CN109457001A - 一种具有脱色能力的细胞外多糖及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞外多糖技术领域，针对现有细胞外多糖废水脱色效果一般的问题，本发明公开了一种具有脱色能力的细胞外多糖及制备方法和应用，该细胞外多糖经由海洋嗜冷菌菌株GHF10经种子培养、扩大发酵培养后的培养发酵液分离得到，细胞外多糖中各单糖的摩尔比例为甘露糖:氨基葡萄糖:核糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖单糖=1:0.25:0.24:0.05:0.04:0.03:1.66:1.08:0.01:0.02。该细胞外多糖可应用于废水脱色，具有较高的废水脱色能力，并且对亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿具有较高的选择性脱除效率，而且该细胞外多糖容易生物分解，可避免带来二次污染问题。

Description

一种具有脱色能力的细胞外多糖及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞外多糖技术领域，具体涉及一种具有脱色能力的细胞外多糖及其制备方法和应用。
背景技术
化工及相关行业生产排放的废水中不仅含有大量的重金属离子等，往往还存在较高浓度和多种类的色素、颜料污染物，尤其是纺织行业排放的印染废水和实验室排出的实验废水。这些含色素废水具有成分复杂、色度深、污染物含量高、难降解等特点。目前一般通过吸附、絮凝、氧化、还原、电解等进行脱色处理，虽然能脱除大部分的色素，但是存在适用面广而选择性较差导致整体脱除效率低的问题，而且这些方法往往还存在能耗高、操作复杂、容易引入新的污染等问题，造成含色素废水处理难度高，相关污染日益严重。因此需要进一步开发出能够针对性脱除色素的方法。
细胞外多糖是一些特殊微生物如细菌等在生长代谢过程中分泌到细胞壁外的水溶性多糖，属于微生物的次级代谢产物。现有研究表明细胞外多糖具有使重金属离子、色素及悬浮颗粒等絮凝沉降的作用。目前已经开发出利用细胞外多糖制备的生物絮凝剂，通过絮凝方法脱除废水中的污染物，但是还主要用于悬浮颗粒、重金属离子等的絮凝脱除，在色素脱除方面的研究还较少，而且对色素脱除的针对性较差。
发明人在前期研究过程中通过筛选获得了可分泌细胞外多糖的海洋细菌，并在中国专利CN201710843126.9，专利名称一株海洋冷杆菌及用其制备絮凝剂的方法中公开了该海洋细菌，保藏编号为CGMCC No.:14509，将该海洋细菌分泌的细胞外多糖原位培养制备细胞外多糖絮凝剂，对小球藻的絮凝沉降率达到70％～77％。发明人在进一步的研究中发现该细胞外多糖絮凝剂具有一定的色素脱除能力，但是脱除效率一般。
发明内容
针对现有细胞外多糖废水脱色效果一般的问题，本发明的目的在于提供一种具有脱色能力的细胞外多糖，对废水中的多种色素具有较高的脱除效率，而且对部分色素具有选择性的脱除，废水脱色处理效率高。
本发明同时提供该细胞外多糖的制备方法和在废水脱色方面的应用。
本发明提供如下的技术方案：
一种具有脱色能力的细胞外多糖，所述细胞外多糖经由海洋嗜冷菌菌株GHF10经种子培养、扩大发酵培养后的培养发酵液分离得到。
作为本发明的优选，所述细胞外多糖由甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖单糖组成。
作为本发明的优选，所述细胞外多糖中各单糖的摩尔比例为甘露糖:氨基葡萄糖:核糖: 鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖单糖＝1:0.25:0.24:0.05:0.04:0.03:1.66:1.08:0.01:0.02。
本发明的细胞外多糖由发明人通过对筛选的海洋嗜冷菌菌株GHF10培养后的发酵培养液中分离得到，经检测，该细胞外多糖单糖及其摩尔比例依次为：甘露糖:氨基葡萄糖:核糖: 鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖单糖＝1:0.25:0.24:0.05:0.04: 0.03:1.66:1.08:0.01:0.02组成，发明人通过实验发现，该细胞外多糖具有较强的脱色能力，废水脱色效率高，而且对脱除废水中部分色素有较强的选择性，如对孔雀石绿的脱除效果达到99％以上。
