CN113717905A - 菌株rd4及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种菌株RD4及其应用，涉及微生物技术领域，本发明提供的菌株RD4，不仅可以显著抑制致病菌的生长，同时不会影响到其他益生菌的生长，避免了抗菌水产药的诸多问题，具备应用于水产养殖，防治渔业病害的潜力，也为其用于科学研究提供了帮助，提供了一种抑菌实验的阳性菌。

Description

菌株RD4及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种菌株RD4及其应用。

背景技术

随着经济的发展和生活水平的提高，我国居民对鱼、虾蟹、贝类等水产品的需求量呈逐年上升的趋势，水产品逐渐成为人类生活的必需品。与此同时，我国的水产养殖行业已经发生了巨大的变化，从最初捕鱼捞鱼的简单模式发展成现在的高密度、规模化、集约化、立体化的绿色养殖模式。我国水产品产量已经连续多年居世界首位。但是，受限于水产养殖对象和养殖模式的特殊性，水产动物疾病的暴发往往是迅速且不可挽回的。高密度养殖引发的水产养殖动物疾病已经成为阻碍水产养殖业发展的一大顽疾，其中细菌性疾病更是严重影响了水产养殖业的可持续发展。

水产养殖业防治细菌性疾病的药物，主要分为2种，天然抗菌鱼药和人工合成抗菌渔药。目前，我国水产中使用的一般有是氨基糖苷类，四环素类，酰胺类抗生素以及磺胺类与喹诺酮类药物等。在生产上，抗菌渔药主要施用于养殖水体或者饲料中，不仅会影响有关共生细菌之间的平衡，甚至可能导致抗生素向邻近生态系统的扩散，导致养殖环境的生态失衡以及大量的生态环境问题，同时随着这些药物的大量使用，耐药菌株不断产生，微生态环境被破坏，药物残留还会使环境以及水产品污染的问题越发严峻。因此，开发相关的替代品成为了研究的热点。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的之一在于提供菌株RD4，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的目的之二在于提供包含上述菌株RD4的菌剂。

本发明的目的之三在于提供上述菌株或菌剂的应用。

本发明的目的之四在于提供包含上述菌株或菌剂的产品。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一株菌株RD4，分类命名为养料嗜冷杆菌（Psychrobactercibarius），于2021年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23457。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述的菌株RD4或发酵菌株RD4得到的发酵液。

本发明还提供了上述的菌株或菌剂在水产养殖中的应用。

本发明还提供了上述的菌株或菌剂在制备防治水产病原菌感染的药物中的应用。

进一步的，所述水产包括鱼类。

进一步的，所述病原菌感染包括肠道病原菌感染。

进一步的，所述肠道病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌。

本发明还提供了一种药物，所述药物包括上述的菌株或菌剂。

进一步的，所述药物还包括药学上可接受的载体或助剂。

此外，本发明还提供了上述的菌株在作为科研抑菌试验的阳性菌的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的菌株RD4，不仅可以显著抑制致病菌的生长，同时不会影响到其他益生菌的生长，避免了抗菌水产药的诸多问题，具备应用于水产养殖，防治渔业病害的潜力，也为其用于科学研究提供了帮助，提供了一种抑菌实验的阳性菌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的待测菌RD4对致病菌的拮抗作用的结果图；

图2为本发明实施例提供的平板对峙培养法示意图；

图3为本发明实施例提供的菌株ED3和RD4的平板对峙实验的结果图。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

许多不同种类的微生物生活在动物的胃肠道内，它们与宿主在生长进化的过程中相互影响、相互作用。其中，部分微生物长期地居住其中，发挥着吸收消化营养物质、防御有害微生物对宿主的伤害以及免疫调节等重要的作用，并且对生物机体的生长发育等都具有显著的影响。通过合适的筛选和分离方法，从水产生物肠道中获取有效抑制致病菌的生长的拮抗菌并推广应用，对于相关产业的进一步发展具有重要的意义。

