CN117603888A - 一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用，菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），命名为WR‑3，于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29355。该菌株对异丙甲草胺具有优异的降解作用，且还可有效降解养殖尾水中的COD、TN和TP；该菌株耐受能力强，可耐受4~25℃的低温环境，在应用过程中不易受外界环境冲击，在实际冬季养殖尾水处理应用中具有良好的价值，具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用。
背景技术
水质污染是水产养殖过程不可避免的问题，尾水中的污染物主要是有机物、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、磷等。养殖密度过高、投喂饵料的方式方法不科学或投喂量过大、渔业生产过程中用药不符合要求等等，必然会对水域环境造成一定程度的破坏，进而影响水产品的品质。养殖方式关乎到水产的质量，而为获取更高的利润，大部分个体想要获取更高的利润，会越来越多的使用化学药品。在水产养殖中，常见的化学成分是杀菌剂、杀真菌剂、寄生虫剂、藻类除草剂、杀虫剂，以及减少水生动物伤口的麻醉药和促进产卵或提高生长的荷尔蒙。这些化学药品使用后会残留在养殖尾水中，对养殖区域和周边环境造成污染，对人类的生产和生活造成极大的影响。
异丙甲草胺是一种非选择性草胺类除草剂，可以用于控制水体中的藻类生长，有效控制过度繁殖的藻类，改善水质，防止水体富营养化和赤潮的发生。然而，带有异丙甲草胺的养殖尾水如果直接排放，会杀死多种植物类型，包括农作物、蔬菜和观赏植物，加速农田退化，减少生物多样性，并且会在土壤中残留一段时间，影响土壤微生物群落的结构和功能，降低土壤肥力和水分保持能力，还可能通过地下水和水生生物链进入生态系统，对水生生物造成危害，从而导致生态环境的失衡。
目前针对异丙甲草胺的处理方法鲜有研究，对养殖尾水中的有机物、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和磷的处理主要以微生物处理为主，而低温状态下菌种的代谢及繁殖能力都会大大缩小甚至休眠死亡，这也导致了养殖塘口在11月至次年三月的集中排水季中排放的尾水温度较低，微生物难以发挥作用处理污染物质。这就需要筛选低温耐受的菌种并且具有高效降解污染物的能力。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株能够在4~25℃水温环境下定殖生长、并能快速降低养殖尾水中异丙甲草胺、COD、TN、TP等浓度水平的菌株，以实现冬季养殖尾水的净化处理。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一株蜡样芽孢杆菌，菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），命名为WR-3，于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29355。
蜡样芽孢杆菌降解养殖尾水中异丙甲草胺的应用，养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为50~100 mg/L，pH为6.0～8.0，温度为4~25℃。
利用蜡样芽孢杆菌制备的菌剂。
蜡样芽孢杆菌降解养殖尾水中异丙甲草胺的应用，养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为 50~100 mg/L，pH为6.0～8.0，温度为4~25℃。
一种利用蜡样芽孢杆菌降解养殖尾水中异丙甲草胺的方法，具体步骤为：将菌剂按照体积比为0.1%~0.2%的投加量投加于养殖尾水中，搅拌均匀，进行降解。
一种菌剂的制备方法，包括以下具体步骤：
S1、将菌株WR-3接种于LB固体平板培养基上，恒温培养至长出菌落，挑选单菌落接种于LB斜面培养基上，继续培养至得到菌种；
S2、将菌种和生理盐水混合制成菌悬液，接种于LB液体培养基中，振荡培养获得种子液；
S3、将种子液接种于发酵培养基中，振荡培养，得到液体菌剂；
S4、向液体菌剂中加入沸石粉，烘干得到固体菌剂。
优选地，前述步骤S1中，LB固体平板培养基的组分为：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0g、氯化钠10.0 g，加水至1.0 L，pH为7.0；LB斜面培养基的组分为：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
