CN107674841A - 一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种出芽短梗霉及其在生产聚苹果酸中的用途。一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ‑6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明提供的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ‑6可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液、麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，相比较于利用葡萄糖作为碳源发酵生产聚苹果酸而言，原料成本更低，且不存在高浓度碳源对菌体生长产生抑制作用的问题。

Description

一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种出芽短梗霉及其在生产聚苹果酸中的用途。
背景技术
聚苹果酸[poly(β-L-malic acid)，PMLA]是以苹果酸为唯一单体通过α-羟基和β-羧基以酯键连接聚合而成的一种新型水溶性高分子化合物，具有良好的化学可塑性、生物降解性、生物相容性，在食品、医药、农业等领域具有广阔的应用前景。1969年聚苹果酸首次在圆弧青霉(Penicillium cyclopium)中被发现，国外研究人员随后对聚苹果酸的制备方法、性质及其用途等进行了广泛研究，国内直到2000年左右才陆续有相关研究报道。
目前，聚苹果酸主要是利用微生物发酵法制备，发酵所用菌株主要包括多头绒泡菌(Physarum polycephalum)和出芽短梗霉(Aureobasium pullulan)。其中，多头绒泡菌合成的聚苹果酸分子量较高(50-300kDa)，但是产量较低，一般在2-3g/L；出芽短梗霉合成的聚苹果酸分子量较低(4-11kDa)，但是产量较高，一般在10-47g/L。相对于高分子量聚苹果酸，低分子量聚苹果酸具有更好的水溶性、生物相容性和生物降解性，其在食品、医药等领域更具应用潜力。因此，从发酵产量和应用潜力来看，出芽短梗霉更适合用于发酵生产聚苹果酸。
菌种是发酵工业的核心，因此国内外研究人员在高产聚苹果酸的出芽短梗霉菌株选育方面做了大量工作。如，天津北洋百川生物技术有限公司的乔长晟等人(CN101979499)利用紫外线诱变技术选育获得一株出芽短梗霉TKPM00006，在优化条件下以葡萄糖(12％，w/v)为碳源，25℃摇瓶分批发酵7-12天，聚苹果酸产量为18.4±1.3g/L；浙江大学徐志南等人(CN 102220248)从植物叶片表面筛选获得一株不产生黑色素的出芽短梗霉ZD-3D，在添加发酵促进剂富马酸钠的条件下，以葡萄糖(12％，w/v)为碳源，25℃摇瓶分批发酵168h，聚苹果酸产量为62.27g/L；西南大学邹祥等人(CN 102827778)选育获得一株出芽短梗霉FMT1801，以工业副产物糖蜜(12％，w/v)为碳源，25℃发酵罐分批发酵96h，聚苹果酸产量为34.4g/L。此外，上述三种出芽短梗霉的发酵培养基中均需要添加一定量的玉米浆或玉米浸出液作为生长因子促进菌株的生长和聚苹果酸的合成。
上述三篇文献中利用选育获得的出芽短梗霉菌株在发酵生产聚苹果酸过程中存在如下不足之处：
(一)高浓度葡萄糖作为碳源，一方面原料成本较高，另一方面高浓度葡萄糖对菌体生长存在底物抑制作用进而限制聚苹果酸产量的提高；而以糖蜜作为碳源时，由于糖蜜本身颜色较深、杂质含量较多，尽管原料成本有所下降，但会增加聚苹果酸提取纯化和发酵废液处理的费用。
(二)聚苹果酸产量仍较低，尽管出芽短梗霉ZD-3D合成聚苹果酸最高产量可达到62.27g/L，但培养基中需要添加富马酸钠作为发酵促进剂，增加了发酵原料成本。
(三)上述三种出芽短梗霉的发酵培养基中均需要添加一定量的玉米浆或玉米浸出液，一方面增加了发酵原料成本，另一方面由于玉米浆或玉米浸出液成分复杂、质量难以控制，对发酵过程的影响存在不确定性。
(四)上述三种出芽短梗霉的发酵温度均为25℃，而微生物发酵是一个放热过程，因此较低的发酵温度需要提供大量的冷却水来维持，从而提高发酵设备运行成本。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
鉴于上述菌种和生产技术的不足，本发明提供一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6，并利用其发酵生产聚苹果酸。该出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6可以利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆作为碳源，在不添加发酵促进剂(如富马酸钠)和生长因子(如玉米浆)的条件下，30℃分批发酵获得60g/L以上的聚苹果酸。该生产方法具有发酵原料成本低、工艺简单、产物易提取纯化的优点，极具工业生产潜力。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)GXZ-6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
本发明还提供了出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6发酵生产聚苹果酸的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，28-30℃恒温培养2-3天；
(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有50-100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养36-48h得到种子液；
(3)发酵培养：将种子液按照8-10％接种量接入装有30-40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养8-9天；
(4)聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80％乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
作为优选，步骤(2)中所述的液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖80-100g/L，硝酸钠2-4g/L，KCl 0.4-0.6g/L，KH2PO4 0.05-0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.2g/L，CaCO315-30g/L。
作为优选，步骤(3)中所述液体发酵培养基的浓度组分如下：碳源120-160g/L，硝酸钠2-4g/L，KCl 0.4-0.6g/L，KH2PO4 0.05-0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.6g/L，ZnSO4·7H2O0.05-0.2g/L，CaCO3 30-50g/L。
