CN107641609A

CN107641609A - 一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法

Info

Publication number: CN107641609A
Application number: CN201710843114.6A
Authority: CN
Inventors: 穆军; 崔霞; 张媛媛; 杨桥
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2017-09-18
Filing date: 2017-09-18
Publication date: 2018-01-30
Anticipated expiration: 2037-09-18
Also published as: CN107641609B

Abstract

本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF1与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，两种菌株从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，首先将两种菌株分别扩大培养制成菌种液，然后将两种菌种液混合在液体培养基中协同发酵培养，在发酵后期向发酵菌液中加入絮凝载体，并加入乙醇使胞外多糖较为完全的沉降。本发明采用两种菌株复配发酵，两种菌株在发酵过程中相互协同，菌种活力强，胞外多糖产量高，发酵后期添加絮凝载体，使菌体在絮凝载体上凝聚成团，促进胞外多糖的沉降，减少乙醇使用，絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

Description

一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法

技术领域

本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法。

背景技术

我国近十年的城市化发展迅速，但由于污水处理设施投入滞后、污水处理效率低，大量的工业废水、生活污水排放造成严重的水环境恶化，使水体中重金属、色素及悬浮颗粒含量超标，蓝藻等藻类爆发，水资源现已成为制约社会城市化和工业化发展的重要因素。提升污水处理技术、强化城市污水治理能力已经成为当务之急。其中在污水中引入适当粒径的絮状颗粒物，利用其巨大的表面积对重金属、色素和悬浮颗粒进行絮凝吸附形成絮状体，通过沉降或离心方式从水体中分离出已经成为治理污水的重要方法。

絮凝法的关键在于选择合适的絮凝剂，常用的絮凝剂有无机絮凝剂、有机絮凝剂、生物絮凝剂等，其中生物絮凝剂因处理效果好，与环境的相容性高而受到重视。生物絮凝剂主要有微生物絮凝体及微生物产生的胞外聚合物，微生物絮凝体在水体中的生存条件要求较为苛刻，而微生物产生的胞外聚合物使用较为方便。胞外聚合物主要是部分胞外多糖，可以使重金属离子、色素及悬浮颗粒等凝集沉降，安全高效。目前从环境中分离出的可以分泌具有絮凝效果的胞外多糖的微生物主要有酱油曲霉、红平红球菌与类芽孢杆菌等，但是利用这些微生物制备胞外多糖絮凝剂还主要处于研究阶段，而且单种菌株分泌胞外多糖存在产量低、絮凝活性低等问题。

发明内容

针对现阶段微生物制备胞外多糖絮凝剂存在絮凝活性低的问题，本发明的目的在于提供一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonassp.GHF1与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，两种菌株从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，两种菌株复配使用在发酵培养过程中相互协同强化，产生的胞外多糖的产量高，胞外多糖的絮凝活性强，所得絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

本发明提供如下的技术方案：

本发明的复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，其中海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14510，建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonas taeanensis；海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。

上述海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11的16S rDNA全序列(1281bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702265，全序列如下：

上述海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的16S rDNA全序列(1280bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702255，全序列如下：

海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2均从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，经实验发现，这两种海洋菌株的分泌物，主要是胞外多糖具有絮凝的能力，两种菌株复配培养可协同强化发酵过程，胞外多糖产量高。

一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液；

(2)混合两种菌种液得到混合菌液，然后接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体并继续发酵培养得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物，经干燥后制成絮凝剂。

首先将两种菌株分别扩大培养制成菌种液，然后将两种菌种液混合在液体培养基中发酵培养，两种菌株协同强化发酵过程，所得发酵菌液中胞外多糖的产量高，在发酵后期向发酵菌液中加入絮凝载体，絮凝载体可以提供菌体的粘附场所，使菌体粘结成团，加快胞外多糖的沉降，在加入的乙醇的作用下发酵菌液中游离的胞外多糖也迅速沉降，并粘附在絮凝载体的菌体结团上，沉降较为完全。

