CN107626285A - 一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，所选用的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离而得，将菌种扩大培养后制成菌种液，经发酵培养产生丰富的胞外多糖，然后将发酵菌液透析去除部分培养基成份后经离心得到上清液，经两次乙醇沉降纯化得胞外多糖的精提产物，将胞外多糖的精提产物与琼脂、淀粉混合制成重金属吸附剂，吸附效率高，可直接在饮用水中使用，安全无害。
Description
技术领域
本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法
背景技术
人们在生产生活中使用的水大多为自来水，主要是通过自来水厂将从地下水或河水等水源抽取的水进行处理获得。由于部分水源受到工业或生活污水排放影响而导致重金属含量超标，虽然在供人畜饮用前经过自来水厂的处理，但是部分重金属的含量依然处于较高的指标，部分甚至超标；另外城市自来水输水管路老旧也会导致重金属如铅等渗入水体中造成重金属含量超标；市场上虽然出售具有重金属脱除功能的净水器，净水器主要靠内部的滤芯对金属离子进行吸附脱除，长期使用后滤芯的吸附能力达到饱和，脱除重金属离子的能力下降，而部分重金属离子还有可能从滤芯上脱附重新进入水体被人引饮用，带来健康风险，而普通市民缺少净水器的维护保养知识和意识，不能对滤芯进行及时科学的更换。除以上原因外不排除其它潜在原因都会导致饮用水存在饮用健康隐患，因此需要对饮用水进行饮用前的重金属终端脱除。
生物吸附法是新兴的水处理方法，具有成本低、可处理低浓度重金属水体、适用的pH值与温度范围宽等优点。生物吸附法包括微生物体吸附法，微生物体吸附主要是利用细胞壁表面具有的络合、配位基团与金属离子形成离子键达到吸附目的，但是微生物体在水中生存条件要求较为严苛限制了微生物体吸附的应用。而微生物体分泌物主要是微生物体分泌的细菌胞外多糖、荚膜多糖等。胞外多糖具有较大的比表面积、丰富的表面羧基、氨基等和强负电性，对重金属具有较强的吸附能力。目前的多数研究肯定了胞外多糖在微生物体吸附过程中的吸附作用，但是专门将胞外多糖分离进行吸附重金属的研究还较少，尤其是用于饮用水饮用前的重金属处理，而且从部分微生物体上分离胞外多糖制备的吸附剂的吸附效率低，吸附剂性能不稳定。
发明内容
针对现有微生物分泌胞外多糖制备的吸附剂的吸附效率低的问题，本发明的目的在于提供一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，所选用的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2从蛤仔吐出的污泥液中分离而得，该菌株分泌的胞外多糖具有较大的比表面积，丰富的络合基团以及强负电性，吸附重金属的能力稳定，由此制备的重金属吸附剂的吸附效率高。
本发明提供如下的技术方案：
本发明所用的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris。该海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得，经实验发现，该海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的分泌物，主要是胞外多糖具有吸附重金属的能力。
上述海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的16S rDNA全序列(1280bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702255，全序列如下：
acttaggaat ctacctagta gtgggggata gcacggggaa actcgtatta ataccgcatacgacctacgg gagaaagggg gcagtttact gctctcgcta ttagatgagc ctaagtcgga ttagctagatggtggggtaa aggcctacca tggcgacgat ctgtagctgg tctgagagga tgatcagcca caccgggactgagacacggc ccggactcct acgggaggca gcagtgggga atattggaca atgggggaaa ccctgatccagccatgccgc gtgtgtgaag aaggcctttt ggttgtaaag cactttaagc agtgaagaag actccgtggttaatacccac ggacgatgac attagctgca gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaatacagagggt gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgagcgta ggtggcttga taagtcagatgtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg catctgaaac tgttaggcta gagtaggtga gagggaagtagaatttcagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctgaag gaataccgat ggcgaaggca gcttcctggcatcatactga cactgaggct cgaaagcgtg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgtaaacgatgtc tactagtcgt tgggtccctt gaggacttag tgacgcagct aacgcaataa gtagaccgcctggggagtac ggccgcaagg ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtggtttaattcg atgcaacgcg aagaacctta cctggtcttg acatatctag aatcctgcag agatgcgggagtgccttcgg gaattagaat acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaagtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagcg ggttaagccg ggaactctaa ggatactgccagtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat catggccctt acgaccaggg ctacacacgtgctacaatgg taggtacaga gggcagctac acagcgatgt gatgcgaatc tcaaaaagcc tatcgtagtccagattggag tctgcaactc gactccatga agtaggaatc gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggtgaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc。
