CN112111426A - 一种亚麻假单胞菌及其在大葱紫斑病生防中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种亚麻假单胞菌Pseudomonas lini X85，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20395。该菌对大葱紫斑病病原菌具有较强的拮抗作用，可应用于农业生产中大葱紫斑病的防治。

Description

一种亚麻假单胞菌及其在大葱紫斑病生防中的应用
技术领域
本发明涉及植物病害防治技术领域，更具体的说是涉及一种亚麻假单胞菌及其在大葱紫斑病生防中的应用。
背景技术
大葱紫斑病是大葱的主要病害，其危害大葱的叶片和花梗，发病严重时病部软化倒折，可导致株叶和花梗全部枯死，造成严重减产。随着大葱种植面积的增加，且多年连作，大葱病叶残留于土壤中致使土壤带菌量增加，进而使得大葱紫斑病日益严重。
目前，针对大葱紫斑病主要采用化学防治，然而化学防治容易使大葱紫斑病病原菌形成耐药性，并且会带来一系列环境污染问题，因此，开展大葱紫斑病的生物防治研究具有重大意义，如何进行大葱紫斑病的生物防治成为本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种亚麻假单胞菌，对大葱紫斑病病原菌具有较强的拮抗作用，可应用于农业生产中大葱紫斑病的防治。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
亚麻假单胞菌Pseudomonas liniX85，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.20395，保藏时间为2020年7月17日。
上述亚麻假单胞菌在大葱紫斑病生防中的应用。
一种生防制剂，包括上述亚麻假单胞菌。
一种大葱紫斑病的防治方法，将上述亚麻假单胞菌或生防制剂施于大葱叶片上，使亚麻假单胞菌在大葱叶片上定植。
优选地，亚麻假单胞菌或生防制剂施用时期为大葱成株期。
优选地，亚麻假单胞菌制成浓度为3.0×106-4.0×106cfu/mL的菌液，喷施于大葱叶片上，喷施量40-50L/亩。
由上述技术方案可知，本发明公开的亚麻假单胞菌Pseudomonas lini X85在大葱叶片上易于定植，对大葱紫斑病病原菌具有较强的拮抗作用，能够较好地满足农业生产中防治大葱紫斑病的需求。
附图说明
图1所示为X85菌落形态。
图2所示为电子显微镜下X85的菌体形态。
图3所示为X85菌株16S rDNA进化树。
图4所示为X85菌株与大葱紫斑病病原菌对峙培养结果。
图5所示为X85菌株发酵液对大葱紫斑病病原菌的抑制效果，其中，左图为对照组，右图为试验组。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1亚麻假单胞菌Pseudomonas lini X85的分离及鉴定
由河南新野县大葱紫斑病发生田的大葱叶片表面分离、筛选和培养获得大葱紫斑病病原拮抗菌菌株，编号X85；将其接种于NA培养基平板上，30℃，培养24小时；菌落呈乳白色，半透明，表面光滑，边缘较为规则(图1)；显微观察菌体呈杆状，两端钝圆，大小为长1.5-1.7μm，宽0.4-0.6μm(图2)。
16S rDNA鉴定：
挑取少量单菌落，置于PCR管中，加入20μL去离子水，95℃处理10分钟，冷却后作为PCR模板，进行PCR扩增。扩增所用引物为细菌16S rDNA序列通用引物27F和1492R。
PCR扩增体系为20μL：模板1μL，正向引物和反向引物各1μL，Taq酶0.3μL，Buffer2μL，dNTP 1.2μL，其余用dd水补足。
扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，31个循环，最后72℃稳定5min。
对扩增获得的16S rDNA进行测序，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，长度为1436bp。经BLAST比对分析，构建系统进化树，如图3所示，X85的16S rDNA与Pseudomonaslini的相似度最高，达98％，是Pseudomonas lini的近似种。
结合形态特征和分子生物学鉴定，确定菌株X85为亚麻假单胞菌Pseudomonaslini。
实施例2鉴定X85对大葱紫斑病病原菌的抑制作用(对峙培养)
X85和大葱紫斑病病原菌(由发病葱叶分离得到)进行对峙培养：
将X85以点接法接种到PDA平板上，距离接种点2cm接种大葱紫斑病病原菌菌饼(直径5mm)；设置3个重复及空白对照。25℃培养7d，记录抑菌带宽度，根据抑菌带宽度大小及生长情况即可判断对大葱紫斑病病原菌的抑制强度。如图4所示，X85抑菌带宽，表明其对大葱紫斑病病原菌的生长抑制效率较高。
