CN117965650B - 一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明提供了一种以工业副产物糖蜜为原料，固定化细胞连续发酵生产聚苹果酸的方法，包括糖蜜预处理、菌种活化、种子培养和发酵产酸四个步骤，发酵体系由分批发酵反应器和填充塔构成，在控制pH及溶解氧条件下，在含糖蜜、氮源、无机盐及微量元素的培养基中培养产黑色素短梗霉连续生产聚苹果酸。本发明方法不引入有毒有害物质，实现环境友好、低成本处理糖蜜并应用于聚苹果酸生产；通过引入固定化载体实现聚苹果酸的连续生产，减少了液体种子培养阶段、并有效提高率聚苹果酸的糖酸转化率。本发明中，经过糖蜜预处理使聚苹果酸产量提高5.9倍；经细胞固定化连续生产使聚苹果酸的产量进一步提高22%，同时获得副产物色素。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法。
背景技术
聚苹果酸（Poly malic acid，简称PMLA），又名 2-羟基丁二酸，是以苹果酸为唯一单体通过酯键聚合而成的一种水溶性脂肪族聚酯类生物高分子材料，具有良好的生物相容性、生物可降解性、高水溶性、无毒性和无免疫原性等多种优良的特性，可广泛应用于食品饮料、医药、化工等领域。
微生物发酵法制备PMLA是PMLA生产的主要方法，主要生产碳源是葡萄糖或蔗糖，生产成本高，同时生产强度较低。为了降低生产成本，中国专利CN201911294055.7（公开号及公开日：CN110819543A， 2020年2月21日）公开了一种利用淀粉生产聚苹果酸的出芽短梗霉及其应用，其中菌株出芽短梗霉GXL-1可以直接利用生淀粉或淀粉液化液为碳源，在不添加发酵促进剂和生长因子的条件下生产聚苹果酸，事实上还是利用的葡萄糖发酵，生产成本仍然较高。甘蔗糖蜜在我国南方糖厂极为丰富，是糖厂的副产物之一，产率约为原料甘蔗2.5%-4%，是一种营养丰富的生物质原料，目前糖蜜主要是用酵母菌发酵成乙醇，附加值较低。利用糖蜜生产如高附加值产物时，需要经过复杂的处理方法，如煮沸法、活性炭法、磷酸钙法、亚铁氰化钾法、硫酸法及联合处理法。如中国专利CN201210135063.9（公开号及公开日：CN102634545A ，2012年8月15日）公开了一种利用蔗糖糖蜜发酵生产L-苹果酸的方法，但里面引入了亚铁氰化钾这种有毒物质，有害于环境，不适合工业化生产，并且产酸量不高，糖的利用率也不高；中国专利CN201710354547.5（公开号及公开日：CN106978450A ，2017年7月25日）引入了十六烷三甲基溴化铵，具有强烈的刺激和毒性，会导致健康问题和环境危害，并且使用的活性炭的不可重复回收使用。因此，如何环境友好、低成本处理糖蜜并应用于PMLA生产，是人需要解决的问题之一。
为了提高PMLA生产强度，中国专利CN200910078227.7（公开号及公开日：CN101487034A ，2009年7月22日）公开了利用膜技术回流菌体及其它成分，提高发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期的方法，但生产流程长，操作复杂。中国专利CN201610825673.X（公开号及公开日：CN106434776A， 2017年2月22日）公开了一种吸附固定化发酵生产β-聚苹果酸的工艺，但吸附固定化材料仅固定在分批发酵反应器中进行单批次发酵，未能明显改善PMLA的生产强度。为了降低PMLA的生产成本并提高其生产强度，本专利拟开发一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法，本发明方法通过原糖蜜稀释、酸化过程、脱色过程和酶解过程，不引入有毒有害物质，实现环境友好、低成本处理糖蜜并应用于PMLA生产；同时，通过引入固定化载体实现聚苹果酸的连续生产，减少了液体种子培养阶段缩短了滞后期和发酵周期、并有效提高率聚苹果酸的糖酸转化率。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法，包括菌种活化、种子培养和发酵产酸，所述方法还包括糖蜜预处理；所述发酵产酸包括分批发酵和连续发酵的过程；所述分批发酵是指在发酵装置中接种菌种进行发酵的过程；所述发酵装置中包含有固定化载体，所述连续发酵是指在分批发酵结束后，将发酵液中的菌种附着于所述固定化载体上，间歇或连续的排除发酵装置中的发酵液并补充等体积的新鲜发酵培养基。
