CN110964647B - 一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法，具体为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW‑001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCC NO.18996；将产黑色素短梗霉活化后在含玉米浆的条件下发酵大幅度提高聚苹果酸产量，其方法简单，直接在发酵培养基中加入玉米浆，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸工业生产。

Description

一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法。
背景技术
产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)是一类酵母真菌，具有菌丝体和酵母样两种形态。该菌种在自然界中存在较为广泛。产黑色素短梗霉发酵高分子产物中主要为聚苹果酸和普鲁兰多糖。
聚苹果酸(Polymalic acid)以L-苹果酸为唯一单体在体内聚合而成，是一种新型完全生物降解性高分子材料，具有高度的生物相容性、生物降解性和生物可吸收性等优点。可用于药物缓控释载体、食品加工等领域。
通常产黑色素短梗霉发酵过程会同时产生聚苹果酸和普鲁兰多糖两个大分子代谢产物。聚苹果酸和普鲁兰多糖的合成共同的前体有葡萄糖-1-磷酸，如碳代谢流进入以TCA循环或者乙酸循环积累苹果酸，最终聚合生成聚苹果酸。而碳代谢流经葡萄糖-1-磷酸转化为UDPG-葡萄糖，将最终合成普鲁兰多糖。由于产黑色素短梗霉发酵过程有两种转化途径，使得微生物发酵生产PMLA产量不高，而且极高的生产成本未能实现大规模的工业生产，以致影响了该物质的应用。
中国专利CN 101979499B提供了一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)TKPM00006及利用该诱变菌株发酵生产聚苹果酸的方法，该菌株是以从我国宁夏回族自治区银川市王太堡果园土壤中筛选出的β-聚苹果酸生产菌TKPM10017的基础上采用多组复合诱变技术育出的高产β-聚苹果酸的诱变菌株。在优化条件下β-聚苹果酸产量达到18.4±1.3g/L。中国专利CN 107674841A提供一种高产聚苹果酸的出芽短梗霉，其分类命名为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)GXZ-6，保藏编号为CCTCC NO：M 2017517，保藏日期为2017年9月20日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学。本发明提供的出芽短梗霉GXZ-6可利用木薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉、可溶性淀粉、淀粉糖化液、麦芽糖浆作为碳源发酵生产聚苹果酸，原料成本更低，且不存在高浓度碳源对菌体生长产生抑制作用的问题。在优化条件下β-聚苹果酸产量达60g/L。
可以看出，聚苹果酸产量虽然在一定程度上有所提高，但产量仍然不是很高，生产成本较高，不能满足工业应用的需求。有鉴于此，本发明的目的在于提供玉米浆提高产黑色素短梗霉中聚苹果酸产量，降低生产成本的方法，通过摇床发酵得到玉米浆的最适添加量，然后利用5L发酵罐验证玉米浆对聚苹果酸发酵的影响。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明公开了一种高产聚苹果酸的菌株及提高聚苹果酸产量的方法，具体为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)，将产黑色素短梗霉活化后在含玉米浆的条件下发酵大幅度提高聚苹果酸产量，其方法简单，直接在发酵培养基中加入玉米浆，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸工业生产。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种高产聚苹果酸的菌株，其特征在于：该菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCC NO.18996。
本发明的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001菌体形态主要为：酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，数个菌体可连成链状，芽分生孢子；菌落形态特征为:最初粘稠、乳白色，最终为黑色，菌落质地粘稠湿润，色泽黑亮；培养特征为:25℃，180-200r/m下振荡培养5-6d，发酵液颜色最终稳定为黄色，不产黑色素；可以利用的碳源有：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖其中之一；可以利用的氮源有：硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏及玉米浆中的一种或几种。
本发明还提供了一种提高聚苹果酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保藏编号为CGMCC NO.18996产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)转接至斜面培养基中活化；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液转接种到种子培养基中培养，制得种子培养液；
(3)发酵培养：将种子培养液接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养；
(4)聚苹果酸提取：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，加入硫酸水解。
作为本发明的优选，所述步骤(1)中，菌种活化条件为:在25℃下恒温培养3-5d；所述斜面培养基各组分及含量如下：20％土豆，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。
作为本发明的优选，所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液接种量接种到种子培养基中，在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养38～50小时；所述种子培养基各组分及含量如下：蔗糖60～150g/L，酵母膏2～5g/L，丁二酸1～3g/L，硫酸铵0.5～1.5g/L，碳酸钾0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.08～0.12g/L，硫酸镁0.08～0.12g/L，硫酸锌0.02～0.08g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙10～30g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液按5％(V/V)接种量接种到种子培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养40h；所述种子培养基各组分及含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
作为本发明的优选，所述步骤(3)中，将种子培养液以8％-10％(V/V)的接种量接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养；所述发酵培养基各组分及含量为：蔗糖80～200g/L，蛋白胨20～50g/L，磷酸二氢钾0.05～0.2g/L，硝酸钠1～4g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，氯化钾0.2～0.6g/L，硫酸锰0.02～0.07g/L，1.00～12.00g/L玉米浆，溶剂为水，121℃灭菌20min。
