CN107502556B - 一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，将食用菌菌丝或子实体，在外加电磁场辅助下进行种子液培养，然后将种子液菌体进行固定化并使其带有磁性，将固定化的菌体，在高压脉冲电场的辅助下进行深层发酵。通过本发明所得到的食用菌活性物质具有以下优点：食用菌有效成分提取充分，生产周期大大减少。固定化菌体可进行多次发酵，磁性固定化菌体有利于产物的分离和纯化，降低下游技术的负担；改善了普通工艺提取食用菌活性物质存在的周期长、有效成分利用率低、染菌多等问题，为后续多元化生产提供技术基础。

Description

一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，具体的说涉及一种发酵技术提取食用菌活性物质的方法。
背景技术
食用菌作为一种兼备食用和药用双重功效的高等真菌，是最具潜力的微生物种类之一。食用菌子实体栽培历史悠久，但人工栽培时间长、技术复杂、受季节和原料的限制，因此，食用菌液体深层发酵技术应运而生。食用菌深层发酵目标产物有2个：一是液体菌种，代替固体菌种投入生产获得子实体；二是菌丝体及其代谢产物，获得子实体无法产生或含量高于子实体的生理活性物质。
磁场可以影响细胞的正常生理功能，利用磁化的溶液配制培养基对酵母细胞进行培养，与未用磁化溶液进行培养的相比酵母细胞数明显增多；利用较低磁感应强度培养红豆杉细胞，发现其细胞活力明显提高，次级代谢有所增强，可见合适的磁场对细胞具有正作用。但目前磁场辅助发酵存在生产周期长的问题。发明专利CN201310025724.7公开的一种高活菌含量复合微生物颗粒肥及其制备方法，利用微生物在液体深层发酵达到营养体数最多时，将物料导入3724高斯的磁场环境中驯化13小时，大大提高了有益菌的抗逆性能和保存时间。
高压脉冲电场是近年来一种新型的食品加工技术，它是将液态的样品溶液充当电解质，在电场中与容器绝缘的两个电极会产生高压电流，具有电脉冲作用，从而对食品进行连续的非热加工处理，目前主要用于食品杀菌方面，采用高压脉冲电场技术提取的物质理化结构、口感、风味等不容易被改变，并具有提取温度低，时间短、耗能低并且高效的特点。近年来，国内外利用高压脉冲电场技术提取食品中的有效成分，如多糖、蛋白质、DNA、可溶性钙、色素及维生素等。发明专利CN201610169995.3公开的一种复合真菌多糖及其组合物的功能性食品，利用高压脉冲电场对原料进行处理，提高多糖得率。研究发现，一定范围内电场强度的脉冲电场可以改变细胞膜的通透性，有利于细胞对外界物质的吸收以及细胞内容物的渗出，但是长时间的高压电场作用会是细胞破裂死亡，这对发酵是不利的。
固定化细胞技术最早用于发酵技术，该技术在一定程度上保护细胞免受发酵过程中的机械搅拌剪切损伤、增加细胞浓度和发酵强度、为实现细胞与产物分离提供便利；细胞固定化后细胞密度大、反应速度快、耐毒能力强、能实现连续操作，可大大提高生产能力。发明专利CN201610552601.2公开的一种温控性相变材料微胶囊载体固定化酶及其制备方法，解决传统载体固定化酶适用工作温度范围窄及储存稳定性、热稳定性和循环稳定性差的问题，使所固定酶的稳定性和活性得到显著提高。
发明内容
本发明针对目前深层发酵提取食用菌活性物质存在的工艺复杂，有效成分利用率低的问题，提供了一种连续深层发酵提取食用菌活性物质方法，本发明以磁场、微胶囊固定化技术，配合高压脉冲电场辅助进行深层发酵，操作简单，不仅可以缩短培养周期，获得高产、抗逆性强的菌体，还可以使食用菌有效成分得到充分提取，降低发酵过程中细胞死亡数，提高生产次数，实现连续操作，减少生产周期，具有很大的发展前景。
本发明的技术方案如下：
一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，包括以下步骤：
A1：取食用菌菌丝或子实体，洗净，干燥至水分含量为6~8%后，将其粉碎至100~120目获得粉末，将粉末与水按料液比1：（40~60）混合均匀，灭菌后得到种子料；
A2：取将A1所得种子料在无菌条件下按15~20%的接种量接种至灭菌后的种子液培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场培养24~96小时，培养温度23~25℃，得种子液；
A3：将A2所得种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化20~30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤2~3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200~230rpm转速下振荡15~30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
所述的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料加入到20~25mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得；所述壁材溶液浓度为0.8~1.2mg/ml；所述的氯化钙溶液浓度为18~22mg/ml；所述混合液与氯化钙溶液体积比为1：（1.5~2）；所述磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：（5~10）；
A4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的60~80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10~12%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.2~6.2，控制深层发酵温度为22~25℃，无菌空气通气量为2.0~2.2m3/min，搅拌速度50~100r/min，罐压38~45kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵72~168小时后，排出深层发酵醪液；