作为优选，所述的碳源为木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆中的至少一种。
作为优选，所述的淀粉糖化液是利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉或可溶性淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取。
作为优选，所述麦芽糖浆为市售麦芽糖浆。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，相比较于利用葡萄糖作为碳源发酵生产聚苹果酸而言，原料成本更低，且不存在高浓度碳源对菌体生长产生抑制作用的问题。此外，其液体发酵培养基中不需要添加发酵促进剂(如富马酸钠)和生长因子(如玉米浆)，菌株营养要求简单、发酵成本低廉，可满足工业化大规模生产，具备显著的经济效益。
(2)本发明的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6可在30℃条件下分批发酵获得60g/L以上的聚苹果酸，相较于大多数出芽短梗霉25℃发酵生产聚苹果酸而言，能够大大减少发酵过程中冷却水的消耗，这个优良特性为工业化生产提供了有利条件。
附图说明
图1为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans GXZ-6在PDA平板上培养2天的菌落形态观察结果；
图2为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans GXZ-6在PDA平板上培养4天的菌落形态观察结果；
图3为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans GXZ-6在PDA平板上培养8天的菌落形态观察结果。
保藏信息说明
出芽短梗霉Aureobasidium pullulans GXZ-6，其保藏编号为CCTCCNO.M2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学。
具体实施方式
以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：菌株的筛选与鉴定
1.1菌株GXZ-6的筛选过程
富集培养：称取5g新鲜树叶样品接入装有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，摇床转速180rpm，30℃培养2天，获得菌悬液。富集培养基的浓度组分如下：甘露醇100g/L，硝酸铵1g/L，柠檬酸2g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，吐温-80 0.2g/L,蒸馏水定容至1L，自然pH。
菌悬液稀释、菌落挑取：将上述所得菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液，选择104，105，106倍的菌悬液100μL涂布于PDA平板培养基上，30℃恒温培养2天，挑取酵母状粘稠菌落。PDA培养基的浓度组分如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH。
划线纯化：用平整、圆滑的接种环，在无菌操作条件下，将获得的单菌落在PDA平板培养基上连续划线纯化，30℃恒温培养8天，如果菌落边缘随培养时间由白色变成浅绿再变成黑色，则为目标菌株，挑取平板上目标菌株的单菌落至试管斜面，经培养后保存。
摇瓶检测发酵性能：用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为2cm的菌苔接入装有50mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速180rpm，30℃培养2天，将种子液按10％接种量接入装有40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速180rpm，30℃培养8天，检测发酵液中聚苹果酸产量。
液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖100g/L，硝酸钠4g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO40.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 30g/L。
液体发酵培养基的浓度组分如下：麦芽糖浆160g/L，硝酸钠4g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 50g/L。
1.2菌株GXZ-6的鉴定
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6具有如下特性：
(1)菌落形态特征
在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水定容至1L，自然pH)平板上30℃培养，菌落培养2天后，表面粘稠，呈乳白色酵母样(参见图1)；培养4天后，边缘逐渐变绿，呈小爪子形态，边缘绿色逐渐变深(参见图2)；培养8天后，从外向内逐渐全部变黑，最终菌落表面变硬，形成厚壁孢子(参见图3)。
(2)生理生化特性
菌株GXZ-6可在25-34℃下较快生长，最适培养温度为30℃；培养基中不需要添加生长因子；可在察氏、萨氏、酵母蔗糖、淀粉、油脂、柠檬酸盐、酪蛋白等基础或半合成培养基中生长，但是不能在明胶和葡萄糖醋酸盐培养基中生长。
(3)ITS序列分析
利用通用扩增引物ITS1(5’-TCC GTAGGT GAACCT GCG G-3’)和ITS4(5’-TCC TCCGCT TAT TGATAT GC-3’)对菌株ITS序列进行扩增测序，测得序列长度1001bp，其序列为SEQID NO.1所示。
将所得序列提交至GenBank数据库，获得序列编号GenBank ID：MG333439，将其与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析，结果表明：菌株GXZ-6与出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)同源性为100％。
结合菌落形态特征、生理生化特性和ITS序列分析，将菌株GXZ-6分类鉴定为出芽短梗霉，命名为出芽短梗霉Aureobasidium pullulans GXZ-6。
实施例2：出芽短梗霉GXZ-6菌株发酵生产聚苹果酸的方法
(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，28℃恒温培养3天；
(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有50mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160rpm，25℃培养48h得到种子液；液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖80g/L，硝酸钠2g/L，KCl 0.4g/L，KH2PO4 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，CaCO315g/L；
