CN115786160A

CN115786160A - 一株拮抗肺炎克雷伯氏菌的冷杆菌yz 33及其应用

Info

Publication number: CN115786160A
Application number: CN202210822062.5A
Authority: CN
Inventors: 尤芷萱; 赵磊; 苏瑾; 梁文华
Original assignee: Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Medical University
Priority date: 2022-07-12
Filing date: 2022-07-12
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2042-07-12
Also published as: CN115786160B

Abstract

本发明公开了一株拮抗肺炎克雷伯氏菌的冷杆菌YZ33及其应用。本发明提供了一株拮抗呼吸道致病菌的Psychrobactersp.YZ33菌株，于2022年07月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCCNo：62605。本发明所述Psychrobactersp.YZ33菌株的发酵上清液可高效拮抗呼吸道致病菌，可用于制备拮抗呼吸道致病菌或治疗呼吸道感染的药剂，具有较大的应用前景。

Description

一株拮抗肺炎克雷伯氏菌的冷杆菌YZ 33及其应用

技术领域：

本发明属于微生物应用技术领域，具体涉及一株拮抗肺炎克雷伯氏菌的冷杆菌Psychrobacter sp.YZ 33及其应用。

背景技术：

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)是一种可引起人和多种动物患病的条件性致病菌。该菌主要引起人和多种动物的肺炎，呼吸道感染。近年来，关于该菌致病的报道越来越多，已经成为除大肠杆菌外最重要的条件致病菌。由于滥用抗生素导致该菌耐药性不断增强，大大增加了该菌所致疾病的发生率和死亡率，给临床治疗带来严重困难，而通过其他微生物的对肺炎克雷伯氏菌的拮抗作用，被认为是一种行之有效的治疗上呼吸道感染的新方法。有几个专利公开了肺炎克雷伯氏菌拮抗益生菌的筛选方法，且针对的呼吸道致病菌种类有限，难以满足实际应用需求。目前也还没有发现Psychrobacter种属中有高效拮抗呼吸道致病菌的肺炎克雷伯氏菌菌株的相关报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供拮抗呼吸道致病菌肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的Psychrobacter sp.YZ 33菌株，其于2022年07月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62605。

本发明的拮抗呼吸道致病菌的Psychrobacter spYZ 33菌株，其上清液可高效拮抗肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)，其对肺炎克雷伯氏菌的抑制率可达92.13％。

因此本发明的第二个目的是提供上述Psychrobacter sp.YZ 33菌株或其发酵上清液在制备拮抗呼吸道致病菌的药剂或治疗呼吸道感染的药物中的应用。

所述的呼吸道致病菌是肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄菌、铜绿假单胞菌、白喉棒状杆菌或结核分枝杆菌中的一种或多种。

优选的，所述的Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液是将活化好的菌株Psychrobacter sp.YZ 33接种于发酵培养液中，接种量为体积比2～6％，于25～40℃下养培养18～36h，再在0～4℃下、以7000～9000rpm的转速离心5～15min后，将上清液经0.20～0.30微米微孔滤膜过滤得到Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液。

优选的，上述Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液是将活化好的菌株Psychrobacter sp.YZ 33接种于发酵培养液中，接种量为体积比2％，于37℃下好氧培养24h，再在4℃下、以8000rpm的转速离心10min后，经过离心处理后，将上清液经0.22微米微孔滤膜过滤得到Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液。

优选的，所述的发酵培养液每升配制方法是：将蛋白胨1g、葡萄糖2g、NaCl 0.5g混合均匀后整体加入1L蒸馏水中，再于121℃下高压灭菌20min得到。

本发明的第三个目的是提供一种拮抗呼吸道致病菌或治疗呼吸道感染的药剂，含有Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液作为活性成分。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株拮抗呼吸道致病菌的Psychrobacter sp.YZ 33菌株，所述菌株于2022年07月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为：GDMCC No：62605。本发明所述Psychrobacter sp.YZ 33菌株的发酵上清液可高效拮抗呼吸道致病菌，可用于制备拮抗呼吸道致病菌或治疗呼吸道感染的药剂，具有较大的应用前景。