A5：将A4所得发酵醪液，过滤后，即可得到含有食用菌活性物质的溶液。
所述磁性材料是一些磁性微粒，具有饱和磁强度低但稳定性好的材料，可选作磁性微粒的仅有少数几种，主要有金属氧化物γ-Fe2O3，MeFe2O4（Me=Co，Mn，Ni），Fe3O4，金属Ni、Co、Fe及其合金Fe-Co、Ni-Fe等；本发明使用Fe3O4。
所述壁材溶液，是能够在水溶液中与海藻酸钠等阴离子聚电解质发生络合反应，形成由聚电解质络合物构成的高分子膜；主要用于壁材溶液制备的物质有蛋白质类、植物胶类、无机盐类、聚赖氨酸、壳聚糖、聚二甲基二烯丙基氯化铵、纤维素硫酸钠、聚亚甲基二胍等，本发明使用壳聚糖制备壁材溶液。
本发明实现的技术原理是：添加有利于菌体生长以及有利于胞内物质合成的复合氨基酸于培养基中，提高菌体生长和胞内物质合成的速度；磁场和高压脉冲电场的作用，不仅可以大幅度促进菌体生长，还能提高细胞代谢活动，增加细胞膜的通透性；此外，微胶囊化的菌体，降低了外界物质浓度的提高对菌体的影响，更有利于菌体生长及胞内物质的释放；该深层发酵体系中，微胶囊化菌体能在高强度的电场作用下持续发酵；与用游离菌体进行深层发酵相比，微胶囊化的菌体还可多次利用，易于分离，提高生产效率。
作为本发明的进一步改进，所述食用菌可为银耳、灵芝、冬虫夏草、香菇、松乳菇、猴头菇、金针菇、茯苓。
作为本发明的进一步改进，所述种子液培养基pH为5~7，含有以下重量分数比的组分：葡萄糖30~40份、蛋白胨15~25份、促进剂0.1~0.3份，KH2PO40.8~1.2份、MgSO4•7H2O0.5~1份、组合氨基酸Ⅱ0.9~1.1份。
所述促进剂为酵母粉、VB2、VB6、橄榄油、茶叶提取物、蚕蛹粉中一种或一种以上组合；所述复合氨基酸为先加入0.5~0.6份谷氨酸和甘氨酸1:1组合量，再加入0.4~0.5份甘氨酸和丝氨酸1:1组合量。所述组合氨基酸Ⅱ为先加入谷氨酸和甘氨酸1:1组合0.5~0.6份，再加入甘氨酸和丝氨酸1:1组合0.4~0.5份。
作为本发明的进一步改进，所述深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：碳源3~5%、氮源0.15~0.3%、大豆分离蛋白3~5%、矿物质盐0.6~0.9%、促进剂1~1.8%、生长因子2~4%、组合氨基酸Ⅰ0.5~0.7%。
所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、玉米粉、山芋粉、豆粕、可溶性淀粉中一种或一种以上组合。
所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、黄豆饼粉、麦麸、玉米粉、尿素、硫酸铵、硝酸钾中一种或一种以上组合。
所述的矿物质盐为硫酸亚铁、氯化钠、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸锌、氯化锌中一种或一种以上组合。
所述促进剂为VB2、VB6、茶叶提取物、垂盆草粉末、板蓝根粉末中一种或一种以上组合。
所述生长因子为蜂花粉、玉米粉、山茶油、枸杞粉中一种或一种以上组合。
所述的组合氨基酸Ⅰ为谷氨酸与甘氨酸1:1组合。
作为本发明的进一步改进，所述的电磁场为铜线绕屏蔽罩形成螺线管，将铜线与整流器、调压器、电源连接形成电磁场产生装置，将种子液放置于屏蔽罩内培养，通过调压器改变电压以改变磁感应强度。培养种子液的磁感应强度为10~20mT，磁场作用时间为5~20min/h。
作为本发明的进一步改进，所述磁性载菌体微胶囊的制备所用的磁性材料为Fe3O4粉末，在磁性海藻酸钠溶液中含量为0.004~0.006g/ml。
作为本发明的进一步改进，所述的壁材溶液浓度为0.8~1.2mg/ml，由4~6万分子量的壳聚糖溶于体积比为1%的醋酸溶液中制备而得。
作为本发明的进一步改进，所述磁性载菌体微胶囊的制备，利用蠕动泵与多个并行注射器组合，构成半自动滴加装置，注射器针头为特制锐孔孔径针头，锐孔孔径为420~460μm之间，制得的微胶囊直径在300~450μm之间。
作为本发明的进一步改进，所述高压脉冲电场设置于发酵罐中，在发酵罐内壁相对位置由两块平行电极板组成，电极板与发酵罐罐壁平行，电极板的大小可以根据发酵罐实际容积进行调节并安装，电极板高度要超过发酵液液面，保证发酵液能充分在电场中，两平板电极分别与罐体外脉冲发生仪的正、负两极相连，脉冲发生仪连接电源装置构成高压脉冲电场发生装置；所述的高压脉冲电场电场频率为40~60Hz，脉宽20~60μs，电场强度20~50v/m，电场作用时间为20~40min。
作为本发明的进一步改进，所述的可调节电磁场为通电导线产生的磁场；在发酵罐外壁设置有大直径导线，导线与地面垂直贴于罐壁，导线两端连接可调节电压的电源；深层发酵进行时关闭电源不产生磁场，深层发酵结束时，打开电源，通过调节电压大小来调节磁场强度。由于Fe3O4磁性粒子的引入，通过向发酵设备通入电磁场，使磁性微球携带细胞定向移动并附着在发酵罐罐壁上，排出发酵醪液后，通入新的深层发酵培养基，取消电磁场，在Fe3O4超顺磁性作用下，微球重新良好悬浮于新鲜培养液中，进行二次发酵，从而实现发酵过程中代谢产物与固定化细胞的在线、快速和连续化分离操作。
本技术方案具有以下的优点：
1.复合氨基酸提高菌体生长速度以及胞内物质的合成，缩短了连续深层发酵的周期；磁场作用大幅加快了菌体生长速度，高压脉冲电场增强了细胞代谢活动，加大细胞膜通透性，使胞内物质分泌更加充分；利用本发明获得的食用菌活性组分比普通深层发酵获得的活性组分含量更高。
2.微胶囊化菌体进行深层发酵，保护了菌体细胞在高压脉冲电场中不破碎，降低了外界物质浓度对菌体生长及胞内物质分泌的影响，微胶囊化后细胞密度大、反应速度快、耐毒能力强，半透膜性质的囊壁更有利于囊内小分子物质的分泌；同时微胶囊化菌体能进行多批次发酵，在微胶囊中引入磁性材料，易于与发酵液进行分离，提高了生产效率，同时不影响发酵液的营养成分、菌体生长及代谢；通过本发明的深层发酵可进行4~5批次。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。
实施例中采用50L发酵罐进行发酵。
实施例1
