CN101381750A - 利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，是将灵芝细胞固定在循环式填充床反应器细胞固定化载体上，通过循环管道，流通管和雾化喷雾头，使发酵液处于流动状态，对固定化细胞进行发酵，一轮发酵结束后，保留部分发酵液与新鲜培养液混合，进行循环发酵。细胞处于固定状态下，进行液体深层发酵，增加了发酵的细胞密度和耐受毒害能力，同时提高了细胞分泌物的产量和含量，而且固定化细胞可反复利用。输出的一部分发酵液不断用于产品开发；另一部分再与输入反应器的细胞培养液混合后再以恒定的速度输入反应器，不但可以连续化生产产品，而且提高了发酵液中产物的浓度。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体地，涉及利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法。
背景技术
灵芝(Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。中华传统医学认为，灵芝味甘、性温、无毒、可补心、肝、肺、脾、肾五胀之气，具滋补强壮、固本扶正之功效。现代医学研究也表明，灵芝的药理成分非常丰富，其中有效成份包括多糖类(即：灵芝多糖)、三萜类(主要为灵芝酸类)、灵芝多肽、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn、等。灵芝对人体具有双向调节作用，所治病种，涉及心脑血管、消化、神经、内分泌、呼吸、运动等各个系统，尤其对肿瘤、肝脏病变、失眠以及衰老的防治作用十分显著。其主要有效成份为灵芝多糖、灵芝酸具有抗癌和抗艾滋病等疗效(Russell R，Paterson M.(2006)Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory.PHytochemistry67:1985-2001；Kun-Chieh Cheng，Hsuan-Cheng Huang，Jenn-Han Chen，et al.(2007)Ganoderma lucidum polysaccharides in human monocytic leukemia cells:from geneexpression to network construction.BMC Genomics.8:411.；E1-MekkawyS，Meselhy MR，Nakamura N，TezukaY，HattoriM，Kakiuchi N，ShimotohnoK，Kawahata T，Otake T.(1998)Anti-HIV 1 and anti-HIV-1-protease substances fromGanoderma lucidum.PHytochemistry 49:1651-1657)。
在灵芝多糖的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝产量和质量成为限制其应用的瓶颈。
目前主要利用发酵方法产生灵芝多糖和灵芝酸等有效成份的方法，主要采用液体深层发酵。如公开号为CN1264743A(发明名称：液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺)、CN1375557A(发明名称：生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法)、授权公告号为CN1141392C(发明名称：中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法)、公开号为101235393A(发明名称：促进灵芝酸和灵芝多糖生物合成的发酵方法)等专利文献公开了一系列通过液体深层发酵产生灵芝多糖和灵芝酸的方法。但液体深层发酵是采用游离细胞生产灵芝糖和灵芝酸，细胞密度低，产物含量和产量低，这正是灵芝多糖和灵芝酸生产行业的瓶颈。
为了解决上述问题，本发明人设计了一种新型循环式填充床反应器，细胞在发酵罐内处于固定状态，提高细胞密度和耐受毒害能力，同时提高了细胞分泌物的产量和含量，而且可多次重复发酵，直到发酵液中目的产物达到理想含量，发酵液处于循环状态，使发酵液能充分而均匀的与新鲜空气接触，提高整体溶氧效果，从而提高发酵液中产生的灵芝多糖的含量。本发明将就利用这种循环式填充床反应器进行发酵产生灵芝多糖的方法进行描述。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用新型循环式填充床反应器进行灵芝发酵产生灵芝多糖的方法，极大的提高灵芝多糖产物的产量和含量。
本发明是通过如下技术方案实现的：本发明所用循环式填充床反应器包括发酵罐、循环系统及通过通气管道与所述发酵罐连通的通气系统，所述发酵罐包括上管道接口和下管道接口，所述酵罐内侧安装有流通管，所述流通管上安装有雾化喷雾头，所述循环系统包括管道装置和细胞固定化装置，所述管道装置包括发酵罐外的循环管道及安装于所述循环管道上的循环液泵，所述循环管道上端与所述发酵罐之上管道接口连通，下端与所述发酵罐之下管道接口连通，所述循环管道还包括成品液管道及补充液管道，所述成品液管道一端与所述循环管道连通，另一端为成品液出口，所述成品液管道与所述循环管道的连接处设有换向阀门，所述补充液管道一端与所述循环管道连通，另一端为补充液接口，所述补充液管道与所述循环管道的连接处设有换向阀门，所述细胞固定化装置位于发酵罐内，包括一中轴，所述中轴上安装至少一层以中轴为中心呈辐射状朝向外的辐条，本发明利用所述循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法包括如下步骤：