优选地，前述步骤S2中，制备菌悬液的浓度为1×109CFU/mL ，菌悬液的接种量为2%~4%；LB液体培养基的组分为：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
优选地，前述步骤S3中，种子液的接种量为2%~ 4%；发酵培养基的组分为碳源10g/L、氮源5 g/L、氯化钠10 g/L，剩余为水，pH为5.5～8.0；所述碳源为废糖蜜或玉米淀粉和废糖蜜的混合物，玉米淀粉和废糖蜜的质量比为2：1；所述氮源为酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨和氯化铵中的一种或几种的混合物；种子液于发酵培养基中培养至活菌数为2×109CFU/mL，中止发酵。
优选地，前述步骤S4中，固体菌剂的具体制备方法为：每100 mL发酵液中加入15 g沸石粉，振荡后静止，离心，去除上清液，得到沉淀物，向每100 g沉淀物中加入30 g沸石粉，烘干，得到固体菌剂。
本发明的有益之处在于：本发明筛选出一株能够降解养殖尾水污染物的菌株WR-3，该菌株对异丙甲草胺具有优异的降解作用，且还可有效降解养殖尾水中的COD、TN和TP；该菌株耐受能力强，可耐受4~25℃的低温环境，在应用过程中不易受外界环境冲击，在实际冬季养殖尾水处理应用中具有良好的价值，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为菌株WR-3的菌落形态图；
图2为菌株WR-3的系统发育树；
图3为菌株WR-3在低温培养基中的OD生长曲线图；
图4为菌株WR-3在不同温度下对异丙甲草胺的降解效果图；
图5为菌株WR-3在不同温度下对COD的降解效果图；
图6为菌株WR-3在不同温度下对TP的降解效果图；
图7为菌株WR-3在不同温度下对TN的降解效果图；
图8为菌株WR-3在不同pH下的降解效果图；
图9为不同异丙甲草胺初始浓度下菌株WR-3的降解效果图；
图10为8℃下菌株WR-3对实际养殖尾水的降解效果图；
图11为15℃下菌株WR-3对实际养殖尾水的降解效果图。
实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
实施例1 Bacillus cereus WR-3的分离及鉴定：
从连云港获取低温养殖尾水样本，煮沸15 min，经过梯度稀释后，将其均匀涂布在牛肉膏琼脂平板上，15℃好氧培养24~48 h。待菌落形成后挑取单菌落再次平板划线分离，得到单菌落。共获得32种菌株，我们对32种不同菌株进行了降解异丙甲草胺测试，发现WR-3菌对降解异丙甲草胺有着优异的性能，至此我们选择WR-3菌作为目标菌种。
对WR-3菌进行革兰氏染色及芽孢染色，该菌株为革兰氏阳性菌，无荚膜，产芽孢，芽孢圆形或柱形，菌体细胞成杆状，其菌落形态图如图1所示。
本发明测定了菌株的16S rDNA序列，其序列表详见SEQ ID NO：1。细菌扩增的引物采用细菌通用引物。正向引物为Eubac27F:(5-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3)，其序列表详见SEQ ID NO：2，反向引物为Eubac1492R:(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3)，其序列表详见SEQ IDNO：3，将25 μL2×Mix Taq与正反向引物各2 μL、菌液2 μL混匀后，加水至50 μL体系后进行PCR扩增。PCR反应程序为94℃预变性4 min；94℃变性30 s；55℃复性1 min；72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。利用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后送至测序公司进行测序，对菌株16S rDNA序列结果采用BLAST方法在NCBI数据库搜索比对分析。将菌株及其相近菌株的16S rDNA序列通过Mega(Version7.0)软件进行多序列比对，并采用Neighbor-joining方法构建系统进化树。如图2，系统发育树结果显示，该菌株为蜡样芽孢杆菌。
上述菌株于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其分类命名为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus WR-3），保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种保藏号为：CGMCC No.29355。
实施例2 菌剂的制备包括以下步骤：
（1）将WR-3菌菌株接种于LB固体平板培养基上，LB固体平板培养基的组分为：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、氯化钠10.0g，加水至1.0 L，pH为7.0，并将其置于恒温培养箱内，15℃培养24 h左右至培养基上长出菌落；然后挑选单菌落接种于LB斜面培养基上，LB斜面培养基的组分为：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L，于15℃培养24 h。