F1：本实施例取银耳子实体50g，洗净烘干粉碎至100目得银耳粉，将银耳粉与水按照料液比1:50混合均匀灭菌，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比15%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度25℃，36小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为15mT，作用时间15min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉15份，葡萄糖30份，KH2PO41份，MgSO4•7H2O 0.8份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6份；调节pH为6.0，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.4份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到22mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.0mg/ml，由5万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：10；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为11%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为6，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.2m3/min，搅拌速度80r/min，罐压40kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵120小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度100mT，作用时间30min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：麦芽糖4%，大豆分离蛋白4%，菊花花粉1.5%，玉米粉1.5%，枸杞粉0.5%，山茶油0.3%，硫酸镁0.3%，硫酸锌0.3%，磷酸氢二钾0.3%，氯化钠0.3%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.5%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽15μs，电场强度35v/m，电场作用时间为30min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得银耳活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵5批次，所得活性成分溶液中，平均银耳多糖含量为8.37g/L。
实施例2
F1：本实施例取灵芝子实体50g，洗净烘干粉碎至100目得灵芝粉，将灵芝粉与水按照料液比1:50混合均匀灭菌，即可得灵芝种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比15%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度28℃，72小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为20mT，作用时间20min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，VB20.2份，VB60.1份，KH2PO41份，MgSO4•7H2O 1份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.5份；调节pH为5，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.5份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到20mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.005g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.0mg/ml，由5万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：10；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的70%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.2，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.2m3/min，搅拌速度50r/min，罐压40kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵120小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度100mT，作用时间30min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：麦芽糖和玉米粉1：1组合4%，酵母粉和豆粕粉1：1组合0.3%，大豆分离蛋白4%、山芋粉4%，菊花花粉1%，枸杞粉0.2%，山茶油0.3%，硫酸镁0.2%，硫酸锌0.2%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.2%，硫酸亚铁0.2%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6%，垂盆草粉末0.2%，板蓝根粉末0.2%，茶叶提取物0.1%，VB60.1%；
