CN110973614A - 一种连续发酵制备灵芝酵素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，具体包括如下步骤：S1、灵芝预处理；S2、灵芝提取液的制备；S3、一次发酵；S4、二次发酵；S5、连续发酵，在灵芝酵素发酵过程前制备灵芝提取液，充分的提取灵芝中含有的活性成分，发酵过程采用连续发酵，有效地缩短了发酵时间，避免现有的发酵过程中存在的杂菌污染的风险，最终制得灵芝多糖、灵芝酸、灵芝有机锗等活性成分含量较高的灵芝酵素。

Description

一种连续发酵制备灵芝酵素的方法

技术领域

本发明属于保健品加工技术领域，具体涉及一种连续发酵制备灵芝酵素的方法。

背景技术

灵芝被我国历代医药学家誉为扶正固本的“瑞草”，对灵芝的药理作用已有大量研究，表明灵芝具有广泛的药理作用，如抗肿瘤作用、免疫调节作用、抗放射与抗化疗作用、镇静安神作用、强心及抗心肌缺血作用、调节血脂作用、降血糖作用、平喘作用、保肝作用、抗缺氧和抗衰老作用等，服用方法多为泡水或泡入酒中饮用。

灵芝的名贵在于它含有丰富的多糖、三萜类物质、腺苷和锗元素，野生灵芝还富含许多如微量元素，但是由于植物细胞的细胞壁由纤维素、半纤维素等构成，其结构致密，采用直接服用的方式不仅费时费力、服用不便，还会导致灵芝中的大多数活性成分难以为人体所吸收，生物利用度低。

酵素，又称为植物综合活性酶，是一种由氨基酸组成的具有特殊生物活性的物质，它存在于所有活的动植物体内，是维持机体正常功能，消化食物，修复组织等生命活动的一种必需物质，酵素可增强人体新陈代谢，清除体内不全代谢产物，迅速活化生理机能，制造新的细胞，是肠道健康的最佳保障，人体内酵素的不足会导致亚健康、衰老加速和疾病的产生，因此，酵素近来成为养生的热门健康食品。国内外酵素发酵的技术工艺较多，共同特征如下：1、生产酵素的原料大多为来自本地的具有某种特殊生理功效成分或高含某种营养素的优质果蔬；2、发酵方式基本上都采用自然发酵或半自然发酵；3、发酵工艺一般采用乳酸菌、酵母菌二次发酵法。

灵芝子实体含有丰富的多糖、三萜物质、氨基酸、核苷酸、醇类、微量元素等有益成分，对灵芝子实体进行酵化处理，不但能有效分离出这些有效成分，还能生成灵芝酵素，制造出含量丰富的浓缩精华液。公开号为CN105935143B的中国专利公开了一种灵芝酵素的制作方法，通过灵芝萃取、液体培养基制备、单体发酵、混合发酵、酶解进行灵芝发酵制得灵芝酵素，有效地释放了灵芝的活性和营养成分，提高了灵芝酵素中灵芝多糖和灵芝三萜类有效活性成分的含量，提高了灵芝酵素的免疫调节功效和抗氧化功效，提高了灵芝酵素的口感和风味，缩短了发酵时间，但是该发明中在灵芝预处理过程中只是利用水提和醇提的方法获得灵芝提取液，无法充分富集灵芝中的活性成分。公开号为CN106692212A的中国专利公开了一种灵芝酵素及其制备工艺，将灵芝子实体粉末与酵素发酵液、糖、纯净水进行综合发酵制得灵芝酵素，制备过程具有简单、实用、适合工业化生产且质量可控。综上所述，现有的灵芝酵素生产工艺较为简单，且生产周期较长，存在着以下缺点：一是酵素的发酵过程需要转换发酵罐或者多次的转接和接种，在这过程中很容易造成腐败菌的滋生或是外界细菌的污染，因为大多都是利用空气中所存在各种微生物所发酵而成，尽管成品是酵素却也不能完全保证无病原菌的污染，容易因为误食导致食物中毒；二是统一的提取、发酵过程控制，对于不同的酵素活性成分无法充分将其将活性保留。制成的灵芝酵素中保留的活性成分偏低。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明旨在提供一种复合发酵灵芝酵素的方法，制得的灵芝酵素能够充分保留灵芝多糖、灵芝酸、灵芝有机锗等活性，同时缩短发酵时间，避免现有的发酵过程中存在的杂菌污染的风险。