（2）将第一步培养的菌种用5‰灭菌的生理盐水制成1×109CFU/mL的菌悬液，以3％的接种量接种于LB液体培养基中，LB液体培养基的组分为：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L ，15℃，180 rpm振荡培养24 h，获得种子液。
（3）将第二步中的种子液以3％的接种量接种于发酵培养基中，发酵培养基的组分为碳源10 g/L、氮源5 g/L、氯化钠10 g/L和纯水，15℃，180 rpm振荡培养，至活菌数为2×109CFU/mL，中止发酵，得到液体菌剂。
（4）向第三步的发酵液中加入沸石粉，每100 mL发酵液中加入15 g沸石粉，150rpm振荡50 min后静止1 h，然后于4℃ 6000 rpm离心20 min，去除上清液，得到沉淀物，向沉淀物每100 g中加入30 g沸石粉，于60℃烘箱中烘干6 h，得到固体菌剂。
上述LB培养基由蛋白胨10.0g，酵母粉5.0 g，氯化钠10.0 g，加水至1.0 L配制，调节pH值至7.0，121℃灭菌20 min后使用。
实施例3 检测WR-3菌株的生长温度范围及最适生长温度：
将WR-3菌株接种至在LB液体培养基中，LB液体培养基的组分为：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，记录WR-3菌株在4~30℃下的生长状况，用OD600nm来表征菌液浓度，我们在15℃下对其进行了相应的生长曲线测定，测定结果如图3所示。
结果表明，菌株WR-3接种到LB培养基后，在4~30℃条件下培养均可以正常生长，在4℃下虽然发现生长缓慢，但是连续四天OD600在不断增加。培养四天后，菌株WR-3的OD600可达到0.689。由图3可知，菌株在16 h之内生长缓慢，16~48 h迅速生长，在72 h之后达到生长阈值，这说明菌株WR-3为一株耐冷菌株。
实施例4 不同温度下菌株WR-3的降解效果：
在温度分别为0℃、4℃、8℃、15℃、20℃、25℃、30℃的条件下，按1%（v/v）的接种量，将菌株WR-3分别接种至12组含不同污染物的无机盐培养基中，无机盐培养基的组分为：Na2HPO4·12H20 2.3 g、NH4NO3 1.5 g、ZnSO40.05 g、KH2PO41.0 g、CuSO40.85 g、MgSO40.6 g、MnSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.3 g和 CaCl21 g，用双蒸水定容至1L，1~3组培养基中分别含50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L的异丙甲草胺，4~6组培养基中分别含50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L的COD，7~9组培养基中分别含1.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0mg/L 的TP，10~12组培养基中分别含10 mg/L、30 mg/L、50 mg/L的TN，pH 7.0，160r/min震荡培养，每48h取样，检测污染物降解效果如图4~7所示。
由图4~7可知，0~3℃时，菌株对异丙甲草胺、COD、TN和TP的降解率几乎为零；4℃时，对异丙甲草胺的降解率在50%左右；8~15℃时，对异丙甲草胺的降解率在60%~80%之间；20~25℃时，对异丙甲草胺的降解率在90%~98%之间，25℃左右时达到最大值。菌株对COD、TN和TP的降解最佳适宜温度为20~25℃，降解率均在65~98%之间，因此，菌株WR-3对养殖尾水的最佳处理温度为20~25℃，处理效果优异，且在4℃时对异丙甲草胺也具有较好的降解效果，可在低温养殖尾水的处理环境下使用。
实施例5 不同PH下菌株WR-3的降解效果：
分别采取10组温度为4℃以及15℃，异丙甲草胺初始浓度为100 mg/L的培养基，每组培养基设置不同的pH（分别为4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5）条件，转速160 r/min，培养48 h，将上述培养结束的培养液取样检测异丙甲草胺的降解情况，如图8所示。
由图8可知，该菌株可适应范围较广，在4℃之间时，处理效果最佳pH值在7.0~8.0之间，异丙甲草胺的降解率在50%左右；温度为15℃时，处理效果最佳pH值在6.0~8.0之间，异丙甲草胺的降解率可达75%~80%左右。因此，菌株WR-3处理养殖尾水的最佳pH值为6.0~8.0。
实施例6 不同异丙甲草胺初始浓度下菌株WR-3的降解效果：