Psychrobacter sp.YZ 33于2022年07月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62605。

附图说明

图1是Psychrobacter spYZ 33的进化树。

具体实施方式

结合以下实施例对本发明作进一步说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1。

以实验例详细说明Arthrobacter phenanthrenivoransL131菌株的分离和鉴定过程。

1、Psychrobacter sp YZ 33菌株的分离

(1)培养基配置

筛选培养基：将氯化铵0.5g、Na₂S₂O₃·5H₂O 5g、蛋白胨1g、CaCl₂0.2g、KH₂PO₄3g、微量元素溶液10mL一起投入蒸馏水1000mL中，调节溶液pH保持7.0，在121℃下进行20min灭菌。

微量元素溶液(g L^-1)的配置是将乙二酸四乙酸二钠(EDTA)0.22g、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O0.11g、CoCl₂·6H₂O 0.1g、MnCl₂·4H₂O 0.425g，ZnCl₂0.05g、CuSO₄·5H₂O 0.015g、Na₂SeO₄·2H₂O0.01g加入到1L水中，搅拌溶解，即得。

(2)本发明的Psychrobacter sp YZ 33菌株是从南方医科大学的运动场的空气中分离、纯化而得。

其分离纯化方法如下：

使用安德森六级空气微生物采样器BY-300采集空气样品，采样前给主机充好电，用75％酒精擦拭撞击器并紫外30分钟。采样时，在选定的采样地点，用三脚架将撞击器支起，放置于距离地面1.5米的高度，用橡胶管连接好主机，校正流量，使采样流量稳定在28.3L/min。带好口罩和手套，一手打开培养盖一手迅速盖上撞击盘，将培养皿(里面含有筛选培养基)按顺序放入。打开撞击器进去口上盖，离开采样点2米之外，启动采用。采样时间为10分钟，3次重复。记录采样当天气象参数。采样结束后，迅速取出采样平皿扣上盖子，放入无菌箱中带回实验室。皿底朝上，于37℃恒温箱中培养24小时，检查菌落生长情况。从中挑取快速生长的菌落进行纯化，并使用硫化物氧化能力筛选，最后获得菌株YZ 33。

2、Psychrobacter sp YZ 33菌株的鉴定

(1)菌株YZ33的形态和生理、生化特性鉴定：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法，菌株YZ33为革兰氏阴性，杆状，氧化酶阴性，过氧化氢酶阳性，生长最佳pH6～8，最佳温度是37℃。

b.在十分之一营养琼脂培养基平板上培养24h后，菌落表面淡黄色，圆形，有小的凸起。

(2)Psychrobacter sp.YZ 33的分子生物学鉴定：

提取菌株YZ 33的16S rRNA并测序，其序列如SEQ ID NO：1所示(aacagagagaagcttgcttctctgctgacgagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctacctagtagtgggggataacttgccgaaaggtaagctaataccgcatacgacctacgggagaaagcaggggaccttttggccttgcgctattagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaagagcctaccaaggcgacgatctgtagctggtctgagaggatgatcagccacaccgggactgagacacggcccggactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatggggggaaccctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttttggttgtaaagcactttaagcagtgaagaagaggttttggctaatacccaaagctgatgacattagctgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcgagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgagcgtaggtggcttgataagtcagatgtgaaagccccgggcttaacctgggaacggcatctgaaactgtcaggctagagtaggtgagaggaaggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccttctggcatcatactgacactgaggttcgaaagcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtctactagtcgttgggggacttgattccttagtgacgcagctaacgcaataagtagaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggtcttgacatacacagaatcttgtagagatacgagagtgccttcgggaattgtgatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttagttaccagcgactcggtcgggaactctaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccagggctacacacgtgctacaatggtaggtacagagggcagcgacacagcgatgtgaagcgaatctcaaaaagcctatcgtagtccagattggagtctgcaactcgactccatgaagtaggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagttgattgcaccagaagtgggtagcctaactt)，将其与NCBI网站数据库进行BLAST分析，结果分析表明，其与菌株Psychrobacter ciconiae的模式菌种的相似性最高，其中与ArthrobacterPsychrobacter ciconiae 170/10^T的序列相似性为96.73％，发育进化树如图1所示。综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，鉴定菌株YZ 33属于冷杆菌Psychrobacter，分类命名为Psychrobacter sp.YZ 33，其于2022年07月06日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编：510070，保藏编号为：GDMCC No：62605。