本发明所用的海洋嗜冷菌菌株GHF10已经向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提出微生物保藏申请，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期2018年10月12日，保藏编号CGMCC NO.16577；建议的分类命名为嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter sp.。该海洋嗜冷菌菌株GHF10的16S rRNA基因(16S ribosomal RNA gene)的DNA全序列已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702266，16S rRNA基因的DNA全序列全序列如下：
上述具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上25～33℃种子培养24～36h，然后加固体培养基3～5倍质量的无菌水搅拌溶解得到菌种液；
(2)取步骤(1)所得的菌种液按1～2mL菌种液/100mL液体培养基的浓度接种到液体培养基上扩大发酵培养3～5天，培养温度25～33℃，摇床转速为180～200r/min，得发酵菌液，高压灭菌并离心得到上清液；
(3)60～63℃减压浓缩上清液至原体积的30％～40％，经截留分子量为6000～8000Da的透析袋去离子水透析处理，向透析后上清液中加入2～4倍体积乙醇溶液静置沉降完全，再 8000～10000r/min离心分离得粗糖产物，所用乙醇溶液的浓度为70～80wt％；
(4)将粗糖产物溶于水中，然后再加入乙醇溶液沉降、离心分离并干燥得到细胞外多糖。
本发明的细胞外多糖经对海洋嗜冷菌菌株GHF10进行种子扩大培养后的发酵培养液沉淀、分离得到。首先将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上培养，然后将得到的菌种液接种到液体培养基中进行扩大发酵培养，控制合适的培养温度和培养时间，并提供充分的营养物质，使海洋嗜冷菌GHF10充分分泌细胞外多糖，其中即含有本发明所需要的具有脱色能力的细胞外多糖，然后通过透析、乙醇沉降得到多糖粗产物，然后再经乙醇溶液二次沉淀得到纯度较高的细胞外多糖产物，该细胞外多糖表现出较高的废水脱色能力和选择性脱除色素的能力。
作为本发明方法的优选，步骤(4)的乙醇溶液沉降过程如下：
第一，将粗糖产物溶于水中，加入浓度为60～65wt％乙醇溶液沉降得到第二粗糖产物；
第二，离心分离第二粗糖产物，干燥后直接置于纯丙酮中50～60℃搅拌4～6小时，然后静置、离心分离并用纯丙酮洗涤、干燥得到第三粗糖产物；
第三，将第三粗糖产物溶于水中，减压浓缩至体积为10％～20％，加入3～5倍体积的乙醇溶液迅速沉降、离心分离并90～105℃干燥得到细胞外多糖，乙醇溶液浓度为75～78wt％。
作为本发明方法的优选，第三步中加入的乙醇溶液的温度为2～5℃，并置于-5～-10℃保持60～90min。
作为本发明方法的优选，1kg的液体培养基由以下组份制成：蛤肉汤25～55g、蛋白胨2.5～4g、磷酸氢二钾0.5～1.5g、硫代硫酸钠0.2～0.8g、柠檬酸铁铵0.3～1g和葡萄糖15～ 25g，余量为陈化海水；固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
发明人在实验中发现，所得细胞外多糖的纯度越高，对色素的选择性脱除的能力就越强。因此发明人对该细胞外多糖针对性的设计纯化过程，将浓度为70～80wt％的乙醇沉淀后的粗糖产物溶于水中，然后加入60～65wt％乙醇溶液再次沉降，由于乙醇溶液浓度降低，更容易将分子量较大的多糖进一步沉淀去除，而目标多糖得到保留从而得到第二粗糖产物，然后将第二粗糖产物再置于纯丙酮中静置，使部分小分子有机物和有机杂质溶解在丙酮中，对目标多糖进一步的纯化得到第三粗糖产物，将第三粗糖产物再溶解于水中，然后有针对性的加入浓度为75～78wt％的乙醇溶液沉降，从而得到纯度更高的细胞外多糖，虽然仍含有部分杂质，但是已经表现出优异的选择性脱除色素的能力。
作为本发明方法的优选，第三步中加入的乙醇溶液的温度为2～5℃，并置于-5～-10℃保持60～90min。通过低温快速沉降加速目标细胞外多糖同其他有机杂质之间的分离速度。
上述具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用。
作为具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用的优选，所述细胞外多糖选择性脱除的色素为亚甲基蓝、墨水蓝或孔雀石绿中一种。
