和、易于工业化放大等优点。但是在原料来源和安全生产上存在一定的问题，主要存在爆炸的危险，此外，化学合成对环境污染大以及生产过程中对人的身体危害十分大。因此，利用微生物发酵法生产α-酮戊二酸具有重要的意义。
对于利用微生物发酵生产α-酮戊二酸的研究，最早见于1946年，Lockwood和Stodola用细菌生物合成α-酮戊二酸。之后，Asai等人利用假单胞杆菌、产气杆菌和粘质沙雷氏菌过量合成α-酮戊二酸，并且提出过量合成α-酮戊二酸的必要条件是培养基中碳氮比。
目前国内对发酵法生产α-酮戊二酸的研究较少。江南大学陈坚等人筛选的解脂亚洛酵母（Yarrowia lipolytica WSH-Z06），液态发酵6天，α-酮戊二酸产量可达39.3g/L。但该方法发酵周期长,且操作复杂。
发明内容
本发明的目的是解决现有发酵生产α-酮戊二酸的方法所需周期长以及产酸率不高的问题，提供一种发酵法生产α-酮戊二酸的残糖控制方法。
本发明涉及的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047，保藏编号为CGMCC No.5481，已于2011年11月22日保藏并在2011103927788号专利中公开。
本发明的技术方案是，以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047为生产菌株，发酵生产α-酮戊二酸，发酵时间35～40h，初始发酵时(0h)，发酵液中底糖浓度为7%～9%，菌体利用过量的葡萄糖合成自身生长所需物质；发酵过程中（产酸阶段），控制发酵液中的残糖浓度，使其质量浓度维持在3%～2%，发酵后期，即发酵30h至发酵结束，发酵液中残糖应该严格高于1%。
本发明方法在长菌阶段，菌种利用基质中大量的葡萄糖快速生长，形成较高的菌体浓度，转型后的产酸阶段，菌体保持较高活性，由于合适的碳氮比，菌体利用葡萄糖合成α-酮戊二酸，同时保持发酵液中一定的残糖浓度，使得菌体不利用发酵液中的α-酮戊二酸产物，从而达到过量积累α-酮戊二酸的目的。
本发明方法的具体操作如下，以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养12～14h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至含底糖为7%～9%的发酵培养基的发酵罐中，34℃，开始发酵；以后每两个小时取样，检测发酵液的残糖浓度，通过流加90%～70%的口服葡萄糖溶液，使得发酵液中残糖浓度维持在3%～2%，发酵后期，即发酵30h至发酵结束，发酵液中残糖应该严格高于1%。
上述方法中：
⑴斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2；
⑵种子培养基成分：口服葡萄糖25g/L，玉米浆45mL/L，豆浓30mL/L，K2HPO4·3H2O2.2g/L，MgSO4·7H2O0.9g/L，NH3NO36g/L，尿素3g/L；
⑶液体发酵培养基成分：口服葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O3.85g/L，VB10.4mg/L，MgSO4·7H2O2g/L，MnSO45mg/L，FeSO45mg/L，ZnSO45mg/L，KCl 1.333g/L，玉米浆3mL/L，糖蜜1.1g/L，豆浓10mL/L。
所述的谷氨酸棒状杆菌，可以替换为芽孢杆菌类细菌，肠杆菌科细菌、或酵母类真菌。
本发明的优点和有益效果：
本发明发酵30～40h便可积累α-酮戊二酸达40g/L以上，国外发酵法生产α-酮戊二酸,使用的发酵基质为非葡萄糖等碳源(如乙醇等)，其对发酵设备要求较高，且几乎没人使用谷氨酸棒状杆菌为生产菌发酵生产α-酮戊二酸，也鲜见有文献具体描述以谷氨酸棒状杆菌为生产菌的发酵控制等技术；而与国内其它发酵生产α-酮戊二酸的方法（需要发酵6天）相比，具有发酵周期短的特点；发酵培养过程中，只需将残糖浓度控制在3%～2%，其它控制都可以由发酵罐控制器智能控制，具有操作简单等特点。本发明根据菌的生长和代谢特性调整相关发酵工艺，实现α-酮戊二酸的积累，建立一种α-酮戊二酸高效生产方法，获得少有或者没有副产物的高纯度产品，同时形成一套简洁易控的α-酮戊二酸发酵工艺。
具体实施方式
本发明实施例1：维持发酵液中残糖质量浓度为3%～2%，发酵积累α-酮戊二酸
将活化斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h;按10%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，34℃，溶氧维持在30%～40%，每两个小时取样,检测发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度低于2%，通过流加90%～70%的口服葡萄糖溶液，使得发酵液中残糖维持在3%～2%，发酵培养40h，α-酮戊二酸产量为42.5g/L。
对比实施例2
维持发酵液中残糖质量浓度为9%～7%之间，发酵积累α-酮戊二酸