作为本发明方法的一种改进，所述的液体培养基经以下过程制成：

a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水＝1:2～4加水在120～122℃下高压蒸煮100～120分钟得到蒸煮肉汤；

b.蒸煮肉汤降温至50～60℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解8～12小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度为4‰～8‰，然后经400～500目筛网过滤得到酶解液；

c.在95～100℃下持续加热酶解液使体积浓缩30％～50％得到浓缩液；

d.向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾0.8～1.4g、葡萄糖25～45g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基；

固体培养基为向1L液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

由上述方法制成的液体培养基可提供海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2与海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11发酵培养所需的营养成分，促进两种菌株的协同发酵，使两种菌株在培养过程中产生充足的胞外多糖。

作为本发明方法的一种改进，贝类海鲜产品包括蛤仔、蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的一种或几种。所选的贝类海鲜产品可以提供两种菌株适宜的营养成分。

作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11的培养温度25～30℃，海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的培养温度18～23℃，培养时间36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比1.0～1.5:1。设定合适的培养温度促进菌种的扩大培养的效果，保证菌种液中合适的菌种浓度。

作为本发明方法的一种改进，步骤(2)中GHF11菌种液与GHF2菌种液混合的体积比为0.5～2:1，混合菌液的接种浓度为1.5～2.5mL混合菌液/100mL液体培养基，发酵培养温度23～27℃、时间3～5天，摇床转速100～160r/min。两种菌株经液体培养基中振荡培养、充分发酵分泌胞外多糖，胞外多糖的产率高。

作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中絮凝载体的加入量为8～15g/100mL发酵菌液，继续培养1～2天。在发酵过程的后期中加入絮凝载体既避免对菌种前期发酵过程的影响，絮凝载体直接凝聚发酵菌液中的菌体及胞外多糖，促进胞外多糖的沉降，减少沉降剂乙醇的使用，而且便于离心分离。

作为本发明方法的一种改进，所述絮凝载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、活性炭、贝壳粉、生物炭、壳聚糖和膨润土中的一种或几种，所述絮凝载体经200～300目筛网过筛后灭菌使用。所选用的絮凝载体具有较大的比表面积或者丰富的孔隙结构，凝聚效果强，并能提高絮凝剂的絮凝能力。

作为本发明方法的一种改进，步骤(4)中乙醇与原料液的体积比为2～4:1，在1～5℃静置6～10小时，离心速率3000～5000r/min，干燥温度为90～105℃，干燥时间1～2小时。通过加入乙醇与絮凝载体共同作用使胞外多糖尽可能充分沉降，提高胞外多糖收率。

本发明的有益效果如下：

本发明采用海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2与海洋盐单胞菌菌株Halomonassp.GHF11复配发酵，两种菌株在发酵过程中相互协同，菌种活力强，胞外多糖的产量高，在发酵后期添加絮凝载体，使菌体在絮凝载体上凝聚成团，促进胞外多糖的沉降，而且减少乙醇的使用，所得絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

陈化海水为取新鲜海水在23℃静置沉降7天后所得的海水的上清液。

复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2。

海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14510，建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonastaeanensis。

海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。

实施例1

一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养36小时，海洋盐单胞菌菌株Halomonassp.GHF11的培养温度25℃，海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的培养温度18℃，分别加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液，无菌水与固体培养基的体积比1.0:1；

(2)按GHF11菌种液与GHF2菌种液混合体积比为0.5:1混合两种菌种液得到混合菌液，然后接种到液体培养基中，混合菌液的接种浓度为1.5mL混合菌液/100mL液体培养基，在23℃发酵培养3天，摇床转速100r/min，制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量8g/100mL发酵菌液，絮凝载体为沙土，优选养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，经200目筛网过筛后灭菌使用，继续发酵培养1天得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇，乙醇与原料液体积比2:1，在1℃静置沉降6小时，然后3000r/min转速离心分离沉降物，经90℃干燥2小时制成絮凝剂。