优选的是，本发明的发酵体系由分批发酵反应器和一个填充固定化载体的反应器（填充塔）构成，在控制pH及溶解氧条件下，在含糖蜜、氮源、无机盐及微量元素的培养基中培养产黑色素短梗霉连续生产聚苹果酸。
上述任一项优选的是，所述糖蜜预处理包括原糖蜜稀释、酸化过程、脱色过程和酶解过程。
上述任一项优选的是，所述原糖蜜稀释：优选的，糖蜜用纯化水稀释，优选的，稀释倍数为0.2-3倍。
上述任一项优选的是，所述酸化过程：加入酸性物质将稀释后的糖蜜酸化至pH1-4，加热后自然冷却并静置，分离沉淀并获得上清液。
上述任一项优选的是，所述脱色过程：指向酸化糖蜜上清液中加入大孔吸附树脂，经搅拌、过滤获得脱色上清液。
上述任一项优选的是，所述酶解过程：将调节脱色糖蜜pH至3.0-7.0，添加果胶酶，30-60 ℃搅拌。
上述任一项优选的是，所述发酵装置包括分批发酵反应器和填充塔，所述填充塔填充有所述固定化载体，所述填充塔上部及底部设置上部筛网和底部筛网、所述填充塔底部设置曝气装置、所述上部筛网和底部筛网间布置有所述固定化载体，所述填充塔的上部直接与所述分批发酵反应器连接，所述填充塔的底部经循环泵与所述分批发酵反应器连接。
上述任一项优选的是，所述发酵产酸过程中：所述分批发酵是指将菌种接种于分批发酵反应器进行分批发酵；所述连续发酵是分批发酵结束时，启动循环泵使发酵液在分批发酵反应器和填充塔间循环一定时间后，间歇或连续的排除分批反应器中的发酵液并补充等体积的新鲜培养基。
上述任一项优选的是，所述循环一定时间为2-10 h，优选2 h；上述任一项优选的是，间歇补料实现连续发酵时，排除发酵液期间，循环泵停止运转，待新鲜培养基补充完毕后，循环泵连续运转；上述任一项优选的是，连续补料实现连续发酵时，循环泵连续运转。
上述任一项优选的是，所述发酵产酸步骤中使用的发酵培养基为含有糖蜜的液体培养基，所述发酵培养基包括如下组分：糖蜜总糖含量在80~250 g/L，碳酸钙15-100 g/L，硝酸盐0.5-10 g/L，磷酸二氢钾0.1-1 g/L，七水硫酸锌0.005-0.5 g/L，氯化钾0.1-1 g/L，七水硫酸镁0.001-0.1 g/L，蛋白胨5-30 g/L，酵母粉1-15 g/L。
上述任一项优选的是，所述分批发酵过程初始，所述发酵培养基中糖蜜初始糖浓度50-150 g/L，随着分批发酵的进行，待发酵液中的糖基本消耗完毕后加预处理后的糖蜜，使发酵过程中糖蜜总糖含量达到80~250 g/L。
上述任一项优选的是，所述发酵过程利用的微生物菌种为产黑色素短梗霉CGMCCNo.18996。产黑色素短梗霉CGMCC No.18996（Aureobasidium melanogenumNo.18996），已于2019年11月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明优选的一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法中，所述糖蜜预处理、菌种活化、种子培养和发酵产酸优选的技术方案为：
上述任一项优选的是，所述菌种活化的步骤中：
优选的，所述菌种活化时使用的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；
优选地，所述述菌种活化为将菌种接种于斜面培养基中，于20-30℃培养48-96 h。
上述任一项优选的是，所述种子培养的步骤中：
优选的，所述种子培养过程中使用的种子培养基为pH 4.0-8.0的含有糖质的液体培养基；
优选的，所述种子培养为将活化后的菌种接种于种子培养基中，于20-30℃振荡培养30-72 h；
优选地，所述种子培养基包括如下组分：糖质40-100g/L，硝酸盐0.5-10 g/L, 磷酸二氢钾0.1-0.5 g/L，蛋白胨0.1-2 g/L，七水硫酸镁0.1-1.0 g/L。
优选地，所述糖质为葡萄糖、果糖或蔗糖中的任意一种或至少两种的组合，优选葡萄糖；
优选地，所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸铵中的任意一种或至少两种的组合，优选硝酸钠；
