CN113234636A - 反硝化细菌假单胞菌株f1及其应用 - Google Patents

反硝化细菌假单胞菌株f1及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.21604的假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)及其应用。本发明的菌株能有效降解环境中的氮，几乎没有铵氮和亚硝酸盐的积累，且只产生少量的N2O排放。

Description

反硝化细菌假单胞菌株F1及其应用
技术领域
本发明涉及环境微生物领域。具体地，本发明涉及一种同化和还原硝酸盐的好氧微生物菌种材料，即假单胞菌株F1(Pseudomonas putida F1)，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保存编号为CGMCC No.21604。本发明还涉及其应用。
背景技术
我国是农业大国，为提升产量，在农业生产过程中大量施用化学氮肥，其中相当一部分并未被作物吸收利用，以硝酸盐的形式在土壤中累积残留。土壤中残留的硝酸盐一方面通过地表径流的形式进入水体，改变河流和湖泊的生态平衡，从而造成水体出现藻华和富营养化；另一方面，通过淋溶的形式进入地下水，造成饮用水中硝酸盐含量过高并危害人体健康。有数据表明，高强度施用化肥造成的农田硝酸盐大量淋溶导致了地下水污染程度逐年增加。针对硝酸盐淋溶问题，研究人员从控释肥、硝化抑制剂和水肥调控等农艺措施入手，提出了多种解决方案。不同方案在经济效益、可行性等方面均有所差异。
土壤中的细菌是土壤的组成部分并对土壤的功能有着重要影响。而由微生物介导的反硝化过程作为低成本、高效率及可持续的生物除氮措施，在废水处理中得到广泛应用，具有阻控农田土壤硝酸盐淋溶的潜力。
反硝化过程是由微生物介导的，将高价态的NO3 --N或NO2 --N还原成气态氮的过程，是自然界氮素循环的一个重要途径之一。尽管反硝化作为一个重要的活性氮汇，可以用来帮助抵消全球人为氮失衡，但增强土壤反硝化活性的同时仍然存在增加N2O温室气体排放的可能。传统的理论认为细菌的反硝化是一个严格的厌氧过程。但是近年来好氧反硝化细菌被发现，克服了传统的反硝化细菌只能在缺氧条件下进行反硝化的缺点。近年来，国内外越来越多的反硝化细菌从土壤或者污泥中分离出来并得到很好的应用。利用好氧反硝化细菌进行生物脱氮，可以大大降低投资费用和系统运行成本，是最经济的脱氮方法。因此，开展其生物学特性的研究对好氧反硝化细菌的应用具有重要的理论价值和实践意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种同化和还原硝酸盐的反硝化菌株，本发明还包括上述菌株的应用。
在本发明中的一个方面中，本发明涉及一种同化和还原硝酸盐的好氧微生物菌种材料，即恶臭假单胞菌株F1(Pseudomonas putida F1)，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保存于2021年1月8日，保存编号为CGMCC No.21604。
在本发明中的一个方面中，本发明所提供的菌株可用于处理土壤中过量的硝酸盐，具体是指：利用微生物以土壤或者水体中的硝态氮作为生命活动的氮源，经过微生物同化和反硝化过程，将其转化为无机态氮或生物体的氮，可用于阻控深层土壤硝酸盐淋失和地下水硝酸盐污染，以及净化处理含氮污水等。
本发明技术方案主要包括以下几个步骤：
a.细菌分离培养：制备牛肉膏蛋白胨细菌培养基，取0-20cm的表层土壤，以无菌水作10倍系列稀释后涂布于反硝化培养基上培养3天后挑取单菌落进行分离纯化。
b.反硝化菌株筛选：将纯化的菌株以BTB(溴麝香草酚蓝)进行显色反应，选取反应阳性的菌株进行反硝化的试验，筛选反硝化能力较高的菌株。
c.扫描电镜观察菌株形态
d.菌种鉴定：形态特征结合16S rDNA序列分析进行；
f.反硝化功能基因鉴定。
具体地，本发明涉及以下技术方案：
1、保藏编号为CGMCC No.21604的假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)。
2、含有项目1所述的假单胞菌F1的假单胞菌制剂。
3、根据项目2所述的假单胞菌制剂，其为固态或液态制剂。
4、根据项目3所述的假单胞菌制剂，其中当所述制剂为液态制剂时，所述制剂中的活菌数>1×1010CFU ml-1。
5、根据项目3所述的假单胞菌制剂，其中当所述制剂为固态制剂时，所述假单胞菌F1吸附于载体(例如粉碎的秸秆)上。
6、对环境样本进行脱氮的方法，该方法包括将项目1所述的假单胞菌或项目2所述的假单胞菌制剂添加到环境样本中，进行培养，从而降解环境样本中的氮含量。
7、根据项目6所述的方法，其中所述环境样本为土壤或水体。