发明人将所得细胞外多糖用于废水色素的脱除，不仅表现出较高的脱色能力，而且对亚甲基蓝、墨水蓝、孔雀石绿等具有高选择性的脱除能力，而且该细胞外多糖脱色后沉降，容易分离，同时细胞外多糖易分解，避免带来二次污染问题。
本发明的有益效果如下：
本发明通过对海洋嗜冷菌菌株GHF10进行扩大发酵培养，然后分离发酵产物得到细胞外多糖，具有较高的废水脱色能力，尤其是对亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿等色素有较高的选择性脱除性能，可用于废水脱色处理，而且该细胞外多糖容易生物分解，可避免带来二次污染。
附图说明
图1是本发明的细胞外多糖PMP衍生物的高效液相色谱图。
图中：1、甘露糖峰，2、氨基葡萄糖峰，3、核糖峰，4、鼠李糖峰，6、葡萄糖醛酸峰，7、半乳糖醛酸峰，8、葡萄糖峰，9、半乳糖峰，10、木糖峰，11、阿拉伯糖峰，101为 PMP峰。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
一种具有脱色能力的细胞外多糖，该细胞外多糖经由海洋嗜冷菌菌株GHF10种子培养、扩大发酵培养后的培养发酵液分离得到，该细胞外多糖经酸水解后PMP柱前衍生高效液相色法分析单糖组成，高效液相色谱分析图谱如图1所示，其中1为甘露糖峰，2为氨基葡萄糖峰，3 为核糖峰，4为鼠李糖峰，6为葡萄糖醛酸峰，7为半乳糖醛酸峰，8为葡萄糖峰，9为半乳糖峰，10为木糖峰，11为阿拉伯糖峰，101为PMP峰。因此该细胞外多糖由甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖单糖组成，各单糖的摩尔比例为甘露糖:氨基葡萄糖:核糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖: 半乳糖:木糖:阿拉伯糖单糖＝1:0.25:0.24:0.05:0.04:0.03:1.66:1.08:0.01:0.02。
实施例2
本发明的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上25℃种子培养24h，然后加固体培养基 3倍质量的无菌水搅拌溶解得到菌种液；
(2)取步骤(1)所得的菌种液按1mL菌种液/100mL液体培养基的浓度接种到液体培养基上扩大发酵培养3天，培养温度25℃，摇床转速为180r/min，得发酵菌液，高压灭菌并离心得到上清液；
(3)60℃减压浓缩上清液至原体积的30％，经截留分子量为6000Da的透析袋去离子水透析处理，向透析后上清液中加入2倍体积乙醇溶液静置沉降完全，再800r/min离心分离得粗糖产物，所用乙醇溶液的浓度为70wt％；
(4)将粗糖产物溶于水中，然后再加入2倍体积的乙醇溶液沉降、离心分离并干燥得到细胞外多糖，所用乙醇溶液的浓度为70wt％。
其中，1kg的液体培养基由以下组份制成：蛤肉汤25g、蛋白胨2.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫代硫酸钠0.2g、柠檬酸铁铵0.3g和葡萄糖15g，余量为陈化海水；固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
上述具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用，脱除废水中的色素，并且可高选择性的脱除废水中的亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿。
实施例3
本发明的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上25℃种子培养24h，然后加固体培养基 3倍质量的无菌水搅拌溶解得到菌种液；
(2)取步骤(1)所得的菌种液按1mL菌种液/100mL液体培养基的浓度接种到液体培养基上扩大发酵培养3天，培养温度25℃，摇床转速为180r/min，得发酵菌液，高压灭菌并离心得到上清液；
(3)60℃减压浓缩上清液至原体积的30％，经截留分子量为6000Da的透析袋去离子水透析处理，向透析后上清液中加入2倍体积乙醇溶液静置沉降完全，再800r/min离心分离得粗糖产物，所用乙醇溶液的浓度为70wt％；
(4)将粗糖产物溶于水中，经以下步骤加入乙醇溶液沉降、离心分离并干燥得到细胞外多糖：
第一，将粗糖产物溶于水中，加入浓度为62wt％乙醇溶液沉降得到第二粗糖产物；
