CN111763640B - 一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物脱胶技术领域，尤其涉及一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法。所述制备方法包括以下步骤：将戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌分别在培养基中培养，得到戊糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液，将这四种菌液混合，得到复合菌剂种子液，将所述复合菌剂种子液接入到复合菌剂培养基中混合发酵，即得到微生物复合菌剂。本发明提供的制备方法简单、成本较低，能够有效地实现苎麻生物脱胶。

Description

一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂及其制 备方法
技术领域
本发明涉及生物脱胶技术领域，尤其涉及一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂及其制备方法。
背景技术
苎麻(学名：Boehmeria nivea(L.)Gaudich.)为荨麻科苎麻属亚灌木或灌木植物)，其纤维具有高强度高模量的特征，广泛用于工业用复合材料。中国是苎麻产量最大的国家，约占全世界总产量的90％左右。苎麻的原麻中含有20-30％的胶质，胶质广义上泛指原麻中的非纤维素成分，包括半纤维素、果胶、木质素、水溶物、脂蜡质、灰分等，实际生产中的脱胶工艺主要是对半纤维素、果胶成分进行破坏以将纤维分离成单纤维状使其适用于纺织的过程。传统纺织工业中主要采用化学方法，通过酸、碱及氧化物的高温煮练，并通过水洗、打纤等物理机械手段实现胶质与纤维的分离。由于整个过程需要反复的水洗步骤以及酸、碱及氧化剂的大量使用，会造成对水资源的严重浪费和污染，这一问题严重制约着现代纺织工业的发展。
生物脱胶通过酶或微生物的作用，在温和的条件下实现对胶质成分的分解，耗水少、污染轻且不损伤纤维，因此生物脱胶技术的开发和产业化应用成为纺织行业发展的必然趋势。
目前的生物脱胶预处理过程通常使用单一微生物，由于胶质成分复杂，单一微生物分解速度缓慢，同时由于对无菌程度要求较高，环境中杂菌的污染会严重影响脱胶效果。而天然沤麻过程中，在天然的复合菌群的作用下脱胶效果好，然而天然菌群增殖速度缓慢，因此传统沤麻不适用于大规模工业生产。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种能够大规模工业生产、对胶质成分具有良好分解效果的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂，解决纺织工业传统化学脱胶工艺中水资源浪费以及污染环境的难题；本发明还提供了该高温微生物复合菌剂的制备方法，制备方法简单、成本较低，能够有效地实现苎麻生物脱胶。
本发明提供一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，步骤为：将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilusMeyer and Gottheil)、土芽孢杆菌(Geobacillus toebii subsp.)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)分别在培养基中培养，得到戊糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液，将这四种菌液混合，得到复合菌剂种子液，将所述复合菌剂种子液接入到复合菌剂培养基中混合发酵，即得到微生物复合菌剂。
进一步地，复合菌剂种子液中戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌的细胞数分别为复合菌剂种子液中细胞总数的25～35％、35～45％、10～20％、5～10％。
进一步地，所述复合菌剂培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～10份、酵母粉3～5份、氯化钠2～7份、(NH4)2SO4 0.5～2份、磷酸氢二钾0.5～1.5份、大米米粉5～10份、苎麻原麻5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到复合菌剂培养基。
进一步地，所述复合菌剂培养基的pH值为7.0～7.2。
进一步地，混合发酵的温度条件为45～55℃，时间为48～72小时。
进一步地，将戊糖片球菌接种到MRS培养基中，在35～45℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到戊糖片球菌菌液。