本发明的技术方案如下：

一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，具体包括如下步骤：

S1、灵芝预处理：将灵芝置于干燥箱中干燥，干燥温度为40～50℃；干燥后将灵芝破碎，并过筛得到干燥的灵芝粉末；在干燥的灵芝粉末中加入去离子水和脱脂剂，脱脂处理后用滤膜过滤去除脂类，最后在40～50℃下再次干燥灵芝粉末；

S2、灵芝提取液的制备：在干燥的灵芝粉末中加入稀碱溶液进行初次浸提，浸提温度控制在50～60℃，超声处理30～40min；超声处理后利用乙酸调整浸提液的酸碱度至中性，加入改性提取剂与浸提液充分混合进行二次提取；二次提取后在溶液中加入D392阴离子交换树脂，降至室温，振荡30～40min后过滤，将滤液装入萃取釜中，萃取釜中的夹带剂为甲醇，同时向萃取釜内通入二氧化碳，萃取结束后取出萃取液为灵芝提取液；

S3、一次发酵：将制得的灵芝提取液加入到液体培养基中，然后添加乳酸菌于一级发酵罐中进行一次发酵，发酵温度为35～45℃，通入无菌空气进行好氧发酵，在开始发酵当天加入油酸，油酸占发酵液质量的4～8％，当发酵液开始变稠，发酵液中含糖量降至1.5％以下时，一次发酵结束；

S4、二次发酵：一次发酵结束后，放出70～80％的发酵液至二级发酵罐，放出的发酵液作为二次发酵的发酵培养基原液，在发酵培养基原液中加入茶叶提取液、蛋白胨和白糖制成新的发酵培养基后以恒定流速将二级发酵罐中的发酵培养基补加到一级发酵罐中并再次加入乳酸菌，控制稀释速率为0.06～0.65h^-1进行二次发酵，二次发酵的发酵温度降至为25～30℃；

S5、连续发酵：当二次发酵后发酵液中含糖量降至0.3％以下，pH值降至3.0～3.5且发酵液由浑浊变为澄清，以恒定流速放成熟的发酵液至二级发酵罐中，取二级发酵罐中10～20％的成熟发酵液返回至一级发酵罐进行循环连续发酵，二级发酵罐中剩余的成熟发酵液抽出至储料罐中；合计2～5次连续发酵后，成熟发酵液均抽至储料罐中混合形成最终的灵芝酵素。

进一步地，所述脱脂剂为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐中的一种或多种。

进一步地，所述步骤S2中的改性提取剂采用无水乙醇作溶剂，加入占溶剂质量5～8％的改性复合酶、10～15％的维生素C、3～8％的柠檬酸和10～15％的甘油；所述改性提取剂的添加量为浸提液质量的2～4％。

进一步地，所述改性复合酶为固定化纤维素酶和金属离子修饰的蛋白酶的混合物；所述固定化纤维素酶的固定化载体为二氧化硅接枝甲壳胺；所述蛋白酶采用Mg²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺中的一种或多种离子修饰后固定在二氧化硅接枝双醛淀粉上。

进一步地，所述步骤S2中二次提取采用微波与超声波结合的作用进行提取，加入改性提取液后的溶液在微波功率200～500W条件下微波处理100～200s，然后于40～50℃下超声处理40～60s，超声功率为150～200W。

进一步地，所述步骤S3初次发酵的液体培养基包括以下重量份的原料：5-10份葡萄糖、4-12份麸皮、2-5份豆粕汁、1-2份维生素B1、1-3份无机盐、1-3份油酸和200～250份去离子水。

进一步地，所述液体培养基的制备过程具体包括如下步骤：

A1、分别称量葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐，将葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐混合加入至去离子水中，升温至70～80℃，搅拌至固体物全部溶解；

A2、混合液首先置于微射流均质机中经过超高压微射流处理；超高压微射流处理的处理压力为60～160Mpa，处理温度为80～90℃，处理次数为1～3次；经过超高压微射流处理后进行高压灭菌处理。

进一步地，所述步骤S4中茶叶提取液的添加量占发酵培养基原液质量的10～15％、蛋白胨的添加量占发酵培养基原液质量的0.5～1.0％、白糖占发酵培养基原液质量的3～8％。