基于此，本发明提供了一株菌株RD4，于2021年9月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23457，该菌株的分类命名为养料嗜冷杆菌（Psychrobactercibarius）。

本发明提供的菌株RD4是由如下方法筛选得到：

取待测肠道菌对致病菌进行抑菌试验，之后观察并记录待测肠道菌对这七株致病菌产生抑菌圈的情况，根据不同肠道菌对致病菌的抑制情况，挑选出抑菌能力更强且更光谱的菌株，得到菌株RD4。

经实验验证，本发明提供的菌株RD4，不仅可以显著抑制致病菌的生长，同时不会影响到其他益生菌的生长，避免了抗菌水产药的诸多问题，具备应用于水产养殖，防治渔业病害的潜力，也为其用于科学研究提供了帮助，提供了一种抑菌实验的阳性菌。

基于本发明提供的菌株RD4的有益效果，本发明还提供了其在水产养殖中的应用。

在一些具体的实施方式中，本发明提供的菌株RD4或菌剂能够制备防治水产病原菌感染的药物。

其中，典型的水产可以为鱼类，典型的病原菌感染包括肠道病原菌感染。

本发明对肠道病原菌的具体种类不做限定，可选地，所述肠道病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌。

除此之外，本发明提供的菌株RD4还可以作为科研抑菌试验的阳性菌。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1：拮抗菌的筛选

分离肠道菌：选取威海远遥市场购买的新鲜日本带鱼（Trichiurus lepturus）。将鱼用灭菌的海水清洗干净，并用75%酒精擦拭鱼的体表，用剪刀将鱼腹部剪开，取完整肠道，置于PBS缓冲液中备用；挤出肠道内容物于灭菌离心管，以1:9的比例使用灭菌海水稀释匀浆。

直接涂布培养法：取匀浆液10ml置于装有40ml灭菌海水的50ml锥形瓶中（灭菌前瓶底铺满玻璃珠），放在20°C摇床中，120rpm，摇床培养30min，得到菌悬液母液。在超净工作台内用无菌海水对菌悬液母液进行梯度稀释，一直稀释至10^-11,取10^-7,10^-8,10^-9,10^-10,10^-11五个梯度的菌液分别进行涂布培养，在LB、PY、2216E、2YT、高氏一号、MRS这六种固体培养基上均匀涂布，每个梯度在每种培养基上保持五个平行。将涂布后的培养皿至于20℃培养箱中培养，每12h观察一次。

富集培养法：取带鱼的肠道内容物1g，放入已加入含2%的KH₂PO₄和10%的NaHCO₃的富集培养基的暗瓶中，加满富集培养基，拧紧瓶盖，上下摇动后置于20°C培养箱中培养，每天早上手动摇一次瓶，10天后进行梯度稀释和涂布。梯度稀释一直稀释至10^-6，取10^-4,10^-5,10^-6三个梯度进行涂布。将涂布后的培养皿置于20°C恒温培养箱中培养，每12h观察一次。

划线分离及纯化：将经两种方法涂布培养后长有菌落生长的平板拿出，用接种环挑取每个平板上形态不一的不同菌进行平板划线分离，分别接在与之相应的培养基上，依然放入20℃培养箱中培养；将培养出的菌落进行2-3次纯化，最终在平板上得到相应的单菌落并低温保存。

肠道菌的活化：从低温冰箱中取出保存肠道菌的冻存管，在超净工作台内的酒精灯火焰附近开启冻存管，用移液枪吸取少量菌液混合物到2216E固体平板上，用涂布棒涂匀。将平板倒置在28℃恒温箱中培养24小时。

致病菌的活化：大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌的活化培养基为LB海水固体培养基，操作同肠道菌的活化。嗜水气单胞菌和爱德华氏菌活化时，从超低温冰箱中取出冻存管，在酒精灯火焰附近用200μl的移液枪枪尖挑取少量菌体混合物到LB海水固体培养平板上，用枪尖滑动混合物，使其快速溶化在平板上，随后倒置在37℃培养箱中培养48小时。

