CN112080488B - 一种野生茅草菇菌丝体的固定化方法及其染料脱色应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种野生茅草菇菌丝体的固定化方法及其染料脱色应用，是通过筛选合适的固定化材料对野生茅草菇菌丝体进行固定。相比较于未固定化的固体培养菌丝体，本发明的固定化茅草菇菌丝体微球对染料废水的脱色效率显著提高，在几个小时内染料脱色率就接近100％，处理时间大大缩短，且其重复利用更加便捷，具有广阔的应用研究价值。

Description

一种野生茅草菇菌丝体的固定化方法及其染料脱色应用
技术领域
本发明属于染料废水脱色领域，具体涉及一种具有高效去除染料功能的野生茅草菇菌丝体的固定化方法及其染料脱色应用。
背景技术
茅草菇学名松乳菇，是一种野生真菌，营养丰富，具有很高的食用价值。同时，茅草菇含有乳菇紫素等抗生素成分，其子实体多糖还具有抗肿瘤、增强免疫、抗炎症等功效，有很高的药用价值。然而，由于茅草菇与宿主植物有着共生关系，且对生长环境有着严格要求，目前没有实现野生茅草菇的人工驯化，价格较高。因而，对野生茅草菇及其菌丝体的高效开发利用意义重大。
染料是现代印染、纺织及造纸行业中应用广泛的活性物质，在现代化工及日用品生产中也被大量使用，然而染料在创造巨大经济价值的同时，也带来了一定程度的环境负荷，即污染问题，特别是对水体资源的污染。我国每年都会有大量的染料或染料中间体直接或间接的排入水体，而大部分染料的化学性质稳定，且具有致癌、致畸和致突变性，对人体健康和生物链的安全造成严重危害，因而如何处理体积庞大的工业染料废水是亟待解决的一大难题。
目前，染料废水的处理方法有化学脱色法、物理去除法及生物处理法等。其中，物理、化学法在实际应用中有着各种不足之处，如成本高昂、副产物极易造成二次污染、染料脱色不彻底等问题。相比较而言，生物法则具有成本低、无二次污染、可重复利用、可持续发展等优点。在生物法脱色处理中，固定化微生物技术经常被应用，该技术在染料废水脱色利用上，除了具有上述优点外，还可以避免微生物在废水中大量逸散，提高细胞对废水毒性的抵抗力等。在微生物固定化技术中，常见方法有包埋法、交联法和吸附法。目前，生物处理法在废水脱色领域中稳步发展，固定化真菌菌丝体是一项具有很大潜力的脱色应用技术。
发明内容
本发明提供一种野生茅草菇菌丝体的固定化方法及其染料脱色应用，目的在于使其在固定化后对染料具有更高效的脱色去除能力。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明野生茅草菇菌丝体的固定化方法，包括以下步骤：
步骤1、液体发酵培养
将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在25-30℃恒温培养箱中活化10-40min，用无菌刀片切下长宽1-4cm的菌片，在无菌环境下将其接种到液体培养基中，置于25-30℃恒温摇床中，以80-160rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体；
步骤2、固定化
将液体发酵菌丝体加入无菌水中，均匀打散，得到菌丝体悬液，其中液体发酵菌丝体的湿重与无菌水体积的比为1-3g：50mL；
将固定化生物材料A或固定化生物材料B加入所述菌丝体悬液中，搅拌至固定化生物材料完全溶解，得到混合悬液Ⅰ，其中固定化生物材料与所述菌丝体悬液的质量体积比为1g：30-80mL；
将固定化生物材料B或固定化生物材料A和固化剂加入无菌水中，搅拌至溶解，得到混合液Ⅱ，其中固定化生物材料、固化剂与无菌水的质量体积比为1-5g：1-10g：500mL；
在搅拌的同时，使用恒流注射泵将混合悬液Ⅰ匀速滴入混合液Ⅱ中，搅拌转速100-500rpm，混合悬液Ⅰ与混合液Ⅱ的体积比为1:10；滴完后，继续保持100-500rpm的转速搅拌固化10-30min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
进一步地，步骤1中，所述液体培养基为察氏培养基、PDA培养基、LB培养基、马丁氏培养基中的一种或两种。
进一步地，步骤2中，所述固定化生物材料A为海藻酸钠、纤维素硫酸钠或硫酸软骨素，所述固定化生物材料B为壳聚糖、氯化壳聚糖或ε-聚赖氨酸，所述固化剂为氯化钙、京尼平和三聚磷酸钠中的一种或两种。
进一步地，步骤2中：若混合悬液Ⅰ选用固定化生物材料A，则混合液Ⅱ选用固定化生物材料B；若混合悬液Ⅰ选用固定化生物材料B，则混合液Ⅱ选用固定化生物材料A。
进一步地，步骤1中，所述摇床的培养方式为气浴或水浴。
进一步地，步骤2中，所述均匀打散的方法为超声波、磁力搅拌、涡旋振荡中的一种。
本发明所制备的固定化茅草菇菌丝体微球，可用于对染料废水进行处理，实现废水中染料的脱色去除，包括铬黑T、考马斯亮蓝、甲基橙、氨基黑等。
本发明的有益效果体现在：
1、相比较于未固定化的固体培养菌丝体，本发明的固定化茅草菇菌丝体微球，对染料废水的脱色效率显著提高，在几个小时内染料脱色率就接近100％，处理时间大大缩短，且其重复利用更加便捷。
2、本发明的固定化方法操作简单、易于实现，具有广阔的应用研究价值，对工业生产废水诸如纺织废水、造纸废水中的染料去除具有潜在的开发价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，旨在更好的解释本发明的内容，以下实施不限制本发明的保护范围。
实施例1
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在25℃恒温培养箱中活化10min，用无菌刀片切下长宽1cm的菌片，在无菌环境下将其接种到LB液体培养基中，置于25℃恒温水浴摇床中，以80rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，超声波均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料海藻酸钠1g加入30mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使海藻酸钠完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量1g固定化生物材料氯化壳聚糖和1g固化剂氯化钙加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速100rpm；滴完后，继续保持100rpm的转速搅拌固化10min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列铬黑T标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对铬黑T的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列铬黑T标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于铬黑T的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌LB液体培养基中加入铬黑T，配制铬黑T浓度为40mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为15g/L，然后置于25℃恒温水浴摇床中，80rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(2000rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理6h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中铬黑T的脱色率达到96.18％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T的脱色率仅有8.53％；处理4d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T的脱色率才达到97.01％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