进一步地，在所述步骤S5连续发酵过程中加入改性复合酶，改性复合酶的添加量为一级发酵罐中发酵液质量的1～2％。

根据本发明一种连续发酵制备灵芝酵素的方法制得的灵芝酵素可分别制成液体酵素原液产品或固体酵素粉末产品。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明在发酵制备酵素的过程前通过对灵芝进行二次提取，针对灵芝中含有的不同活性成分进行分级提取，有利于后续发酵过程更加充分的释放并且保留灵芝中的活性成分；其中，由于灵芝中的有机锗约50％是与多糖、蛋白质等生物等生物大分子结合，约50％是与三萜类物质、氨基酸和肽等小分子结合，因此，利用稀碱溶液进行初次浸提且在超声的帮助下既能能够实现灵芝中大分子的碱性多糖、碱性蛋白以及小分子的氨基酸、肽类的初步提取，也能够同时富集有机锗，另一方面，碱提能够提高灵芝多糖的提取率同时能够保持灵芝多糖对自由基的清除率，进而保证灵芝提取液的抗氧化活性；二次提取过程中加入改性提取剂，改性提取剂由改性复合酶、维生素、柠檬酸和甘油制成，改性复合酶能够辅助灵芝细胞破壁，营造良好的提取环境，维生素C、柠檬酸和甘油有助于吸附提取酸性多糖和酸性蛋白；二次提取后在溶液中加入了D392阴离子交换树脂，D392阴离子交换树脂为大孔吸附树脂，能够吸附去除被提出灵芝中的色素杂质；最后再将利用甲醇作为夹带剂进行超临界CO₂萃取，能够促进三萜类物质的提取，同时甲醇萃取灵芝可以得到酚类化合物，增强抗氧化作用，抑制脂类的过氧化。

2、本发明在灵芝酵素的发酵过程中采取连续发酵，首先，利用连通的一级发酵罐和二级发酵罐甚至连接多级发酵罐，共同完成连续发酵过程能够避免现有技术中二次发酵转换发酵罐或者接种的过程中腐败菌的滋生或是外界细菌的污染，导致酵素的品质受到影响的问题；其次，在本发明连续发酵过程中每一都提取保留前一级的发酵液作为后一级发酵的发酵培养基原液，前一级的发酵液对于后一级的发酵过程具有诱导效应，即使外加新的发酵培养基也能够能够维持发酵的持续性和连续性，极大的缩短发酵时间；最后，连续发酵过程较分批次发酵能够节约反复灭菌，洗罐等非发酵时间，提高生产效率。

3、本发明在连续发酵过程的一次发酵中加入油酸作为发酵的诱导剂，能够充分释放和保留灵芝提取液中三萜类物质，提高灵芝发酵液中三萜类活性物质的含量；在上一级发酵液中添加了茶叶提取液、蛋白胨和白糖制成新的发酵培养基，茶叶提取液与麸皮、蛋白胨配合有利用充分释放和保留灵芝提取液中的灵芝腺苷，提高灵芝发酵液中腺苷的含量；相较于现有技术中在发酵前或发酵后加入酶进行酶解，本发明在连续发酵过程中加入改性复合酶，让酶解和发酵同时进行，灵芝提取液中未被释放的功能性物质在酶解的作用持续释放，同时发酵进一步增强功能性物质发生小分子化，发酵还解决了酶解过程中的反馈抑制作用，提高了最终酵素中的活性成分含量。

4、本发明中的改性复合酶由固定化纤维素酶和金属离子修饰的蛋白酶的混合物，同时经过金属离子修饰的蛋白酶固定在二氧化硅接枝双醛淀粉上，改性复合酶主要由固定化酶混合，相较于游离酶，固定化酶的酶活力能够保持更久，对于需要持续发酵的酵素制备过程具有更好的效果，同时固定化载体为二氧化硅接枝甲壳胺和二氧化硅接枝双醛淀粉，增强纤维酶和蛋白质酶对底物的亲和力，有利于进行酶促反应，有效地减少了纤维素酶和蛋白质酶在固定化后构象的改变，始终维持二者较高的酶活性，同时蛋白质酶利用金属离子进行修饰，经过Mg²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺修饰后的蛋白质酶在热条件下的稳定性增加，酸碱条件的也比未修饰的蛋白质酶的稳定性增加，即使当连续发酵过程中，发酵液的pH不断降低，也不会影响蛋白质酶的活性。