作为本发明的优选，所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养；摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养90～150h；发酵罐发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为300～800rpm、通气比1:0.8～1:1.8条件下培养72～150h；
作为本发明的进一步优选，摇瓶发酵培养时，发酵在温度25℃、转速为200rpm条件下培养144h；发酵罐发酵培养时，发酵在温度为25℃、转速为600rpm、通气比1:1.6条件下培养144小时。
作为本发明的优选，所述步骤(4)中，收集步骤(3)的发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心10min后取上清2ml，加浓度为2mol/L的硫酸2mL，然后在110℃烘箱中水解11h。
本发明的有益效果是：利用本发明的产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)BCSW-001在发酵培养基中加入玉米浆的方式，大大提高了聚苹果酸的产量，当用含6.00g/L玉米浆的发酵培养基发酵培养产黑色素短梗霉时，聚苹果酸的产量高达85g/L，相比于现有技术有较大的突破。本发明根据产黑色素短梗霉合成聚苹果酸的合成特点，采用含玉米浆的培养基建立定向调控策略，以实现产物更加偏流向聚苹果酸，进而实现聚苹果酸产量的大幅度提高。本发明具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于聚苹果酸的工业生产；在发酵培养基中加入玉米浆既可以提供有机氮源，又提供菌种发酵所需要的生长因子。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明方法。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供了一种高产聚苹果酸的菌株，该菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCC NO.18996。
本发明的高产聚苹果酸的菌株是从土壤中分离纯化得到，取新鲜土壤样品5g放入100mL的无菌三角瓶内，加入无菌水与玻璃珠，制成10-1的土壤稀释液。震荡均匀后吸取1mL，移入装有9mL的无菌水的试管中，制成10-2的稀释液，震荡均匀后再吸取1mL，移入装有9mL的无菌水的试管中，制成10-3的稀释液，依次稀释至10-7。吸取100μL稀释液，共吸取3次分别置于3个YPD培养皿中，分别用涂布器将稀释液均匀涂开，于25℃恒温条件下培养，待长出菌丝后于显微镜下观察其形态。
YPD培养皿配方：1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。
本发明的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001的特征为：
(1)菌体形态主要为：酵母样形态，细胞椭圆形，大小均匀，数个菌体可连成链状，芽分生孢子；
(2)菌落形态特征：最初粘稠、乳白色，最终为黑色，菌落质地粘稠湿润，色泽黑亮；
(3)培养特征为：25℃，180-200r/m下振荡培养5-6d，发酵液颜色最终稳定为黄色，不产黑色素；
(4)可以利用的碳源有：葡萄糖、麦芽糖、蔗糖其中之一；
(5)可以利用的氮源有：硝酸钠、硫酸铵、蛋白胨、酵母膏及玉米浆中的一种或几种。
本发明的产黑色素短梗霉BCSW-001培养方法为：
(1)菌种活化：将产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基，于25℃恒温培养3-5d；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子,制备孢子悬浮液,按5％(V/V)接种量接种到种子培养基中，于25℃，200r/m下培养38～50h，制得种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)中的种子培养液以8％-10％(V/V)接种量接种到发酵培养基中，于25℃，200r/m下振荡培养72～150h。
产黑色素短梗霉BCSW-001培养过程中用的培养基及其配制方法为：
斜面培养基：各组分及含量如下：20％土豆，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。
种子培养基：各组分及含量如下：蔗糖60～150g/L，酵母膏2～5g/L，丁二酸1～3g/L，硫酸铵0.5～1.5g/L，碳酸钾0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.08～0.12g/L，硫酸镁0.08～0.12g/L，硫酸锌0.02～0.08g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙10～30g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
发酵培养基：各组分及含量为：蔗糖80～200g/L，蛋白胨20～50g/L，磷酸二氢钾0.05～0.2g/L，硝酸钠1～4g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，氯化钾0.2～0.6g/L，硫酸锰0.02～0.07g/L，1.00～12.00g/L玉米浆，溶剂为水，121℃灭菌20min。
本发明还提供了一种提高聚苹果酸产量的方法，将产黑色素短梗霉活化后在含玉米浆的条件下发酵测量聚苹果酸含量，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保藏编号为CGMCC NO.18996产黑色素短梗霉(Aureobasidiummelanogenum)转接至斜面培养基中活化；菌种活化条件为：在25℃下恒温培养3-5d；所述斜面培养基各组分及含量如下：20％土豆，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种到种子培养基中培养，在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养38～50小时，制得种子培养液；所述种子培养基各组分及含量如下：蔗糖60～150g/L，酵母膏2～5g/L，丁二酸1～3g/L，硫酸铵0.5～1.5g/L，碳酸钾0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.08～0.12g/L，硫酸镁0.08～0.12g/L，硫酸锌0.02～0.08g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙10～30g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
(3)发酵培养：将种子培养液以8％-10％(V/V)的接种量接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养；所述发酵培养基各组分及含量为：蔗糖80～200g/L，蛋白胨20～50g/L，磷酸二氢钾0.05～0.2g/L，硝酸钠1～4g/L，硫酸镁0.1～0.5g/L，氯化钾0.2～0.6g/L，硫酸锰0.02～0.07g/L，1.00～12.00g/L玉米浆，溶剂为水，121℃灭菌20min。
(4)聚苹果酸提取：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，加入硫酸水解。
作为本发明的优选培养条件，所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液按5％(V/V)接种量接种到种子培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养40h；所述种子培养基各组分及含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
