CN112251382A - 一种恶臭假单胞菌db-1及其培养方法和应用 - Google Patents

一种恶臭假单胞菌db-1及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种恶臭假单胞菌DB‑1及其培养方法和应用，所述恶臭假单胞菌DB‑1为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）DB‑1，于2020年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M 2020311；所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）DB‑1用LB液体培养基在30℃、170 r/min振荡培养24h；所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）DB‑1用于降解养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮。本发明的恶臭假单胞菌DB‑1能使养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐、总氮明显降低，且对人和养殖动物无害，不产生二次污染，可规模化生产应用于改良水产养殖环境和养殖尾水减量排放。

Description

一种恶臭假单胞菌DB-1及其培养方法和应用
【技术领域】
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种恶臭假单胞菌DB-1及其培养方法和应用。
【背景技术】
我国是水产养殖大国，养殖产量约占世界养殖产量的68%，其中，池塘养殖产量约占45%。养殖过程中由于大量投喂饲料，导致氮元素在水中的积累，也是养殖水质恶化的主要原因之一。水体中的硝酸盐氮的积累对养殖动物具有一定的潜在的威胁和毒性，特别是在局部缺氧环境中，硝酸盐氮会被转化为亚硝酸盐氮，亚硝酸盐氮的致癌性使得原本毒性很小的污染物毒性增强，造成水质恶化，并伴随着滋生大量的病毒、细菌、浮游生物等微生物，亚硝酸盐浓度过高时容易导致鱼虾等养殖动物大批患病甚至死亡，严重影响水质和水产品安全。另一方面，我国的池塘养殖尾水基本未经处理直接排放，由于养殖尾水中一般都含有较高的总氮，导致了对周边水域环境不同程度的富营养化污染。为改良养殖水质、减少养殖病害发生、减少养殖动物应激、确保养殖安全和保护周边水域生态环境，很多水产养殖者都通过采用微生物制剂来降解水中的硝酸盐和总氮，改善水体环境，缓解水质恶化产生的经济损失及环境污染。众多研究也发现，从养殖废水或养殖污泥中筛选出的土著微生物的脱氮性能更加高效。然而，当前降解硝酸盐和总氮的微生物制剂产品，普遍存在用量偏大、养殖应用成本偏高、降解处理效率偏低和处理效果稳定性较差等问题。因此，急需开发既能高效地降解养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮，又能提高处理效果稳定性和降低使用成本的益生菌。
本申请的所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1与现有公开专利（专利号为CN200610140871.9和CN200710049432.1）所公开的恶臭假单胞菌菌株的主要区别与优势在于：
（1）本申请的恶臭假单胞菌DB-1的接种量都明显低于现有菌株的接种量，节约了使用成本；
（2）恶臭假单胞菌DB-1具有较强的降解硝酸盐和总氮的能力，在C/N比值与它们接近或更低的条件下，对硝酸盐和总氮浓度的降解率明显高于现有菌株；
（3）恶臭假单胞菌DB-1是属于厌氧反硝化细菌，不需要提供溶解氧。而现有的菌株都属于好氧反硝化细菌，降解硝酸盐和总氮的过程中必须提供一定浓度的溶解氧。
（4）恶臭假单胞菌DB-1可广泛应用于降解极低C/N比值的养殖水体（C/N＜1）中的硝酸盐和总氮浓度，在不投放补充碳源的条件下，仍然具有较高的降解率：24h硝酸盐氮浓度的降解率59.6%、总氮浓度的降解率45.0%。
【发明内容】
本发明要解决的技术问题，在于提供一种恶臭假单胞菌DB-1及其培养方法和应用，该菌株既能高效地降解养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮，又能提高处理效果稳定性和降低使用成本，具有运行成本较低，不产生二次污染等优点。
本发明是这样实现的：
本发明的第一个目是提供一种恶臭假单胞菌DB-1，所述恶臭假单胞菌DB-1为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1，于2020年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020311。
本发明的第二个目是提供一种恶臭假单胞菌DB-1的培养方法，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用LB液体培养基在30℃、170 r/min振荡培养24h。
本发明的第三个目是提供一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1在改良养殖水质和养殖尾水减量排放中的应用。
优选的，上述应用中，将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于降解养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮。
优选的，上述应用中，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1在降解养殖水体中硝酸盐和总氮时，恶臭假单胞菌DB-1的用量为104 cfu/mL；在降解养殖尾水中硝酸盐和总氮时，恶臭假单胞菌DB-1的用量为105 cfu/ mL。