一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将选取的海洋冷杆菌菌株的菌种接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成菌种液；
(2)将菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，再加入乙醇静置沉降、离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物并干燥得到精提产物；
(5)将精提产物溶于琼脂与淀粉的混合水溶液中，再冷却凝固制成重金属高效吸附剂。
将海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的菌种扩大培养后制成菌种液，将菌种液经发酵培养后制成发酵菌液，发酵菌液中含有丰富的胞外多糖，然后将发酵菌液经离心得到上清液，并经两次乙醇沉降纯化得到胞外多糖的精提产物，将得到的胞外多糖的精提产物与琼脂、淀粉混合制成重金属吸附剂，吸附效率高，可直接在水体中使用安全无害。
作为本发明方法的一种改进，1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤30～50g、蛋白胨2～3g、磷酸氢二钾0.6～1.8g、硫代硫酸钠0.3～0.7g、柠檬酸铁铵0.5～1.1g和葡萄糖20～30g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。满足菌种扩大培养及发酵培养要求，提高胞外多糖产率。
作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中培养温度为18～23℃、时间36～48小时，无菌水与固体培养基体积比为1.0～1.5:1。获得充足的菌种，满足菌种液的浓度要求。
作为本发明方法的一种改进，步骤(2)中菌种液接种浓度为0.8～1.4mL菌种液/100mL液体培养基，发酵培养温度为18～23℃、时间3～5天，摇床转速为160～200r/min。经过发酵培养促进海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2充分分泌胞外多糖，提高胞外多糖产率。
作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中发酵菌液透析去除部分培养基成份的过程如下：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在60～65℃下减压浓缩至原体积的10％～15％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味。经透析袋充分透析后大部分的培养基成份从发酵菌液中分离，提高胞外多糖的清洁程度。
作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中乙醇与上清液的体积比2～4:1，1～5℃静置6～10小时，离心速率6000～8000r/min。通过加入乙醇沉降得到胞外多糖的粗产品，粗产品中还含有蛋白质等成份。
作为本发明方法的一种改进，步骤(4)中的乙醇与粗产品溶液体积比为2～4:1，在1～5℃静置沉降6～10小时，离心速率为6000～8000r/min，干燥温度为90～105℃、时间为1～2小时。经乙醇进一步沉降纯化提高胞外多糖的纯度，提高重金属吸附剂的吸附效果。
作为本发明方法的一种改进，步骤(5)中向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂质量百分浓度为2％～5％，琼脂与淀粉的重量比为1.2～2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温凝固，在60～80℃干燥90～120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.2～1.8。将胞外多糖经琼脂、淀粉固定成块制成的重金属吸附剂的性能稳定，能吸附多种重金属，吸附率高。
本发明的有益效果如下：
本发明筛选海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2产生胞外多糖，所得胞外多糖的吸附能力强，通过乙醇两次沉降纯化得到胞外多糖的精提产物，然后经琼脂、淀粉固化制成重金属吸附剂，可直接添加到饮用水中使用，吸附效率高，性能稳定，而且安全无害。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
陈化海水为取新鲜海水在23℃静置沉降7天后所得的海水的上清液。
蛤肉汤为250g蛤仔洗净后置于2kg蒸馏水中在高压锅内蒸煮2小时后过滤的汁液。
本发明所用的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No.：14509，建议的分类命名为海水嗜冷杆菌，拉丁文学名为Psychrobacter aquimaris，从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化而得。
实施例1
一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将选取的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的菌种接种到固体培养基上18℃培养36小时，加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基体积比为1.0:1；
(2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为0.8mL菌种液/100mL液体培养基，18℃发酵培养3天，摇床转速为160r/min，制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，具体过程为：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在60℃下减压浓缩至原体积的10％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味，再将透析袋中的液体离心处理得到上清液；然后加入乙醇静置沉降，乙醇与上清液的体积比2:1，静置沉降时间6小时、温度1℃，以6000r/min离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入2倍粗产品溶液体积的乙醇，在1℃静置沉降6小时，然后以6000r/min离心分离沉降物，将沉降物在90℃干燥1小时得到精提产物；
(5)向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂质量百分浓度为2％，琼脂与淀粉的重量比为1.2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温至25℃凝固，在60℃干燥120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.2。