本发明中，所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养；摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养90～150h；发酵罐发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为300～800rpm、通气比1:0.8～1:1.8条件下培养72～150h；
作为本发明优选条件，摇瓶发酵培养时，发酵在温度25℃、转速为200rpm条件下培养144h；发酵罐发酵培养时，发酵在温度为25℃、转速为600rpm、通气比1:1.6条件下培养144小时。
作为本发明的优选提取条件，所述步骤(4)中，收集步骤(3)的发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心10min后取上清2ml，加浓度为2mol/L的硫酸2mL，然后在110℃烘箱中水解11h。
下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述，为了方便对比试验结果，各实施例的菌种在相同的培养基中进行培养，但并不能作为对本发明保护范围的限制。
本发明中检测培养液中聚苹果酸的含量的方法：收集发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心10min后取上清2ml，加浓度为2mol/L的硫酸2mL，然后在110℃烘箱中水解11h，得分析样品。分析样品进行HPLC分析，HPLC流动相为25mmol/L的磷酸二氢钾溶液与1％(V/V)的乙腈，检测波长为210nm，流速为1mL/min，同时用苹果酸标准品配制标准溶液，通过HPLC检测后绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算聚苹果酸的含量。
实施例1
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCCNO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h；然后取培养液按接种量为10％接种于摇瓶中，摇瓶含有100ml不含玉米浆的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养144h，检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为60.33g/L。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
实施例2
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCC NO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100ml种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500ml)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h；然后取培养液按接种量为10％接种于摇瓶中，摇瓶含有100ml含3.00g/L玉米浆的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养144h，检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例中聚苹果酸的产量为76.03g/L。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1ml/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，3.00g/L玉米浆，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
将实施例1作为对比试验，实施例2与实施例1的方法基本一致，区别在于实施例1中发酵培养基中未加入玉米浆，发酵结束后检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，实施例2聚苹果酸产量相对于对比实施例1聚苹果酸产量提高了26.03％。
实施例3
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCC NO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h；然后取培养液按接种量为10％接种于摇瓶中，摇瓶含有100mL含6.00g/L玉米浆的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养144h后检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为82.26g/L。。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1ml/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，6.00g/L玉米浆，溶剂为水。
将实施例1作为对比试验，实施例3与实施例1的方法基本一致，区别在于实施例1中发酵培养基中未加入玉米浆，发酵结束后检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，实施例3聚苹果酸产量相对于对比实施例1聚苹果酸产量提高了36.35％。
实施例4：
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCC NO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h；然后取培养液按接种量为10％接种于摇瓶中，摇瓶含有100mL含9.00g/L玉米浆的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养144h后，检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为73.28g/L。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1ml/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，9.00g/L玉米浆，溶剂为水。
将实施例1作为对比试验，实施例4与实施例1的方法基本一致，区别在于实施例1中发酵培养基中未加入玉米浆，发酵结束后检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，实施例4聚苹果酸产量相对于对比实施例1聚苹果酸产量提高了21.47％。
实施例5：
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCC NO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h；然后取培养液按接种量为10％接种于摇瓶中，摇瓶含有100mL含12.00g/L玉米浆的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养144h后，检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为62.78g/L。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1ml/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，12.00g/L玉米浆，溶剂为水。
