CN106834392A - 一种从液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽的方法 - Google Patents

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孙勇
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Abstract

本发明公开了一种液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽的方法。它包括以下步骤：A:芝深层发酵培养，B、将7吨发酵罐中的灵芝发酵原液升温，加入酸性纤维素酶，搅拌酶解3~4小时，得到灵芝酶解液；C、将上述灵芝酶解液降至40~45℃，并加入质量浓度为10%的NaOH溶液；D、板框压滤：将所述步骤C酶解灵芝混合液取出；E、采用孔径1~8nm的膜过滤步骤D的灵芝酶解原液，收集透过液，向截留液中加水稀释后再过滤，F、将步骤E得到的精制液，蒸发浓缩至固含量为35~55%真空干澡或喷雾干燥得到灵芝肽粉。本发明的有益效果在于：在深层发酵灵芝后处理工艺简单，设计合理，加工灵活。酶解提取的灵芝肽分子量小，可以做为新一代低聚肽原料，实现了深层发酵灵芝高值化利用。

Description

一种从液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽的方法
技术领域
本发明涉及液体深层发酵灵芝有效成份提取技术，具体地说是一种从从液体深层发酵灵芝（含灵芝发酵液和灵芝菌丝体）中提取灵芝肽的方法。
背景技术
灵芝被我国历代医药学家誉为扶正固本的“瑞草”，对灵芝的药理作用已有大量研究，研究表明灵芝具有广泛的药理作用，如抗肿瘤作用、免疫调节作用、抗放射与抗化疗作用、镇静安神作用、强心及抗心肌缺血作用、调节血脂作用、降血糖作用、平喘作用、保肝作用、抗缺氧和抗衰老作用等。随着现代科学对灵芝研究的深入，至目前为止，总共分离到350余种化学成分，主要是多糖类、肽类、氨基酸类、萜类、生物碱类、甾醇类、维生素类等。
人体很多活性物质都是以肽的形式存在的。肽涉及人体的激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统和细胞的生理功能，激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应。肽是涉及人体内多种细胞功能的重要物质。肽可以合成细胞，并调节细胞的功能活动。肽在人体作为神经递质，传递信息。肽可在人体作为运输工具，将人体所食的各种营养物质与各种维生素、生物素、钙及对人体有益的微量元素输送到人体各细胞、器官和组织。肽是人体重要的生理调节物，它可全面调节人体生理功能，增强和发挥人体生理活性，它具有重要的生物学功能。肽对人的细胞活性、功能活动、生命存在太重要了。
其中运用液体深层发酵技术生产的灵芝菌丝中含有非常丰富的活性多肽，其含量是栽培灵芝子实体和灵芝孢子粉的5~10倍。从液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽，具有非常可观的经济价值，现有技术中还不存在该提取的技术。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种通过多种复合酶解处理，经膜过滤、干燥获得高纯度灵芝肽粉的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法。
为了解决上述技术问题，本发明的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，包括以下步骤：
A:芝深层发酵培养
a、灵芝菌种培养：培养温度为25～26℃，
取灵芝菌种在菌种培养基中培养20～30天；
b、摇床种：保持温度在25～26℃，在30L搅拌罐中装入所述步骤1)中培养有灵芝菌种的菌种培养基，用水稀释，然后置于振荡器上，搅拌3～4天，控制搅拌速度为100～120转/min；
c、一级放大：保持温度在25～26℃，将所述步骤b中稀释搅拌后的培养基负压吸入300L种子罐中，培养2～3天；
d、二级放大：保持温度在25～26℃，将所述步骤c中搅拌后的培养基负压吸入1.5吨的种子罐中，培养2～3天；
e、发酵培养：保持温度在25～26℃，将所述步骤d中培养后的培养基负压吸入7吨的发酵罐中，并加入发酵培养基发酵;
待达到以下标准时，发酵结束：
a)、待灵芝菌丝上无明显芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象发生时；
b)、菌丝湿重达到15～20％；
c)、发酵原液的pH值为3.0～3.5；