本过程以谷氨酸棒状杆菌GKG-047为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养14h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h;按10%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，34℃，溶氧维持在30%～40%，每两个小时取样,检测发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度低于5%，通过流加90%～70%的口服葡萄糖溶液，使发酵液中残糖浓度维持在5%～6%之间，至发酵结束，α-酮戊二酸产量为31.7g/L。
对比实施例3：维持发酵液中残糖质量浓度为1%以下，发酵积累α-酮戊二酸
将活化斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h;按10%的接种量转接至装有发酵培养基的发酵罐中，34℃，溶氧维持在30%～40%，每两个小时取样,检测发酵液的残糖浓度，当发酵液残糖浓度低于0.5%，通过流加90%～70%的口服葡萄糖溶液，使得发酵液中残糖维持在1%～0.5%，至发酵结束,α-酮戊二酸产量为37.8g/L。
以上各实施例中涉及的培养基成分及培养条件如下：
⑴斜面培养基成分(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2。
培养条件：32℃，pH7.0～7.2，培养14h。
⑵种子培养基成分：口服葡萄糖25g/L，玉米浆45mL/L，豆浓30mL/L，K2HPO4·3H2O2.2g/L，MgSO4·7H2O0.9g/L，NH3NO36g/L，尿素3g/L。
培养条件：32℃，pH7.0～7.2，200rpm，培养7～8h。
⑶液体发酵培养基成分：口服葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O3.85g/L，VB10.4mg/L，MgSO4·7H2O2g/L，MnSO45mg/L，FeSO45mg/L，ZnSO45mg/L，KCl 1.333g/L，玉米浆3mL/L，糖蜜1.1g/L，豆浓10mL/L。
⑷利用高效液相色谱法测定发酵液中α-酮戊二酸含量。
色谱条件为：色谱柱为Bio-Rad Aminex HPX-87H（300×7.8mm,L×I.D.），流动相为0.005M的H2SO4，流速0.5ml/min，柱温25°C，检测波长210nm。
在本发明实施例1的条件下，重复5批次发酵，α-酮戊二酸产量稳定在40g/L以上。
本发明实施例1与对比实施例2相比较：对比实施例2中α-酮戊二酸产量为31.7g/L；本发明实施例1中α-酮戊二酸产量为42.5g/L，比对比实施例2提高了25.4%；
本发明实施例1与对比实施例3相比较：对比实施例3中，发酵36h处，测得测得残糖浓度为0.8，α-酮戊二酸为40.2g/L，此后，发酵液中残糖浓度一直没有降低，40h，发酵结束，测得α-酮戊二酸的最终产量为37.8g/L，比之前降低了5.97%；本发明实施例1中α-酮戊二酸产量为42.5g/L，比对比实施例3提高了11.1%。
Claims (4)
1.一种发酵法生产α-酮戊二酸的残糖控制方法，其特征在于：以谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)GKG-047为生产菌株，发酵生产α-酮戊二酸，发酵时间35～40h，初始发酵发酵时,发酵液中底糖浓度为7%～9%，发酵过程中，控制发酵液中残糖浓度维持在3%～2%，发酵后期，即发酵30至发酵结束，发酵液中残糖应该严格高于1%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于该方法的具体操作如下，以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株，接种至活化斜面，32℃培养12～14h后，用接种环刮取斜面菌种接种至种子培养基，32℃，200rpm培养7～8h；按10%的接种量转接至含底糖为7%～9%的发酵培养基的发酵罐中，34℃，开始发酵；以后每两个小时取样，检测发酵液的残糖浓度，通过流加90%～70%的口服葡萄糖溶液，使得发酵液中残糖浓度维持在3%～2%，发酵后期，即发酵30至发酵结束，发酵液中残糖应该严格高于1%。
3.根据权利要求2所述方法，其特征是：
⑴斜面培养基成分以g/L计为：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl2.5，琼脂30，pH7.0～7.2；
⑵种子培养基成分：口服葡萄糖25g/L，玉米浆45mL/L，豆浓30mL/L，K2HPO4·3H2O2.2g/L，MgSO4·7H2O0.9g/L，NH3NO36g/L，尿素3g/L；
⑶液体发酵培养基成分：口服葡萄糖80g/L，Na2HPO4·12H2O3.85g/L，VB10.4mg/L，MgSO4·7H2O2g/L，MnSO45mg/L，FeSO45mg/L，ZnSO45mg/L，KCl1.333g/L，玉米浆3mL/L，糖蜜1.1g/L，豆浓10mL/L。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于：所述的谷氨酸棒状杆菌，替换为芽孢杆菌类细菌，肠杆菌科细菌、或酵母类真菌。
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