优选地，所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖80 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，硝酸钠2.0 g/L，蛋白胨1.0 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L。
上述任一项优选的是，所述发酵产酸的步骤中：
优选地，所述发酵产酸步骤中使用的发酵培养基为含有糖蜜的液体培养基；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：糖蜜总糖含量在80~250 g/L，碳酸钙15-100 g/L，硝酸盐0.5-10 g/L，磷酸二氢钾0.1-1 g/L，七水硫酸锌0.005-0.5 g/L，氯化钾0.1-1 g/L，七水硫酸镁0.001-0.1 g/L，蛋白胨5-30 g/L，酵母粉1-15 g/L；
优选地，所述发酵培养基包括如下组分：糖蜜总糖含量在100-200 g/L，碳酸钙65g/L，硝酸钠6 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸锌0.005 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母粉5 g/L。
优选的，所述发酵时的菌种接种量为发酵培养基体积的4-30%；
优选地，所述发酵时的温度为20-30℃；
优选地，所述接种量为10%。
上述任一项优选的是，所述分批发酵过程初始糖蜜总糖浓度50-150 g/L，待糖基本消耗完毕后间歇或连续流加预处理后的糖蜜，直至聚苹果酸浓度达到45-55g/L，结束分批发酵过程；优选地，所述初始糖蜜中总糖浓度为100 g/L；优选地，所述连续补料糖蜜中总糖浓度为100 g/L；优选地，所述发酵结束时聚苹果酸浓度为50 g/L。
上述任一项优选的是，所述的糖蜜预处理依次经过稀释、酸化、脱色和酶解过程的技术方案为：
优选地，所述糖蜜稀释倍数为0.2-3倍，优选0.5倍；
优选地，所述稀释糖蜜酸化至pH1-4，优选pH2；
优选地，所述酶解用酶为果胶酶，优选酸性或中性果胶酶；
优选地，所述脱色所用介质为大孔吸附树脂，优选HPD600树脂；
优选地，所述糖蜜酸化过程包括稀释糖蜜酸化至pH1-4，100℃加热1 h，之后自然冷却8-24 h，分离沉淀并获得上清液；
优选地，所述脱色过程包括向酸化糖蜜上清液中加入0.1-1倍重量的树脂，在25-50℃搅拌4-12 h，过滤获得脱色上清液；优选添加0.4倍重量的树脂，脱色8 h；
优选地，所述糖蜜酶解过程包括调脱色糖蜜pH至3.0-7.0，之后添加0.1-10%（w/v）的果胶酶，30-60 ℃搅拌4-12 h；
优选地，酸化过程所用的酸为硫酸；
优选地，调pH所用的碱为石灰、碳酸钙、氧化钙任意一种或至少两种的组合，优选石灰。
优选地，吸附色素饱和的树脂，经有机溶剂解吸附后，用于下一批次酸化糖蜜的预处理；优选地，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮中的至少一种，优选乙醇。
上述任一项优选的是，所述分批发酵过程初始糖蜜总糖浓度50-150 g/L，待糖基本消耗完毕后间歇或连续流加预处理后的糖蜜，直至聚苹果酸浓度达到45-55g/L，结束分批发酵过程。
优选地，所述初始糖蜜中总糖浓度为100 g/L；
优选地，所述连续补料糖蜜中总糖浓度为100 g/L；
优选地，所述发酵结束时聚苹果酸浓度为50 g/L。
本发明还提供了一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的发酵装置，用于上述任一项所述的方法。
优选的是，所述发酵装置包括分批发酵反应器和填充塔，所述填充塔填充有所述固定化载体，所述填充塔上部及底部设置上部筛网和底部筛网、所述填充塔底部设置曝气装置、所述上部筛网和底部筛网间布置有所述固定化载体，所述填充塔的上部直接与所述分批发酵反应器连接，所述填充塔的底部经循环泵与所述分批发酵反应器连接。
上述任一项优选的是，所述填充塔中的固定化载体包括天然纤维或人造纤维的至少一种。
上述任一项优选的是，所述天然纤维包括丝瓜络、棉花、麻类、秸秆的任意一种或至少两种的组合；优选为丝瓜络。
上述任一项优选的是，所述人造纤维包括聚酯纤维、聚酰胺纤维、聚丙烯腈纤维、聚烯烃纤维的任意一种或至少两种的组合；优选为聚酯纤维。