第二，离心分离第二粗糖产物，干燥后直接置于纯丙酮中50℃搅拌4小时，然后静置、离心分离并用纯丙酮洗涤离心产物、干燥得到第三粗糖产物；
第三，将第三粗糖产物溶于水中，减压浓缩至体积为10％，加入3倍体积的乙醇溶液并置于 -5℃保持60min，使细胞外多糖迅速沉降，乙醇溶液的温度为2℃，然后离心分离并90℃干燥得到细胞外多糖，乙醇溶液浓度为75wt％。
其中，1kg的液体培养基由以下组份制成：蛤肉汤25g、蛋白胨2.5g、磷酸氢二钾0.5g、硫代硫酸钠0.2g、柠檬酸铁铵0.3g和葡萄糖15g，余量为陈化海水；固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
上述具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用，脱除废水中的色素，并且可高选择性的脱除废水中的亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿。
实施例4
本发明的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上32℃种子培养30h，然后加固体培养基 5倍质量的无菌水搅拌溶解得到菌种液；
(2)取步骤(1)所得的菌种液按2mL菌种液/100mL液体培养基的浓度接种到液体培养基上扩大发酵培养5天，培养温度32℃，摇床转速为1200r/min，得发酵菌液，高压灭菌并离心得到上清液；
(3)63℃减压浓缩上清液至原体积的40％，经截留分子量为8000Da的透析袋去离子水透析处理，向透析后上清液中加入4倍体积乙醇溶液静置沉降完全，再10000r/min离心分离得粗糖产物，所用乙醇溶液的浓度为80wt％；
(4)将粗糖产物溶于水中，经以下步骤加入乙醇溶液沉降、离心分离并干燥得到细胞外多糖：
第一，将粗糖产物溶于水中，加入浓度为60wt％乙醇溶液沉降得到第二粗糖产物；
第二，离心分离第二粗糖产物，干燥后直接置于纯丙酮中60℃搅拌5小时，然后静置、离心分离并用纯丙酮洗涤离心产物，干燥得到第三粗糖产物；
第三，将第三粗糖产物溶于水中，减压浓缩至体积为20％，加入5倍体积的乙醇溶液并置于 -10℃保持90min使细胞外多糖迅速沉降，乙醇溶液的温度为3℃，然后离心分离并100℃干燥得到细胞外多糖，乙醇溶液浓度为78wt％。
其中，1kg的液体培养基由以下组份制成：蛤肉汤40g、蛋白胨3.5g、磷酸氢二钾1.0g、硫代硫酸钠0.8g、柠檬酸铁铵1g和葡萄糖25g，余量为陈化海水；固体培养基为向1kg的液体培养基中加入20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
上述具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用，脱除废水中的色素，并且可高选择性的脱除废水中的亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿。
实施例5
本发明的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上33℃种子培养36h，然后加固体培养基 4倍质量的无菌水搅拌溶解得到菌种液；
(2)取步骤(1)所得的菌种液按1.5mL菌种液/100mL液体培养基的浓度接种到液体培养基上扩大发酵培养4天，培养温度33℃，摇床转速为200r/min，得发酵菌液，高压灭菌并离心得到上清液；
(3)62℃减压浓缩上清液至原体积的35％，经截留分子量为7000Da的透析袋去离子水透析处理，向透析后上清液中加入3倍体积乙醇溶液静置沉降完全，再8000r/min离心分离得粗糖产物，所用乙醇溶液的浓度为75wt％；
(4)将粗糖产物溶于水中，经以下步骤加入乙醇溶液沉降、离心分离并干燥得到细胞外多糖：
第一，将粗糖产物溶于水中，加入浓度为65wt％乙醇溶液沉降得到第二粗糖产物；
第二，离心分离第二粗糖产物，干燥后直接置于纯丙酮中55℃搅拌6小时，然后静置、离心分离并用纯丙酮洗涤离心产物，干燥得到第三粗糖产物；
第三，将第三粗糖产物溶于水中，减压浓缩至体积为15％，加入4倍体积的乙醇溶液并置于 -8℃保持75min使细胞外多糖迅速沉降，乙醇溶液的温度为3℃，然后离心分离并105℃干燥得到细胞外多糖，乙醇溶液浓度为76wt％。
其中，1kg的液体培养基由以下组份制成：蛤肉汤55g、蛋白胨4g、磷酸氢二钾1.5g、硫代硫酸钠0.6g、柠檬酸铁铵0.7g和葡萄糖20g，余量为陈化海水；固体培养基为向1kg的液体培养基中加入18g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