(1)菌液制备：将灵芝细胞在液体培养基中发酵预培养至细胞干质量达到0.6～1.2mg/ml；
(2)细胞固定化载体和培养液制备：取细胞固定化载体，洗净，按菌液体积与细胞固定化载体干质量的比例为6～12ml∶1～1.5mg，将细胞固定化载体安装在循环式填充床反应器细胞固定化装置的辐条上，121℃灭菌45～60min；同时灭菌配置好的培养液；
(3)细胞固定化：待循环式填充床反应器冷却到室温，控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将菌液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制菌液流向，使菌液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使细胞固定在细胞固定化载体上，菌液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，开始下一轮循环；通过循环液泵控制菌液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为8～12ml/min；本步骤(3)进行8～12小时；
(4)第一次发酵培养：控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将灭菌的培养液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制培养液流向，使培养液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使固定在细胞固定化载体上的细胞发酵，培养液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，进入下一轮循环，通过循环液泵控制培养液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为8～12ml/min；
(5)收集成品：上述步骤(4)之发酵过程进行8～12小时后，通过换向阀门控制发酵液从成品液管道流出收集，收集发酵液体积的60-80％作为成品储存；
(6)循环发酵：补充与步骤(5)中所收集成品液等体积的新鲜培养液，与剩余的发酵液混合，再重复上述步骤(4)和步骤(5)；
(7)重复上述步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)，整个发酵过程持续18-25天。
利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，步骤(1)所用灵芝为紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1 CGMCC No.0742。
利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，步骤(1)所述细胞干质量达到0.7～1.0mg/ml。
利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，所述多孔介质细胞固定化载体选自但不限于玉米芯、人造海绵和丝瓜瓤。
利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，步骤(2)所述菌液体积与细胞固定化载体干质量的比例为8～10ml∶1～1.5mg。
利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，步骤(3)所述喷雾头的喷射速率为9～11ml/min。
利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，步骤(4)所述发酵液体积为发酵罐体积的40％-80％。
本发明的有益效果为：(1)细胞处于固定状态下，进行液体深层发酵，增加了发酵的细胞密度和耐受毒害能力，同时提高了细胞分泌物的产量和含量，而且固定化细胞可反复利用。(2)输出的一部分发酵液不断用于产品开发；另一部分再与输入反应器的细胞培养液混合后再以恒定的速度输入反应器，不但可以连续化生产产品，而且提高了发酵液中产物的浓度。(3)同时，依赖输入反应器的培养液，使固定化细胞处于流化状态，提高了床内热、质传递和氧溶量，有利于细胞的生长繁殖和产物的生物合成。
附图说明
图1为本发明利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法中所用循环式填充床反应器的组成示意图。
图2为图1所示循环式填充床反应器之细胞固定化装置除去发酵罐顶盖的俯视图。
图3为本发明利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法中所用另一种循环式填充床反应器的组成示意图。