上述任一项优选的是，所述固定化载体裁剪为 0.5-3立方厘米大小块状。优选地，所述丝瓜络裁剪为约3cm大小块状；优选地，所述聚氨酯切割成高1cm，长宽都为3cm大小的块状。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明在于对糖蜜的处理工艺简单，糖蜜经过处理比不经过处理直接发酵聚苹果酸产量更高，提高了5.9倍。将稀释糖蜜经酸化过程，首先去除了糖蜜中的大颗粒沉淀和尘土，然后还去除了糖蜜中的大部分的重金属离子，最后还把糖蜜中的蔗糖完全转化为葡萄糖和果糖，有利于提高糖酸转化率；用树脂吸附糖蜜中的色素，更加的经济，节约成本，树脂吸附后可以解吸附重复利用，并且可以通过旋蒸、冷冻干燥得到色素这种副产物，用于食品等其他行业；果胶酶是一种廉价的工业酶，处理糖蜜，不仅把果胶这种大分子分解成小分子糖，作为细胞的碳源利用，还降低了糖蜜的粘度，更有利于细胞的传质；采用丝瓜络、玉米芯、聚氨酯等固定化细胞重复分批补料发酵，因为固定化载体吸附了上一批发酵液中的的生物量，使下一批发酵初期具有有一个较高的初始生物量，缩短了滞后期，从而缩短了发酵周期，显著降低了时间成本。因为初始有较高的菌体量积累，使新一批发酵液中营养物质有更多的部分用于生产聚苹果酸，加快了碳源的利用效率，从而提高聚苹果酸的产率和产量，尤其是以丝瓜络作为固定化载体，聚苹果酸的产率和产量提升的最多，达到了22%。丝瓜络为细胞提供了容易附着的理想表面积和天然的良好生存环境，使细胞驯化呈现出更圆、更光滑、更饱满的酵母形态细胞，更有利于细胞的增殖和代谢产物的积累。
本发明相比于现有技术有较大突破，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强，可连续重复生产等优点，可应用于工业化生产。
附图说明
图1为本发明优选实施例8中提供的一种发酵装置。
图2为本发明优选实施例9中经过分批发酵和连续发酵循环后附着于固定化载体上的菌体的电镜检测结果。
附图中的说明：1，分批发酵反应器；2，填充塔；3，循环泵；4，空气过滤器；5，开关；6，气进方向；7，尾气排出方向；8，发酵液循环方向；9，发酵液排出方向；10，发动机。
菌种保藏信息说明
分类命名：产黑色素短梗霉Aureobasidium melanogenum；
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC ）；
保藏日期：2019年11月22日；
保藏编号：CGMCC No.18996；
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为7.6g/L，细胞的生物量为62g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量200g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中总糖指的是不处理的糖蜜，直接稀释，糖蜜与纯化水1：0.5倍稀释，使分批发酵反应器中总糖为200g/l。
实施例2
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为10.92g/L，细胞的生物量为78.6g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量200g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中总糖指的是糖蜜经硫酸调pH水解离心处理，稀释使分批发酵反应器中总糖为200g/l。
优选的是，所述糖蜜的酸化过程为：稀释后的糖蜜加硫酸调pH至2，100℃加热1 h，之后自然冷却8-24 h，分离沉淀并获得上清液；
结论经加硫酸调pH至2加热酸解离心，首先去除了糖蜜中的大颗粒沉淀和尘土，然后还去除了糖蜜中的大部分的重金属离子，最后还把糖蜜中的蔗糖完全转化为葡萄糖和果糖，更利于细胞的吸收，用糖蜜代替培养基中的碳源，即节约了成本，还可以减少培养基中无机矿物质的添加量，聚苹果酸产量和生物量有一定的提升。
实施例3