将实施例1作为对比试验，实施例5与实施例1的方法基本一致，区别在于实施例1中发酵培养基中未加入玉米浆，发酵结束后检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，实施例5聚苹果酸产量相对于对比实施例1聚苹果酸产量提高了4.06％。
实施例6：
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCCNO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100ml种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500ml)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h，然后取培养液按接种量为10％接种于5L发酵罐中，发酵罐中装有3L不含玉米浆的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为600rpm、通气比为1:1.2条件下培养144h后，检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为62.85g/L。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1ml/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
实施例7：
本实施例中利用产黑色素短梗霉提高聚苹果酸产量的具体过程为：取保藏号为CGMCC NO.18996的产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001转接至斜面培养基中在25℃下恒温培养3d，选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液按5％(V/V)接种量转接种于含100ml种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500ml)，在温度为25℃，转速为200rpm条件下培养40h，然后取培养液按接种量为10％接种于5L发酵罐中，发酵罐中装有3L含6.00g/L玉米浆，然后在温度为25℃、转速为600rpm、通气比为1:1.2条件下培养144h后，检测培养液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为85.26g/L。
本实例中种子培养基的组成和含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1ml/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
本实例中发酵培养基的组成和含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，6.00g/L玉米浆，溶剂为水。
按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于对比试验的发酵培养基中未加入玉米浆，即实施例6作为对比试验；发酵结束检测培养液中聚苹果酸的含量与单位菌体产酸率。结果显示，实施例7与对比实施例6相比聚苹果酸产量提高了35.65％。
以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (8)

1.一种利用高产聚苹果酸的菌株提高聚苹果酸产量的方法，其特征在于包括步骤：(1)菌种活化、(2)种子培养、(3)发酵培养、(4)聚苹果酸提取；其中步骤(3)发酵培养的过程为：将种子培养液以8％-10％(V/V)的接种量接种到含有玉米浆的发酵培养基中发酵培养，所述发酵培养基各组分及含量为：蔗糖180g/L，蛋白胨35g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硝酸钠2g/L，硫酸镁0.3g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，6.00g/L玉米浆，溶剂为水，121℃灭菌20min；所述菌株的分类命名为产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)BCSW-001，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2019年11月22日，保藏编号为：CGMCC NO.18996。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)菌种活化过程为：将保藏编号为CGMCC NO.18996产黑色素短梗霉(Aureobasidium melanogenum)转接至斜面培养基中活化；菌种活化条件为：在25℃下恒温培养3-5d；所述斜面培养基各组分及含量如下：20％土豆，2％葡萄糖，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)种子培养过程为：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子悬浮液，将孢子悬浮液转接种到种子培养基中培养，在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养38～50小时，制得种子培养液；所述种子培养基各组分及含量如下：蔗糖60～150g/L，酵母膏2～5g/L，丁二酸1～3g/L，硫酸铵0.5～1.5g/L，碳酸钾0.2～0.6g/L，磷酸二氢钾0.08～0.12g/L，硫酸镁0.08～0.12g/L，硫酸锌0.02～0.08g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙10～30g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)聚苹果酸提取过程为：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，加入硫酸水解。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，将产黑色素短梗霉的孢子悬浮液按5％(V/V)接种量接种到种子培养基中，在温度为25℃、转速为200rpm条件下培养40h；所述种子培养基各组分及含量为：蔗糖140g/L，酵母膏3g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1g/L，碳酸钾0.4g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸镁0.1g/L，硫酸锌0.05g/L，玉米浆1mL/L，碳酸钙20g/L，溶剂为水。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养；摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为180～250rpm的条件下培养90～150h；发酵罐发酵培养时，发酵培养条件为：在温度为22～28℃、转速为300～800rpm、通气比1:0.8～1:1.8条件下培养72～150h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：摇瓶发酵培养时,发酵在温度25℃、转速为200rpm条件下培养144h；发酵罐发酵培养时，发酵在温度为25℃、转速为600rpm、通气比1:1.6条件下培养144h。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，收集步骤(3)的发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心10min后取上清2ml，加浓度为2mol/L的硫酸2mL，然后在110℃烘箱中水解11h。
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