实施例3鉴定X85对大葱紫斑病病原菌的抑制作用
将纯化的X85单菌落接种于假单胞菌基础培养基(牛肌肉组织消化物16.0g、酶水解酪蛋白10.0g、K2SO410.0 g、六水氯化镁MgCl2·6H2O 1.4g、琼脂11.0g，pH＝7.1±0.2)上，30℃培养48h后，接入装有100mL假单胞菌基础液体培养基(牛肌肉组织消化物16.0g、酶水解酪蛋白10.0g、K2SO410.0g、MgCl2·6H2O1.4g，pH＝7.0±0.2)的250mL三角瓶中，30℃、200r/min振荡培养24h。菌悬液经12000rpm离心，再经孔径0.22μm细菌过滤器过滤。
试验组：吸取1mL滤液加入到19mL 45℃左右的PDA培养基中，混匀，待培养基冷却后，接入大葱紫斑病病原菌饼(直径5mm)；
对照组：吸取1mL假单胞菌基础液体培养基加入到19mL45℃左右的PDA培养基中，混匀，待培养基冷却后，接入大葱紫斑病病原菌饼(直径5mm)；
每组3次重复，25℃培养7d；培养结束后采用十字交叉法测量菌落直径，根据如下公式计算抑制率。
抑制率＝[(对照组菌落直径－试验组菌落直径)/(对照组菌落直径－菌饼直径)]×100％。
如图5所示，对照组大葱紫斑病病原菌生长快速，生长7d的菌落直径平均为4.2cm，而加入菌株X85发酵液的PDA培养基上，大葱紫斑病病原菌生长缓慢，菌落直径平均为1.7cm，因此计算抑菌率平均为67.5％。
实施例4制备生防制剂(悬浮液菌剂)
(1)活化：使用假单胞菌基础培养基(同实施例3)对X85菌株进行活化。
(2)种子培养：将步骤(1)培养出的单菌落接入装有假单胞菌液体培养基(同实施例3)的250mL三角瓶中，在30℃、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期。
(3)生产培养：将步骤(2)种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，按5％(体积)接种量接入假单胞菌生产培养基(同假单胞菌液体培养基)，于30-32℃、pH＝7.0条件下培养至对数生长期，即制得生防菌剂。
测得生防菌剂中亚麻假单胞菌体数量约为4.2×108cfu/mL。
实施例5田间测试实施例4生防菌剂在大葱紫斑病生防中的应用效果
在新野大葱种植区，随机选取6个小区，每个小区大约200株大葱，面积约为4m2，于成株期开展试验。
试验组：取实施例4生防菌剂稀释100倍，使菌体浓度约为4.0×106cfu/mL，采用喷雾法喷施到大葱植株叶片，共处理3个小区，每个小区喷施0.3L，即亩用量约为50L。
对照组：于大葱植株叶片喷施无菌水，共处理3个小区，每个小区喷施0.3L。
20d后调查大葱叶片发病情况，统计病情指数，根据实验组和对照组病情指数计算防效。
病情分级标准：
0级无病斑；
1级病斑占整个叶面积的5％以下；
3级病斑占整个叶面积的6％～10％；
5级病斑占整个叶面积的11％～20％；
7级病斑占整个叶面积的21％～50％；
9级病斑占整个叶面积的51％以上。
病情指数＝100×∑(各级病叶数×相应级数代表值)/(调查总叶数×最高级数代表值)。
结果显示，试验组大葱紫斑病病情指数平均为22，而对照组病情指数为62，故实施例4生防菌剂的平均防效为64.5％。
防效(100％)＝((对照组病情指数-试验组病情指数)/对照组病情指数)×100％。
实施例6X85在大葱叶片上的定植能力检测
实施例5田间试验中，调查大葱紫斑病病情指数的同时，采回各组大葱叶片，分离叶片表面细菌，并鉴定是否存在亚麻假单胞菌：
用无菌水刷洗大葱叶片表面微生物到1.5mL离心管中，12000rpm离心3min，弃上清后，加入无菌水后重悬，将悬浮液涂布在营养琼脂培养基平板(NA)，30℃培养24h，待细菌菌落长出后，纯化菌落，PCR扩增，进行16S rDNA鉴定。
经鉴定，从实验组大葱叶片表面能够分离出亚麻假单胞菌，占所有分离细菌总数的25.5％。从对照组大葱叶片表面分离的亚麻假单胞菌仅为2.4％。由此可见，亚麻假单胞菌X85在大葱叶片的定植能力较好，能够持续地发挥生防效果。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 河南科技学院
<120> 一种亚麻假单胞菌及其在大葱紫斑病生防中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1436
<212> DNA
<213> Pseudomonas lini
<400> 1
ctggcgggcg gctaacacat gcaagtcgag cggtagagag gtgcttgcac ctcttgagag 60
cggcggacgg gtgagtaatg cctaggaatc tgcctggtag tgggggataa cgctcggaaa 120