上述具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用，脱除废水中的色素，并且可高选择性的脱除废水中的亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿。
脱色性能测试
实验过程如下：配置含有亚甲基蓝、甲基橙、墨水蓝、苏木素、结晶紫、蕃红、孔雀石绿、伊红、溴芬蓝等共9种色素的水溶液，各色素的浓度为0.4mg/L；然后取200mL的上述水溶液6份，对应分别加入本发明的实施例2～4的方法制备的细胞外多糖，以及对比例1和对比例2的细胞外多糖或絮凝剂，加入浓度为0.15g/L，然后室温下100r/min搅拌2小时，然后静置4小时，分别测试上清液中各色素剩余浓度，计算脱色率，结果如表1所示，其中：
对比例1为专利CN201710843126.9中公开的海洋细菌(保藏编号为CGMCC No.:14509)按本申请的实施例3的方法处理得到的细胞外多糖；
对比例2为专利CN201710843126.9中的实施例3得到的细胞外多糖絮凝剂。
表1实验记录及结果
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种具有脱色能力的细胞外多糖及制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1279
<212> DNA
<213> 海洋嗜冷菌菌株GHF10(Psychrobacter sp. strain GHF10)
<400> 1
tacttaggaa tctacctagt agtgggggat agcacgggga aactcgtatt aataccgcat 60
acgacctacg ggagaaaggg ggcagtttac tgctctcgct attagatgag cctaagtcgg 120
attagctaga tggtggggta aaggcctacc atggcgacga tctgtagctg gtctgagagg 180
atgatcagcc acaccgggac tgagacacgg cccggactcc tacgggaggc agcagtgggg 240
aatattggac aatgggggaa accctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggccttt 300
tggttgtaaa gcactttaag cagtgaagaa gactccatgg ttaataccca tggacgatga 360
cattagctgc agaataagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta atacagaggg 420
tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagggagcgt aggtggctct ataagtcaga 480
tgtgaaatcc ccgggcttaa cctgggaact gcatctgaaa ctgtagagct agagtatgtg 540
agaggaaggt agaattccag gtgtagcggt gaaatgcgta gagatctgga ggaataccga 600
tggcgaaggc agccttctgg cataatactg acactgaggc tcgaaagcgt gggtagcaaa 660
caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt ctactagtcg ttgggtccct 720
tgaggactta gtgacgcagc taacgcaata agtagaccgc ctggggagta cggccgcaag 780
gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 840
gatgcaacgc gaagaacctt acctggtctt gacatatcta gaatcctgca gagatgcggg 900
agtgccttcg ggaattagaa tacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 960
tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctt agttaccagc gggttaagcc 1020
gggaactcta aggatactgc cagtgacaaa ctggaggaag gcggggacga cgtcaagtca 1080
tcatggccct tacgaccagg gctacacacg tgctacaatg gtaggtacag agggcagcta 1140
cacagcgatg tgatgcgaat ctcaaaaagc ctatcgtagt ccagattgga gtctgcaact 1200
cgactccatg aagtaggaat cgctagtaat cgcggatcag aatgccgcgg tgaatacgtt 1260
cccgggcctt gtacacacc 1279

Claims (9)

1.一种具有脱色能力的细胞外多糖，其特征在于，所述细胞外多糖经由海洋嗜冷菌菌株GHF10经种子培养、扩大发酵培养后的培养发酵液分离得到。
2.根据权利要求1所述的具有脱色能力的细胞外多糖，其特征在于，所述细胞外多糖由甘露糖、氨基葡萄糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖单糖组成。
3.根据权利要求1或2所述的具有脱色能力的细胞外多糖，其特征在于，所述细胞外多糖中各单糖的摩尔比例为甘露糖:氨基葡萄糖:核糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖单糖=1:0.25:0.24:0.05:0.04:0.03:1.66:1.08:0.01:0.02。
4.一种如权利要求1至3任一所述的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将海洋嗜冷菌菌株GHF10接种到固体培养基上25～33℃种子培养24～36h，然后加固体培养基3～5倍质量的无菌水搅拌溶解得到菌种液；
（2）取步骤（1）所得的菌种液按1～2mL菌种液/100 mL液体培养基的浓度接种到液体培养基上扩大发酵培养3～5天，培养温度25～33℃，摇床转速为180～200 r/min，得发酵菌液，高压灭菌并离心得到上清液；
（3）60～63℃减压浓缩上清液至原体积的30%～40%，经截留分子量为6000～8000Da的透析袋去离子水透析处理，向透析后上清液中加入2～4倍体积乙醇溶液静置沉降完全，再8000～10000 r/min离心分离得粗糖产物，所用乙醇溶液的浓度为70～80wt%；
（4）将粗糖产物溶于水中，然后再加入乙醇溶液沉降、离心分离并干燥得到细胞外多糖。
5.根据权利要求4所述的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，其特征在于，步骤（4）的乙醇溶液沉降过程如下：
第一，将粗糖产物溶于水中，加入浓度为60～65wt%乙醇溶液沉降得到第二粗糖产物；
第二，离心分离第二粗糖产物，干燥后直接置于纯丙酮中50～60℃搅拌4～6小时，然后静置、离心分离并用纯丙酮洗涤、干燥得到第三粗糖产物；
第三，将第三粗糖产物溶于水中，减压浓缩至体积为10%～20%，加入3～5倍体积的乙醇溶液迅速沉降、离心分离并90～105 ℃干燥得到细胞外多糖，乙醇溶液浓度为75～78wt%。
6.根据权利要求5所述的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，其特征在于，第三步中加入的乙醇溶液的温度为2～5℃，并置于-5～-10℃保持60～90min。
7.根据权利要求4所示的具有脱色能力的细胞外多糖的制备方法，其特征在于，1kg的液体培养基由以下组份制成：蛤肉汤25～55g、蛋白胨2.5～4g、磷酸氢二钾0.5～1.5g、硫代硫酸钠0.2～0.8g、柠檬酸铁铵0.3～1g和葡萄糖15～25g，余量为陈化海水；固体培养基为向1 kg的液体培养基中加入15～20 g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
8.一种如权利要求1至3任一所述的具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用。
9.根据权利要求8所述的具有脱色能力的细胞外多糖在废水脱色上的应用，其特征在于，所述细胞外多糖选择性地脱除亚甲基蓝、墨水蓝和孔雀石绿中一种。
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