其中，1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤30g、蛋白胨2g、磷酸氢二钾0.6g、硫代硫酸钠0.3g、柠檬酸铁铵0.5g和葡萄糖20g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg液体培养基中加入15g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
实施例2
一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将选取的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的菌种接种到固体培养基上，20℃培养42小时，加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基体积比为1.25:1；
(2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为1.1mL菌种液/100mL液体培养基，在20℃发酵培养4天，摇床转速为180r/min，制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，具体过程为：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在62℃下减压浓缩至原体积的12％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味，再将透析袋中的液体离心处理得到上清液；然后加入乙醇静置沉降，乙醇与上清液的体积比为3:1，静置沉降时间8小时、温度4℃，以7000r/min离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入3倍粗产品溶液体积的乙醇，在4℃静置沉降8小时，以7000r/min离心分离沉降物，将沉降物在100℃干燥1.5小时得到精提产物；
(5)向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂质量百分浓度为3％，琼脂与淀粉的重量比为1.6:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温至23℃凝固，在70℃干燥100分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.5。
其中，1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤40g、蛋白胨2.5g、磷酸氢二钾1.2g、硫代硫酸钠0.5g、柠檬酸铁铵0.8g和葡萄糖25g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg液体培养基中加入17g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
实施例3
一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，包括以下步骤：
(1)将选取的海洋冷杆菌菌株Psychrobacter sp.GHF2的菌种接种到固体培养基上，23℃培养48小时，加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基体积比为1.5:1；
(2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为1.4mL菌种液/100mL液体培养基，23℃发酵培养5天，摇床转速为200r/min，制成发酵菌液；
(3)将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，具体过程为：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在65℃下减压浓缩至原体积的15％，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味，再将透析袋中的液体离心处理得到上清液；然后加入乙醇静置沉降，乙醇与上清液的体积比4:1，静置沉降时间10小时、温度5℃，以8000r/min离心分离得粗提产物；
(4)将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入4倍粗产品溶液体积的乙醇，在5℃静置沉降10小时，以8000r/min离心分离沉降物，将沉降物在105℃干燥1小时得到精提产物；
(5)向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂质量百分浓度为5％，琼脂与淀粉的重量比为2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温至18℃凝固，在80℃干燥90分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.8。
其中，1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤50g、蛋白胨3g、磷酸氢二钾1.8g、硫代硫酸钠0.7g、柠檬酸铁铵1.1g和葡萄糖30g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg液体培养基中加入20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
重金属高效吸附剂除去饮用水中重金属的应用方法
取10g重金属高效吸附剂加入茶杯中，冲入300～500mL的热开水，温度为95～100℃，浸泡5～10分钟后将水杯摇晃5～10次即可饮用。水中的重金属被吸附剂吸附，饮用水的安全系数提高，而吸附剂被茶杯的滤网隔离，且由于热开水短时间内即发生降温，琼脂在热开水中无法溶解，因此吸附剂不会进入体内，安全无害，使用后可直接丢弃降解，使用方便。
重金属高效吸附剂的吸附性能
测试液配制：用蒸馏水配制锰液(Mn2+)、铬液(Cr6+)、镉液(Cd2+)、铜液(Cu2+)、铅液(Pb2 +)五种测试液，浓度依次为：0.5mg/L、0.25mg/L、0.025mg/L、2mg/L、0.05mg/L；吸附重金属离子：每种测试液各取3份成为1组，每份50mL，取实施例1、实施例2、实施例3中的重金属高效吸附剂各10g加入每组的3份测试液内，1份测试液只加入1个实施例的重金属高效吸附剂，摇晃10分钟后通过原子火焰吸收法测量各测试液中所含金属离子的浓度，从而计算吸附率，吸附率为金属离子的浓度的前后差值与吸附前的浓度值的百分比，结果见表1。
表1吸附率
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法
<130> JWE173053
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1280
<212> DNA
<213> 海水冷杆菌的16S rDNA基因全序列(Psychrobacter aquimaris 16Sribosomal DNA gene)
<400> 1