(3)发酵培养：将种子液按照8％接种量接入装有30mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160rpm，25℃培养9天；液体发酵培养基的浓度组分如下：麦芽糖浆120g/L，硝酸钠2g/L，KCl 0.4g/L，KH2PO4 0.05g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，CaCO3 30g/L；
(4)聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80％乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
聚苹果酸产量检测方法如下：聚苹果酸水溶液加入等体积2M硫酸，90℃条件下水解12h，水解后溶液中的苹果酸浓度经高效液相色谱分析，色谱柱采用C18柱，色谱条件：流动相50mM KH2PO4，流速0.7mL/min，进样量5μL，温度25℃。
经检测，聚苹果酸产量34.5g/L。
实施例3：出芽短梗霉GXZ-6菌株发酵生产聚苹果酸的方法
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6发酵生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：
(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，30℃恒温培养2天；
(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速220rpm，30℃培养36h得到种子液；液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖100g/L，硝酸钠4g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CaCO3 30g/L；
(3)发酵培养：将种子液按照10％接种量接入装有40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速220rpm，30℃培养8天；液体发酵培养基的浓度组分如下：麦芽糖浆160g/L，硝酸钠4g/L，KCl 0.6g/L，KH2PO4 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.2g/L，CaCO3 50g/L；
(4)聚苹果酸提取：方法同实施例1。
经检测，聚苹果酸产量62.8g/L。
由实施例2-3可知，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6在30℃发酵条件下利用160g/L麦芽糖浆作为碳源，分批发酵可获得60g/L以上的聚苹果酸产量，远远高于25℃发酵条件下利用120g/L麦芽糖浆作为碳源所获得的聚苹果酸产量。而且发酵培养基中不需要添加发酵促进剂(如富马酸钠)和生长因子(如玉米浆)，菌株营养要求简单、发酵成本低廉且聚苹果酸产量高，可满足工业化大规模生产要求。此外，相较于大多数出芽短梗霉25℃发酵生产聚苹果酸而言，30℃发酵能够大大减少发酵过程中冷却水的消耗，这个优良特性为工业化生产提供了有利条件。
实施例4-8：
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6发酵生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：
(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，30℃恒温培养2.5天；
(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有80mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200rpm，30℃培养42h得到种子液；液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖80g/L，硝酸钠3g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 30g/L；
(3)发酵培养：将种子液按照10％接种量接入装有40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速200rpm，30℃培养8.5天；液体发酵培养基的浓度组分如下：碳源160g/L，硝酸钠3g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO340g/L；
(4)聚苹果酸提取：方法同实施例1。
实施例4-8中所述的碳源分别为木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、麦芽糖浆，其它条件均相同，按上述方法经摇瓶发酵后，分析所得发酵液中聚苹果酸含量如下表1所示。
表1GXZ-6菌株发酵生产得到聚苹果酸的含量
由表1可知，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6可以广泛利用各种来源的淀粉原料作为碳源直接发酵生产聚苹果酸，且产量均达到32g/L以上。
实施例9-12：
出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6发酵生产聚苹果酸的方法，具体步骤为：
(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，28℃恒温培养2.5天；
(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有80mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速200rpm，30℃培养36h得到种子液；液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖100g/L，硝酸钠4g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 30g/L；
(3)发酵培养：将种子液按照10％接种量接入装有40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速200rpm，30℃培养8.5天；液体发酵培养基的浓度组分如下：淀粉糖化液160g/L，硝酸钠4g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，CaCO3 50g/L；
(4)聚苹果酸提取：方法同实施例1。
实施例9-12中所述的淀粉糖化液分别为木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉和可溶性淀粉经过α-淀粉酶液化，然后用β-糖化酶糖化制取，按上述方法经摇瓶发酵后，分析所得发酵液中聚苹果酸含量如下表2所示。