具体实施方式

下面结合较佳实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，具体包括如下步骤：

S1、灵芝预处理：将灵芝置于干燥箱中干燥，干燥温度为40℃；干燥后将灵芝破碎，并过筛得到干燥的灵芝粉末；在干燥的灵芝粉末中加入去离子水和脱脂剂，脱脂处理后用滤膜过滤去除脂类，最后在40℃下再次干燥灵芝粉末；所述脱脂剂为碱金属氢氧化物和碱金属碳酸盐的混合物；

S2、灵芝提取液的制备：在干燥的灵芝粉末中加入稀碱溶液进行初次浸提，浸提温度控制在50℃，超声处理30min；超声处理后利用乙酸调整浸提液的酸碱度至中性，加入改性提取剂与浸提液充分混合进行二次提取；二次提取采用微波与超声波结合的作用进行提取，加入改性提取液后的溶液在微波功率200W条件下微波处理200s，然后于40℃下超声处理60s，超声功率为150W，微波与超声的结合，结合了高能作用和空化作用，促进细胞破裂，活性成分释放；二次提取后在溶液中加入D392阴离子交换树脂，降至室温，振荡30min用于吸附去除提取液中的色素或者脂类等杂质后过滤，将滤液装入萃取釜中，萃取釜压力为30～40MPa，萃取温度为40～50℃，萃取时间为1～2h，萃取釜中的夹带剂为甲醇，同时向萃取釜内通入二氧化碳，二氧化碳的流量为30～35L/h；萃取结束后取出萃取液为灵芝提取液；

S3、一次发酵：将制得的灵芝提取液加入到液体培养基中，然后添加乳酸菌于一级发酵罐中进行一次发酵，发酵温度为35℃，通入无菌空气进行好氧发酵，在开始发酵当天加入油酸，油酸占发酵液质量的4％，当发酵液开始变稠，发酵液中含糖量降至1.5％以下时，一次发酵结束；

S4、二次发酵：一次发酵结束后，放出70％的发酵液至二级发酵罐，放出的发酵液作为二次发酵的发酵培养基原液，在发酵培养基原液中加入茶叶提取液、蛋白胨和白糖制成新的发酵培养基后以恒定流速将二级发酵罐中的发酵培养基补加到一级发酵罐中并再次加入乳酸菌，控制稀释速率为0.06h^-1进行二次发酵，二次发酵的发酵温度降至25℃；二次发酵前，茶叶提取液的添加量占发酵培养基原液质量的10％、蛋白胨的添加量占发酵培养基原液质量的0.5％、白糖占发酵培养基原液质量的3％；

S5、连续发酵：当二次发酵后发酵液中含糖量降至0.3％以下，pH值降至3.0且发酵液由浑浊变为澄清，以恒定流速放成熟的发酵液至二级发酵罐中，取二级发酵罐中10％的成熟发酵液返回至一级发酵罐进行循环连续发酵，二级发酵罐中剩余的成熟发酵液抽出至储料罐中；在连续发酵过程中，每次将后一级的发酵液返回至前一级发酵过程中后均需在发酵罐立加入改性复合酶，改性复合酶的添加量为一级发酵罐中发酵液质量的1％；合计2-5次连续发酵后，成熟发酵液均抽至储料罐中混合形成最终的灵芝酵素。

进一步地，所述步骤S2中的改性提取剂采用无水乙醇作溶剂，加入占溶剂质量5％的改性复合酶、10％的维生素C、3％的柠檬酸和10％的甘油；所述改性提取剂的添加量为浸提液质量的4％；所述改性复合酶为固定化纤维素酶和金属离子修饰的蛋白酶的混合物；所述固定化纤维素酶的固定化载体为二氧化硅接枝甲壳胺；所述蛋白酶采用Mg²⁺修饰后固定在二氧化硅接枝双醛淀粉上。

进一步地，所述步骤S3初次发酵的液体培养基包括以下重量份的原料：5份葡萄糖、12份皮、2份豆粕汁、1份维生素B1、1份无机盐、3份油酸和250份去离子水；所述液体培养基的制备过程具体包括如下步骤：

A1、分别称量葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐，将葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐混合加入至去离子水中，升温至75℃，搅拌至固体物全部溶解；其中，无机盐为钠盐、钙盐、钾盐或镁盐中的一种或多种；

A2、混合液首先置于微射流均质机中经过超高压微射流处理；超高压微射流处理的处理压力为60Mpa，处理温度为80℃，处理次数为1次；经过超高压微射流处理后进行高压灭菌处理；超高压微射流技术通过强烈的剪切力、高速撞击力以及高频振荡，在相对较低的压力条件下达到超高压的作用效果，促进培养基中各种固体物质之间的快速均匀溶解进去离子水中。