致病菌悬液制备：取生长状态良好的六株致病菌，用灼烧冷却后的接种环在平板上沾取相应的适量致病菌菌落；在装有已灭菌的1% NaCl溶液的试管中沿管壁和水面交接处慢慢研磨，使菌落溶解在NaCl溶液中，振荡混匀；用比浊管对应着调节麦氏浊度至0.5（细菌的近似浓度为1.5×10⁸CFU/ml）。

拮抗菌的初筛：用记号笔和直尺在培养皿底部均匀划分出九个区域，对应的标记对应的待测菌编号，再倒入灭菌的2216E固体培养基，待其冷却至凝固。使用移液枪分别从六株致病菌的菌悬液中吸取0.1 ml加入固体平板中，用涂布棒十字涂匀整个板。等待菌悬液被吸收后，用接种环挑取待测菌点种到含致病菌的平板中，每个平板分别接种九种待测肠道菌，然后放在28℃的恒温培养箱中倒置培养24小时。培养24小时之后，观察并记录待测肠道菌对这六株致病菌产生抑菌圈的情况。将能产生抑菌圈的肠道菌记录下来，并且重新将这些拮抗菌划线接种到2216E固体平板上进行保存备用。

表1 拮抗菌的初筛结果

从表中可以看出：25株肠道菌对大肠杆菌有拮抗活性，15株肠道菌对金黄色葡萄球菌具有拮抗活性，20株肠道菌对哈维氏弧菌具有拮抗活性，14株肠道菌对鲍曼不动杆菌具有拮抗活性，10株肠道菌对嗜水气单胞菌具有拮抗活性，22株肠道菌对爱德华氏菌具有拮抗活性。

同时还发现，有多种肠道菌具有广谱抑菌作用，即可以抑制多种致病菌。在六种致病菌中，只有金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，其余五种致病菌均为革兰氏阴性菌。通过表2可以发现，RD4对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制效果。

表2 鱼肠道拮抗菌对革兰氏菌的抑制测定结果

注：表中的G⁺是金黄色葡萄球菌；G^-是大肠杆菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌五种致病菌。

实施例2：体外溶血试验

将筛选出的具有拮抗性的待测菌接种在血琼脂平板上，倒置在28℃恒温箱中培养。当拮抗菌没有溶血能力时，菌落周围不会产生溶血圈，就属于γ-溶血，血琼脂平板仍然和未接种菌的血琼脂平板一样呈现鲜艳的红色；当拮抗菌具有溶血能力时，菌落的周围就会出现溶血圈，根据溶血圈颜色的不同又分为草绿色溶血圈（α-溶血）和透明溶血圈（β-溶血）。

表3 体外溶血测定结果

当菌种具有溶血能力并且进入鱼体时，会在体内使红细胞大量的破裂，导致血红蛋白从细胞内漏出，从而引发贫血和免疫系统被破坏等一系列反应。表3表明，RD4不会产生溶血现象，表明该拮抗菌具有一定安全性。

实施例3：打孔法测定拮抗菌RD4的拮抗活性

取六种致病菌活力旺盛的培养平板，用灼烧冷却后的接种环沾取菌落，在装有无菌的1% NaCl溶液的试管中沿管壁水面处慢慢研磨，使菌落溶解在NaCl溶液中，振荡混匀，并且调节麦氏浊度至0.5。

随后使用移液枪分别吸取100 μl上述致病菌的菌悬液加入到2216E固体平板中央，并且用涂布棒均匀地涂布。用灭菌后的牛津杯和镊子（牛津杯内径为6 mm，外径为8mm，高为10mm）在划线接种了待测菌的平板上打孔，取下带有待测拮抗菌的琼脂块，然后将琼脂块倒扣在涂有相应致病菌的2216E平板中，每组进行三个平行试验。然后将平板倒置在28℃恒温箱中培养24小时。