表2GXZ-6菌株发酵生产得到聚苹果酸的含量
由表2可知，出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6可以广泛利用各种来源的淀粉原料经糖化后作为碳源生产聚苹果酸，且产量均达到48g/L以上。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
序列表
<110> 广西大学
<120> 一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途
<130> ZYWS
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1001
<212> DNA
<213> 一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉及其用途(Aureobasidium pullulans)
<400> 1
aggggtacct gctcagcgcc cgacctccaa ccctttgttg ttaaaactac cttgttgctt 60
tggcgggacc gctcggtctc gagccgctgg ggattcgtcc caggcgagcg cccgccagag 120
ttaaaccaaa ctcttgttat caaaaccggt cgtctgagta aaaattttga ataaatcaaa 180
actttcaaca acggatctct tggttctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa 240
gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat tgcgcccctt 300
ggtattccga ggggcatgcc tgttcgagcg tcattacacc actcaagcta tgcttggtat 360
tgggtgccgt ccttagttgg gcgcgcctta aagacctcgg cgaggcctca ccggctttag 420
gcgtagtaga atttattcga acgtctgtca aaggagagga cttctgccga ctgaaacctt 480
ttattttttc taggttgacc tcggatcagg tagggatacc cgctgaactt aagcatatca 540
aaacgacagg aagaaaaaga aaattaaagg agtaaggggt gctcacgccc gacctccacc 600
ttttgtttgt ttaaaaacta cctgtgtttg cttttgggcg ggaacctctc gtttctcaac 660
ccgggggaaa tatttccctc gggaaggccc ccccaaaaat ttaaaccaaa cttcttgttt 720
tatcaaaaac gggtgcctct gaaaataaaa aaattttttg aaaataaaat tcaaaaactt 780
tttcaacagc gaacattctt tgtgtggtct tctccatcta ataaaaaaaa aaaaccccaa 840
caagggaaat gaacaaaata agagaattaa aatggaatgg aaaatattgc ccaaataaag 900
tttccgaaat gtacaatttc cctacccaac attttccttt ttcgaaaaac cctcgcaata 960
atgtgtgccc cacgaaagaa aagagtggag cctggggaac c 1001

Claims (7)

1.一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其特征在于，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。
2.根据权利要求1所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将甘油保藏的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6划线于PDA斜面培养基上，28-30℃恒温培养2-3天；
(2)种子培养：取活化好的斜面菌种一环，接种于装有50-100mL液体种子培养基的500mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养36-48h得到种子液；
(3)发酵培养：将种子液按照8-10％接种量接入装有30-40mL液体发酵培养基的250mL三角瓶中，摇床转速160-220rpm，25-30℃培养8-9天；
(4)聚苹果酸提取：将发酵液离心去除菌体和残余碳酸钙，收集上清液并加入等体积无水乙醇，轻微搅动后静置1h，离心去除多糖沉淀，收集上清液并继续加入等体积无水乙醇，4℃静置过夜后，离心收集沉淀，沉淀物用80％乙醇洗涤，冷冻干燥后得到聚苹果酸。
3.根据权利要求2所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的液体种子培养基的浓度组分如下：葡萄糖80-100g/L，硝酸钠2-4g/L，KCl 0.4-0.6g/L，KH2PO4 0.05-0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.1-0.3g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.2g/L，CaCO315-30g/L。
4.根据权利要求2所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤(3)中所述液体发酵培养基的浓度组分如下：碳源120-160g/L，硝酸钠2-4g/L，KCl 0.4-0.6g/L，KH2PO4 0.05-0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2-0.6g/L，ZnSO4·7H2O 0.05-0.2g/L，CaCO3 30-50g/L。
5.根据权利要求4所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，所述的碳源为木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液和麦芽糖浆中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，所述的淀粉糖化液是利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉或可溶性淀粉经过α-淀粉酶或真菌淀粉酶液化，然后用β-糖化酶或真菌淀粉酶糖化制取。
7.根据权利要求5所述的出芽短梗霉发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，所述麦芽糖浆为市售麦芽糖浆。
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