B、将7吨发酵罐中的灵芝发酵原液升温至45~55℃，加入20000u/g的酸性纤维素酶，加入量为发酵罐实际装量的0.0001~0.0004%，搅拌酶解3~4小时，得到灵芝酶解液；
C、将上述灵芝酶解液降至40~45℃，并加入质量浓度为10%的NaOH溶液，调节pH至7.0~9.0，加入发酵罐实际装量的0.006~0.012%的复合蛋白酶，搅拌酶解3~5小时，升温至85~95℃，灭酶活10~30分钟；
D、板框压滤：将所述步骤C酶解灵芝混合液取出，用50～60kg的压力压滤，除去固体物，得到灵芝酶解原液；
E、采用孔径1~8nm的膜过滤步骤D的灵芝酶解原液，收集透过液，向截留液中加水稀释后再过滤，重复4~6次，合并收集的透过液，将所述的透过液进行电渗析至液体电导率小于30μs/㎝２、活性炭精制、脱炭，得到精制液。
F、将步骤E得到的精制液，蒸发浓缩至固含量为35~55%真空干澡或喷雾干燥得到灵芝肽粉。
按质量百分数计，所述发酵培养基的配方组成为：玉米粉1～3％、蔗糖2～4％、磷酸二氢钾0.01～0.02％、硫酸铵0.2～0.3％、酵母粉0.2～0.4％、豆油0.05～0.1％、余量为水；
所述得复合蛋白酶的质量组成为：
10万u/g的中性蛋白酶35%
20万u/g的碱性蛋白酶 35%
10万u/g胰蛋白酶 10%
10万u/g的木瓜蛋白酶15%
10万u/g的糖肽酶 5%
所述步骤E中，电渗析的操作条件为：电压75V，进所述透过液流速为1.2吨/小时，浓水流速为1.25吨/小时，电极冷却水流速为1吨/小时。
所述菌种培养基的配方组成为：马铃薯200～250g、葡萄糖20～25g、磷酸二氢钾3～4g、七水硫酸镁1.5～2g、维生素B110～20mg、琼脂18～20g、水1000ml。
本发明的有益效果在于：
1、本发明采用20000u/g的酸性纤维素酶对灵芝发酵混合液进行酶解，将灵芝菌丝的细胞壁酶解破碎，有利于进一步提取灵芝多肽。
2、本发明采用的复合蛋白酶可有效的将蛋白质酶解成小分子肽，对灵芝酶解收率达90%以上，分子量小于2000Da的小分子肽含量占95%以上。
3、本发明采用膜分离获得的透过液，采用电渗析法除去透过液中的残留的无机离子，保留了小分子肽。
4、本发明在深层发酵灵芝后处理工艺简单，设计合理，加工灵活。酶解提取的灵芝肽分子量小，可以做为新一代低聚肽原料，实现了深层发酵灵芝高值化利用。
具体实施方式
以下实例是本发明的进一步说明：
实施例一、
一种从液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽的方法，包括如下步聚：
1)、灵芝菌种培养：培养温度为25～26℃，
取灵芝菌种在菌种培养基中培养20～30天，所述菌种培养基的配方组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、磷酸二氢钾3g、七水硫酸镁1.5g、维生素B110mg、琼脂18g、水1000ml；
2)、摇床种：保持温度在25～26℃，在30L搅拌罐中装入所述步骤1)中培养有灵芝菌种的菌种培养基，用水稀释，然后置于振荡器上，搅拌3～4天，控制搅拌速度为100～120转/min；
3)、一级放大：保持温度在25～26℃，将所述步骤2)中稀释搅拌后的培 养基负压吸入一300L种子罐中，培养2～3天；
4)、二级放大：保持温度在25～26℃，将所述步骤3)中搅拌后的培养基负压吸入一1.5吨的种子罐中，培养2～3天；
5)、发酵培养：保持温度在25～26℃，将所述步骤4)中培养后的培养基负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入发酵培养基发酵，
按质量百分数计，所述发酵培养基的配方组成为：玉米粉1％、蔗糖2％、磷酸二氢钾0.01％、硫酸铵0.2％、酵母粉0.2％、豆油0.05％、余量为水；
待达到以下标准时，发酵结束：
a)、待灵芝菌丝上无明显芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象发生时；
b)、菌丝湿重达到15％；
c)、培养基的pH值为3.0～3.5；
2、将7吨发酵罐中的灵芝发酵原液升温至55℃，加入10g的20000u/g的酸性纤维素酶，搅拌酶解4小时，得到灵芝酶解液；
3、将上述灵芝酶解液降至45℃，并加入质量浓度为10%的NaOH溶液，调节pH至7.6，加入发酵罐实际装量的500g的复合蛋白酶（10万u/g的中性蛋白酶175g；20万u/g的碱性蛋白酶175g；10万u/g的胰蛋白酶50g；20万u/g的木瓜蛋白酶75g；10万u/g的糖肽酶25g），搅拌酶解3.5小时，升温至90℃，灭酶30分钟；
4、板框压滤：将所述步骤3酶解灵芝混合液取出，用55kg的压力压滤，除去固体物，得到灵芝酶解原液；
