CN102220248A

CN102220248A - 一种产生聚苹果酸的菌株及利用其发酵生产聚苹果酸的方法

Info

Publication number: CN102220248A
Application number: CN 201110131566
Authority: CN
Inventors: 徐志南; 张慧莉; 黄磊; 蔡谨
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Shandong Jin Cheng Bioceuticals Inc
Priority date: 2011-05-20
Filing date: 2011-05-20
Publication date: 2011-10-19
Anticipated expiration: 2031-05-20
Also published as: CN102220248B

Abstract

本发明公开的产生聚苹果酸的菌株，是从植物叶片表面筛选得到的不产生黑色素的菌株，分类命名为出芽短梗霉，拉丁文学名为（Aureobasidium pullulans）ZD-3D,该菌株保藏编号为CGMCC No.4605。利用该菌株发酵生产聚苹果酸方法简单易行，有利于聚苹果酸的分离纯化，产量最高可达到50~60g/L。

Description

一种产生聚苹果酸的菌株及利用其发酵生产聚苹果酸的方法

技术领域

本发明涉及一种高产聚苹果酸[poly (β-L- malic acid), PMLA]的菌株以及利用该菌株发酵生产聚苹果酸的方法。

背景技术

聚苹果酸[poly (β-L- malic acid)，PMLA]是以苹果酸为唯一单体、相互通过酯键联接而成的一种特殊的脂肪族聚酯，它是天然多聚物中新近开发的一种生物多聚物。PMLA是以苹果酸为基本结构单元，以一个苹果酸分子的-OH和另一个苹果酸分子的α或β-COOH连接而成。目前发现有3种结构的PMLA：α型、β型和γ型三种聚苹果酸可以通过化学的或生物的方法合成,目前两种方法都在研究中。通过学合成可以得到3种类型聚苹果酸; 而从微生物细胞中分离的聚苹果酸有β型一种。

聚苹果酸含有很多自由羧基和非对称碳原子，具有良好的水溶性，生物可降解性，生物相容性和生物可吸收性。这些性质使得聚苹果酸及其衍生物在制药、医学、食品和化妆品领域有很重要的应用。目前已经涉及应用的领域包括药物载体及微胶囊材料、生物医学材料如固体药物外包装、渗析袋、医疗器械附加高分子涂层、组织工程的支架材料等、化妆产品辅料等。

目前聚苹果酸的制备主要有化学合成法和生物合成法两种。生物合成法采用微生物发酵生产聚苹果酸。聚β-L-聚苹果酸可以由各种各样的黏菌和丝状真菌合成。短梗霉属菌株合成较低等分子量的聚苹果酸，分子量约为11KDa，由黏菌合成的聚苹果酸分子量约为50～300KDa。短梗霉属菌株生产的聚苹果酸产量很高，菌株Aureobasidium sp. 以葡萄糖、丁二酸铵分别为碳氮源, 添加适量的丁二酸, CaCO₃ 调节发酵液的pH 值, 得到的发酵液中含量为47 g/l聚苹果酸。普鲁兰多糖是短梗霉属菌株生产聚苹果酸时产生的主要副产物，同时很多短梗霉属菌株还产生大量黑色素。由黏菌产生的聚苹果酸产量相对较低，最大3.3g/l。另外，生物合成的聚苹果酸具有高度的光学纯度，均为聚-β-L-苹果酸。

化学合成法有直接聚合法和开环聚合法。一般来说, 直接聚合得到的主要是γ型聚苹果酸，其相对分子质量比较低, 最大只有5KDa, 且催化剂有毒性, 较难分离得到产物。开环聚合法得到的聚苹果酸相对分子质量较大,最大可以达到174KDa。由于目前研究关注的热点是在微生物体内发现的天然β型聚苹果酸，而β型的聚苹果酸只有内酯开环法可以合成, 但该方法形成内酯的步骤较多、且产率太低, 中间产物分离提纯步骤繁琐，反应对于原料和装置都有很高要求，导致了高成本，这些制约了该方法的实际应用。