进一步地，所述MRS培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨8～12份、酵母提取物3～6份、牛肉膏8～12份、葡萄糖15～25份、乙酸钠3～6份、柠檬酸二铵2～3份、吐温80 0.5～2份、硫酸镁0.4～0.6份、硫酸锰0.04～0.06份、磷酸氢二钾1.5～2.5份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到MRS培养基。
进一步地，所述MRS培养基的pH值为7.0～7.2。
进一步地，将短小芽胞杆菌接种到LB培养基中，在40～50℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到短小芽胞杆菌菌液。
进一步地，所述LB培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～15份、酵母提取物3～10份、氯化钠5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到LB培养基。
进一步地，所述LB培养基的pH值为7.0～7.2。
进一步地，将土芽胞杆菌接种到MSM培养基中，在40～60℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到土芽胞杆菌菌液。
进一步地，将热纤梭菌接种到MSM培养基中，在40～60℃的温度条件下静置培养24～48小时，得到热纤梭菌菌液。
进一步地，所述MSM培养基的配制过程为：按重量份计，称取氯化钠2～5份、CaCO31～2.5份、蛋白胨15～20份、酵母粉0.5～1.2份、磷酸氢二钾0.7～1.2份、MgSO4·7H2O 0.2～0.4份、FeSO4·7H2O 0.003～0.005份、硫酸锰0.001～0.002份、ZnCl2 0.0008～0.0016份、CoCl2 0.001～0.0015份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到MSM培养基。
进一步地，所述MSM培养基的pH值7.0～7.2。
本发明还提供了利用上述制备方法制得的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂。
本发明通过将戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌分别进行培养，使戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌进行大量的繁殖，在其达到较高的活性和生长状态后，得到戊糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液；然后将菌液按照特定比例混合，进一步在复合菌剂培养基中混合发酵，获得微生物复合菌剂，微生物复合菌剂中的各种菌协同作用，能够实现对苎麻中胶质成分的高效分解。
本发明提供的技术方案带来的有益效果是：利用本发明提供的微生物复合菌剂进行苎麻生物脱胶预处理时，耗能耗水少，解决了纺织工业传统化学脱胶工艺中水资源浪费以及污染环境的难题；本发明提供的微生物复合菌剂中的多种微生物协同作用，能够实现苎麻中胶质成分的有效分解，提高了生物脱胶速度，脱胶效果好不伤麻纤维，同时通过菌剂的应用解决了天然菌群增殖速度慢的问题；本发明提供的微生物复合菌剂适宜在高温条件下生长，该微生物复合菌剂产生的酶最适作用温度为50-60℃，较高的作用温度能够促进脱胶反应的进行。
附图说明
图1是本发明一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例和附图对本发明实施方式作进一步地描述。
以下实施例中，使用的戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌和热纤梭菌均购自明舟生物。
优选地，戊糖片球菌的商品货号为ATCC 43201，短小芽胞杆菌的商品货号为B80482，土芽孢杆菌的商品货号为DSM 17041，热纤梭菌的商品货号为ATCC27405。
实施例1：
本发明的实施例1提供了一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)、配制pH值为7.0的MRS培养基：称取蛋白胨90g、酵母提取物50g、牛肉膏85g、葡萄糖200g、乙酸钠45g、柠檬酸二铵25g、吐温80 10g、硫酸镁5g、硫酸锰0.5g、磷酸氢二钾20g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(2)、配制pH值为7.0的LB培养基：称取蛋白胨100g、酵母提取物80g、氯化钠75g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(3)、配制pH值为7.0的MSM培养基：称取氯化钠35g、CaCO3 15g、蛋白胨180g、酵母粉10g、磷酸氢二钾10g、MgSO4·7H2O 3g、FeSO4·7H2O 0.04g、硫酸锰0.01g、ZnCl2 0.013g、CoCl2 0.012g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(4)、配制pH值为7.0的复合菌剂培养基：称取蛋白胨80g、酵母粉40g、氯化钠55g、(NH4)2SO4 