5、采用孔径4nm的膜过滤步骤4的灵芝酶解原液，收集透过液，向截留液中加纯水稀释后再过滤，重复3次，合并收集的透过液，将所述的透过液进行电渗析至液体电导率小于30μs/㎝２、（电渗析的操作条件为：电压75V，进所述透过液流速为1.2吨/小时，浓水流速为1.25吨/小时，电极冷却水流速为1吨/小时）活性炭精制、脱炭，得到精制液。蒸发浓缩至固含量为55%真空干澡得13.5kg灵芝肽粉，测得多肽含量为85%，其中分子量小于2000Da的小分子肽占多肽含量的90.6%。
实施例二、
一种从液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽的方法，包括如下步聚：
1)、灵芝菌种培养：培养温度为25～26℃，
取灵芝菌种在菌种培养基中培养20～30天，所述菌种培养基的配方组成为：马铃薯250g、葡萄糖25g、磷酸二氢钾4g、七水硫酸镁2g、维生素B120mg、琼脂20g、水1000ml；
步骤2)～步骤4)如同实施例1；
5)、发酵培养：保持温度在25～26℃，将所述步骤4)中培养后的培养基负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入发酵培养基发酵，
按质量百分数计，所述发酵培养基的配方组成为：玉米粉3％、蔗糖4％、磷酸二氢钾0.02％、硫酸铵0.3％、酵母粉0.4％、豆油0.1％、余量为水；
待达到以下标准时，发酵结束：
a)、待灵芝菌丝上无明显芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，茵丝有自溶现象发生时；
b)、菌丝湿重达到20％；
c)、培养基的pH值为3.0～3.5；
2、将7吨发酵罐中的灵芝发酵原液升温至60℃，加入15g的20000u/g的酸性纤维素酶，搅拌酶解3.5小时，得到灵芝酶解液；
3、将上述灵芝酶解液降至45℃，并加入质量浓度为10%的NaOH溶液，调节pH至7.0，加入发酵罐实际装量的600g的复合蛋白酶（10万u/g的中性蛋白酶210g；20万u/g的碱性蛋白酶210g；10万u/g的胰蛋白酶60g；20万u/g的木瓜蛋白酶90g；10万u/g的糖肽酶30g），搅拌酶解4小时，升温至90℃，灭酶30分钟；
4、板框压滤：将所述步骤3酶解灵芝混合液取出，用60kg的压力压滤，除去固体物，得到灵芝酶解原液；
5、采用孔径2nm的膜过滤步骤4的灵芝酶解原液，收集透过液，向截留液中加纯水稀释后再过滤，重复4次，合并收集的透过液，将所述的透过液进行电渗析至液体电导率小于30μs/㎝２、（电渗析的操作条件为：电压75V，进所述透过液流速为1.2吨/小时，浓水流速为1.25吨/小时，电极冷却水流速为1吨/小时）活性炭精制、脱炭，得到精制液。蒸发浓缩至固含量为50%真空干澡得11.8kg灵芝肽粉，测得多肽含量为89.4%，其中分子量小于2000Da的小分子肽占多肽含量的91.3%。
实施例三、
一种从液体深层发酵灵芝中提取灵芝肽的方法，包括如下步聚：
1)、灵芝菌种培养：培养温度为25～26℃，
取灵芝菌种在菌种培养基中培养20～30天，所述菌种培养基的配方组成为：马铃薯225g、葡萄糖22.5g、磷酸二氢钾3.5g、七水硫酸镁1.7g、维生素B115mg、琼脂19g、水1000ml；
步骤2)～步骤4)如同实施例1；
5)、发酵培养：保持温度在25～26℃，将所述步骤4)中培养后的培养基负压吸入一7吨的发酵罐中，并加入发酵培养基发酵，
按质量百分数计，所述发酵培养基的配方组成为：玉米粉2％、蔗糖3％、磷酸二氢钾0.015％、硫酸铵0.25％、酵母粉0.3％、豆油0.07％、余量为水；
待达到以下标准时，发酵结束：
a)、待灵芝菌丝上无明显芽头和锁状联合现象，且茵丝变细，茵丝原生质凝集，菌丝有自溶现象发生时；
b)、茵丝湿重达到17％；
c)、培养基的pH值为3.0～3.5；
2、将7吨发酵罐中的灵芝发酵原液升温至50℃，加入12g的20000u/g的酸性纤维素酶，搅拌酶解3小时，得到灵芝酶解液；
3、将上述灵芝酶解液降至40℃，并加入质量浓度为10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加入发酵罐实际装量的550g的复合蛋白酶（10万u/g的中性蛋白酶192.5g；20万u/g的碱性蛋白酶192.5g；10万u/g的胰蛋白酶55g；20万u/g的木瓜蛋白酶82.5g；10万u/g的糖肽酶27.5g），搅拌酶解4小时，升温至90℃，灭酶30分钟；
4、板框压滤：将所述步骤3酶解灵芝混合液取出，用60kg的压力压滤，除去固体物，得到灵芝酶解原液；