其中，液体培养基经以下过程制成：

a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，然后加入贝类海鲜产品的质量2倍的水混合，在120℃下高压蒸煮100分钟得到蒸煮肉汤，所用贝类海鲜产品为蛤仔；

b.将蒸煮肉汤降温至50℃，然后加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶发酵酶解8小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度均为4‰，然后经400目的筛网过滤后得到酶解液；

c.在95℃下持续加热酶解液，使其体积浓缩50％得到浓缩液；

d.向100mL的浓缩液中加入磷酸氢二钾0.8g、葡萄糖25g，溶解后加陈化海水定容至1L，经高压灭菌制成液体培养基。

固体培养基为向液体培养基加入琼脂凝固制成的斜面培养基，琼脂加入浓度为15g/L。

实施例2

一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养42小时，海洋盐单胞菌菌株Halomonassp.GHF11的培养温度28℃，海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的培养温度20℃，分别加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液，无菌水与固体培养基的体积比1.25:1；

(2)按GHF11菌种液与GHF2菌种液混合体积比为1:1混合两种菌种液得到混合菌液，然后接种到液体培养基中，混合菌液的接种浓度为2.0mL混合菌液/100mL液体培养基，在25℃发酵培养4天，摇床转速140r/min，制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量12g/100mL发酵菌液，絮凝载体为沙土，优选养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，经250目筛网过筛后灭菌使用，继续发酵培养1天得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇，乙醇与原料液体积比3:1，在4℃静置沉降8小时，然后4000r/min转速离心分离沉降物，经100℃干燥1.5小时制成絮凝剂。

其中，液体培养基经以下过程制成：

a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，然后加入3倍贝类海鲜产品质量的水混合，在121℃下高压蒸煮110分钟得到蒸煮肉汤，所用贝类海鲜产品为蛤仔；

b.将蒸煮肉汤降温至55℃，然后加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶发酵酶解10小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度均为6‰，然后经450目的筛网过滤后得到酶解液；

c.在98℃下持续加热酶解液，使其体积浓缩40％得到浓缩液；

d.向100mL的浓缩液中加入磷酸氢二钾1.1g、葡萄糖35g，溶解后加陈化海水定容至1L，经高压灭菌制成液体培养基。

固体培养基为向液体培养基加入琼脂凝固制成的斜面培养基，琼脂加入浓度为17g/L。

实施例3

一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养48小时，海洋盐单胞菌菌株Halomonassp.GHF11的培养温度30℃，海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的培养温度23℃，分别加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液，无菌水与固体培养基的体积比1.5:1；

(2)按GHF11菌种液与GHF2菌种液混合体积比为2:1混合两种菌种液得到混合菌液，然后接种到液体培养基中，混合菌液的接种浓度为2.5mL混合菌液/100mL液体培养基，在27℃发酵培养5天，摇床转速160r/min，制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量15g/100mL发酵菌液，絮凝载体为沙土，优选养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，经300目筛网过筛后灭菌使用，继续发酵培养2天得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇，乙醇与原料液体积比4:1，在5℃静置沉降10小时，然后5000r/min转速离心分离沉降物，经105℃干燥1小时制成絮凝剂。

其中，液体培养基经以下过程制成：

a.将贝类海鲜产品用水清洗干净，然后加入贝类海鲜产品的质量4倍的水混合，在122℃下高压蒸煮120分钟得到蒸煮肉汤，所用贝类海鲜产品为蛤仔；

b.将蒸煮肉汤降温至60℃，然后加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶发酵酶解12小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度均为8‰，然后经500目的筛网过滤后得到酶解液；

c.在100℃下持续加热酶解液，使其体积浓缩30％得到浓缩液；

d.向100mL的浓缩液中加入磷酸氢二钾1.4g、葡萄糖45g，溶解后加陈化海水定容至1L，经高压灭菌制成液体培养基。

固体培养基为向液体培养基加入琼脂凝固制成的斜面培养基，琼脂加入浓度为20g/L。

需要说明的是；制备液体培养基时，可以用蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的一种或者蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的任意两种或多种的混合代替蛤仔，可以提供与蛤仔相近的营养效果。而将沙土替换为泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中的一种，或者泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中任意两种或多种的混合也可以起到相近的沉降效果，且絮凝剂性能保持相近。