15g、磷酸氢二钾10g、大米米粉70g、苎麻原麻80g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(5)、制备微生物复合菌剂：将戊糖片球菌接种到MRS培养基中，在40℃以及好氧条件下培养36小时，得到戊糖片球菌菌液；将短小芽胞杆菌接种到LB培养基中，在45℃以及好氧条件下培养36小时，得到短小芽胞杆菌菌液；将土芽胞杆菌接种到MSM培养基中，在50℃以及好氧条件下培养36小时，得到土芽胞杆菌菌液；将热纤梭菌接种到MSM培养基中，在50℃下静置培养36小时，得到热纤梭菌菌液；将糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液混合，得到复合菌剂种子液，将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中在50℃下静置培养60小时，即得到微生物复合菌剂。
复合菌剂种子液中戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌的细胞数分别为复合菌剂种子液中细胞总数的30％、40％、20％、10％。
实施例1中每10g为一份。
实施例1的制备过程见图1。
实施例1采用对照实验对微生物脱胶过程进行分析，具体设置实验组一和对照组一至五，实验组一为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种实施例1制备的微生物复合菌剂；对照组一为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种戊糖片球菌和短小芽胞杆菌；对照组二为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种土芽孢杆菌和热纤梭菌；对照组三为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种戊糖片球菌、土芽孢杆菌和热纤梭菌；对照组四为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌和热纤梭菌；对照组五为将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基，接种戊糖片球菌、短小芽胞杆菌和土芽孢杆菌。
上述实验一和对照组一至五中，苎麻的添加比例为1-5g苎麻/100ml培养基，菌剂的接种量为1％-5％。
将实验组一、对照组一至五在50℃温度条件以及好氧条件下培养72h，取出后80℃烘干至恒重对苎麻成分(脂蜡质含量、水溶物含量、果胶物含量、半纤维素含量、纤维素含量)进行测定，苎麻成分分析方法参照国标参照GB 5889—1986《苎麻化学成分定量分析方法》进行测定。胶质降解率＝(原麻残胶率-72h样品残胶率)/原麻残胶率×100，测定结果见表1。
表1：苎麻成分测定
Figure BDA0002558879050000071
取上述72h培养液10000rpm离心5min收集上清液，分别测甘露糖酶酶活、木聚糖酶酶活(均参照GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，分别以甘露聚糖和木聚糖为底物，通过DNS法测底物水解产生的还原糖的含量)、果胶酶酶活(QB/T 4482-2013碱性果胶酶制剂)，测定结果见表2。
表2：酶活测定结果
Figure BDA0002558879050000072
从表1和表2可以看出，在各种菌的协同作用下，实验组一的微生物复合菌剂具有最高的果胶酶、甘露糖酶、木聚糖酶酶活，对苎麻中的果胶、水溶物、半纤维素具有最佳的分解效果，胶质降解率最高达73.48％，实现了对苎麻的有效脱胶。同时在脱去胶质成分的同时，很好的保留了苎麻中的纤维素成分，在脱胶预处理后纤维素含量提升至91.38％。
对实验组一的微生物复合菌剂进行不同温度条件的酶活测试，结果见表3。
表3：不同温度的酶活测试
Figure BDA0002558879050000081
从表3可以看出，微生物复合菌剂在50-60℃条件下酶活最高，温度到70℃时依然具有较高的酶活，具有很好的热稳定。
实施例2：
本发明的实施例2提供了一种用于苎麻脱胶的高温微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)、配制pH值为7.2的MRS培养基：称取蛋白胨100g、酵母提取物45g、牛肉膏95g、葡萄糖160g、乙酸钠55g、柠檬酸二铵28g、吐温80 12g、硫酸镁6g、硫酸锰0.4g、磷酸氢二钾18g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(2)、配制pH值为7.2的LB培养基：称取蛋白胨120g、酵母提取物60g、氯化钠65g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(3)、配制pH值为7.2的MSM培养基：称取氯化钠45g、CaCO3 18g、蛋白胨160g、酵母粉8g、磷酸氢二钾8g、MgSO4·7H2O 