图4为本发明利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法之第一实施例，图中展示了细胞原液的循环流向。
图5展示了第一实施例中的培养液或发酵液与培养液的混合液的循环流向。
图6为展示了第一实施例中的成品的流向。
图7为本发明利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法之第二实施例，图中展示了培养液的流向。
图8展示了第二实施例中细胞原液的循环流向。
图9展示了第二实施例中发酵液或发酵液与培养液的混合液的循环流向。
图10展示了第二实施例中成品的流向。
具体实施方式
为了详细说明循环式填充床反应器的技术内容，以下结合实施方式并配合附图作进一步说明。
首先结合图示介绍本发明所利用的循环式填充床反应器。
如图1所示，图1展示了本发明所涉及到的一种循环式填充床反应器组成示意图，包括发酵罐100、通气系统200以及循环系统300。
所述发酵罐100包括发酵罐顶盖110、侧壁120、底部130和内腔140。所述发酵罐顶盖110外侧面上安装有一调速电机111、呼吸阀112和视镜灯113。呼吸阀112上安装一第一阀门1121控制呼吸阀112的开关。所述发酵罐侧壁120外侧安装有一压力检测装置121和两个观察镜122，侧壁120内侧安装有数根流通管123，在所述流通管123上安装有数个雾化喷雾头124，侧壁120设有通气接口125，连通所述通气系统200。所述发酵罐上部还设有一上管道接口126，连通所述循环系统300，所述发酵罐底部130设有一下管道接口131，也连通所述循环系统300。所述循环系统300包括细胞固定化装置310和管道装置320。请配合参阅图2，所述细胞固定化装置310包括中轴311和固定于中轴311并以中轴为中心向外呈辐射状排列的数排辐条312，辐条312上安装有细胞固定化载体313，细胞固定化载体313为多孔介质，所述中轴311穿过所述发酵罐顶盖110，与所述调速电机111连接，使整个细胞固定化装置310在发酵罐中悬空，调速电机111控制所述细胞固定化装置310在发酵罐内旋转速率，所述雾化喷雾头124对安装于顶盖的细胞固定化装置310喷射培养液或发酵液。
所述管道装置320包括循环管道321和循环管道321上的循环液泵322，所述循环管道321上端与发酵罐上管道接口126连通，循环管道321下端与发酵罐下管道接口131连通。
所述循环管道321还包括成品液管道325，所述成品液管道325一端与所述循环管道321连通，另一端为成品液出口326，所述成品液管道326与所述循环管道的连接处设有第一换向阀门323。
所述循环管道321还包括补充液管道327，所述补充液管道327一端与所述循环管道321连通，另一端为补充液接口328，所述补充液管道327与所述循环管道321的连接处设有第二换向阀门324。
当然，也可把补充液接口328直接设在发酵罐上部，成品液出326直接设在发酵罐下部，或将补充液接口328设在发酵罐上部，成品液出口326通过成品液管道325与所述循环管道321连通，并在连接处设有换向阀门323，或将成品液出口326设在发酵罐下部，补充液接口328通过补充液管道327与所述循环管道321连通，并在连接处设有换向阀门324。
所述循环管道321上还安装有一第二阀门329、一细胞截留器330和一取样口331，所述第二阀门329、细胞截留器330和取样口331依次位于发酵罐100底部之下管道接口131和第二换向阀门324之间。
所述通气系统200包括螺茨风机201、空气过滤系统202、空气冷却系统203、通气管道204和通气管道204上的第三阀门205，所述螺茨风机201、空气过滤系统202和空气冷却系统203依次通过管道连通，所述通气管道204与所述发酵罐100侧壁之通气接口125连通，并通过通气管道204向发酵罐内输送空气。
图3展示了本发明涉及到的另一种循环式填充床反应器的组成示意图。所述反应器还包括与所述发酵罐100、所述通气系统200、所述循环系统300分别连通的一灭菌罐400。所述灭菌罐400包括外壁410、夹层420、内壁430和内腔440；外壁410和内壁430在灭菌罐400顶部和底部连接一体，所述灭菌罐400顶部内外壁连接处设有一通道411，并通过通道411与所述发酵罐100之底部130下管道接口131连通，使发酵罐100内腔140和灭菌罐内腔440连通，所述通道411上安装一第四阀门412，第四阀门412的开关控制发酵罐100内腔140和灭菌罐内腔440的连通和隔绝；所述通道411在所述发酵罐100下管道接口131和第四阀门412之间设有一通道管道接口413，所述通道管道接口413通过循环管道321经第二换向阀门332连通补充液管道327。灭菌罐400底部设有一出口414，出口414连通所述循环管道321下端；所述灭菌罐400内壁430上安装一文丘里管431，所述文丘里管431开口朝向所述灭菌罐400底部，并穿过所述灭菌罐内、外壁与通气系统200之另一通气管道206连通，所述灭菌罐400内壁430上还安装一压力检测装置432，检测灭菌罐400内腔440的压力。
通气管道206上设有第五阀门207，控制通气系统200是否向灭菌罐内腔440通气，所述通气管道206在空气冷却系统203和第三阀门205之间连通通气管道204。