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为30.06g/L，细胞的生物量为53.25g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量100g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中总糖指的糖蜜是经硫酸调pH水解离心处理，加果胶酶处理，稀释使分批发酵反应器中初始总糖为200g/l。优选的，按照实施例2方法获得的酸化处理后糖蜜，在实施例3中进一步进行酶解处理，优选的糖蜜酶解过程为调酸化后糖蜜pH至3.0-7.0，之后添加0.1-10%（w/v）的果胶酶，30-60 ℃搅拌4-12 h。
结论：果胶酶处理糖蜜，不仅把果胶这种大分子分解成小分子糖，作为细胞的碳源利用，还降低了糖蜜的粘度，更有利于发酵中氧的传质；结合硫酸调pH值的影响，聚苹果酸产量有较大的增幅。
实施例4
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为54.95g/L，细胞的生物量为82.85g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量100g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，并且在发酵24-48h内补糖蜜，使分批发酵反应器中总糖含量和之前一样为200g/l，其中总糖指的是经硫酸调pH水解离心处理，加树脂处理，加果胶酶处理，稀释使分批发酵反应器中初始总糖为100g/l。
优选的，按照实施例2方法获得的酸化处理后糖蜜，在实施例4中先树脂处理，再进行酶解处理。优选的将酸化后糖蜜上清液中加入0.1-1倍重量的树脂，在25-50℃搅拌4-12h，过滤获得脱色上清液；优选添加0.4倍重量的树脂，脱色8 h；然后调节脱色后糖蜜的pH至3.0-7.0，之后添加0.1-10%（w/v）的果胶酶，30-60 ℃搅拌4-12 h。
结论：有研究表明色素是具有还原性，而我们聚苹果酸的生产是一个高好氧的过程，因此用树脂把糖蜜中的色素去除掉，更有利于聚苹果酸的产生，再结合硫酸调pH至2，果胶酶，分批补料培养，所以聚苹果酸的产量增幅巨大。
实施例5
与实施例1-4的单次、传统发酵方式不同的是，实施例5采用的是采用的是重复补料分批发酵与细胞固定化结合发酵方法，将分批发酵和连续发酵结合的细胞固定化的发酵方法。
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为54.95g/L，细胞的生物量为82.85g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量100g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，并且在发酵24-48h内补糖蜜，使分批发酵反应器中总糖含量和之前一样为200g/l，其中总糖指的是糖蜜经硫酸调pH水解离心处理，加树脂处理，加果胶酶处理，稀释使分批发酵反应器中初始总糖为100g/l。其中糖蜜的酸化处理、树脂处理、酶解步骤与实施例1-4相同。以上过程即为分批发酵过程。
在发酵72h后（也就是分批发酵结束后）开始所述连续发酵过程，在分批发酵反应器（本发明所述分批发酵反应器）旁边接一个填充塔，填充塔里面装满处理过的聚氨酯（本发明所述固定化载体），填充塔在121℃ 20min整体灭菌后用管路和分批发酵反应器相接，分批发酵反应器出料口管接一个循环泵，整体构造图见图1。用泵把分批发酵反应器中发酵72h后的发酵液泵到装满固定化材料的填充塔中，再通过管路循环回到分批发酵反应器，固定两个小时，排出发酵液，重新加入新的灭过菌的培养基，同上面第一批中的补料分批发酵一样，72h为一个批次，重复三次，测生物量和聚苹果酸的含量如表1。
表1.聚氨酯固定化细胞重复分批补料发酵
，
结论：糖蜜经过处理比不经过处理直接发酵聚苹果酸产量更高，提高了5.9倍；经固定化重复分批发酵聚苹果酸产量进一步高，因为载体吸附了上一批的生物量，使下一批发酵有一个较高的初始生物量，缩短了滞后期，从而缩短了发酵周期，也使新培养基中的营养成分更多的用来生成聚苹果酸，加快了碳源的利用效率，从而提高聚苹果酸的产率和产量，以聚氨酯作为固定化载体，聚苹果酸的产率和产量提升了 9 %。同时本发明检测方法更先进准确，工业化生产更加便捷。
实施例6
实施例6与实施例5相似，采用的是重复补料分批发酵与细胞固定化结合发酵方法，将分批发酵和连续发酵结合的细胞固定化的发酵方法。实施例6中所述固定化载体为玉米芯。