2g、FeSO4·7H2O 0.03g、硫酸锰0.01g、ZnCl2 0.013g、CoCl2 0.009g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(4)、配制pH值为7.2的复合菌剂培养基：称取蛋白胨65g、酵母粉35g、氯化钠45g、(NH4)2SO4 18g、磷酸氢二钾8g、大米米粉60g、苎麻原麻70g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(5)、制备微生物复合菌剂：将戊糖片球菌接种到MRS培养基中，在35℃以及好氧条件下培养48小时，得到戊糖片球菌菌液；将短小芽胞杆菌接种到LB培养基中，在45℃以及好氧条件下培养48小时，得到短小芽胞杆菌菌液；将土芽胞杆菌接种到MSM培养基中，在45℃以及好氧条件下培养48小时，得到土芽胞杆菌菌液；将热纤梭菌接种到MSM培养基中，在50℃下静置培养48小时，得到热纤梭菌菌液；将糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液混合，得到复合菌剂种子液，将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中在45℃下静置培养48小时，即得到微生物复合菌剂。
复合菌剂种子液中戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌的细胞数分别为复合菌剂种子液中细胞总数的28％、44％、18％、10％。
实施例2中，每10g为一份。
将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基(苎麻的添加比例为1-5g苎麻/100ml培养基)，按接种量1％-5％接种实施例2制备的微生物复合菌剂，在50℃温度条件以及好氧条件下培养72h，取出后80℃烘干至恒重对苎麻成分(脂蜡质含量、水溶物含量、果胶物含量、半纤维素含量、纤维素含量)进行测定，测定结果见表4。
取上述72h培养液10000rpm离心5min收集上清液，分别测甘露糖酶酶活、木聚糖酶酶活(均参照GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，分别以甘露聚糖和木聚糖为底物，通过DNS法测底物水解产生的还原糖的含量)、果胶酶酶活(QB/T 4482-2013碱性果胶酶制剂)，测定结果见表4。
表4：实施例2制备的微生物复合菌剂的测试结果
Figure BDA0002558879050000091
实施例3：
本发明的实施例3提供了一种用于苎麻脱胶的高温微生物复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)、配制pH值为7.0的MRS培养基：称取蛋白胨110g、酵母提取物55g、牛肉膏100g、葡萄糖220g、乙酸钠55g、柠檬酸二铵26g、吐温80 18g、硫酸镁6g、硫酸锰0.6g、磷酸氢二钾22g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(2)、配制pH值为7.0的LB培养基：称取蛋白胨135g、酵母提取物90g、氯化钠95g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(3)、配制pH值为7.0的MSM培养基：称取氯化钠25g、CaCO3 20g、蛋白胨190g、酵母粉6g、磷酸氢二钾11g、MgSO4·7H2O 4g、FeSO4·7H2O 0.05g、硫酸锰0.01g、ZnCl2 0.015g、CoCl2 0.014g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(4)、配制pH值为7.0的复合菌剂培养基：称取蛋白胨95g、酵母粉45g、氯化钠65g、(NH4)2SO4 18g、磷酸氢二钾12g、大米米粉85g、苎麻原麻85g和蒸馏水10L混合，121℃灭菌20min；
(5)、制备微生物复合菌剂：将戊糖片球菌接种到MRS培养基中，在45℃以及好氧条件下培养36小时，得到戊糖片球菌菌液；将短小芽胞杆菌接种到LB培养基中，在45℃以及好氧条件下培养36小时，得到短小芽胞杆菌菌液；将土芽胞杆菌接种到MSM培养基中，在50℃以及好氧条件下培养36小时，得到土芽胞杆菌菌液；将热纤梭菌接种到MSM培养基中，在50℃下静置培养36小时，得到热纤梭菌菌液；将糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液混合，得到复合菌剂种子液，将复合菌剂种子液接种到复合菌剂培养基中在50℃下静置培养60小时，即得到微生物复合菌剂。
复合菌剂种子液中戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌的细胞数分别为复合菌剂种子液中细胞总数的32％、41％、18％、9％。
实施例3中，每10g为一份。