本实施例高压脉冲电场频率为60Hz，脉宽15μs，电场强度35v/m，电场作用时间为30min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得灵芝活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵4批次，所得活性成分溶液中，平均灵芝多糖含量为5.92g/L；平均三帖酸含量为6.85g/L。
实施例3
F1：本实施例取冬虫夏草菌丝体10cm2，与水按照料液比1:50混合均匀，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比10%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度22℃，72小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为20mT，作用时间10min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，酵母粉0.8份，蚕蛹粉0.2份，KH2PO40.8份，MgSO4•7H2O 0.8份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.4份；调节pH为5.5，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.6份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到22mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.2mg/ml，由6万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：10；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的60%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.5，控制深层发酵温度为23℃，无菌空气通气量为2.0m3/min，搅拌速度120r/min，罐压35kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵168小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度80mT，作用时间30min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：葡萄糖4%，牛肉膏0.3%，大豆分离蛋白4%，菊花花粉1%，酵母粉0.1%，山茶油0.3%，黄豆饼粉2.0%，硫酸镁0.2%，硫酸锌0.2%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.2%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽15μs，电场强度30v/m，电场作用时间为30min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得冬虫夏草活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵4批次，所得活性成分溶液中，平均虫草多糖含量为4.51g/L；平均核苷酸类化合物含量为3.68mg/g；平均虫草酸算含量为66.42mg/g；平均虫草素含量为3.65mg/g。
实施例4
F1：本实施例取香菇子实体50g，洗净烘干粉碎至110目得香菇粉，将香菇粉与水按照料液比1:50混合均匀，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比15%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度22℃，72小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为20mT，作用时间10min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，酵母粉0.3份，KH2PO40.8份，MgSO4•7H2O 0.8份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.4份；调节pH为5.5，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.6份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到22mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.2mg/ml，由6万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：8；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为6，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.0m3/min，搅拌速度120r/min，罐压35kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵120小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度80mT，作用时间30min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：葡萄糖5%，牛肉膏0.4%，大豆分离蛋白3%，菊花花粉1%，酵母粉0.1%，山茶油0.3%，黄豆饼粉2.0%，硫酸镁0.2%，硫酸锌0.2%，硫酸钾0.1%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.2%，硫酸亚铁0.2%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽15μs，电场强度20v/m，电场作用时间为35min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得香菇活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵5批次，所得活性成分溶液中，平均香菇多糖含量为4.58g/L。
