CN113699085B - 拮抗菌ed5及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种拮抗菌ED5及其应用，涉及微生物技术领域，本发明以常见海洋鱼类肠道菌群为研究对象，筛选出了一种能有效拮抗常见的6种鱼类致病菌的拮抗菌ED5。该拮抗菌ED5作为益生菌不仅对多种致病菌均有明显的抑菌效果，而且和其他益生菌具有一定亲和性，有希望发挥协同抗菌作用。

Description

拮抗菌ED5及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种拮抗菌ED5及其应用。

背景技术

近年来，抗生素的滥用已经成为人们关注的一个重要话题。尽管抗生素的广泛使用可以治疗好很多相关疾病，但同时也带来一系列不可避免的严重的问题，比如长时间使用同一种药物使得致病菌对药品产生耐药性或者发生突变、残留在水产品体内的药物随着水产品被人类食用进入人体从而引发了严重的食品安全问题等，这些问题给人类的健康及生活增加了许多直接或间接的不好的影响。因此，开发各种抗生素的替代品成为了研究的热点。

随着人们对于肠道菌群研究的不断深入，鱼类的肠道微生物也逐渐进入了研究者的视野，引起了广泛关注。许多不同种类的微生物生活在动物的胃肠道内，它们与宿主在生长进化的过程中相互影响、相互作用，逐渐与宿主的肠道形成了特定的肠道微生物生态系统；其中，部分微生物长期地居住其中，发挥着吸收消化营养物质、防御有害微生物对宿主的伤害以及免疫调节等重要的作用，并且对生物机体的生长发育等都具有显著的影响。海水鱼体内的主要肠道微生物是多种兼性厌氧菌，包括一些弧菌（Vibrio）、假单胞菌（Pseudomonas）、不动杆菌（Acinetobacter）、棒状杆菌（Corynebacterium）、交替单胞菌（Alteromonas）、黄杆菌（Flavobacterium）和微球菌（Micrococcus）。在人们不断对鱼类肠道微生物的研究中，发现在肠道中的一些微生物能够有效的抑制致病菌的生长，他们称之为益生菌，因此鱼用益生菌凭借其安全环保、无污染、无残留等特点在众多抑菌方法中脱颖而出，受到了业内的广泛关注。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供拮抗菌ED5，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的目的之二在于提供包含上述拮抗菌ED5的菌剂。

本发明的目的之三在于提供上述拮抗菌ED5或菌剂的应用。

本发明的目的之四在于提供包含上述拮抗菌ED5或菌剂的产品。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

本发明提供了一株拮抗菌ED5，分类命名为婴儿芽孢杆菌（Bacillus infantis），于2021年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23456。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分包括上述的拮抗菌ED5或发酵拮抗菌ED5得到的发酵液。

本发明还提供了上述的拮抗菌ED5或菌剂在水产动物养殖中的应用。

本发明还提供了上述的拮抗菌ED5或菌剂在制备防治水产动物病原菌感染的药物中的应用。

进一步的，所述水产动物包括鱼类。

进一步的，所述鱼类包括带鱼及虾虎鱼。

进一步的，所述病原菌感染包括肠道病原菌感染。

进一步的，所述肠道病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌。

本发明还提供了一种药物，所述药物包括上述的拮抗菌ED5或菌剂。

进一步的，所述药物还包括药学上可接受的载体或助剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明以常见海洋鱼类肠道菌群为研究对象，筛选出了一种能有效拮抗常见的6种鱼类致病菌的拮抗菌ED5。该拮抗菌ED5作为益生菌不仅对多种致病菌均有明显的抑菌效果，而且和其他益生菌具有一定亲和性，有希望发挥协同抗菌作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例提供的抑菌试验中拮抗菌ED5的抑菌圈；