实施例2

一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，具体包括如下步骤：

S1、灵芝预处理：将灵芝置于干燥箱中干燥，干燥温度为50℃；干燥后将灵芝破碎，并过筛得到干燥的灵芝粉末；在干燥的灵芝粉末中加入去离子水和脱脂剂，脱脂处理后用滤膜过滤去除脂类，最后在50℃下再次干燥灵芝粉末；所述脱脂剂为碱金属碳酸氢盐；

S2、灵芝提取液的制备：在干燥的灵芝粉末中加入稀碱溶液进行初次浸提，浸提温度控制在60℃，超声处理35min；超声处理后利用乙酸调整浸提液的酸碱度至中性，加入改性提取剂与浸提液充分混合进行二次提取；二次提取采用微波与超声波结合的作用进行提取，加入改性提取液后的溶液在微波功率500W条件下微波处理100s，然后于50℃下超声处理40s，超声功率为200W，微波与超声的结合，结合了高能作用和空化作用，促进细胞破裂，活性成分释放；二次提取后在溶液中加入D392阴离子交换树脂，降至室温，振荡40min用于吸附去除提取液中的色素或者脂类等杂质后过滤，将滤液装入萃取釜中，萃取釜压力为30～40MPa，萃取温度为40～50℃，萃取时间为1～2h，萃取釜中的夹带剂为甲醇，同时向萃取釜内通入二氧化碳，二氧化碳的流量为30～35L/h；萃取结束后取出萃取液为灵芝提取液；

S3、一次发酵：将制得的灵芝提取液加入到液体培养基中，然后添加乳酸菌于一级发酵罐中进行一次发酵，发酵温度为45℃，通入无菌空气进行好氧发酵，在开始发酵当天加入油酸，油酸占发酵液质量的8％，当发酵液开始变稠，发酵液中含糖量降至1.5％以下时，一次发酵结束；

S4、二次发酵：一次发酵结束后，放出80％的发酵液至二级发酵罐，放出的发酵液作为二次发酵的发酵培养基原液，在发酵培养基原液中加入茶叶提取液、蛋白胨和白糖制成新的发酵培养基后以恒定流速将二级发酵罐中的发酵培养基补加到一级发酵罐中并再次加入乳酸菌，控制稀释速率为0.65h^-1进行二次发酵，二次发酵的发酵温度为30℃；茶叶提取液的添加量占发酵培养基原液质量的15％、蛋白胨的添加量占发酵培养基原液质量的1.0％、白糖占发酵培养基原液质量的8％；

S5、连续发酵：当二次发酵后发酵液中含糖量降至0.3％以下，pH值降至3.5且发酵液由浑浊变为澄清，以恒定流速放成熟的发酵液至二级发酵罐中，取二级发酵罐中20％的成熟发酵液返回至一级发酵罐进行循环连续发酵，二级发酵罐中剩余的成熟发酵液抽出至储料罐中；在连续发酵过程中，每次将后一级的发酵液返回至前一级发酵过程中后均需在发酵罐立加入改性复合酶，改性复合酶的添加量为一级发酵罐中发酵液质量的2％；合计2-5次连续发酵后，成熟发酵液均抽至储料罐中混合形成最终的灵芝酵素。

进一步地,所述步骤S2中的改性提取剂采用无水乙醇作溶剂，加入占溶剂质量8％的改性复合酶、15％的维生素C、8％的柠檬酸和15％的甘油；所述改性提取剂的添加量为浸提液质量的2％；所述改性复合酶为固定化纤维素酶和金属离子修饰的蛋白酶的混合物；所述固定化纤维素酶的固定化载体为二氧化硅接枝甲壳胺；所述蛋白酶采用Mg⁺和Zn²⁺修饰后固定在二氧化硅接枝双醛淀粉上。

进一步地，所述步骤S3初次发酵的液体培养基包括以下重量份的原料：10份葡萄糖、4份麸皮、5份豆粕汁、2份维生素B1、3份无机盐、1份油酸和200份去离子水；所述液体培养基的制备过程具体包括如下步骤：

A1、分别称量葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐，将葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐混合加入至去离子水中，升温至70℃，搅拌至固体物全部溶解；其中，无机盐为钠盐、钙盐、钾盐或镁盐中的一种或多种；