8、根据项目7所述的方法，其中当所述环境样本为水体时，所述水体中的碳氮比为6～8，饱和溶解氧为50％～98％。
9、根据项目6所述的方法，其中在所述环境样本中存在的氮为铵氮或硝态氮，例如硝酸盐或亚硝酸盐。
10、项目1所述的假单胞菌或项目2所述的假单胞菌制剂在环境脱氮中的应用。
发明的效果
经过对大量富集培养的单菌落进行分离纯化和BTB显色反应，共获得9株显阳性的菌株，将这9株菌在100mg/kg NO3 --N的反硝化液体培养基中作进一步的筛选，发现F1菌株具有快速去除硝酸盐的能力。通过F1和模式菌Paracoccus denitrificans strain PD1222在100mg/kg NO3 --N反硝化培养基培养结果可知，F1对于硝酸盐的去除在12h就可以达到90％以上(参见图3)，而在相同的培养条件下，Paracoccus denitrificans strain PD1222菌株对于硝酸盐的去除能力只有60％。相比于之前公开的一株好氧反硝化细菌变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)YIM DC16(其在培养36h后对硝态氮的去除率达到90.07％)，F1更具有应用的价值。F1在整个反硝化培养过程中，几乎没有铵氮和亚硝酸盐的积累，相比PD1222，F1只有微弱的N2O的排放。因此，F1菌株具有应用于水体硝酸盐的去除并且不会造成水体的铵氮和亚硝酸盐的二次污染和土壤农田硝酸盐淋溶的阻控的价值。
菌株鉴定结果：F1菌落是乳白色，在反硝化的液体培养基中，培养过程是淡绿色的液体。扫描电镜(SEM)下，F1细胞呈杆状。Genbank中与菌株F1同源性达到99％以上的菌株主要是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，假单胞菌(Pseudomonas putida strain BR-PH17，Pseudomonas putida W619，Pseudomonas putida strain B1)与菌株F1的16S rRNA序列相似度达100％，所以确定该菌为恶臭假单胞菌，暂定名字为恶臭假单胞菌F1。
附图说明
图1为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F1的菌落形态照片(反硝化培养基)；
图2为扫描电镜(SEM)下的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)F1细胞形态；
图3恶臭假单胞菌F1和模式菌PD1222(阳性对照)对硝态氮去除(a)和N2O排放(b)的影响。
图4显示了恶臭假单胞菌F1在去除硝态氮过程中的铵氮积累。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。
实施例1.材料准备：
A.BTB分离培养基：
Figure BDA0003107630030000041
Figure BDA0003107630030000051
B.反硝化培养基(DM)：
Figure BDA0003107630030000052
其中，微量元素为：(超纯水1L)
CuSO4·5H2O 0.2g ZnSO4·7H2O 0.2g
FeSO4·7H2O 0.2g
C.牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏3g 蛋白胨10g
NaCl 5g pH：7.0±0.2
琼脂：1.5％(m/v) 超纯水1L
培养基配制完成后以NaOH调节pH至7.0，115℃湿热灭菌30min后制备平板。以上述成份不加琼脂配制得相应的液体培养基。
实施例2.细菌分离
在无菌蒸馏水中以土水比1:10稀释20g的土壤(例如，河南省许昌的潮土)的0～20cm的表层土壤，混匀后取1ml到9ml无菌水作10倍系列稀释后取0.2ml悬液涂布于上述反硝化培养平板，30℃培养2周。选取菌落数为30-100的培养皿挑取具有不同菌落特征的单菌落，划线分离培养，培养条件同上。
实施例3.具有反硝化活性的细菌菌株筛选
A.BTB(溴麝香草酚蓝)定性检测：
由于反硝化反应是产碱过程(消耗环境中的H+)，当有反硝化反应发生，会使BTB培养基的指示剂溴百里酚蓝呈现蓝色，即菌落会呈现蓝色或蓝色晕圈。将筛选到的单菌落于BTB培养基平板上划线，30℃恒温培养3天。当有反硝化反应发生，会使BTB培养基的指示剂溴百里酚蓝呈现蓝色，即菌落会呈现蓝色或蓝色晕圈。从BTB培养基平板中挑选出蓝色晕圈的单菌落，划线分离培养，培养条件同上。
B.反硝化培养基的定量筛选