夹层420通过一通气管道421与所述发酵罐内腔140连通，通气管道421上安装有第六和第七阀门423和424，一压力检测装置425分别与灭菌罐夹层420和通气管道421之第六和第七阀门423和424之间连通，检测灭菌罐夹层420的气压。所述灭菌罐400还安装有电力装置433，所述夹层420内装有水，所述电力装置433加热所述夹层420内水，对灭菌腔440进行灭菌，当通气管道421上的第六和第七阀门423、424打开时，所述发酵罐100的发酵腔140也被灭菌，当第六阀门423关闭，第七阀门424打开时，仅灭菌腔440被灭菌。所述灭菌罐400还安装有压力检测装置432、温度检测装置434、pH检测装置435和溶解氧检测装置436，检测所述灭菌腔440内发酵液的参数。
以下对本发明涉及到的循环式填充床反应器的工作方式做进一步说明。
第一种循环式填充床反应器的工作过程：
一、灭菌：
打开发酵管100之顶盖110，向细胞固定化装置310之辐条312上安装上预处理好的细胞固定化载体313，关上顶盖110，对反应器进行灭菌。
二、接种：参照图4，箭头所示为细胞原液的流向图。
反应器冷却到室温，将制备好的细胞原液通过补充液接口328注入补充液管道327，旋转第二换向阀门324，使细胞原液经过第二换向阀门324流向循环液泵322，并利用循环液泵322提供的动力，经循环管道流向第一换向阀门323，旋转第一换向阀门323，使细胞原液通过管道流向发酵罐100内的流通管123，通过流通管123经雾化喷雾头124，向所述细胞固定化载体313喷射细胞原液，细胞在细胞固定化载体313上被固定。细胞原液在发酵罐底部130聚集，并经发酵罐底部之下管道接口131再次进入循环管道321，依次经第二阀门329、细胞截留器330、取样口331和第二换向阀门324，进入下一个循环。细胞原液往复循环流动，使大量细胞固定到细胞固定化载体313上，当接种量达到预定值，停止循环。
此进程中细胞原液的流向：补充液接口328-补充液管道327-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-流通管123-雾化喷雾头124-细胞固定化载体313—发酵罐底部130下管道接口131-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324-循环液泵322。
三、第一次发酵培养：参照图5，箭头所示为培养液的流向图。
培养液灭菌后，通过补充液接口328注入补充液管道327，旋转第二换向阀门324，使培养液经过第二换向阀门324流向循环液泵322，并利用循环液泵322提供的动力，经循环管道流向第一换向阀门323，旋转第一换向阀门323，使培养液通过管道流向发酵罐100内的流通管123，通过流通管123经雾化喷雾头124，向所述细胞固定化载体313喷射培养液，细胞在细胞固定化载体313上被固定。培养液在发酵罐底部130聚集，并经发酵罐底部之下管道接口131再次进入循环管道321，依次经第二阀门329、细胞截留器330、取样口331和第二换向阀门324，进入下一个循环。
培养液流向：补充液接口328-补充液管道327-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-流通管123-雾化喷雾头124-细胞固定化载体313—发酵罐底部130管道接口131-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324。
四、循环发酵培养并同时收集部分成品：参照图6，箭头所示为成品液的流向图。
收集成品：当细胞发酵到一定时间，从取样口331取样，检测发酵液所含成份达到目的值，停止第一轮发酵。旋转第一换向阀门323，使发酵液流向成品液出口326，收集成品。
成品流向：成品—下管道接口131-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-成品液管道325-成品液出口326。
循环发酵：也请参照图5，箭头所示也代表混合液的流向图。在收集成品中仍保留部分发酵液在发酵罐100中。向发酵罐中补充新鲜培养液。培养液灭菌后，通过补充液接口328注入补充液管道327，旋转第二换向阀门324，使培养液经过第二换向阀门324流向循环液泵322，并利用循环液泵322提供的动力，经循环管道流向第一换向阀门323，旋转第一换向阀门323，使培养液通过管道流向发酵罐100内的流通管123，通过流通管123经雾化喷雾头124，向所述细胞固定化载体313喷射培养液。培养液在发酵罐底部130聚集，并与聚集在那里的剩余发酵液混合，混合液并经发酵罐底部之下管道接口131再次进入循环管道321，依次经第二阀门329、细胞截留器330、取样口331和第二换向阀门324，进入下一个循环。
混合液流向：培养液-补充液接口328-补充液管道327-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-流通管123-雾化喷雾头124-细胞固定化载体313—发酵罐底部130下管道接口131处，培养液与发酵罐内剩余发酵液混合—出口414-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324。
重复上述第三和第四步骤，直到检测发酵液中目的成份到达目的值。