分批发酵过程：
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为54.95g/L，细胞的生物量为82.85g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量100g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，并且在发酵24-48h内补糖蜜，使分批发酵反应器中总糖含量和之前一样为200g/l，其中总糖指的是糖蜜经硫酸调pH水解离心处理，加树脂处理，加果胶酶处理，稀释使分批发酵反应器中初始总糖为100g/l。其中糖蜜的酸化处理、树脂处理、酶解步骤与实施例1-4相同。
连续发酵过程：
在发酵72h后，在分批发酵反应器旁边接一个填充塔，填充塔里面装满处理过的玉米芯，填充塔在121℃20min整体灭菌后用管路和分批发酵反应器相接，分批发酵反应器出料口管接一个循环泵，整体构造图见附图1。用泵把分批发酵反应器中发酵72h后的发酵液泵到装满固定化材料的填充塔中，再通过管路循环回到分批发酵反应器，固定两个小时，排出发酵液，重新加入新的灭过菌的培养基，同上面第一批中的补料分批发酵一样，72h为一个批次，重复三次，测生物量和聚苹果酸的含量如表2。
表2.玉米芯固定化细胞重复分批补料发酵
，
结论：糖蜜经过处理比不经过处理直接发酵聚苹果酸产量更高，提高了5.9倍；经固定化重复分批发酵聚苹果酸产量进一步高，因为载体吸附了上一批的生物量，使下一批发酵有一个较高的初始生物量，缩短了滞后期，从而缩短了发酵周期，也使新培养基中的营养成分更多的用来生成聚苹果酸，加快了碳源的利用效率，从而提高聚苹果酸的产率和产量，以玉米芯作为固定化载体，聚苹果酸的产率和产量提升了 14 %。同时本发明检测方法更先进准确，工业化生产更加便捷。
实施例7
实施例7与实施例5相似，采用的是重复补料分批发酵与细胞固定化结合发酵方法，将分批发酵和连续发酵结合的细胞固定化的发酵方法。实施例7中所述固定化载体为丝瓜络。
分批发酵过程：
本实施例中利用糖蜜发酵生产聚苹果酸的具体过程为：取出芽短梗霉菌转接至斜面培养基中于25℃下恒温培养72-96h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在25℃，转速110rpm条件下培养48h，然后取培养液按接种量10%接种于分批发酵反应器中，发酵体积为4L，分批发酵反应器体积为7.5L，分批发酵反应器中含有发酵培养基，然后在温度25℃、转速800-1200rpm，pH6.5条件下培养72h，检测发酵液中聚苹果酸的含量。结果显示，本实例中聚苹果酸产量为54.95g/L，细胞的生物量为82.85g/l。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖88g/L，蛋白胨1g/L，七水硫酸镁0.2g/L，磷酸氢二钾0.1g/L。溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：总糖含量100g/l，硝酸钠6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，七水硫酸镁0.2g/L，氯化钾0.5g/L，七水硫酸锌0.005g/L，氯化钙0.1g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，并且在发酵24-48h内补糖蜜，使分批发酵反应器中总糖含量和之前一样为200g/l，其中总糖指的是糖蜜经硫酸调pH水解离心处理，加树脂处理，加果胶酶处理，稀释使分批发酵反应器中初始总糖为100g/l。其中糖蜜的酸化处理、树脂处理、酶解步骤与实施例1-4相同。
连续发酵过程：
在发酵72h后，在分批发酵反应器旁边接一个填充塔，填充塔里面装满处理过的丝瓜络，填充塔在121℃ 20min整体灭菌后用管路和分批发酵反应器相接，分批发酵反应器出料口管接一个循环泵，整体构造图见附图1。用泵把分批发酵反应器中发酵72h后的发酵液泵到装满固定化材料的填充塔中，再通过管路循环回到分批发酵反应器，固定两个小时，排出发酵液，重新加入新的灭过菌的培养基，同上面第一批中的补料分批发酵一样，72h为一个批次，重复三次，测生物量和聚苹果酸的含量如表3。
表3.丝瓜络固定化细胞重复分批补料发酵