实施例2
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在26℃恒温培养箱中活化20min，用无菌刀片切下长宽1cm的菌片，在无菌环境下将其接种到察氏液体培养基中，置于26℃恒温水浴摇床中，以100rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，超声波均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料海藻酸钠1g加入40mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使海藻酸钠完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量2g固定化生物材料ε-聚赖氨酸和3g固化剂氯化钙加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速200rpm；滴完后，继续保持200rpm的转速搅拌固化10min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列铬黑T标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对铬黑T的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列铬黑T标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于铬黑T的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌察氏液体培养基中加入铬黑T，配制铬黑T浓度为50mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为18g/L，然后置于26℃恒温水浴摇床中，100rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(3000rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理6h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中铬黑T的脱色率达到97.09％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T的脱色率仅有9.67％；处理3d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T的脱色率才达到97.32％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
实施例3
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在27℃恒温培养箱中活化20min，用无菌刀片切下长宽约2cm的菌片，在无菌环境下将其接种到PDA液体培养基中，置于27℃恒温水浴摇床中，以120rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，超声波均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料壳聚糖1g加入40mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使壳聚糖完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量3g固定化生物材料海藻酸钠和2g固化剂三聚磷酸钠加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速300rpm；滴完后，继续保持300rpm的转速搅拌固化20min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列考马斯亮蓝标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对考马斯亮蓝的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列考马斯亮蓝标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于考马斯亮蓝的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌PDA液体培养基中加入考马斯亮蓝，配制考马斯亮蓝浓度为50mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为12g/L，然后置于27℃恒温水浴摇床中，120rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(3000rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理6h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中考马斯亮蓝的脱色率达到97.09％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中考马斯亮蓝的脱色率仅有9.67％；处理3d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中考马斯亮蓝的脱色率才达到97.32％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
实施例4
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在28℃恒温培养箱中活化30min，用无菌刀片切下长宽约2cm的菌片，在无菌环境下将其接种到LB液体培养基中，置于28℃恒温气浴摇床中，以140rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，磁力搅拌均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料氯化壳聚糖1g加入50mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使氯化壳聚糖完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量5g固定化生物材料纤维素硫酸钠和3g固化剂三聚磷酸钠加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速400rpm；滴完后，继续保持400rpm的转速搅拌固化20min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列甲基橙标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对甲基橙的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列甲基橙标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于甲基橙的