五、收集成品：收集成品，停止发酵。
值得提出的是，在整个细胞生长和发酵的过程中，通气系统一直通过管道向发酵罐提供细胞生长繁殖所需要的气体，并通过呼吸阀排出废气。
以下结合第一实施例对本发明利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，做进一步详细描述。
(1)菌液制备：将灵芝细胞在液体培养基中发酵预培养至细胞干质量达到0.8mg/ml；
(2)细胞固定化载体和培养液制备：取细胞固定化载体，洗净，按菌液体积与细胞固定化载体干质量的比例为10ml∶1.2mg，将细胞固定化载体安装在循环式填充床反应器细胞固定化装置的辐条上，121℃灭菌45～60min；同时灭菌配置好的培养液；
(3)细胞固定化：待循环式填充床反应器冷却到室温，控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将菌液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制菌液流向，使菌液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使细胞固定在细胞固定化载体上，菌液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，开始下一轮循环；通过循环液泵控制菌液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为10ml/min；本步骤(3)进行10小时；
(4)第一次发酵培养：控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将灭菌的培养液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制培养液流向，使培养液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使固定在细胞固定化载体上的细胞发酵，培养液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，进入下一轮循环，通过循环液泵控制培养液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为10ml/min；
(5)收集成品：上述步骤(4)之发酵过程进行10个小时后，通过换向阀门控制发酵液从成品液管道流出收集，收集发酵液体积的80％作为成品储存；
(6)循环发酵：补充与步骤(5)中所收集成品液等体积的新鲜培养液，与剩余的发酵液混合，再重复上述步骤(4)和步骤(5)；
(7)重复上述步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)，整个发酵过程持续20天。
第二种循环式填充床反应器的工作过程：
一、灭菌：参照图7，箭头所示为培养液的流向图。
打开发酵管100之顶盖110，向细胞固定化装置310之辐条312上安装上预处理好的细胞固定化载体313，关上顶盖110。打开通气管道421上的阀门423，424，使灭菌罐夹层420和发酵罐内腔140，保持气流畅通。将配置好的培养液通过补充液接口328注入补充液管道327，旋转第三换向阀门332和第二换向阀门324，并打开第二阀门329，使培养液经过第三换向阀门332，流入循环管道，再经第二换向阀门324流向取样口331，并通过取样口331和细胞截留器330到达灭菌罐底部之出口414，经出口414进入灭菌罐内腔440，打开电力装置450，对发酵罐100内腔140和灭菌罐内腔340及其内腔内细胞载体313和培养液进行灭菌。
培养液的流向为：补充液接口328-补充液管道327-第三换向阀门332-第二换向阀门324-取样口331-细胞截留器330-第二阀门329-灭菌罐底部之出口414-灭菌罐内腔440。
二、接种：参照图8，箭头所示为细胞原液的流向图。
冷却到室温，关闭通气管道421上的阀门423和通道411上的阀门412，使发酵罐内腔140和灭菌罐夹层430、内腔440隔绝，将制备好的细胞原液通过补充液接口328注入补充液管道327，旋转第三换向阀门332和第二换向阀门324，使细胞原液经过第三换向阀门332和第二换向阀门324流向循环液泵322，并利用循环液泵322提供的动力，经循环管道流向第一换向阀门323，旋转第一换向阀门323，使细胞原液通过管道流向发酵罐100内的流通管123，通过流通管123经雾化喷雾头124，向所述细胞固定化载体313喷射细胞原液，细胞在细胞固定化载体313上被固定。细胞原液在发酵罐底部130聚集，并通过通道411流向第三换向阀门332，进入下一个循环。细胞原液往复循环流动，使大量细胞固定到细胞固定化载体上。当接种量达到预定值，停止循环。
细胞原液的流向：补充液接口328-补充液管道327-第三换向阀门332-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门32-流通管123-雾化喷雾头124-细胞固定化载体313—发酵罐底部130-通道411-第三换向阀门332。
三、第一次发酵培养：参照图9，箭头所示为发酵液的流向图。