A2、混合液首先置于微射流均质机中经过超高压微射流处理；超高压微射流处理的处理压力为160Mpa，处理温度为90℃，处理次数为3次；经过超高压微射流处理后进行高压灭菌处理；超高压微射流技术通过强烈的剪切力、高速撞击力以及高频振荡，在相对较低的压力条件下达到超高压的作用效果，促进培养基中各种固体物质之间的快速均匀溶解进去离子水中。

实施例3

一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，具体包括如下步骤：

S1、灵芝预处理：将灵芝置于干燥箱中干燥，干燥温度为45℃；干燥后将灵芝破碎，并过筛得到干燥的灵芝粉末；在干燥的灵芝粉末中加入去离子水和脱脂剂，脱脂处理后用滤膜过滤去除脂类，最后在45℃下再次干燥灵芝粉末；所述脱脂剂为碱金属氢氧化物；

S2、灵芝提取液的制备：在干燥的灵芝粉末中加入稀碱溶液进行初次浸提，浸提温度控制在55℃，超声处理40min；超声处理后利用乙酸调整浸提液的酸碱度至中性，加入改性提取剂与浸提液充分混合进行二次提取；二次提取采用微波与超声波结合的作用进行提取，加入改性提取液后的溶液在微波功率300W条件下微波处理130s，然后于45℃下超声处理50s，超声功率为170W，微波与超声的结合，结合了高能作用和空化作用，促进细胞破裂，活性成分释放；二次提取后在溶液中加入D392阴离子交换树脂，降至室温，振荡35min后用于吸附去除提取液中的色素或者脂类等杂质后过滤，将滤液装入萃取釜中，萃取釜压力为30～40MPa，萃取温度为40～50℃，萃取时间为1～2h，萃取釜中的夹带剂为甲醇，同时向萃取釜内通入二氧化碳，二氧化碳的流量为30～35L/h；萃取结束后取出萃取液为灵芝提取液；

S3、一次发酵：将制得的灵芝提取液加入到液体培养基中，然后添加乳酸菌于一级发酵罐中进行一次发酵，发酵温度为40℃，通入无菌空气进行好氧发酵，在开始发酵当天加入油酸，油酸占发酵液质量的5％，当发酵液开始变稠，发酵液中含糖量降至1.5％以下时，一次发酵结束；

S4、二次发酵：一次发酵结束后，放出75％的发酵液至二级发酵罐，放出的发酵液作为二次发酵的发酵培养基原液，在发酵培养基原液中加入茶叶提取液、蛋白胨和白糖制成新的发酵培养基后以恒定流速将二级发酵罐中的发酵培养基补加到一级发酵罐中并再次加入乳酸菌，控制稀释速率为0.06h^-1进行二次发酵，二次发酵的发酵温度为28℃；茶叶提取液的添加量占发酵培养基原液质量的12％、蛋白胨的添加量占发酵培养基原液质量的0.8％、白糖占发酵培养基原液质量的5％；

S5、连续发酵：当二次发酵后发酵液中含糖量降至0.3％以下，pH值降至3.5且发酵液由浑浊变为澄清，以恒定流速放成熟的发酵液至二级发酵罐中，取二级发酵罐中15％的成熟发酵液返回至一级发酵罐进行循环连续发酵，二级发酵罐中剩余的成熟发酵液抽出至储料罐中；在连续发酵过程中，每次将后一级的发酵液返回至前一级发酵过程中后均需在发酵罐立加入改性复合酶，改性复合酶的添加量为一级发酵罐中发酵液质量的1％；合计2-5次连续发酵后，成熟发酵液均抽至储料罐中混合形成最终的灵芝酵素。

进一步地，所述步骤S2中的改性提取剂采用无水乙醇作溶剂，加入占溶剂质量6％的改性复合酶、12％的维生素C、5％的柠檬酸和13％的甘油；所述改性提取剂的添加量为浸提液质量的3％；所述改性复合酶为固定化纤维素酶和金属离子修饰的蛋白酶的混合物；所述固定化纤维素酶的固定化载体为二氧化硅接枝甲壳胺；所述蛋白酶采用Zn²⁺修饰后固定在二氧化硅接枝双醛淀粉上。

进一步地，所述步骤S3初次发酵的液体培养基包括以下重量份的原料：8份8葡萄糖、10份麸皮、3份豆粕汁、1份维生素B1、2份无机盐、2份油酸和220份去离子水；所述液体培养基的制备过程具体包括如下步骤：