3.Psychrobacter sp.YZ 33菌株上清液的拮抗作用

(1)将活化好的菌株Psychrobacter sp.YZ 33，按2％(v/v)接种于十分之一营养琼脂液体培养基(g/L，营养琼脂液体培养基的配制过程具体是将蛋白胨1g，葡萄糖2g，NaCl0.5g，加入1L蒸馏水中，再于121℃高压灭菌20min)中37℃，好氧培养24h，再在4℃下、以8000rpm的转速离心10min，然后取其上清液经0.22微米微孔滤膜过滤，所得液体即为菌株的无细胞发酵液，置于4℃保存备用。

(2)将活化好的致病菌株：肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia CMCC(B)46117)，致病菌稀释成OD₆₀₀为0.2，以体积比10％的接种量把步骤(1)的无细胞发酵液接种到致病菌的发酵液中。对照组为无添加细胞发酵液，37℃恒温培养。在12h取样1mL，14000rpm，30s，去上清液，加1mLPBS缓冲溶液重悬；以PBS缓冲溶液为空白对照，测试OD₆₀₀的值。其原始测试结果如表1所示，计算得到的抑制作用的平均值如表1所示。

表1菌株YZ 33的无细胞上清液对肺炎克雷伯氏菌的抑制作用

由此可见，该拮抗呼吸道致病菌的Psychrobacter sp YZ 33菌株，其上清液可高效拮抗肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)，对肺炎克雷伯氏菌的抑制率可达92.13％。Psychrobacter sp.YZ 33菌株的发酵上清液可高效拮抗呼吸道致病菌，可用于制备拮抗呼吸道致病菌或治疗呼吸道感染的药剂，具有较大的应用前景。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.Psychrobacter sp.YZ 33菌株，保藏编号为：GDMCC No：62605。

2.权利要求1所述的Psychrobacter sp.YZ 33菌株或其发酵上清液在制备拮抗呼吸道致病菌的药剂或治疗呼吸道感染的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的呼吸道致病菌是肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄菌、铜绿假单胞菌、白喉棒状杆菌或结核分枝杆菌中的一种或多种。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液是将活化好的菌株Psychrobacter sp.YZ 33接种于发酵培养液中，接种量为体积比2～6％，于25～40℃下养培养18～36h，再在0～4℃下、以7000～9000rpm的转速离心5～15min后，将上清液经0.20～0.30微米微孔滤膜过滤得到Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，上述Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液是将活化好的菌株Psychrobacter sp.YZ 33接种于发酵培养液中，接种量为体积比2％，于37℃下好氧培养24h，再在4℃下、以8000rpm的转速离心10min后，经过离心处理后，将上清液经0.22微米微孔滤膜过滤得到Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养液每升配制方法是：将蛋白胨1g、葡萄糖2g、NaCl 0.5g混合均匀后整体加入1L蒸馏水中，再于121℃下高压灭菌20min得到。

7.一种拮抗呼吸道致病菌或治疗呼吸道感染的药剂，其特征在于，含有权利要求1所述的Psychrobacter sp.YZ 33菌株发酵上清液作为活性成分。