在异丙甲草胺初始浓度分别为20 mg/L、50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L的条件下，按1%（v/v）的接种量，将菌株WR-3分别接种至含不同异丙甲草胺初始浓度的无机盐培养基中，无机盐培养基的组分为：Na2HPO4·12H20 2.3 g、NH4NO3 1.5 g、ZnSO40.05 g、KH2PO41.0 g、CuSO40.85 g、MgSO40.6 g、MnSO4·H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 0.3g和 CaCl21 g，用双蒸水定容至1 L，降解温度为20℃，pH 7.0，160 r/min震荡培养，每48h取样，检测降解效果如图9所示。
由图9可知，异丙甲草胺初始浓度为50~100 mg/L时，降解率在90%以上，降解效果优异。
实施例7 菌剂对养殖废水的处理效果：
按照实施例2的方法制备WR-3菌剂，培养温度为15±1℃，得到的菌剂活菌数为1.2×1010cfu/mL。处理水质来源为低温养殖尾水治理系统，实验室模拟生化系统曝气处理，处理量为5 L，菌剂的添加量为0.1％（V/V），曝气处理使溶氧在2 mg/L以上，污水pH6.0～8.5，控制处理温度分别为8℃和15℃，48 h为1 d进出水一次，每次进出水1 L，取样分别检测两种温度下菌剂的处理效果，结果见图10和图11。
根据图10和图11可知，在pH6.0～8.5，温度为8℃的低温环境下，菌剂对异丙甲草胺的降解率最高可达65%，对COD、TP和TN的降解率均为40%~55%之间；温度为15℃时，菌剂对异丙甲草胺的降解率可达80%以上，对COD、TP和TN的降解率均为75%以上，由此可以看出，菌剂对低温养殖尾水的处理具有很好的降解效果，可快速有效的去除异丙甲草胺、COD、TP和TN。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一株蜡样芽孢杆菌，其特征在于，所述蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）命名为WR-3，于2023年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.29355。
2.权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌在降解养殖尾水中异丙甲草胺中的应用，其特征在于，所述养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为50~100 mg/L，pH为6.0～8.0，温度为4~25℃。
3.利用权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌制备的菌剂。
4.权利要求3所述的菌剂在降解养殖尾水中异丙甲草胺中的应用，其特征在于，所述养殖尾水中异丙甲草胺的浓度为50~100 mg/L，pH为6.0～8.0，温度为4~25℃。
5.一种利用权利要求3所述的菌剂降解养殖尾水中异丙甲草胺的方法，其特征在于，具体步骤为：将菌剂按照体积比为0.1%~0.2%的投加量投加于养殖尾水中，搅拌均匀，进行降解。
6.一种权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1、将菌株WR-3接种于LB固体平板培养基上，恒温培养至长出菌落，挑选单菌落接种于LB斜面培养基上，继续培养至得到菌种；
S2、将菌种和生理盐水混合制成菌悬液，接种于LB液体培养基中，振荡培养获得种子液；
S3、将种子液接种于发酵培养基中，振荡培养，得到液体菌剂；
S4、向液体菌剂中加入沸石粉，烘干得到固体菌剂。
7.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，LB固体平板培养基的组分为：蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、氯化钠10.0 g，加水至1.0 L，pH为7.0；LB斜面培养基的组分为：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
8.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，LB液体培养基的组分为：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L和氯化钠10 g/L。
9.根据权利要求6所述的菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，发酵培养基的组分为碳源10 g/L、氮源5 g/L、氯化钠10 g/L，剩余为水，pH为5.5～8.0。
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