A1、分别称量葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐，将葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐混合加入至去离子水中，升温至80℃，搅拌至固体物全部溶解；其中，无机盐为钠盐、钙盐、钾盐或镁盐中的一种或多种；

A2、混合液首先置于微射流均质机中经过超高压微射流处理；超高压微射流处理的处理压力为100Mpa，处理温度为85℃，处理次数为2次；经过超高压微射流处理后进行高压灭菌处理；超高压微射流技术通过强烈的剪切力、高速撞击力以及高频振荡，在相对较低的压力条件下达到超高压的作用效果，促进培养基中各种固体物质之间的快速均匀溶解进去离子水中。

根据上述实施例1-3的方法发酵得到的灵芝酵素可分别制成液体酵素原液产品或固体酵素粉末产品。

对比实施例1(CN105935143B)：

(1)灵芝萃取：利用醇提加热法获得灵芝提取液；

(2)制备液体培养基；

(3)单体发酵：将获得的灵芝提取液添加到液体培养基中，再添加乳酸菌，在发酵罐中发酵；另起发酵罐，在发酵罐内发酵果蔬发酵液；

(4)混合发酵：取出单体发酵的灵芝发酵液和果蔬发酵液，然后再添加乳酸菌，进行混合发酵，制得灵芝混合发酵液；

(5)酶解：在灵芝混合发酵液中加入淀粉酶、蛋白酶和纤维素酶进行酶解，酶解后获得灵芝酵素。

对比实施例2：

(1)将灵芝破碎后浸泡于水中，萃取，取清液；

(2)向清液中加入培养基成分后，接入肠膜明串珠菌进行第一发酵，制得第一发酵液；

(3)向果蔬液中加入果胶酶进行酶解，制得酶解果蔬液；

(4)向酶解果蔬液中加入培养基成分后，接入复合乳酸菌进行第二发酵，制得第二发酵液；

(5)向第二发酵液中加入培养基成分后，接入复合酵母菌进行第三发酵，制得第三发酵液；

(6)将第一发酵液和第三发酵液混匀后离心，对离心上清液均质，灭菌后制得灵芝发酵制品。

酵素中灵芝活性成分检测：将根据本发明实施例1、实施例2和实施例3的方法制备得到的灵芝酵素中的活性成分与对比实施例1、对比实施例2制备的灵芝酵素、灵芝发酵制品中的活性成分进行对比，从表1至4中可以看出，依据本发明的方法制得的灵芝酵素中的灵芝三萜类物质、多糖和腺苷相较于现有技术中的灵芝酵素中的成分都有明显的提高，具体数据分析如下表所示：

1、利用DB44/T496-2008《灵芝中三萜类物质的测定》检测灵芝酵素中三萜类物质的含量；

2、利用苯酚硫酸法检测灵芝酵素中多糖的含量；

3、利用高效液相色谱法检测灵芝酵素中腺苷的含量；

4、选用回流下酸消化结合分光光度比色法检测灵芝酵素中有机锗的含量；

表1灵芝酵素中灵芝三萜类物质含量

试样	实施例1	实施例2	实施例3	对比实施例1	对比实施例2
						含量g/100g	10.3	11.2	10.8	8.6	5.4

表2灵芝酵素中多糖的含量

试样	实施例1	实施例2	实施例3	对比实施例1	对比实施例2
						含量g/100g	30.7	30.5	31.1	27.6	10.3

表3灵芝酵素中腺苷的含量

试样	实施例1	实施例2	实施例3	对比实施例1	对比实施例2
						含量mg/100g	4.62	4.46	4.78	3.35	2.91

表4灵芝酵素中有机锗的含量

试样	实施例1	实施例2	实施例3
				含量10<sup>-6</sup>g/100g	5.52	6.28	5.71

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

S1、灵芝预处理：将灵芝置于干燥箱中干燥，干燥温度为40~50℃；干燥后将灵芝破碎，并过筛得到干燥的灵芝粉末；在干燥的灵芝粉末中加入去离子水和脱脂剂，脱脂处理后用滤膜过滤去除脂类，最后在40~50℃下再次干燥灵芝粉末；