5、采用孔径5nm的膜过滤步骤4的灵芝酶解原液，收集透过液，向截留液中加纯水稀释后再过滤，重复4次，合并收集的透过液，将所述的透过液进行电渗析至液体电导率小于30μs/㎝２、（电渗析的操作条件为：电压75V，进所述透过液流速为1.2吨/小时，浓水流速为1.25吨/小时，电极冷却水流速为1吨/小时）活性炭精制、脱炭，得到精制液。蒸发浓缩至固含量为55%真空干澡得15.4kg灵芝肽粉，测得多肽含量为82.6%，其中分子量小于2000Da的小分子肽占多肽含量的89.8%。
本发明充分利用了液体深层发酵技术培养灵芝发酵原液经处理后，通过多种复合酶解处理，经膜过滤、干燥获得高纯度灵芝肽粉。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

Claims (8)

1.一种液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，包括以下步骤：
A:芝深层发酵培养
a、灵芝菌种培养：培养温度为25～26℃，
取灵芝菌种在菌种培养基中培养20～30天；
b、摇床种：保持温度在25～26℃，在30L搅拌罐中装入所述步骤1)中培养有灵芝菌种的菌种培养基，用水稀释，然后置于振荡器上，搅拌3～4天，控制搅拌速度为100～120转/min；
c、一级放大：保持温度在25～26℃，将所述步骤b中稀释搅拌后的培养基负压吸入300L种子罐中，培养2～3天；
d、二级放大：保持温度在25～26℃，将所述步骤c中搅拌后的培养基负压吸入1.5吨的种子罐中，培养2～3天；
e、发酵培养：保持温度在25～26℃，将所述步骤d中培养后的培养基负压吸入7吨的发酵罐中，并加入发酵培养基发酵;
B、将7吨发酵罐中的灵芝发酵原液升温至45~55℃，加入20000u/g的酸性纤维素酶，加入量为发酵罐实际装量的0.0001~0.0004%，搅拌酶解3~4小时，得到灵芝酶解液；
C、将上述灵芝酶解液降至40~45℃，并加入质量浓度为10%的NaOH溶液，调节pH至7.0~9.0，加入发酵罐实际装量的0.006~0.012%的复合蛋白酶，搅拌酶解3~5小时，升温至85~95℃，灭酶活10~30分钟；
D、板框压滤：将所述步骤C酶解灵芝混合液取出，用50～60kg的压力压滤，除去固体物，得到灵芝酶解原液；
E、采用孔径1~8nm的膜过滤步骤D的灵芝酶解原液，收集透过液，向截留液中加水稀释后再过滤，重复4~6次，合并收集的透过液，将所述的透过液进行电渗析至液体电导率小于30μs/㎝２、活性炭精制、脱炭，得到精制液；
F、将步骤E得到的精制液，蒸发浓缩至固含量为35~55%真空干澡或喷雾干燥得到灵芝肽粉。
2.按照权利要求1所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：按质量百分数计，所述发酵培养基的配方组成为：玉米粉1～3％、蔗糖2～4％、磷酸二氢钾0.01～0.02％、硫酸铵0.2～0.3％、酵母粉0.2～0.4％、豆油0.05～0.1％、余量为水。
3.按照权利要求1或2所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：所述得复合蛋白酶的质量组成为：
10万u/g的中性蛋白酶35%
20万u/g的碱性蛋白酶 35%
10万u/g胰蛋白酶 10%
10万u/g的木瓜蛋白酶15%
10万u/g的糖肽酶 5%。
4.按照权利要求3所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：所述步骤E中，电渗析的操作条件为：电压75V，进所述透过液流速为1.2吨/小时，浓水流速为1.25吨/小时，电极冷却水流速为1吨/小时。
5.按照权利要求4所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：所述步骤A中e工序中，待达到以下标准时，发酵结束：待灵芝菌丝上无明显芽头和锁状联合现象，且菌丝变细，菌丝原生质凝集，菌丝有自溶现象发生时。
6.按照权利要求4所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：所述步骤A中e工序中，待达到以下标准时，发酵结束：菌丝湿重达到15～20％。
7.按照权利要求4所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：所述步骤A中e工序中，待达到以下标准时，发酵结束：发酵原液的pH值为3.0～3.5。
8.按照权利要求7所述的液体深层发酵灵芝后提取灵芝肽的方法，其特征在于：所述步骤A中菌种培养基的配方组成为：马铃薯200～250g、葡萄糖20～25g、磷酸二氢钾3～4g、七水硫酸镁1.5～2g、维生素B110～20mg、琼脂18～20g、水1000ml。
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