实施例5
F1：本实施例取松乳菇子实体50g，洗净烘干粉碎至120目得松乳菇粉，将松乳菇粉与水按照料液比1:55混合均匀，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比10%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度22℃，72小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为20mT，作用时间10min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，酵母粉0.3份，KH2PO41份，MgSO4•7H2O 0.5份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.4份；调节pH为6，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.6份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到20mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.2mg/ml，由5万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为18mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：9；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为7，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.0m3/min，搅拌速度120r/min，罐压35kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵120小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度80mT，作用时间30min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：葡萄糖5%，牛肉膏0.4%，大豆分离蛋白3%，菊花花粉1%，酵母粉0.1%，山茶油0.3%，黄豆饼粉2.0%，硫酸镁0.1%，硫酸锌0.2%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.2%，硫酸亚铁0.2%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽15μs，电场强度30v/m，电场作用时间为40min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得松乳菇活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵4批次，所得活性成分溶液中，平均松乳菇粗多糖含量为24.5g/L；平均粗蛋白含量为432.1g/L；平均粗脂肪含量为36.18g/L。
实施例6
F1：本实施例取猴头菇子实体50g，洗净烘干粉碎至120目得松乳菇粉，将松乳菇粉与水按照料液比1:55混合均匀，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比10%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度22℃，72小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为20mT，作用时间10min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，酵母粉0.3份，KH2PO41份，MgSO4•7H2O 0.5份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.4份；调节pH为5.6，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.6份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到21mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.0mg/ml，由6万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：10；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.5，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.1m3/min，搅拌速度100r/min，罐压40kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵120小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度100mT，作用时间20min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：葡萄糖5%，蛋白胨0.4%，大豆分离蛋白3%，菊花花粉1%，酵母膏0.3%，山茶油0.3%，黄豆饼粉2.0%，硫酸镁0.1%，硫酸锌0.2%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.2%，硫酸亚铁0.2%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽15μs，电场强度30v/m，电场作用时间为30min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得猴头菇活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵4批次，所得活性成分溶液中，平均猴头菇多糖含量为22.6g/L。