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌LB液体培养基中加入甲基橙，配制甲基橙浓度为60mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为14g/L，然后置于28℃恒温气浴摇床中，140rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(4000rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理8h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中甲基橙的脱色率达到96.24％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中甲基橙的脱色率仅有10.55％；处理4d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中甲基橙的脱色率才达到97.83％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
实施例5
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在29℃恒温培养箱中活化30min，用无菌刀片切下长宽约3cm的菌片，在无菌环境下将其接种到PDA液体培养基中，置于29℃恒温气浴摇床中，以160rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，磁力搅拌均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料氯化壳聚糖1g加入60mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使氯化壳聚糖完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量7g固定化生物材料纤维素硫酸钠和3g固化剂京尼平加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速400rpm；滴完后，继续保持400rpm的转速搅拌固化30min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列氨基黑标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对氨基黑的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列氨基黑标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于氨基黑的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌PDA液体培养基中加入氨基黑，配制氨基黑浓度为70mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为16g/L，然后置于29℃恒温气浴摇床中，160rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(5000rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理8h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中氨基黑的脱色率达到95.86％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中氨基黑的脱色率仅有6.37％；处理5d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中氨基黑的脱色率才达到96.11％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
实施例6
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在30℃恒温培养箱中活化40min，用无菌刀片切下长宽约3cm的菌片，在无菌环境下将其接种到马丁氏液体培养基中，置于30℃恒温气浴摇床中，以160rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，涡旋振荡均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料壳聚糖1g加入70mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使壳聚糖完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量1g固定化生物材料硫酸软骨素和1g固化剂三聚磷酸钠加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速500rpm；滴完后，继续保持500rpm的转速搅拌固化30min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列铬黑T或氨基黑标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对铬黑T或氨基黑的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列铬黑T或氨基黑标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于铬黑T或氨基黑的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌马丁氏液体培养基中加入铬黑T或氨基黑，配制铬黑T或氨基黑浓度为80mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为18g/L，然后置于30℃恒温气浴摇床中，160rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(6000rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理10h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中铬黑T和氨基黑脱色率分别达到98.59％、96.95％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T和氨基黑脱色率仅有7.53％、8.31％；处理3d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T和氨基黑脱色率才分别达到99.11％、97.88％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率
实施例7