acttaggaat ctacctagta gtgggggata gcacggggaa actcgtatta ataccgcata 60
cgacctacgg gagaaagggg gcagtttact gctctcgcta ttagatgagc ctaagtcgga 120
ttagctagat ggtggggtaa aggcctacca tggcgacgat ctgtagctgg tctgagagga 180
tgatcagcca caccgggact gagacacggc ccggactcct acgggaggca gcagtgggga 240
atattggaca atgggggaaa ccctgatcca gccatgccgc gtgtgtgaag aaggcctttt 300
ggttgtaaag cactttaagc agtgaagaag actccgtggt taatacccac ggacgatgac 360
attagctgca gaataagcac cggctaactc tgtgccagca gccgcggtaa tacagagggt 420
gcaagcgtta atcggaatta ctgggcgtaa agcgagcgta ggtggcttga taagtcagat 480
gtgaaatccc cgggcttaac ctgggaactg catctgaaac tgttaggcta gagtaggtga 540
gagggaagta gaatttcagg tgtagcggtg aaatgcgtag agatctgaag gaataccgat 600
ggcgaaggca gcttcctggc atcatactga cactgaggct cgaaagcgtg ggtagcaaac 660
aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgtc tactagtcgt tgggtccctt 720
gaggacttag tgacgcagct aacgcaataa gtagaccgcc tggggagtac ggccgcaagg 780
ttaaaactca aatgaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 840
atgcaacgcg aagaacctta cctggtcttg acatatctag aatcctgcag agatgcggga 900
gtgccttcgg gaattagaat acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 960
gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgtcctta gttaccagcg ggttaagccg 1020
ggaactctaa ggatactgcc agtgacaaac tggaggaagg cggggacgac gtcaagtcat 1080
catggccctt acgaccaggg ctacacacgt gctacaatgg taggtacaga gggcagctac 1140
acagcgatgt gatgcgaatc tcaaaaagcc tatcgtagtc cagattggag tctgcaactc 1200
gactccatga agtaggaatc gctagtaatc gcggatcaga atgccgcggt gaatacgttc 1260
ccgggccttg tacacaccgc 1280
Claims (9)
1.一种利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，包括以下步骤：
（1）将选取的海洋冷杆菌菌株的菌种接种到固体培养基上培养，加入无菌水制成菌种液；
（2）将菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；
（3）将发酵菌液透析去除部分培养基成份后离心得上清液，再加入乙醇静置沉降、离心分离得粗提产物；
（4）将粗提产物溶于水中得到粗产品溶液，加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物并干燥得到精提产物；
（5）将精提产物溶于琼脂与淀粉的混合水溶液中，再冷却凝固制成重金属高效吸附剂。
2.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，所述的海洋冷杆菌菌株为Psychrobacter sp. GHF2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年8月9日；保藏编号CGMCC No. ：14509。
3.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，1kg的液体培养基的组份如下：蛤肉汤30～50 g、蛋白胨2～3 g、磷酸氢二钾0.6～1.8g、硫代硫酸钠0.3～0.7 g、柠檬酸铁铵0.5～1.1 g和葡萄糖20～30 g，余量为陈化海水，固体培养基为向1 kg液体培养基中加入15～20 g的琼脂凝固制成的斜面培养基。
4.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，步骤（1）中培养温度为18～23℃、时间36～48小时，无菌水与固体培养基体积比为1.0～1.5:1。
5.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，步骤（2）中菌种液接种浓度为0.8～1.4 mL菌种液/100 mL液体培养基，发酵培养温度为18～23 ℃、时间3～5天，摇床转速为160～200 r/min。
6.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，其特征在于，步骤（3）中发酵菌液透析去除部分培养基成份的过程如下：将发酵菌液置于旋转蒸发仪上，在60～65℃下减压浓缩至原体积的10%～15%，然后装入截留分子量为8000道尔顿的透析袋中用去离子水透析，至透析袋外侧的去离子水无色无味。
7.根据权利要求1或6所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，步骤（3）中乙醇与上清液的体积比为2～4:1，1～5 ℃静置6～10小时，离心速率为6000～8000 r/min。
8.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，步骤（4）中的乙醇与粗产品溶液体积比2～4:1，1～5 ℃静置6～10小时，离心速率6000～8000 r/min，干燥温度为90～105 ℃、时间为1～2小时。
9.根据权利要求1所述的利用海洋冷杆菌属菌株制备重金属吸附剂的方法，其特征在于，步骤（5）中向琼脂与淀粉的混合物中加入水并加热溶解，琼脂质量百分浓度为2%～5%，琼脂与淀粉的重量比为1.2～2:1，然后加入精提产物溶解均匀，将混合液降温凝固，在60～80℃干燥90～120分钟得到重金属吸附剂，琼脂与精提产物的重量比为1:1.2～1.8。
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