以接种环刮取A中9个阳性菌株的单菌落和模式菌Paracoccus denitrificansstrain PD1222分别接种到上述反硝化液体培养基中30℃，160rpm培养36小时制得种子液，将种子液分别按1％(v/v)的比例接种到反硝化液体培养基，在培养0，12，24，36，48h进行破坏性取样，测定OD值，NO3 --N，NO2 --N，NH4 +-N，N2O的含量，培养条件同上。以不接种菌液的上述液体培养基为空白对照，每个处理设3个重复。选取氮去除效率最高的菌株。
由上得到高效脱氮的假单胞菌F1，并将其保藏于中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期为2021年1月8日、保藏编号CGMCC No.21604；该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
结果显示(参见图3)，F1菌株硝酸盐氮去除最快出现在培养时间的0～12h之间，并且对于硝酸盐的去除在12h就可以达到90％以上，而在相同的培养条件下，Paracoccusdenitrificans strain PD1222菌株对于硝酸盐的去除能力只有60％。F1在整个反硝化培养过程中，几乎没有铵氮的积累(参见图4，铵氮积累低于1mg/L)，并且只有微弱N2O的排放，明显的低于PD1222的排放。
实施例4.菌株F1形态观察
F1菌落是乳白色，在反硝化的液体培养基中，培养过程是淡绿色的液体。革兰氏性质(还没有鉴定)，F1细胞呈杆状，细菌大小0.4×0.75μm-1μm。
实施例5.细菌基因组DNA提取及16S rDNA序列分析
通过QIAamp DNA试剂盒(Qiagen)提取细菌基因组DNA，并将其送到深圳华大基因股份有限公司进行全基因组测序。将测得的结果用MasuRCA软件进行组装，Prokka软件进行注释，对注释出的16S rRNA进行人工校对后用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)BLAST程序在GenBank中进行核苷酸同源性比较。Genbank中与菌株F1同源性达到99％以上的菌株主要是恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，假单胞菌(Pseudomonasputida strain BR-PH17，Pseudomonas putida W619，Pseudomonas putida strain B1)与菌株F1的16S rRNA序列相似度达100％，所以确定该菌为恶臭假单胞菌，暂定名字为恶臭假单胞菌F1。
表1菌株F1的16S rDNA的BLAST结果
Figure BDA0003107630030000071
实施例6.反硝化功能基因鉴定
通过QIAamp DNA试剂盒(Qiagen)提取细菌基因组DNA，并将其送到深圳华大基因股份有限公司进行全基因组测序。将测得的结果用MasuRCA软件进行组装，Prokka软件进行功能基因注释，发现F1菌株含有硝酸盐的同化基因nasA和硝酸盐还原基因napA。
实施例7.反硝化细菌的菌剂信息
液体菌剂：通过对菌种在牛肉膏蛋白胨培养基上进行活化，得到种子菌，按照1％的比例添加到液体的牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃，180rpm的培养条件下进行24小时的培养。会得到活菌数>1×1010CFU ml-1液体菌剂，可以用粉碎的秸秆在121℃下灭菌2h，烘干后作为载体，将菌剂吸附于秸秆，喷洒到需要的土壤。具有很好的应用价值。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.保藏编号为CGMCC No.21604的假单胞菌F1(Pseudomonas putida F1)。
2.含有权利要求1所述的假单胞菌F1的假单胞菌制剂。
3.根据权利要求2所述的假单胞菌制剂，其为固态或液态制剂。
4.根据权利要求3所述的假单胞菌制剂，其中当所述制剂为液态制剂时，所述制剂中的活菌数>1×1010CFU ml-1。
5.根据权利要求3所述的假单胞菌制剂，其中当所述制剂为固态制剂时，所述假单胞菌F1吸附于载体(例如粉碎的秸秆)上。
6.对环境样本进行脱氮的方法，该方法包括将权利要求1所述的假单胞菌或权利要求2所述的假单胞菌制剂添加到环境样本中，进行培养，从而降解环境样本中的氮含量。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述环境样本为土壤或水体。
8.根据权利要求7所述的方法，其中当所述环境样本为水体时，所述水体中的碳氮比为6～8，饱和溶解氧为50％～98％。
9.根据权利要求6所述的方法，其中在所述环境样本中存在的氮为铵氮或硝态氮，例如硝酸盐或亚硝酸盐。
10.权利要求1所述的假单胞菌或权利要求2所述的假单胞菌制剂在环境脱氮中的应用。
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