实验测试

1.发酵菌液中胞外多糖的含量测定

取100mL的步骤(2)中的发酵菌液测定其中胞外多糖的质量含量，测定方法参考期刊“光谱实验室”2006年5月第23卷第3期中“雷蘑深层发酵胞外多糖含量测定方法的确定”，各实施例的发酵菌液中的胞外多糖的质量含量见表1所示。

表1 胞外多糖的质量含量

项目	实施例1	实施例2	实施例3
				胞外多糖含量/‰	4.8	5.4	5.3

2.絮凝剂性能测定

分别用蒸馏水配制4g/L的高岭土悬浊液与10g/L的氯化钙溶液，取100mL高岭土悬浊液与5mL氯化钙溶液混匀得到混合液，用3支10mL的比色管各盛取5mL的混合液，依次标记为管1、管2、管3，然后分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的絮凝剂0.3g各自对应加入管1、管2、管3中，300r/min下搅拌10分钟，再50r/min下搅拌2分钟，然后静置10分钟，在波长550nm处测量吸光度，对照样为配制混合液所用蒸馏水，根据吸光度计算絮凝率。其中絮凝率为测试样的吸光度值排除对照样的吸光度值后相对测试样的吸光度值的百分比，各实施例所得絮凝剂的结果如表2所示。

表2 絮凝率

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				絮凝率/％	93	95	95

絮凝剂的应用

取对数期生长的小球藻的藻液100mL，加入由复配菌剂制备的絮凝剂0.3g，在23℃下快速搅拌2～3分钟，搅拌速率150r/min，然后静置30分钟，小球藻的沉降率达到70％～80％，具体结果如表3所示。

表3 小球藻絮凝率

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				絮凝率/％	71％	76％	80.2％

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法

<130> JWE173057

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> 大安盐单胞菌的16S rDNA基因全序列(Halomonas taeanensis 16S ribosomalDNA gene)

<400> 1

cataggaatc tgcccggtag tgggggataa cgtggggaaa ctcacgctaa taccgcatac 60

gccccaaggg ggaaagcagg ggatcttcgg accttgcgct atcggatgag cctatgtcgg 120

attagcttgt tggtgaggta atggctcacc aaggcagcga tccgtagctg gtctgagagg 180

atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 240

aatattggac aatgggggaa accctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggctttc 300

gggttgtaaa gcactttcag cgaggaagaa ggcctgatga ttaatactcg ccaggaagga 360

catcactcgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 420

tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg ataagccggt 480

tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccggaa ctgtcaggct agagtgcagg 540

agaggaaggt agaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga ggaataccag 600

tggcgaaggc ggccttctgg actgacactg acactgaggt gcgaaagcgt gggtagcaaa 660

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaactatgt cgactagccg ttgggagcct 720

tgagttctta gtggcgcagc taacgcaata agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 780

gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 840

gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatcgtgc gaactttcca gagatggatt 900

ggtgccttcg ggagcgcaca gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 960

tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccctatcctt atttgccagc gagtaatgtc 1020

gggaactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1080

tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gcaggtacaa agggtcgcaa 1140

gacggcgacg tggagctaat cccagaaagc ctgcctcagt ccggatcgga gtctgcaact 1200

cgactccgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1260

cccgggcctt gtacacaccg c 1281

<210> 2

<211> 1280

<212> DNA

<213> 海水冷杆菌的16S rDNA基因全序列(Psychrobacter aquimaris 16Sribosomal DNA gene)

