CN104962538A - 一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法 - Google Patents

一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法 Download PDF

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Abstract

一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，涉及一种细菌产β-甘露聚糖酶的方法。本发明的目的是为了拓展产β-甘露聚糖酶的微生物菌种来源，提供一种细菌产β-甘露聚糖酶的新方法。方法：一、将芽孢盐杆菌属细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基中；二、在温度为32～38℃的条件下，培养得到发酵液，发酵液中即含有β-甘露聚糖酶。魔芋粉培养基由魔芋粉、硝酸铵、氯化钠和自来水制成。发酵液中β-甘露聚糖酶活力为2000-3000U/mL。本方法发酵周期短、成本低、操作简便；发酵液成分简单，β-甘露聚糖酶易于纯化，发酵液对环境无污染。本发明用于产β-甘露聚糖酶。

Description

一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法
技术领域
本发明涉及一种细菌产β-甘露聚糖酶的方法。
背景技术
芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌是一种能够在高盐环境下厌氧生活的产芽孢细菌。该属细菌包含两个种，分别是洛氏芽孢盐杆菌(S.lortetii)和死海芽孢盐杆菌(S.marimortui)。目前尚无该属细菌产β-甘露聚糖酶的报道。
β-甘露聚糖酶，英文名β-mannanase，是水解1,4-β-D-吡喃甘露糖为主链的内切水解酶。β-甘露聚糖酶底物范围宽泛，包括葡萄甘露聚糖、甘露聚糖及半乳甘露聚糖。β-甘露聚糖酶有广泛的工业用途，如造纸业的纸浆漂白、食品业中的果汁澄清等。β-甘露聚糖酶将多糖降解为低聚糖，利于肠道益生微生物生长，近年来日益引人关注。微生物β-甘露聚糖酶来源广、作用条件温和、易于纯化，是β-甘露聚糖酶理论和实践研究的热点。与真菌相比，细菌产β-甘露聚糖酶具有发酵周期短、营养要求简单等优越性。挖掘自然界中丰富的细菌资源，寻找高产β-甘露聚糖酶的新细菌，以短周期、低成本获得更多的β-甘露聚糖酶，一直是微生物学领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是为了拓展产β-甘露聚糖酶的微生物菌种来源，提供一种细菌产β-甘露聚糖酶的新方法。
本发明芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，按以下步骤进行：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基中，使培养基中初始细胞浓度为(1.0～2.0)×107个/mL；其中，魔芋粉培养基由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成
二、在温度为32～38℃的条件下，培养36～60h，得到发酵液，对发酵液进行提取，获得β-甘露聚糖酶。
步骤一所述魔芋粉培养基由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成，魔芋粉培养基的pH值为6.4～7.4。
上述获得的芽孢盐杆菌属细菌HDYM-27发酵液可用于亚麻脱胶，以1:20的体积比加入到沤麻液中，于32～38℃下沤麻72h，即可完成脱麻。
本发明的有益效果：
本发明中的芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27为化能异养型产芽孢细菌，分离自亚麻温水沤麻液。
本发明中芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27在魔芋粉培养基中，由于魔芋粉及硝酸铵、氯化钠的底物诱导作用，能够产生胞外β-甘露聚糖酶。目前尚无该属细菌产β-甘露聚糖酶的报道。
本发明中魔芋粉培养基成分简单，只有魔芋粉、硝酸铵和氯化钠，均为工业级原料，成本低廉。随着发酵的进行，魔芋粉被降解为小分子还原糖，可被细菌利用；硝酸铵和氯化钠中的硝酸根、铵根和钠离子均可被细菌利用。因此，该发酵液成分简单，β-甘露聚糖酶易于分离。并且，该发酵液对环境几乎没有污染。
本发明中芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27在魔芋粉中发酵时，温度范围32-38℃，温度参数宽泛，易于实现。
本发明中芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27在魔芋粉中发酵时，培养36～60h后发酵液中β-甘露聚糖酶活力即可达到2000-3000U/mL，周期短，酶活高。