生物法合成聚苹果酸可以利用可再生的生物资源发酵生产，成本低廉，合成条件温和，产物的分子量相对较高，从发酵液中提取纯化步骤简单，通过甲醇或乙醇反复沉淀就可以得到聚苹果酸钙盐。因此生物法合成具有很大优势，但其开发和应用受到了高成本，低效率的制约，目前还没有一个优化的可以工业化生产的路线，只有少量的天然聚苹果酸和人工合成聚苹果酸可以提供。如果能够提高天然聚苹果酸的产量，降低其生产成本，其应用领域将会得到进一步开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种产生聚苹果酸的菌株及利用该菌株发酵生产聚苹果酸的方法

本发明的产生聚苹果酸的菌株，是从植物叶片表面筛选得到的不产生黑色素的菌株，分类命名为出芽短梗霉，拉丁文学名为（Aureobasidium pullulans）ZD-3D, 该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No. 4605。保藏日期：2011.2.24，保藏单位地址：中国科学院微生物研究所。

本发明所述的菌株其形态特征为：菌落表面粘稠，最初为白色，逐渐变为黑色，边缘有菌丝伸入琼脂内部，没有气生菌丝。可产生椭圆形酵母样芽生孢子，厚壁孢子，肿胀孢子和菌丝。

通过将该菌株的rDNA 的ITS序列和其他真菌的比对，结果证实本发明的菌株为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）。

利用产生聚苹果酸的菌株生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：

1）取25℃培养48~60h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌种一环，接种于液体种子培养基，装液量为500ml三角瓶中30~60ml培养基，转速为160~220rpm，20~30℃ 培养48~80h得到种子液；

上述的种子培养基为：40~160g/l碳源，0.5~4g/l氮源，0.1~1.0g/lK₂CO₃，0.1~1.0g/lKH₂PO₄，0.1~1.0g/lMgSO₄·7H₂O，0.01~0.1g/l ZnSO₄·7H₂O，0.5~2g/l玉米浆，10~30g/l碳酸钙；

2）将制备好的种子液按5%~10%比例接种到发酵培养基中，装液量500ml三角摇瓶中30~60ml培养基，转速为160~220rpm，25℃，培养100~180h；或者将制备好的种子液接种到发酵罐，发酵培养基装液量为发酵罐容积的40-70%, 接种量5%~10%，温度25℃，通气量0.2~0.4m^--3/h，转速200~400rpm，发酵时间120~180h；

上述的发酵培养基：100~160g/l碳源，0.5~4g/l氮源，0.1~1.0g/lK₂CO₃，0.1~1.0g/lKH₂PO₄，0.1~1.0g/lMgSO₄·7H₂O，0.01~0.1g/l ZnSO₄·7H₂O，0.5~2g/l玉米浆， 10~40g/l碳酸钙；

3）将步骤2）得到的发酵液用硅藻土抽滤除去菌体和剩余碳酸钙，过滤的上清液中加入等倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，用滤纸过滤除去多糖沉淀，在上清液中继续加入等倍体积甲醇，4℃放置过夜后，离心去上清，沉淀物用80%甲醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。

上述培养基中的碳源可以为葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖或麦芽糖。培养基中的氮源可以为硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、蛋白胨、酵母膏、尿素或玉米浆。

本发明所述的培养基中，碳酸钙可以起调节发酵液pH的作用。除了调节pH外，添加碳酸钙可以减少副产物普鲁兰多糖的产生，同时增加聚苹果酸的产量。碳酸钙在本培养基中的作用是关键的，使用其他碱性试剂代替碳酸钙调节pH不能起到相同的效果。而过量的碳酸钙会抑制细胞生长。