本发明的第四个目是提供一种恶臭假单胞菌DB-1的应用之二，将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于制备养殖水体中硝酸盐和总氮的降解制剂。
本发明的第五个目是提供一种恶臭假单胞菌DB-1的应用之三，将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于制备养殖尾水中硝酸盐和总氮的降解制剂。
本发明具有如下优点：
本发明提供的一种能净化水质的恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1属于异养菌，具有良好降解硝酸盐和总氮的能力和使用量较低的优点，有助于降低使用成本；总之，其能使养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮浓度明显降低，且对人和养殖动物无害，不产生二次污染，可规模化生产应用于改良水产养殖环境和养殖尾水减量排放，具有良好的市场应用前景。
【具体实施方式】
本发明涉及一种恶臭假单胞菌DB-1，所述恶臭假单胞菌DB-1为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1，于2020年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020311。
所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用LB液体培养基在30℃、170 r/min振荡培养24h。
本发明还涉及上述一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1在改良养殖水质和养殖尾水减量排放中的应用。具体的，将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于降解养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮。
较优的，所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1在降解养殖水体中硝酸盐和总氮时，恶臭假单胞菌DB-1的用量为104 cfu/mL；在降解养殖尾水中硝酸盐和总氮时，恶臭假单胞菌DB-1的用量为105 cfu/ mL。
本发明又涉及上述一种恶臭假单胞菌DB-1的应用之二，将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于制备养殖水体中硝酸盐和总氮的降解制剂。
本发明涉及上述一种恶臭假单胞菌DB-1的应用之三，将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于制备养殖尾水中硝酸盐和总氮的降解制剂。
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1、恶臭假单胞菌DB-1的分离筛选
取样：从福建省厦门市集美区集美大学水产试验场鳗鱼养殖车间，取10g鳗鲡循环水水处理系统生物滤池底部的生物填料。
富集：生物填料加入装有100mL液体富集培养基的无菌蓝盖瓶中，测定富集培养基的起始硝酸盐氮浓度，在低温摇床上20℃培养48h后，每24h测定富集培养基中的硝酸盐氮浓度，当硝酸盐氮浓度下降达90%以上时，菌液用于细菌分离。
富集培养基(g/L)：KNaC4H4O6·4H2O 20、KNO3 2、K2HPO4 0.5、MgSO4·7H2O 0.2，单蒸馏水配制，pH 7.2 ～ 7.6，121℃灭菌30min。
分离纯化：取0.1mL经富集培养后的菌悬液，用无菌水以10倍稀释法分别稀释到10-3，10-4，10-5等。后取0.1mL稀释液涂布于BTB固体培养基上，每个稀释浓度分别涂布3个平板，在厌氧恒温培养箱（20℃）中培养24h，待BTB固体培养基上长出菌落。选择菌落数量合适的培养基平板，刮取单菌落（选择菌落周围有出现蓝色晕圈的单菌落）接种于新鲜的BTB固体培养基上，重复3次。直到得到纯培养物。
BTB固体培养基(g/L)：KNO3 1、KH2PO4 1、FeC12·6H2O 0.5、CaC12·2H2O 0.2、MgSO4·7H2O 1、琥珀酸钠8.5、琼脂18、1%溴百里酚蓝（无水乙醇溶解）1mL，单蒸馏水配制，调节pH至7.2 ～ 7.6，121℃灭菌30min。
筛选和保藏：挑选BTB 培养基上菌落周围出现蓝色晕圈的单菌落，于厌氧条件下，划线接种至分离纯化培养基中，在厌氧恒温培养箱（20℃）中培养24h，重复分离纯化3次，直到单菌落长出。接种至斜面分离纯化培养基中培养并4℃保藏，备用。
分离纯化培养基(g/L)：KNaC4H4O6·4H2O 20、KNO3 2、K2HPO4 0.5、Mg SO4·7H2O0.2、琼脂18，单蒸馏水配制，pH值7.2 ～ 7.6，121℃灭菌30min。
实施例2、恶臭假单胞菌DB-1的鉴定
挑取上述保藏的菌株单菌落，接种在LB 液体培养基中30℃条件下 170 r/min 振荡培养 12h后，离心收集菌体，利用细菌 DNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取菌株的基因组DNA，利用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）（如SEQ ID No:1所示）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）（如SEQ ID No:2所示），进行16S rRNA基因的PCR扩增，PCR反应条件为：95℃预变性5 min，30个循环（95℃ 1 min、53℃ 1 min、72℃1.5min），延伸72℃10min。用胶回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）纯化大约1.5kb的目的片段，将纯化后的PCR产物送至（北京奥维森基因科技有限公司）进行测序。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠 10，单蒸馏水配制，pH值7.5，121℃灭菌30min。