实施例7
F1：本实施例取金针菇子实体50g，洗净烘干粉碎至120目得金针菇粉，将金针菇粉与水按照料液比1:60混合均匀，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比15%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度25℃，48小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为20mT，作用时间15min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，酵母粉0.3份，KH2PO41份，MgSO4•7H2O 0.5份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.4份；调节pH为5.6，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.6份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到22mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.2mg/ml，由6万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：8；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为15%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.5，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.1m3/min，搅拌速度100r/min，罐压40kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵96小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度100mT，作用时间20min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：葡萄糖5%，蛋白胨0.3%，大豆分离蛋白3%，菊花花粉1%，酵母膏0.2%，山茶油0.3%，橄榄油0.3%，黄豆饼粉3.0%，硫酸镁0.1%，硫酸锌0.2%，磷酸氢二钾0.2%，氯化钠0.2%，硫酸亚铁0.2%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.6%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽60μs，电场强度20v/m，电场作用时间为40min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得金针菇活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵5批次，所得活性成分溶液中，平均金针菇多糖含量为9.56g/L。
实施例8
F1：本实施例取茯苓子实体50g，洗净烘干粉碎至120目得茯苓粉，将茯苓粉与水按照料液比1:50混合均匀，即可得种子料。
F2：本实施例种子液按重量百分比12%的接种量接种至灭菌后的复合氨基酸培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场进行培养，培养温度25℃，48小时后，得到种子液；
本实施例电磁场强度为10mT，作用时间15min/h；
本实施例种子液培养基以1000ml水计，加入可溶性淀粉20份，葡萄糖40份，酵母粉0.3份，KH2PO41份，MgSO4•7H2O 0.5份，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.4份；调节pH为5.4，搅拌均匀后加入甘氨酸与丝氨酸1:1组合0.6份，分装于250ml三角瓶中，装液量100ml，121℃高温灭菌30min，待冷却至室温后使用。
F3：将F2种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200rpm转速下振荡30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
本实施例的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料Fe3O4加入到22mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得，Fe3O4在磁性海藻酸纳溶液中含量为0.006g/ml；
本实施例的壁材溶液浓度为1.2mg/ml，由6万分子量壳聚糖溶于1%（v/v）醋酸溶液中制备而得；
本实施例的氯化钙溶液浓度为20mg/ml；
本实施例混合液与氯化钙溶液体积比为1：2；
本实施例磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：8；
F4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的70%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.5，控制深层发酵温度为25℃，无菌空气通气量为2.1m3/min，搅拌速度100r/min，罐压40kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵120小时后，开启发酵罐外可调节电磁场，磁场强度100mT，作用时间20min将磁性载菌体外胶囊吸引至发酵罐壁，然后排出发酵醪液，再接入新的培养基，取消电磁场，调节发酵参数与前述参数一致，进行深层发酵。