培养液冷却到室温，开始发酵。打开第二阀门329和通道411上的阀门412，培养液经灭菌罐底部之出口之414，依次经过第二阀门329、细胞截留器330、取样口331到第二换向阀门324，旋转第二换向阀门324，使培养液通过管道流向循环液泵322，并利用循环液泵322提供的动力，经循环管道流向第一换向阀门323，旋转第一换向阀门323，使培养液通过管道流向发酵罐100内的流通管123，通过流通管123经雾化喷雾头124，向所述细胞固定化载体313喷射培养液，培养液在发酵罐底部130聚集，并通过通道411流入灭菌罐100内腔140，然后再经过灭菌罐底部出口414，进入下一个循环。为了避免循环中可能存在的细胞堵塞出口414，打开阀门207，通过通气管道206向文丘里管332通气，使灭菌罐300内的液体处以翻滚状态，从而避免出口414堵塞。
发酵液流向：培养液—出口之414-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-流通管123-雾化喷雾头124-细胞固定化载体313-发酵罐底部130聚集-通道411-灭菌罐100内腔140-出口414。
四、第二次循环发酵培养：参照图10，箭头所示为成品的流向图。
收集成品：当细胞发酵到一定时间，从取样口331取样，检测发酵液所含成份达到目的值，停止第一轮发酵。关闭通道411阀门412，使发酵罐内腔140和灭菌罐内腔440隔绝。旋转第一换向阀门323，使发酵液流向成品出口326，收集成品。
成品流向：成品—出口414-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-成品液管道325-成品液出口326。
循环发酵：也请参照图9，箭头所示也代表混合液的流向图。保留部分发酵液，旋转第一换向阀门323，使发酵液流向发酵罐100并保存在发酵罐100中。待灭菌罐内腔340发酵液全部流出后，旋转第三换向阀门332和第二换向阀门324，向补充液接口328注入配置好的培养液，使培养液经过三换向阀门332和第二换向阀门324，流向细胞截留器501，进入灭菌罐内腔340进行灭菌。待培养液冷却到室温，打开通道411阀门412，剩余发酵液和培养液混合。旋转第二换向阀门324和第一换向阀门323，混合液依次经过灭菌罐出口414、细胞截留器330、取样口331、第二换向阀门324、循环液泵322和第一换向阀门323，进入发酵罐侧壁之流通管123，通过流通管123经雾化喷雾头124，向所述细胞固定化载体313喷射培养液，进入下一个发酵循环。
混合液流向：在灭菌罐中，发酵罐内剩余发酵液与灭菌罐内培养液混合—出口之414-第二阀门329-细胞截留器330-取样口331-第二换向阀门324-循环液泵322-第一换向阀门323-流通管123-雾化喷雾头124-细胞固定化载体313-发酵罐底部130聚集-通道411-灭菌罐100内腔140-出口414。
重复上述三，四步骤，直到检测发酵液中目的成份到达目的值。
五、收集成品：收集成品，停止发酵。
值得提出的是，在整个细胞生长和发酵的过程中，通气系统，一直通过管道向发酵罐提供细胞生长繁殖所需要的气体，并通过呼吸阀，排出废气。
以下结合第二实施例对本发明利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，做进一步详细描述：
(1)菌液制备：将灵芝细胞在液体培养基中发酵预培养至细胞干质量达到1.0mg/ml；
(2)细胞固定化载体和培养液制备：取细胞固定化载体，洗净，按菌液体积与细胞固定化载体干质量的比例为10ml∶1.5mg，将细胞固定化载体安装在循环式填充床反应器细胞固定化装置的辐条上，121℃灭菌45～60min；同时灭菌配置好的培养液；
(3)细胞固定化：待循环式填充床反应器冷却到室温，控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将菌液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制菌液流向，使菌液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使细胞固定在细胞固定化载体上，菌液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，开始下一轮循环；通过循环液泵控制菌液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为10ml/min；本步骤(3)进行10小时；
(4)第一次发酵培养：控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将灭菌的培养液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制培养液流向，使培养液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使固定在细胞固定化载体上的细胞发酵，培养液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，进入下一轮循环，通过循环液泵控制培养液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为10ml/min；