本发明中芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27在魔芋粉发酵培养基中，由于底物诱导作用，能产生β-甘露聚糖酶。因此，该菌在魔芋粉发酵培养基中发酵而得的发酵液中，含有β-甘露聚糖酶，降解亚麻原茎胶质中的半纤维素，具有脱胶周期短、脱胶彻底的优点。该细菌发酵液中的细菌，可以在沤麻液中继续生长繁殖，分泌更多的脱胶酶，进一步缩短脱胶周期，彻底降解胶质。而且，该菌不产生纤维素酶，不破坏亚麻纤维的质量。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，按以下步骤进行：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基中，使培养基中初始细胞浓度为(1.0～2.0)×107个/mL；
二、在温度为32～38℃的条件下，培养36～60h，得到发酵液，对发酵液进行提取，获得β-甘露聚糖酶。
发酵结束后，发酵液中β-甘露聚糖酶活力为2000-3000U/mL。本方法发酵周期短、成本低、操作简便；发酵液成分简单，β-甘露聚糖酶易于纯化，发酵液对环境无污染。该发酵液用于亚麻脱胶时间短、胶质去除彻底、残胶率低，亚麻纤维得率高、强度高
本实施方式用于发酵产β-甘露聚糖酶的是芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27，在“黑龙江省不同地区亚麻沤麻液中功能菌生物多样性的研究”中公开记载，现保藏于黑龙江大学生命科学学院省高校微生物重点实验室中。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中所述魔芋粉培养基由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述魔芋粉培养基的pH值为6.4～7.4。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是：所述魔芋粉培养基的pH值为7.0。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一培养基中初始细胞浓度为1.5×107个/mL。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中在温度为34～36℃的条件下，培养40～55h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中在温度为35℃的条件下，培养45～50h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤二中在温度为35℃的条件下，培养36h。其它与具体实施方式一至五之一相同。
为验证本发明的有益效果进行以下试验：
实施例1：
本实施例芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，按以下步骤进行：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基A中，使培养基中初始细胞浓度为1.5×107个/mL；所述魔芋粉培养基A由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成，魔芋粉培养基A的pH值为7.0；
二、在温度为35℃的条件下，培养36h，得到发酵液，对发酵液进行提取，获得β-甘露聚糖酶。
本实施例获得的发酵液中β-甘露聚糖酶活力为3000U/mL，纤维素酶活力＜5U/mL。
实施例2：
本实施例芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，按以下步骤进行：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基B中，使培养基中初始细胞浓度为1.5×107个/mL；所述魔芋粉培养基B由2g魔芋粉、0.2g氯化钠和100mL自来水制成，魔芋粉培养基的pH值为7.0；
二、在温度为35℃的条件下，培养36h，得到发酵液，检测发酵液中β-甘露聚糖酶活力。
本实施例获得的发酵液中β-甘露聚糖酶活力为1800U/mL。
实施例3：
本实施例芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，按以下步骤进行：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基C中，使培养基中初始细胞浓度为1.5×107个/mL；所述魔芋粉培养基C由20g魔芋粉、5g硝酸钠和1000mL自来水制成，魔芋粉培养基的pH值为7.5；
二、在温度为35℃的条件下，培养36h，得到发酵液，检测发酵液中β-甘露聚糖酶活力。
本实施例获得的发酵液中β-甘露聚糖酶活力为2000U/mL。
由以上试验结果可知，只有以魔芋粉培养基A(由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成，魔芋粉培养基的pH值为7.0)培养获得的细菌种子液中含有β-甘露聚糖酶，且β-甘露聚糖酶活力较高，为3000U/mL。
利用以上3个实施例制备的发酵液进行亚麻脱胶试验，具体如下：