cggacgctaa taccgcatac gtcctacggg agaaagcagg ggaccttcgg gccttgcgct 180
atcagatgag cctaggtcgg attagctagt tggtgaggta atggctcacc aaggcgacga 240
tccgtaactg gtctgagagg atgatcagtc acactggaac tgagacacgg tccagactcc 300
tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agccatgccg 360
cgtgtgtgaa gaaggtcttc ggattgtaaa gcactttaag ttgggaggaa gggcagttac 420
ctaatacgta attgttttga cgttaccgac agaataagca ccggctaact ctgtgccagc 480
agccgcggta atacagaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt 540
aggtggttcg ttaagttgga tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcattcaaaa 600
ctgtcgagct agagtatggt agagggtggt ggaatttcct gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gatataggaa ggaacaccag tggcgaaggc gaccacctgg actgatactg acactgaggt 720
gcgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780
caactagccg ttgggagcct tgagctctta gtggcgcagc taacgcatta agttgaccgc 840
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggcctt gacatccaat 960
gaactttcca gagatggatt ggtgccttcg ggagcattga gacaggtgct gcatggctgt 1020
cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccttgtcctt 1080
agttaccagc acgtaatggt gggcactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacggcctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gtcggtacag agggttgcca agccgcgagg tggagctaat cccgcaaaac cgatcgtagt 1260
ccggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagtcggaat cgctagtaat cgcgaatcag 1320
aatgtcgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380
ggttgcacca gaagtagcta gtctaacctt cggggggacg gtaccacggt ggattc 1436

Claims (6)

1.一种亚麻假单胞菌，其特征在于，亚麻假单胞菌Pseudomonas liniX85，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20395。
2.根据权利要求1所述的一种亚麻假单胞菌在大葱紫斑病生防中的应用。
3.一种生防制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的一种亚麻假单胞菌。
4.一种大葱紫斑病的防治方法，其特征在于，将权利要求1所述的一种亚麻假单胞菌或权利要求3所述的一种生防制剂施于大葱叶片上，使亚麻假单胞菌在大葱叶片上定植。
5.根据权利要求4所述的一种大葱紫斑病的防治方法，其特征在于，所述亚麻假单胞菌或所述生防制剂施用时期为大葱成株期。
6.根据权利要求4所述的一种大葱紫斑病的防治方法，其特征在于，亚麻假单胞菌制成浓度为3.0×106-4.0×106cfu/mL的菌液，喷施于大葱叶片上，喷施量40-50L/亩。
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