(5)收集成品：上述步骤(4)之发酵过程进行10个小时后，通过换向阀门控制发酵液从成品液管道流出收集，收集发酵液体积的70％作为成品储存；
(6)循环发酵：补充与步骤(5)中所收集成品液等体积的新鲜培养液，与剩余的发酵液混合，再重复上述步骤(4)和步骤(5)；
(7)重复上述步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)，整个发酵过程持续20天。
上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。
Claims (7)
1.一种利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，所述循环式填充床反应器包括发酵罐、循环系统及通过通气管道与所述发酵罐连通的通气系统，所述发酵罐包括上管道接口和下管道接口，所述酵罐内侧安装有流通管，所述流通管上安装有雾化喷雾头，所述循环系统包括管道装置和细胞固定化装置，所述管道装置包括发酵罐外的循环管道及安装于所述循环管道上的循环液泵，所述循环管道上端与所述发酵罐之上管道接口连通，下端与所述发酵罐之下管道接口连通，所述循环管道还包括成品液管道及补充液管道，所述成品液管道一端与所述循环管道连通，另一端为成品液出口，所述成品液管道与所述循环管道的连接处设有换向阀门，所述补充液管道一端与所述循环管道连通，另一端为补充液接口，所述补充液管道与所述循环管道的连接处设有换向阀门，所述细胞固定化装置位于发酵罐内，包括一中轴，所述中轴上安装至少一层以中轴为中心呈辐射状朝向外的辐条，其特征在于:所述方法包括以下步骤:
(1)菌液制备:将灵芝细胞在液体培养基中发酵预培养至细胞干质量达到0.6～1.2mg/ml；
(2)细胞固定化载体和培养液制备:取细胞固定化载体，洗净，按菌液体积与细胞固定化载体干质量的比例为6～12ml∶1～1.5mg，将细胞固定化载体安装在循环式填充床反应器细胞固定化装置的辐条上，121℃灭菌45～60min；同时灭菌配置好的培养液；
(3)细胞固定化:待循环式填充床反应器冷却到室温，控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将菌液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制菌液流向，使菌液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使细胞固定在细胞固定化载体上，菌液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，开始下一轮循环；通过循环液泵控制菌液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为8～12ml/min；本步骤(3)进行8～12小时；
(4)第一次发酵培养:控制发酵罐内腔温度为26-28℃，常压，和通气状态，将灭菌的培养液从补充液接口导入循环管道，通过换向阀门控制培养液流向，使培养液经循环管道进入流通管，并通过雾化喷雾头向细胞固定化载体喷射，从而使固定在细胞固定化载体上的细胞发酵，培养液在发酵罐底部聚集，经下管道接口再次进入循环管道，进入下一轮循环，通过循环液泵控制培养液的流速，使每个雾化喷雾头的喷射速率为8～12ml/min；
(5)收集成品:上述步骤(4)之发酵过程进行8～12小时后，通过换向阀门控制发酵液从成品液管道流出收集，收集发酵液体积的60-80％作为成品储存；
(6)循环发酵:补充与步骤(5)中所收集成品液等体积的新鲜培养液，与剩余的发酵液混合，再重复上述步骤(4)和步骤(5)；
(7)重复上述步骤(4)、步骤(5)和步骤(6)，整个发酵过程持续18-25天。
2.如权利要求1所述的利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，其特征在于:步骤(1)所用灵芝为紫芝(Ganoderma Sinense)YTZ9k1 CGMCC No.0742。
3.如权利要求1所述的利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，其特征在于:步骤(1)所述细胞干质量达到0.7～1.0mg/ml。
4如权利要求1所述的利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，其特征在于:所述多孔介质细胞固定化载体选自但不限于玉米芯、人造海绵和丝瓜瓤。
5.如权利要求1所述的利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，其特征在于:步骤(2)所述菌液体积与细胞固定化载体干质量的比例为8～10ml∶1～1.5mg。
6.如权利要求1所述的利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，其特征在于:步骤(3)所述喷雾头的喷射速率为9～11ml/min。
7.如权利要求1所述的利用循环式填充床反应器发酵产生灵芝多糖的方法，其特征在于:步骤(4)所述发酵液体积为发酵罐体积的40％-80％。
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