S2、灵芝提取液的制备：在干燥的灵芝粉末中加入稀碱溶液进行初次浸提，浸提温度控制在50~60℃，超声处理30~40min；超声处理后利用乙酸调整浸提液的酸碱度至中性，加入改性提取剂与浸提液充分混合进行二次提取；二次提取后在溶液中加入D392阴离子交换树脂，降至室温，振荡30~40min后过滤，将滤液装入萃取釜中，萃取釜中的夹带剂为甲醇，同时向萃取釜内通入二氧化碳，萃取结束后取出萃取液为灵芝提取液；

S3、一次发酵：将制得的灵芝提取液加入到液体培养基中，然后添加乳酸菌于一级发酵罐中进行一次发酵，发酵温度为35~45℃，通入无菌空气进行好氧发酵，在开始发酵当天加入油酸，油酸占发酵液质量的4~8%，当发酵液开始变稠，发酵液中含糖量降至1.5%以下时，一次发酵结束；

S4、二次发酵：一次发酵结束后，放出70~80%的发酵液至二级发酵罐，放出的发酵液作为二次发酵的发酵培养基原液，在发酵培养基原液中加入茶叶提取液、蛋白胨和白糖制成新的发酵培养基后以恒定流速将二级发酵罐中的发酵培养基补加到一级发酵罐中并再次加入乳酸菌，控制稀释速率为0.06~0.65h^-1进行二次发酵，二次发酵的发酵温度降至25~30℃；

S5、连续发酵：当二次发酵后发酵液中含糖量降至0.3%以下，pH值降至3.0~3.5且发酵液由浑浊变为澄清，以恒定流速放成熟的发酵液至二级发酵罐中，取二级发酵罐中10~20%的成熟发酵液返回至一级发酵罐进行循环连续发酵，二级发酵罐中剩余的成熟发酵液抽出至储料罐中；合计2~5次连续发酵后，成熟发酵液均抽至储料罐中混合形成最终的灵芝酵素。

2.如权利要求1所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：所述脱脂剂为碱金属氢氧化物、碱金属碳酸盐或碱金属碳酸氢盐中的一种或多种。

3.如权利要求1所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：所述步骤S2中的改性提取剂采用无水乙醇作溶剂，加入占溶剂质量5~8%的改性复合酶、10~15%的维生素C、3~8%的柠檬酸和10~15%的甘油；所述改性提取剂的添加量为浸提液质量的2~4%。

4.如权利要求3所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：所述改性复合酶为固定化纤维素酶和金属离子修饰的蛋白酶的混合物；所述固定化纤维素酶的固定化载体为二氧化硅接枝甲壳胺或二氧化硅接枝；所述蛋白酶采用Mg²⁺、Ca²⁺或Zn²⁺中的一种或多种离子修饰后固定在二氧化硅接枝双醛淀粉上。

5.如权利要求1所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：所述步骤S2中二次提取采用微波与超声波结合的作用进行提取，加入改性提取剂后的溶液在微波功率200~500W条件下微波处理100~200s，然后于40~50℃下超声处理40~60s，超声功率为150~200W。

6.如权利要求1所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：所述步骤S3初次发酵的液体培养基包括以下重量份的原料：5-10份 葡萄糖、4-12份麸皮、2-5份 豆粕汁、1-2份 维生素B1、1-3份无机盐、1-3份 油酸和200~250份 去离子水。

7.如权利要求6所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于，所述液体培养基的制备过程具体包括如下步骤：

A1、分别称量葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐，将葡萄糖、麸皮、豆粕汁、维生素B1和无机盐混合加入至去离子水中，升温至70~80℃，搅拌至固体物全部溶解；

A2、混合液首先置于微射流均质机中经过超高压微射流处理；超高压微射流处理的处理压力为60~160Mpa，处理温度为80~90℃，处理次数为1~3次；经过超高压微射流处理后进行高压灭菌处理。

8.如权利要求1所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：所述步骤S4中茶叶提取液的添加量占发酵培养基原液质量的10~15%、蛋白胨的添加量占发酵培养基原液质量的0.5~1.0%、白糖占发酵培养基原液质量的3~8%。

9.如权利要求1所述的一种连续发酵制备灵芝酵素的方法，其特征在于：在所述步骤S5连续发酵过程中加入改性复合酶，改性复合酶的添加量为一级发酵罐中发酵液质量的1~2%。

10.如权利要求1至9任一所述的连续发酵制备灵芝酵素的方法制得的灵芝酵素可分别制成液体酵素原液产品或固体酵素粉末产品。