本发明得到的聚苹果酸[poly (β-L- malic acid), PMLA]具有如下性质：

1．易溶于水，不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂。

2．聚苹果酸经过2M硫酸在90℃水解18~24h后，经HPLC检测，其水解产物为单一产物苹果酸。

3．聚苹果酸经过红外光谱测定，具有1172 cm^-1 (–C–O–C)和1732 cm^-1 (–C=O)酯键特征吸收峰，1732 cm^-1(–C=O) 和1428 cm^-1(–C–O)羧基特征吸收峰。聚苹果酸盐具有1602 cm^-1羧酸盐吸收峰。

4．聚苹果酸经过核磁共振碳谱测定，化学位移分别为C-1(-COOH-)175.6，C-2(-CHOH-)71.5，C-3(-CH₂-) 35.8，C-4(-CO-)171.6。

5．聚苹果酸经过GPC检测，Mn, Mw和分散度分别为4247, 4631和1.09。

本发明的有益效果：

1．本发明提供了一种自行筛选的出芽短梗霉菌株（编号为CGMCC No. 4605），可以高效的发酵产生聚苹果酸（PMLA）。

2．本发明所提供的菌株不产生黑色素，发酵液为白色，有利于简化后期处理工艺。

3．本发明所提供的方法通过加入碳酸钙来调节副产物普鲁兰多糖的产生，提高聚苹果酸的产量，有利于聚苹果酸的分离纯化。

4．本发明所提供的方法简单易行，所用的原料简单，聚苹果酸产量最高可达到50~60g/l，为商业化，大规模生产提供了适合的方法。

5．本发明所得的聚苹果酸产品为白色，提取方法简单，产品无毒害，具有良好的水溶性和生物可降解性，可以广泛应用与医药，化妆品或食品行业。

附图说明

图1是发酵过程曲线。

具体实施方式

以下实施例用以说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

1）取25℃培养48h的出芽短梗霉ZD-3D斜面菌种一环，接种于液体种子培养基，装液量为500ml三角瓶中60ml培养基，转速为220rpm，25℃ 培养48h得到种子液；

2）将制备好的种子液按10%比例接种到发酵培养基中，装液量500ml三角摇瓶中60ml培养基，转速为220rpm，25℃，培养160h；

上述的种子培养基为： 80g/l葡萄糖， 2g/l硝酸钠，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，20g/l碳酸钙；

上述的发酵培养基：120g/l葡萄糖，2g/l硝酸钠，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，30g/l碳酸钙。

碳酸钙单独灭菌后与已灭菌的其他培养基成分混合。

3）将步骤2）得到的发酵液用硅藻土抽滤除去菌体和剩余碳酸钙，过滤的上清液中加入等倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，用滤纸过滤除去多糖沉淀，在上清液中继续加入等倍体积甲醇，4℃放置过夜后，离心去上清，沉淀物用80%甲醇洗涤2次，冷冻干燥后得到聚苹果酸白色粉末。经PMLA产量测定，产量可达到49.76g/l。

PMLA产量测定方法如下：

聚苹果酸水溶液加入等体积的2M H₂SO_-4, ,90℃水解12h，水解后的苹果酸含量经高效液相色谱分析，色谱柱Bio-Rad Aminex HPX-87H，色谱条件：流动相5mM H₂SO-₄，流速0.6ml/min，温度45℃。

实施例2

上述的种子培养基为：80g/l葡萄糖， 2g/l硝酸钠，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，20g/l碳酸钙。

上述的发酵培养基：120g/l蔗糖，2g/l硝酸钠，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，30g/l碳酸钙。

碳酸钙单独灭菌后与已灭菌的其他培养基成分混合。

3）将步骤2）得到的发酵液用硅藻土抽滤除去菌体和剩余碳酸钙，过滤的上清液中加入等倍体积的甲醇，轻轻搅动后，放置1h，用滤纸过滤除去多糖沉淀，在上清液中继续加入等倍体积甲醇，4℃放置过夜后，离心去上清，沉淀物用80%甲醇洗涤2次，冷冻干燥后得到聚苹果酸白色粉末。经PMLA产量测定，产量可达到53.65g/l。