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在26℃恒温培养箱中活化40min，用无菌刀片切下长宽约3cm的菌片，在无菌环境下将其接种到LB液体培养基中，置于26℃恒温水浴摇床中，以120rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，涡旋振荡均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料氯化壳聚糖1g加入80mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使氯化壳聚糖完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量2g固定化生物材料硫酸软骨素和4g固化剂京尼平加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速250rpm；滴完后，继续保持250rpm的转速搅拌固化20min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列氨基黑标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对氨基黑的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列氨基黑标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于氨基黑的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌LB液体培养基中加入氨基黑，配制氨基黑浓度为80mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为16g/L，然后置于26℃恒温水浴摇床中，120rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(3500rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理8h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中氨基黑的脱色率达到95.43％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中氨基黑的脱色率仅有6.33％；处理4d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中氨基黑的脱色率才达到97.21％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
实施例8
本实施例按如下步骤对野生茅草菇菌丝体进行固定化，并验证其对染料废水的脱色效率：
步骤1、液体发酵培养
对采摘自安徽省潜山县的野生茅草菇的子实体进行消毒，在无菌环境下将子实体中的菌肉接种到固体平板上培养，待长出菌丝体后低温冷藏备用。将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在29℃恒温培养箱中活化20min，用无菌刀片切下长宽约2cm的菌片，在无菌环境下将其接种到马丁氏液体培养基中，置于29℃恒温气浴摇床中，以170rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体。
步骤2、固定化
称量湿重为2g的液体发酵菌丝体加入50mL无菌水中，涡旋振荡均匀打散，得到菌丝体悬液；
称量固定化生物材料壳聚糖1g加入80mL菌丝体悬液中，使用磁力搅拌器使壳聚糖完全溶解，得到混合悬液Ⅰ；
称量3g固定化生物材料纤维素硫酸钠和5g固化剂京尼平加入500mL蒸馏水中，搅拌至彻底溶解，得到混合液Ⅱ；
使用恒流注射泵将10mL混合悬液Ⅰ匀速滴入100mL混合液Ⅱ中，在此过程中对混合液Ⅱ进行磁力搅拌，搅拌转速150rpm；滴完后，继续保持150rpm的转速搅拌固化20min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球。
步骤3、标准曲线的绘制
精确配制等差浓度梯度的一系列铬黑T标准溶液，每组设置3个平行，利用UV-Vis光谱法对铬黑T的标准溶液进行全波长扫描，根据全波长扫描图谱确定染料的最大吸收峰对应的波长，在此波长下，测定一系列铬黑T标准溶液的吸光值，并绘制标准曲线，得到线性回归方程(R2≥0.999)，用于铬黑T的定量分析。
步骤4、染料脱色
向无菌LB液体培养基中加入铬黑T，配制铬黑T浓度为90mg/L的模拟废水；在无菌环境下，将步骤2制得的固定化茅草菇菌丝体微球接种于模拟废水中，接种量为20g/L，然后置于29℃恒温水浴摇床中，170rpm下振荡培养。
步骤5、脱色率计算
振荡培养一定时间后，从步骤4振荡处理的废水中用移液器抽取2mL处理液，离心(4500rpm，5min)，取上清液，用UV-Vis光谱法测定特定波长下溶液的吸光值，并带入步骤3绘制的标准曲线中，计算待测溶液染料浓度。染料脱色率计算方法如下：
染料脱色率(％)＝(C0-Ct)/C0×100％
其中：C0为染料的初始浓度，Ct为某一时刻测定的染料浓度。
为进行对比，将步骤1所得固体培养菌丝体用灭菌后的5mL移液枪枪头尾部按压成菌片，然后按照步骤3～5相同的方法计算染料脱色率。
结果表明：处理8h后，加入固定化茅草菇菌丝体微球的废水中铬黑T的脱色率达到96.85％，而加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T的脱色率仅有6.69％；处理4d后，加入未固定化的固体培养菌丝体的废水中铬黑T的脱色率才达到97.38％。因此可知，本实施例的固定法方法可以显著提高染料脱色效率。
以上仅为本发明的示例性实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种野生茅草菇菌丝体的固定化方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、液体发酵培养
将低温保存的野生茅草菇菌种固体平板在25-30℃恒温培养箱中活化10-40min，用无菌刀片切下长宽1-4cm的菌片，在无菌环境下将其接种到液体培养基中，置于25-30℃恒温摇床中，以80-160rpm的转速振荡培养3d，得到野生茅草菇的液体发酵菌丝体；
步骤2、固定化
将液体发酵菌丝体加入无菌水中，均匀打散，得到菌丝体悬液，其中液体发酵菌丝体的湿重与无菌水体积的比为1-3g：50mL；
将固定化生物材料A或固定化生物材料B加入所述菌丝体悬液中，搅拌至固定化生物材料完全溶解，得到混合悬液Ⅰ，其中固定化生物材料与所述菌丝体悬液的质量体积比为1g：30-80mL；
将固定化生物材料B或固定化生物材料A和固化剂加入无菌水中，搅拌至溶解，得到混合液Ⅱ，其中固定化生物材料、固化剂与无菌水的质量体积比为1-5g：1-10g：500mL；
在搅拌的同时，使用恒流注射泵将混合悬液Ⅰ匀速滴入混合液Ⅱ中，搅拌转速100-500rpm，混合悬液Ⅰ与混合液Ⅱ的体积比为1:10；滴完后，继续保持100-500rpm的转速搅拌固化10-30min，过滤、用无菌水冲洗，即得到固定化茅草菇菌丝体微球；
所述固定化生物材料A为海藻酸钠、纤维素硫酸钠或硫酸软骨素，所述固定化生物材料B为壳聚糖、氯化壳聚糖或ε-聚赖氨酸，所述固化剂为氯化钙、京尼平和三聚磷酸钠中的一种或两种；若混合悬液Ⅰ选用固定化生物材料A，则混合液Ⅱ选用固定化生物材料B；若混合悬液Ⅰ选用固定化生物材料B，则混合液Ⅱ选用固定化生物材料A。
2.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于：步骤1中，所述液体培养基为察氏培养基、PDA培养基、LB培养基、马丁氏培养基中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于：步骤1中，所述摇床的培养方式为气浴或水浴。
4.根据权利要求1所述的固定化方法，其特征在于：步骤2中，所述均匀打散的方法为超声波、磁力搅拌、涡旋振荡中的一种。
5.一种权利要求1～4任意一项所述固定化方法所获得的固定化茅草菇菌丝体微球。
6.一种权利要求5所述固定化茅草菇菌丝体微球的染料脱色应用，其特征在于：用于对染料废水进行处理，实现废水中染料的脱色去除。
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