本实施例深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：葡萄糖4%，蛋白胨0.2%，大豆分离蛋白3%，菊花花粉1%，酵母膏0.1%，山茶油0.3%，橄榄油0.3%，黄豆饼粉3.0%，硫酸镁0.1%，硫酸锌0.3%，磷酸氢二钾0.3%，氯化钠0.3%，硫酸亚铁0.3%，谷氨酸与甘氨酸1:1组合0.5%；
本实施例高压脉冲电场频率为50Hz，脉宽50μs，电场强度25 v/m，电场作用时间为40min。
F5：取F4所得发酵醪液过滤后，得茯苓活性成分溶液。
本实施例中，可连续深层发酵4批次，所得活性成分溶液中，平均茯苓多糖含量为10.56g/L；平均总氨基酸含量为6.73g/L。

Claims (9)

1.一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于,包括以下步骤：
A1：取食用菌菌丝或子实体，洗净，干燥至水分含量为6~8%后，将其粉碎至100~120目获得粉末，将粉末与水按料液比1：（40~60）混合均匀，灭菌后得到种子料；
A2：取将A1所得种子料在无菌条件下按15~20%的接种量接种至灭菌后的种子液培养基中，然后置于摇床上并通入电磁场培养24~96小时，培养温度23~25℃，得种子液；
A3：将A2所得种子液离心获得的沉淀物，在无菌条件下与磁性海藻酸钠溶液混合均匀得到混合液；将混合液通过注射器滴入氯化钙溶液进行固化20~30min，得到磁性载菌体海藻酸钙凝珠；将磁性海藻酸钙凝珠用蒸馏水洗涤2~3次，然后与灭菌后的壁材溶液在无菌条件下混合，200~230rpm转速下振荡15~30min进行成膜反应，得到磁性载菌体微胶囊；
所述的磁性海藻酸钠溶液，是将磁性材料加入到20~25mg/ml海藻酸钠溶液中混合均匀制备而得；所述壁材溶液浓度为0.8~1.2mg/ml；所述的氯化钙溶液浓度为18~22mg/ml；所述混合液与氯化钙溶液体积比为1：（1.5~2）；所述磁性海藻酸钙凝珠与壁材溶液体积比为1：（5~10）；
A4：将深层发酵培养基按发酵罐体积的60~80%加入发酵罐中，搅拌均匀后，将发酵罐封好进行灭菌；待深层发酵培养基冷却后，将F3所得磁性载菌体微胶囊按接种量为10~12%接种至深层发酵培养基中得到深层发酵液；调节深层发酵液pH为5.2~6.2，控制深层发酵温度为22~25℃，无菌空气通气量为2.0~2.2m3/min，搅拌速度50~100r/min，罐压38~45kPa，并通入高压脉冲电场进行深层发酵，发酵72~168小时后，排出深层发酵醪液；
所述深层发酵培养基含有以下重量百分比的组分：碳源3~5%、氮源0.15~0.3%、大豆分离蛋白3~5%、矿物质盐0.6~0.9%、促进剂1~1.8%、生长因子2~4%、组合氨基酸Ⅰ0.5~0.7%；所述的组合氨基酸Ⅰ为谷氨酸与甘氨酸1:1组合；
所述碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、玉米粉、山芋粉、豆粕、可溶性淀粉中的一种或一种以上组合；
所述氮源为蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、黄豆饼粉、玉米粉、硫酸铵、硝酸钾中一种或一种以上组合；
所述的矿物质盐为硫酸亚铁、氯化钠、硫酸镁、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸锌、氯化锌中的一种或一种以上组合；
所述促进剂为橄榄油、中药提取物、茶叶提取物、垂盆草、板蓝根中的一种或一种以上组合；
所述生长因子为蜂花粉、玉米粉、山茶油、枸杞粉中一种或一种以上组合；
A5：将A4所得发酵醪液，过滤后，即可得到含有食用菌活性物质的溶液。
2.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：A1所用食用菌为银耳、灵芝、冬虫夏草、香菇、松乳菇、猴头菇、金针菇、茯苓中一种。
3.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：A1所述种子液培养基pH为5~7，含有以下重量分数比的组分：葡萄糖30~40份、蛋白胨15~25份，促进剂0.1~0.3份，KH2PO40.8~1.2份，MgSO4•7H2O0.5~1份，组合氨基酸Ⅱ0.9~1.1份；所述促进剂为酵母粉、VB2、VB6、橄榄油、茶叶提取物、蚕蛹粉中一种或一种以上组合；所述组合氨基酸Ⅱ为先加入谷氨酸和甘氨酸1:1组合0.5~0.6份，再加入甘氨酸和丝氨酸1:1组合0.4~0.5份。
4.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：A1所述电磁场强度为10~20mT，作用时间5~20min/h。
5.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：A3所述的磁性材料为分析纯等级的四氧化三铁，在磁性海藻酸钠溶液中含量为0.004~0.006g/ml。
6.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：F3所述壁材溶液制备方法如下：取分子量4~6万的壳聚糖溶于体积比为1%醋酸溶液中。
7.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：所述磁性载菌体微胶囊的制备，制得的磁性载菌体微胶囊直径为300~450μm。
8.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：A4所述的高压脉冲电场设置于发酵罐体中，电场频率为40~60Hz，脉宽20~60μs，电场强度20~50v/m，电场作用时间为20~40min。
9.根据权利要求1所述的一种连续深层发酵提取食用菌活性物质的方法，其特征在于：A4排出发酵醪液的方法为利用可调节电磁场将磁性载菌体微胶囊定向吸引至发酵罐罐壁上，菌液分离后，排出发酵醪液；可调节电磁场设置于发酵罐外壁，磁场强度50~100mT，作用时间20~30min。
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