实施例3

1）同实施例1。

2）同实施例1，区别在于：发酵培养基：120g/l葡萄糖，2g/l NH₄NO₃，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆， 30g/l碳酸钙。

3）同实施例1。

经PMLA产量测定，产量可达到50.75g/l。

实施例4

1）同实施例1。

2）同实施例1，区别在于：发酵培养基：120g/l葡萄糖，2g/l 硝酸钠，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，5g/l 富马酸钠，30g/l碳酸钙。

3）同实施例1。

经PMLA产量测定，产量可达到62.27g/l。

实施例5

1）同实施例1。

2）同实施例1，区别在于：发酵培养基：120g/l木糖，2g/l NH₄NO₃，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆， 30g/l碳酸钙。

3）同实施例1。

经PMLA产量测定，产量可达到29.63g/l。

实施例6

1）同实施例1。

2）同实施例1，区别在于：发酵培养基：120g/l葡萄糖，2g/l硝酸钠，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，0、10、20、30、40g/l碳酸钙（碳酸钙添加量对PMLA和副产物普鲁兰多糖产量的影响见表1）。

碳酸钙单独灭菌后与已灭菌的其他培养基成分混合。

3）同实施例1。

PMLA产量测定和普鲁兰多糖含量测定：

PMLA产量测定方法同实施例1。

普鲁兰多糖采用苯酚-硫酸法测定：首先对硅藻土抽滤除菌后的发酵液用95%的乙醇沉淀多糖，将获得的多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，在490nm处测定光吸收值。以已知含量葡萄糖做标准曲线。

测定结果见表1。随着碳酸钙添加量的增加，PMLA产量也增加，当添加40g/l碳酸钙时，PMLA产量达到最大45.42g/l，而副产物多糖产量减少到最少0.76g/l。

表1 碳酸钙添加量对PMLA和副产物普鲁兰多糖产量的影响

碳酸钙添加量（g/l）	PMLA产量（g/l）	普鲁兰多糖产量（g/l）
			0	12.49	4.41
10	34.80	1.39
			20	43.42	1.0
30	43.93	0.89
			40	45.42	0.76

实施例7

1）同实施例1。

2）将制备好的种子液接种到10L发酵罐，发酵培养基装液量为6L, 接种量10%，温度25℃，通气量0.4m^--3/h，转速400rpm，发酵时间170h；

上述的发酵培养基：120g/l葡萄糖，2g/l硝酸铵，0.04%K₂CO₃，0.01%KH₂PO₄，0.01%MgSO₄·7H₂O，0.01% ZnSO₄·7H₂O，0.5g/l玉米浆，30g/l碳酸钙。碳酸钙单独灭菌后与已灭菌的其他培养基成分混合。

最终消耗葡萄糖113g/L，聚苹果酸的产量是57.2g/L，转化率为每消耗1g葡萄糖生成0.51g的聚苹果酸。发酵过程曲线见图1，图中■表示残余葡萄糖浓度，●表示聚苹果酸浓度，▲表示菌体干重。

Claims

1.一种产生聚苹果酸的菌株，其特征在于该菌株是从植物叶片表面筛选得到的不产生黑色素的菌株，分类命名为出芽短梗霉，拉丁文学名为（Aureobasidium pullulans）ZD-3D, 该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,，编号为CGMCC No. 4605。

2.用权利要求1所述的产生聚苹果酸的菌株发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的用产生聚苹果酸的菌株发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于培养基中的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、半乳糖或麦芽糖。

4.根据权利要求2所述的用产生聚苹果酸的菌株发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于培养基中的氮源为硝酸铵、硝酸钠、氯化铵、蛋白胨、酵母膏、尿素或玉米浆。