，
结论：糖蜜经过处理比不经过处理直接发酵聚苹果酸产量更高，提高了5.9倍；经固定化重复分批发酵聚苹果酸产量进一步高，因为载体吸附了上一批的生物量，使下一批发酵有一个较高的初始生物量，缩短了滞后期，从而缩短了发酵周期，也使新培养基中的营养成分更多的用来生成聚苹果酸，加快了碳源的利用效率，从而提高聚苹果酸的产率和产量，丝瓜络提升的最多，提升了22%。同时本发明检测方法更先进准确，工业化生产更加便捷。
实施例8
实施例8提供了如图1所示的重复分批补料发酵装置图。
所述发酵装置包括分批发酵反应器1和填充塔2，所述填充塔2填充有所述固定化载体，所述填充塔上部及底部设置上部筛网和底部筛网、所述填充塔底部设置曝气装置、所述上部筛网和底部筛网间布置有所述固定化载体，所述填充塔的上部直接与所述分批发酵反应器连接，所述填充塔的底部经循环泵3与所述分批发酵反应器连接。气进通道设置有空气过滤器4，发酵液排出处设置有开关5。图1中表明了气进方向6，尾气排出方向7，发酵液循环方向8，发酵液排出方向9。分批发酵反应器1顶端连接有发动机10。
在实施例8所提供的装置中，实施本发明所提供的方法：
步骤1：菌种经菌种活化、种子培养后，将菌种接种于分批发酵反应器1进行分批发酵。
发酵条件：
发酵培养基：糖蜜总糖含量在80~250 g/L，碳酸钙15-100 g/L，硝酸盐0.5-10 g/L，磷酸二氢钾0.1-1 g/L，七水硫酸锌0.005-0.5 g/L，氯化钾0.1-1 g/L，七水硫酸镁0.001-0.1 g/L，蛋白胨5-30 g/L，酵母粉1-15 g/L。
分批发酵过程初始，所述发酵培养基中糖蜜初始糖浓度50-150 g/L，随着分批发酵的进行，待发酵液中的糖基本消耗完毕后加预处理后的糖蜜，直至聚苹果酸浓度达到45-55g/L，结束分批发酵过程。分批发酵过程中糖蜜总糖含量达到80~250 g/L。
发酵时的菌种接种量为发酵培养基体积的4-30%；优选为4、10、15、20、25、30%。最为优选的为10%。
发酵时的温度为20-30℃；优选为20、25、30℃。
转速800-1200rpm，pH6.5，发酵培养72h。
步骤2：分批发酵72h结束时，开始连续发酵。启动循环泵使发酵液在分批发酵反应器和填充塔间循环一定时间后，间歇或连续的排除分批反应器中的发酵液并补充等体积的新鲜培养基。
所述循环一定时间为2-10 h，优选2 h。
间歇补料实现连续发酵时，排除发酵液期间，循环泵停止运转，待新鲜培养基补充完毕后，循环泵连续运转。
连续补料实现连续发酵时，循环泵连续运转。
连续发酵培养过程发酵温度、转速、培养基成分和组成与分批发酵培养过程一致。
分批发酵和连续发酵中，发酵培养基中的糖蜜为经过预处理的糖蜜：
将原糖蜜稀释倍数为0.2-3倍，优选0.5倍。
用硫酸将稀释糖蜜酸化至pH1-4，优选pH2；具体的，所述糖蜜酸化过程包括稀释糖蜜酸化至pH1-4，100℃加热1 h，之后自然冷却8-24 h，分离沉淀并获得上清液。
利用大孔吸附树脂，优选HPD600树脂对对酸化后的糖蜜进行脱色。具体的，所述脱色过程包括向酸化糖蜜上清液中加入0.1-1倍重量的树脂，在25-50℃搅拌4-12 h，过滤获得脱色上清液；优选添加0.4倍重量的树脂，脱色8 h。
利用果胶酶进行糖蜜酶解，所述酶解用酶为优选为酸性或中性果胶酶；具体的，所述糖蜜酶解过程包括调脱色糖蜜pH至3.0-7.0，之后添加0.1-10%（w/v）的果胶酶，30-60 ℃搅拌4-12 h。
调pH所用的碱为石灰、碳酸钙、氧化钙任意一种或至少两种的组合，优选石灰。
优选地，吸附色素饱和的树脂，经有机溶剂解吸附后，用于下一批次酸化糖蜜的预处理，解析附后的液体可以通过旋蒸、冷冻干燥等处理得到副产物色素；优选地，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、丙酮中的至少一种，优选乙醇。
接种于分批发酵反应器的菌种经过菌种活化和种子培养过程。
菌种活化：将菌种接种于斜面培养基中，于20-30℃培养48-96 h。所述菌种活化时使用的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基；所述菌种优选为产黑色素短梗霉CGMCCNo.18996。本发明所提供的方法，适用于但不局限于黑色素短梗霉CGMCC No.18996。