<400> 2

acttaggaat ctacctagta gtgggggata gcacggggaa actcgtatta ataccgcata 60

cgacctacgg gagaaagggg gcagtttact gctctcgcta ttagatgagc ctaagtcgga 120

ttagctagat ggtggggtaa aggcctacca tggcgacgat ctgtagctgg tctgagagga 180

tgatcagcca caccgggact gagacacggc ccggactcct acgggaggca gcagtgggga 240

atattggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggcctttt 300

ggttgtaaag cactttaagc agtgaagaag actccgtggt taatacccac ggacgatgac 360

attagctgca gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt 420

gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgagcgta ggtggcttga taagtcagat 480

gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg catctgaaac tgttaggcta gagtaggtga 540

gagggaagta gaatttcagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctgaag gaataccgat 600

ggcgaaggca gcttcctggc atcatactga cactgaggct cgaaagcgtg ggtagcaaac 660

aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc tactagtcgt tgggtccctt 720

gaggacttag tgacgcagct aacgcaataa gtagaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 780

ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 840

atgcaacgcg aagaacctta cctggtcttg acatatctag aatcctgcag agatgcggga 900

gtgccttcgg gaattagaat acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 960

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagcg ggttaagccg 1020

ggaactctaa ggatactgcc agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat 1080

catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg taggtacaga gggcagctac 1140

acagcgatgt gatgcgaatc tcaaaaagcc tatcgtagtc cagattggag tctgcaactc 1200

gactccatga agtaggaatc gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggt gaatacgttc 1260

ccgggccttg tacacaccgc 1280

Claims

1.一种利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，所述复配菌剂为海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp. GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp. GHF2，包括以下步骤：

（1）将海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp. GHF11与海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的菌种分别接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成GHF11菌种液与GHF2菌种液；

（2）混合两种菌种液得到混合菌液，然后接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；

（3）向发酵菌液中加入絮凝载体并继续发酵培养得到原料液；

（4）向原料液中加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物，经干燥后制成絮凝剂。

2.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，

所述海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp. GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No. ：14510；

所述海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp. GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No. ：14509。

3.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述的液体培养基经以下过程制成：

a．将贝类海鲜产品用水清洗干净，按质量比贝类海鲜产品:水=1: 2～4加水在120～122 ℃高压蒸煮100～120分钟得到蒸煮肉汤；

b．蒸煮肉汤降温至50～60 ℃，加入枯草杆菌蛋白酶、菠萝蛋白酶酶解8～12小时，两种蛋白酶添加后的质量浓度为4‰～8‰，然后经400～500目筛网过滤得到酶解液；

c．在95～100 ℃下持续加热酶解液使体积浓缩30%～50%得到浓缩液；

d．向100mL浓缩液中加入磷酸氢二钾0.8～1.4g、葡萄糖25～45g溶解均匀，然后加入陈化海水定容到1L，经高压灭菌制成液体培养基；

4.根据权利要求3所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，贝类海鲜产品包括蛤仔、蛏子、蚬子、海虹、扇贝与贻贝中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（1）中海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp. GHF11培养温度25～30℃，海洋冷杆菌菌株Psychrobactersp. GHF2培养温度18～23℃，培养时间36～48小时，无菌水与固体培养基的体积比1.0～1.5:1。

6.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（2）中GHF11菌种液与GHF2菌种液混合的体积比为0.5～2:1，混合菌液的接种浓度为1.5～2.5 mL混合菌液/100 mL液体培养基，发酵培养温度23～27℃、时间3～5天，摇床转速100～160 r/min。

7.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（3）中絮凝载体的加入量为8～15 g/100 mL发酵菌液，继续培养1～2天。

8.根据权利要求1或7所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述絮凝载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、活性炭、贝壳粉、生物炭、壳聚糖和膨润土中的一种或几种，所述絮凝载体经200～300目筛网过筛后灭菌使用。

9.根据权利要求1所述的利用复配菌剂制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（4）中乙醇与原料液的体积比为2～4:1，在1～5 ℃静置6～10小时，离心速率3000～5000 r/min，干燥温度为90～105 ℃，干燥时间1～2小时。