获得的基因序列如SEQ ID No:3所示。
将所得上述序列SEQ ID No:3经NCBI网站的BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行在线比对分析，利用MEGA X软件中的Neighbor-Joining方法构建系统发育树，鉴定菌株DB-1是恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），命名为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）DB-1。
实施例3、恶臭假单胞菌DB-1的养殖水体硝酸盐氮和总氮降解率与安全性检测
挑取恶臭假单胞菌DB-1单菌落接种于灭菌LB培养基中，30℃条件下170 r/min振荡培养24h。以3.5×104 cfu/mL的接种量一次性添加至含1m3水体的养殖美洲鳗鲡的塑料桶中，对照组不加细菌，设双平行对照试验，处理组和对照组每桶的养殖美洲鳗鲡重量11.2kg，平均规格140g/尾，试验周期7天，于0h、24h和168h分别采集各桶养殖水样，水样经离心取上清液测定硝酸盐和总氮的浓度，计算降解率。处理组和对照组均正常按1.8%投料率投喂饲料和管理，美洲鳗鲡健康生长，无病和死亡。
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠 10，单蒸馏水配制，pH值7.5，121℃灭菌30min。
结果（表1）表明，添加菌液的处理组24h鳗鲡养殖水体（C/N＜1）中的硝酸盐氮浓度从4.611mg/L降至1.863mg/L（降解率59.6%），总氮浓度从10.83mg/L降至5.957mg/L（降解率45.0%）；168h处理组鳗鲡养殖水体的硝酸盐氮浓度2.426mg/L，显著低于对照组69.7%，总氮浓度9.01mg/L，显著低于对照组52.4%；由此可知，恶臭假单胞菌DB-1在C/N＜1的养殖水体中能降解硝酸盐氮浓度60%～70%、总氮浓度45%～52%，能良好控制硝酸盐氮和总氮浓度，稳定水质且具有良好的养殖安全性。
表1. 鳗鲡养殖水质因子浓度动态对比
因子（mg/L） 0 0 24h 24h 168h 168h
对照组 处理组 对照组 处理组 对照组 处理组
硝酸盐氮 4.507 4.611 5.018 1.863 8.015 2.426
总氮 10.68 10.83 12.13 5.957 18.91 9.01
实施例4、恶臭假单胞菌DB-1的养殖尾水硝酸盐氮和总氮降解率测定和异养性
挑取菌株DB-1单菌落接于灭菌LB培养基中，30℃条件下170 r/min振荡培养24h。以3.5×105 cfu/mL的接种量一次性添加至1L的鳗鲡养殖尾水中（调节C/N比为11.8），24h采集水样离心取上清液测定硝酸盐和总氮氮的降解率。
结果表明，添加菌液的养殖尾水（C/N比11.8）经24h，硝酸盐氮浓度从14.88mg/L降至0.804mg/L（降解率94.6%），总氮浓度从16.64mg/L降至3.927mg/L（降解率76.4%）。另一方面也表明，由于C/N比较高，碳源的增加使恶臭假单胞菌DB-1对硝酸盐氮和总氮的降解率比在低C/N比值养殖水体中的降解率有大幅度的提升，也证明了恶臭假单胞菌DB-1属于异养菌。
综上，恶臭假单胞菌DB-1属于异养菌，具有良好降解硝酸盐和总氮的能力；恶臭假单胞菌DB-1具有使用量较低的优点，当应用于改良养殖水质时，养殖水体中仅需要3.5×104 cfu/mL的接种量，应用于养殖尾水处理时也仅需要3.5×105 cfu/mL的接种量，普遍低于当前国内类似的微生物制剂产品的接种量，有助于降低使用成本；
同时，还具有较高效的硝酸盐和总氮降解率，高于当前国内类似的微生物制剂产品的处理效率，添加菌液的养殖水体（C/N＜1）经24h，硝酸盐氮浓度从4.611mg/L降至1.863mg/L（降解率59.6%），总氮浓度从10.83mg/L降至5.957mg/L（降解率45.0%）；添加菌液的养殖尾水（C/N比11.8）经24h，硝酸盐氮浓度从14.88mg/L降至0.804mg/L（降解率94.6%），总氮浓度从16.64mg/L降至3.927mg/L（降解率76.4%）；因此，本发明恶臭假单胞菌DB-1具有良好的市场应用前景。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
序列表
<110> 集美大学
<120> 一种恶臭假单胞菌DB-1及其培养方法和应用
<130> P67212
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1361
<212> DNA
<213> （Pseudomonas putida）
<400> 3
tagactagct acttctggtg caacccactc ccatggtgtg acgggcggtg tgtacaaggc 60
ccgggaacgt attcaccgcg acattctgat tcgcgattac tagcgattcc gacttcacgc 120
agtcgagttg cagactgcga tccggactac gatcggtttt gtgagattag ctccacctcg 180
cggcttggca accctctgta ccgaccattg tagcacgtgt gtagcccagg ccgtaagggc 240