种子培养：将活化后的菌种接种于种子培养基中，于20-30℃振荡培养30-72 h。
所述种子培养基包括如下组分：糖质40-100g/L，硝酸盐0.5-10 g/L, 磷酸二氢钾0.1-0.5 g/L，蛋白胨0.1-2 g/L，七水硫酸镁0.1-1.0 g/L。
优选为，葡萄糖80 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L，硝酸钠2.0 g/L，蛋白胨1.0 g/L，七水硫酸镁0.2 g/L。
实施例9
实施例9对实施例5-8中，经过分批发酵和连续发酵循环后，附着于固定化载体上的菌体进行了电镜检测。如图2所示，其中A为对照组，是没有菌体附着的固定化载体，B为经过分批发酵和连续发酵循环后附着于固定化载体上的菌体细胞驯化呈现出更圆、更光滑、更饱满的酵母形态细胞，更有利于细胞的增殖和代谢产物的积累。（由于不同固定化载体的电镜检测均取得相同的技术效果，即经过分批发酵和连续发酵循环后附着于不同固定化载体的菌体细胞均得到驯化，因此，图2仅以丝瓜酪作为固定化载体的电镜检测图片为例，其他固定化载体的检测结果在此不进行重复展示）。
实施例9对本发明利用固定化载体连续发酵提高产量的机理进行了验证：1，因为固定化载体吸附了上一批发酵液中的菌体，使下一批发酵初期有一个较高的生物量，缩短了滞后期，从而缩短了发酵周期，显著降低了时间成本。2.因为初始有较高的菌体量积累，使新一批发酵液中营养物质有更多的部分用于生产聚苹果酸。3，丝瓜络为细胞提供了容易附着的理想表面积和天然的良好生存环境，使细胞驯化呈现出更圆、更光滑、更饱满的酵母形态细胞，更有利于细胞的增殖和代谢产物的积累。
上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (4)
1.一种以糖蜜为原料细胞固定化生产聚苹果酸的方法，包括菌种活化、种子培养和发酵产酸，其特征在于，所述方法还包括糖蜜预处理；所述发酵产酸包括分批发酵和连续发酵的过程；所述分批发酵是指在发酵装置中接种菌种进行发酵的过程；所述发酵装置中包含有固定化载体，所述连续发酵是指在分批发酵结束后，将发酵液中的菌种附着于所述固定化载体上，间歇或连续的排出发酵装置中的发酵液并补充等体积的新鲜发酵培养基；
发酵过程利用的微生物菌种为产黑色素短梗霉（ Aureobasidium melanogenum）CGMCCNo.18996；
所述固定化载体为聚氨酯、玉米芯或丝瓜络；
所述糖蜜预处理包括原糖蜜稀释、酸化过程、脱色过程和酶解过程；
所述糖蜜预处理步骤为：
所述原糖蜜稀释：糖蜜的稀释倍数为0.2-3倍；
所述酸化过程：加入酸性物质将稀释后的糖蜜酸化至pH1-4，加热后自然冷却并静置，分离沉淀并获得上清液；
所述脱色过程：指向酸化糖蜜上清液中加入大孔吸附树脂，经搅拌、过滤获得脱色上清液；
所述酶解过程：将调节脱色糖蜜pH至3.0-7.0，添加果胶酶，30-60 ℃搅拌。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵装置包括分批发酵反应器和填充塔，所述填充塔填充有所述固定化载体，所述填充塔上部及底部设置上部筛网和底部筛网、所述填充塔底部设置曝气装置、所述上部筛网和底部筛网间布置有所述固定化载体，所述填充塔的上部直接与所述分批发酵反应器连接，所述填充塔的底部经循环泵与所述分批发酵反应器连接。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵产酸过程中：所述分批发酵是指将菌种接种于分批发酵反应器进行分批发酵；所述连续发酵是分批发酵结束时，启动循环泵使发酵液在分批发酵反应器和填充塔间循环一定时间后，间歇或连续的排出分批反应器中的发酵液并补充等体积的新鲜培养基。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵产酸步骤中使用的发酵培养基为含有糖蜜的液体培养基，所述发酵培养基包括如下组分：糖蜜总糖含量在80~250 g/L，碳酸钙15-100 g/L，硝酸盐0.5-10 g/L，磷酸二氢钾0.1-1 g/L，七水硫酸锌0.005-0.5 g/L，氯化钾0.1-1 g/L，七水硫酸镁0.001-0.1 g/L，蛋白胨5-30 g/L，酵母粉1-15 g/L。
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