先对亚麻原茎进行去灰尘泥土处理，即将亚麻原茎在自来水中浸泡约1h，取出后室温放置数小时晾干。取600g上述处理过的亚麻原茎，均分为三份，每份200g。将三份亚麻原茎平整、密实的铺放在三个电热恒温水浴锅中，加入自来水，麻水比例为1kg：20L。第一个水浴锅中加入1L实施例1获得的发酵液，第二个水浴锅中加入1L实施例2获得的发酵液，第三个水浴锅中加入1L实施例3获得的发酵液，进行沤麻试验。
三组沤麻试验时间均为72h。
沤麻结束后取出亚麻原茎，放置于阳关充足的通风处晾干，再将干茎养生48h。上机打麻获得亚麻纤维。
测定亚麻纤维强度、纤维得率和残胶率，结果如表1所示。
表1亚麻纤维强度、纤维得率和残胶率
序号 脱胶时间(h) 纤维强度(N) 纤维得率(％) 残胶率(％)
1 实施例1获得的发酵液 72 181.5±3.6 86.2±2.5 2.1±0.1
2 实施例2获得的发酵液 72 160.8±3.5 74.8±1.9 3.4±0.1
3 实施例3获得的发酵液 72 162.9±4.0 78.5±2.2 3.2±0.1
由以上试验结果可知，只有实施例1使用的魔芋粉培养基(由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成，魔芋粉培养基的pH值为7.0)培养获得的发酵液中含有β-甘露聚糖酶，以该发酵液用于亚麻脱胶的效果最佳。
对比试验：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基A中，使培养基中初始细胞浓度为1.5×107个/mL；所述魔芋粉培养基A由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成，魔芋粉培养基A的pH值为7.0；
在温度为35℃的条件下，培养36h，得到发酵液，对发酵液进行提取，获得β-甘露聚糖酶。
获得的发酵液中β-甘露聚糖酶活力为3000U/mL，纤维素酶活力＜5U/mL。
二、先对亚麻原茎进行去灰尘泥土处理，即将亚麻原茎在自来水中浸泡约1h，取出后室温放置数小时晾干。取600g上述处理过的亚麻原茎，均分为三份，每份200g。将三份亚麻原茎平整、密实的铺放在三个电热恒温水浴锅中，加入自来水，麻水比例为1kg：20L。第一个水浴锅中加入1L步骤一获得的芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27发酵液，第二个水浴锅中加入1L自来水，第三个水浴锅中加入1L甘露聚糖酶的纯酶混合液(甘露聚糖酶活力3000U/mL)，进行沤麻试验。
三、自来水沤麻试验时间为96h，其余两组沤麻试验时间为72h。
四、沤麻结束后取出亚麻原茎，放置于阳关充足的通风处晾干，再将干茎养生48h。上机打麻获得亚麻纤维。
测定亚麻纤维强度、纤维得率和残胶率，结果如表2所示。
表2亚麻纤维强度、纤维得率和残胶率
本试验方法中将芽孢盐杆菌属细菌HDYM-27发酵液直接加入到沤麻液中即可，操作简便；脱胶时间仅需72h，比常规天然沤麻时间(96-120h)显著缩短；获得的亚麻纤维残胶率低、纤维得率高、纤维强度高。
本试验芽孢盐杆菌属细菌HDYM-27发酵液制备成本低廉，使用本试验芽孢盐杆菌属细菌HDYM-27发酵液的成本仅为使用纯酶制剂的20％～25％。

Claims (7)

1.一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将芽孢盐杆菌属(Sporohalobacter sp.)细菌HDYM-27接种于魔芋粉培养基中，使培养基中初始细胞浓度为(1.0～2.0)×107个/mL；其中，魔芋粉培养基由2g魔芋粉、0.5g硝酸铵、0.5g氯化钠和100mL自来水制成；
二、在温度为32～38℃的条件下，培养36～60h，得到发酵液，对发酵液进行提取，获得β-甘露聚糖酶。
2.根据权利要求1所述的一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于所述魔芋粉培养基的pH值为6.4～7.4。
3.根据权利要求1所述的一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于所述魔芋粉培养基的pH值为7.0。
4.根据权利要求1或2所述的一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤一培养基中初始细胞浓度为1.5×107个/mL。
5.根据权利要求4所述的一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤二中在温度为34～36℃的条件下，培养40～55h。
6.根据权利要求4所述的一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤二中在温度为35℃的条件下，培养45～50h。
7.根据权利要求4所述的一种芽孢盐杆菌属细菌产β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于步骤二中在温度为35℃的条件下，培养36h。
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