将苎麻加入到上述配制的复合菌剂培养基(苎麻的添加比例为1-5g苎麻/100ml培养基)，按接种量1％-5％接种实施例3制备的微生物复合菌剂，在50℃温度条件以及好氧条件下培养72h，取出后80℃烘干至恒重对苎麻成分(脂蜡质含量、水溶物含量、果胶物含量、半纤维素含量、纤维素含量)进行测定，测定结果见表5。
取上述72h培养液10000rpm离心5min收集上清液，分别测甘露糖酶酶活、木聚糖酶酶活(均参照GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的测定，分别以甘露聚糖和木聚糖为底物，通过DNS法测底物水解产生的还原糖的含量)、果胶酶酶活(QB/T 4482-2013碱性果胶酶制剂)，测定结果见表5。
表5：实施例3制备的微生物复合菌剂的测试结果
Figure BDA0002558879050000111
在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、短小芽胞杆菌(Bacilluspumilus)、土芽孢杆菌(Geobacillus sp.)、热纤梭菌(Clostridium thermocellum)分别接种在培养基中培养，得到戊糖片球菌菌液、短小芽胞杆菌菌液、土芽孢杆菌菌液、热纤梭菌菌液，将这四种菌液混合，得到复合菌剂种子液，将所述复合菌剂种子液接入到复合菌剂培养基中混合发酵，即得到微生物复合菌剂，所述复合菌剂种子液中戊糖片球菌、短小芽胞杆菌、土芽孢杆菌、热纤梭菌的细胞数分别为复合菌剂种子液中细胞总数的25～35％、35～45％、10～20％、5～10％，其中，戊糖片球菌的商品货号为ATCC 43201，短小芽胞杆菌的商品货号为B80482，土芽孢杆菌的商品货号为DSM 17041，热纤梭菌的商品货号为ATCC27405。
2.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述复合菌剂培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～10份、酵母粉3～5份、氯化钠2～7份、(NH4)2SO4 0.5～2份、磷酸氢二钾0.5～1.5份、大米米粉5～10份、苎麻原麻5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到复合菌剂培养基。
3.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，将戊糖片球菌接种到MRS培养基中，在35～45℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到戊糖片球菌菌液。
4.根据权利要求3所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述MRS培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨8～12份、酵母提取物3～6份、牛肉膏8～12份、葡萄糖15～25份、乙酸钠3～6份、柠檬酸二铵2～3份、吐温800.5～2份、硫酸镁0.4～0.6份、硫酸锰0.04～0.06份、磷酸氢二钾1.5～2.5份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到MRS培养基。
5.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，将短小芽胞杆菌接种到LB培养基中，在40～50℃的温度条件以及好氧条件下培养24～48小时，得到短小芽胞杆菌菌液。
6.根据权利要求5所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的配制过程为：按重量份计，称取蛋白胨5～15份、酵母提取物3～10份、氯化钠5～10份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到LB培养基。
7.根据权利要求1所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，将土芽胞杆菌和热纤梭菌分别接种到MSM培养基中，在40～60℃的温度条件下静置培养24～48小时，得到土芽胞杆菌菌液和热纤梭菌菌液。
8.根据权利要求7所述的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂的制备方法，其特征在于，所述MSM培养基的配制过程为：按重量份计，称取氯化钠2～5份、CaCO3 1～2.5份、蛋白胨15～20份、酵母粉0.5～1.2份、磷酸氢二钾0.7～1.2份、MgSO4·7H2O 0.2～0.4份、FeSO4·7H2O 0.003～0.005份、硫酸锰0.001～0.002份、ZnCl2 0.0008～0.0016份、CoCl2 0.001～0.0015份和蒸馏水950～1050份混合，121℃灭菌20min，即得到MSM培养基。
9.利用权利要求1至8任一项所述制备方法制得的用于苎麻生物脱胶预处理的高温微生物复合菌剂。
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