培养结束后观察待测菌的琼脂块周围是否出现抑菌圈。如果出现抑菌圈，就使用游标卡尺对抑菌圈的直径进行测量，然后求取抑菌圈直径的平均值，以此来表示该待测菌对于此种致病菌的拮抗作用强弱。实验结果如图1和表4所示。

表4 待测菌RD4对六种致病菌的拮抗作用

注：表中“++++”代表抑菌圈直径R＞20 mm；“+++”代表15 mm＜R≤20 mm；“++”代表10 mm＜R≤15 mm；“+”代表6 mm＜R≤10 mm；“-”代表R≤6 mm，表示没有拮抗性。“+”越多代表拮抗性越高。

结果表明，拮抗菌RD4对六种致病菌均有较好的抑菌能力。

实施例4：平板对峙实验检测抑菌率

将筛选出的对致病菌拮抗作用较强的肠道菌重新转接培养，再用接种环接取适量菌添加到预先灭菌处理的1% NaCl溶液中，震荡混匀制成菌悬液，调节麦氏浊度至0.5。

随后使用记号笔和直尺在已经灭菌烘干后的培养皿底部画出7条大小相同的长方形条带（长、宽分别为4cm、4mm），并且两条相邻的条带之间的间隔距离为5mm，7条条带在培养皿底部均匀地排布。并且在条带的上方或者下方空白处标记好菌种的名称。

同时分别设置各种肠道菌的对照组，对照组与对峙实验组的操作类似，但是对照组的相邻条带之间的间隔是12 mm。具体情况如图2所示，其中：“1”、“2”分别泛指菌种1、菌种2的编号，实验时只需要在其位置上标记上相应的菌株编号即可。

之后倒入2216E海水琼脂培养基，等待其冷却凝固后倒置。随后将筛选出的拮抗作用较强的肠道菌两两一组。用接种环将每一组中两种拮抗菌的菌悬液交替地涂布在长方形条带内，一般一个条带内涂布一环，每一组都做三个平行实验（涂布的时候注意灼烧接种环冷却后再蘸取菌液并且不要涂布到长方形条带的外面以免影响实验结果）。

待菌悬液被吸收后将涂布好的肠道菌做好标记后放入28℃恒温箱中倒置培养。观察拮抗菌的生长情况。当对照组中的菌株组合任意一条待测菌株的菌落宽度达到9mm及以上时，就可以使用游标卡尺分别测量该对峙实验组与对照组的所有菌带宽度，并求出拮抗菌相互之间的抑菌率：

抑菌率=（对照组菌带的平均宽度-对峙组菌带的平均宽度）/对照组菌带的平均宽度×100%随后作出表格计算菌株间的相互抑菌率和相互抑制等级。

拮抗菌的相互作用主要分为表5中显示的五个等级，结合抑菌率就可以判断出拮抗菌两两之间的相互作用关系。

表5 抑菌等级说明

表6菌种RD4对其他拮抗菌的抑菌率

RD4与大部分菌株之间的相互作用等级为Ⅱ级，说明两菌株之间具有一定的亲和性，可以放置在同一环境中共同培养。这表明RD4抑制有害菌同时可以与相应益生菌共同生长，具有良好的推广应用潜力。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.菌株RD4，分类命名为养料嗜冷杆菌（Psychrobactercibarius），于2021年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23457。

2.菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的菌株RD4或发酵菌株RD4得到的发酵液。

3.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在水产养殖中的应用。

4.权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂在制备防治水产病原菌感染的药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述水产包括鱼类。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病原菌感染包括肠道病原菌感染。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肠道病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌。

8.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的菌株或权利要求2所述的菌剂。

9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或助剂。

10.权利要求1所述的菌株RD4在作为科研抑菌试验的阳性菌的应用。

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