图2为本发明实施例提供的抑菌试验中阴性菌DOT1的抑菌圈；

图3为本发明实施例提供的拮抗菌ED5对6种致病菌的抑制作用的结果图；

图4为本发明实施例提供的拮抗菌ED5和菌株ED3的平板对峙实验的结果图。

具体实施方式

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在益生菌中，许多都是人们从鱼类自身的胃肠道中分离筛选出来的。鱼体内的部分肠道微生物存在于肠黏膜的表面，能够产生分泌出一系列的抗菌物质来抑制病原体的侵袭和感染，从而有效地抑制有害微生物的生长。不仅如此，由于水产动物的肠道本来就是一种特定的生态环境，从鱼类自身分离出的拮抗菌株对于鱼类的肠道环境就能够更强更快的适应，能够更容易在宿主的肠道中定植，不会对鱼类的肠道造成二次伤害，而且来源于宿主本身的拮抗菌不管是在安全性还是在作用效果上都比较好。

由此可见，鱼类肠道微生物研究的重要性不言而喻。但是目前淡水鱼类肠道微生物的研究较多，而海洋鱼类则研究相对较少。因此，本发明从带鱼、海参及虾虎鱼肠道中分离出的肠道菌中筛选出的具有一定拮抗性的拮抗菌ED5，有希望应用于人及动物相关的肠道疾病治疗。

本发明提供的拮抗菌ED5，于2021年9月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.23456，该菌株的分类命名为婴儿芽孢杆菌（Bacillus infantis）。

本发明提供的拮抗菌ED5是由如下方法筛选得到：

（a）从海洋鱼类肠道中分离出肠道菌；

（b）选取鱼类常见的致病菌；

（c）对分离的肠道菌进行拮抗菌筛选；

（d）将筛选的拮抗菌进行体外溶血实验；

（e）测定拮抗菌的拮抗活性；

（f）检测拮抗菌间的抑菌率。

其中，海洋鱼类包括带鱼及虾虎鱼。

致病菌包括肠道病原菌感染，例如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌。

经实验验证，本发明提供的拮抗菌ED5，该拮抗菌ED5作为益生菌不仅对多种致病菌均有明显的抑菌效果，而且和其他益生菌具有一定亲和性，有希望发挥协同抗菌作用。

基于本发明提供的拮抗菌ED5的有益效果，本发明还提供了其在水产动物养殖中的应用。

在一些具体的实施方式中，本发明提供的拮抗菌ED5或菌剂能够制备防治水产动物病原菌感染的药物。

下面通过实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，实施例中的材料为根据现有方法制备而得，或直接从市场上购得。

实施例1 肠道菌和致病菌的分离和选取

（1）分离肠道菌

选取威海远遥市场购买的新鲜日本带鱼（Trichiurus lepturus）。将鱼用灭菌的海水清洗干净，并用75%酒精擦拭鱼的体表，用剪刀将鱼腹部剪开，取完整肠道，置于PBS缓冲液中备用；挤出肠道内容物于灭菌离心管，以1:9的比例使用灭菌海水稀释匀浆。

直接涂布培养法：取匀浆液10ml置于装有40ml灭菌海水的50ml锥形瓶中（灭菌前瓶底铺满玻璃珠），放在20°C摇床中，120rpm，摇床培养30min，得到菌悬液母液。在超净工作台内用无菌海水对菌悬液母液进行梯度稀释，一直稀释至10^-11,取10^-7,10^-8,10^-9,10^-10,10^-11五个梯度的菌液分别进行涂布培养，在LB、PY、2216E、2YT、高氏一号、MRS这六种固体培养基上均匀涂布，每个梯度在每种培养基上保持五个平行。将涂布后的培养皿至于20℃培养箱中培养，每12h观察一次。

富集培养法：取带鱼的肠道内容物1g，放入已加入含2%的KH₂PO₄和10%的NaHCO₃的富集培养基的暗瓶中，加满富集培养基，拧紧瓶盖，上下摇动后置于20°C培养箱中培养，每天早上手动摇一次瓶，10天后进行梯度稀释和涂布。梯度稀释一直稀释至10^-6，取10^-4,10^-5,10^-6三个梯度进行涂布。将涂布后的培养皿置于20°C恒温培养箱中培养，每12h观察一次。

划线分离及纯化：将经两种方法涂布培养后长有菌落生长的平板拿出，用接种环挑取每个平板上形态不一的不同菌进行平板划线分离，分别接在与之相应的培养基上，依然放入20℃培养箱中培养；将培养出的菌落进行2-3次纯化，最终在平板上得到相应的单菌落。