catgatgact tgacgtcatc cccaccttcc tccggtttgt caccggcagt ctccttagag 300
tgcccaccat tacgtgctgg taactaagga caagggttgc gctcgttacg ggacttaacc 360
caacatctca cgacacgagc tgacgacagc catgcagcac ctgtgtcaga gttcccgaag 420
gcaccaatcc atctctggaa agttctctgc atgtcaaggc ctggtaaggt tcttcgcgtt 480
gcttcgaatt aaaccacatg ctccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt catttgagtt 540
ttaaccttgc ggccgtactc cccaggcggt caacttaatg cgttagctgc gccactaaaa 600
tctcaaggat tccaacggct agttgacatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa 660
tcctgtttgc tccccacgct ttcgcacctc agtgtcagta tcagtccagg tggtcgcctt 720
cgccactggt gttccttcct atatctacgc atttcaccgc tacacaggaa attccaccac 780
cctctaccgt actctagctt gccagttttg gatgcagttc ccaggttgag cccggggctt 840
tcacatccaa cttaacaaac cacctacgcg cgctttacgc ccagtaattc cgattaacgc 900
ttgcaccctc tgtattaccg cggctgctgg cacagagtta gccggtgctt attctgtcgg 960
taacgtcaaa acactaacgt attaggttaa tgcccttcct cccaacttaa agtgctttac 1020
aatccgaaga ccttcttcac acacgcggca tggctggatc aggctttcgc ccattgtcca 1080
atattcccca ctgctgcctc ccgtaggagt ctggaccgtg tctcagttcc agtgtgactg 1140
atcatcctct cagaccagtt acggatcgtc gccttggtga gccattacct caccaactag 1200
ctaatccgac ctaggctcat ctgatagcgc aaggcccgaa ggtcccctgc tttctcccgt 1260
aggacgtatg cggtattagc gttcctttcg aaacgttgtc ccccactacc aggcagattc 1320
ctaggcatta ctcacccgtc cgccgctgaa tcgaagagca a 1361

Claims (7)

1.一种恶臭假单胞菌DB-1，其特征在于：所述恶臭假单胞菌DB-1为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1，于2020年7月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 2020311。
2.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌DB-1的培养方法，其特征在于：所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用LB液体培养基在30℃、170 r/min振荡培养24h。
3.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，其特征在于：所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1在改良养殖水质和养殖尾水减量排放中的应用。
4.根据权利要求3所述的一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，其特征在于：将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于降解养殖水体和养殖尾水中的硝酸盐和总氮。
5.根据权利要求4所述的一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，其特征在于：所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1在降解养殖水体中硝酸盐和总氮时，恶臭假单胞菌DB-1的用量为104 cfu/mL；在降解养殖尾水中硝酸盐和总氮时，恶臭假单胞菌DB-1的用量为105cfu/ mL。
6.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，其特征在于：将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于制备养殖水体中硝酸盐和总氮的降解制剂。
7.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌DB-1的应用，其特征在于：将所述恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida） DB-1用于制备养殖尾水中硝酸盐和总氮的降解制剂。
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