（2）选取致病菌

从山东省海洋微生物菌种保藏与应用工程技术研究中心菌库中选取大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）、爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）等6种常见致病菌。

实施例2 拮抗菌的筛选

将待测菌点种在涂布有致病菌的平板上，置于28℃恒温箱中培养24小时，待测菌和致病菌均长势良好，观察出现抑菌圈情况，实验结果见表1，2。

在6种致病菌中，只有金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，其余5种致病菌均为革兰氏阴性菌。当待测肠道菌对于致病菌具有拮抗作用，就会在待测菌菌落的周围出现透明且界限明显的抑菌圈，如图1；当待测肠道菌对致病菌不具有拮抗作用的时候，就不会出现抑菌圈，拮抗性为阴性，如图2。

表1 拮抗菌的初筛结果

表2 对革兰氏菌的抑制测定结果

注：表中的G⁺是金黄色葡萄球菌；G^-是大肠杆菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌、爱德华氏菌5种致病菌。

从上述结果不难看出，拮抗菌ED5对多种致病菌均有抑制作用，且对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑制效果。

实施例3体外溶血实验

将筛选出的具有拮抗性的待测菌接种在血琼脂平板上，倒置在28℃恒温箱中培养，由表3可知，拮抗菌ED5不产生溶血圈。

表3 体外溶血实验结果

当菌种具有溶血能力并且进入鱼体时，会在体内使红细胞大量的破裂，导致血红蛋白从细胞内漏出，从而引发贫血和免疫系统被破坏等一系列反应。表3表明，拮抗菌ED5不会产生溶血现象，表明该拮抗菌具有一定安全性。

实施例4 打孔法测定拮抗菌的拮抗活性

结合点种法初筛的实验结果，使用打孔法测定ED5对于相应的致病菌的拮抗作用的强弱。结果表明：拮抗菌ED5对这6种致病菌均有很强的抑制作用，见表4，图3。

表4待测菌ED5对6种致病菌的拮抗作用

注：表中“++++”代表抑菌圈直径R＞20 mm；“+++”代表15 mm＜R≤20 mm；“++”代表10 mm＜R≤15 mm；“+”代表6 mm＜R≤10 mm；“-”代表R≤6 mm，表示没有拮抗性。“+”越多代表拮抗性越高。

结果表明，拮抗菌ED5对六种致病菌均有较好的抑菌能力。

实施例5 平板对峙实验检测抑菌率

选取拮抗性较好的菌株，即ED3、ED5、EH3、RD4、RH3和RH4，采用平板对峙培养法探究其两两之间的相互作用，实验结果见表6。图4表示的是菌株ED5和ED3的平板对峙实验，通过测量菌带的宽度，按照抑菌率的公式就可以计算两两之间的抑菌率。

表5 抑菌等级说明

表6 菌种 ED5 对其他拮抗菌的抑菌率

从表6可以看出，菌株ED5与ED3、EH3、RD4、RH3、RH4的相互作用等级均为Ⅱ级，说明两菌株之间具有一定的亲和性，可以放置在同一环境中共同培养。因此，在实际应用中，可以考虑将上述多菌种充分发挥协同作用，应用效果比单一的菌种更加显著，也更加稳定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.拮抗菌ED5，分类命名为婴儿芽孢杆菌（Bacillus infantis）于2021年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23456。

2.菌剂，其特征在于，所述菌剂的活性成分包括权利要求1所述的拮抗菌ED5或发酵拮抗菌ED5得到的发酵液。

3.权利要求1所述的拮抗菌ED5或权利要求2所述的菌剂在制备防治水产动物病原菌感染的药物中的应用；

所述病原菌感染包括肠道病原菌感染，所述肠道病原菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、哈维氏弧菌、鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌和爱德华氏菌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述水产动物包括鱼类。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述鱼类包括带鱼及虾虎鱼。

6.一种药物，其特征在于，所述药物包括权利要求1所述的拮抗菌ED5或权利要求2所述的菌剂。

7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或助剂。

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