CN115820482A - 一株解淀粉芽孢杆菌yn-ba2及其菌剂和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株解淀粉芽孢杆菌YN‑BA2及其菌剂和应用，属于生物防治和微生物技术领域，所述解淀粉芽孢杆菌YN‑BA2，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已进行保藏，保藏编号为GDMCC No：62746。该菌株耐热耐酸耐胆盐特性较好，在体外对鸡白痢沙门氏菌以及肠炎沙门氏菌有着较高的抑制效果，可利用该菌株制备生物防治微生态制剂，并通过口服给以鸡群，适用于畜禽业对鸡白痢沙门氏菌病害的防治。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌YN-BA2及其菌剂和应用

技术领域

本发明涉及生物防治和微生物技术领域，具体涉及一株解淀粉芽孢杆菌YN-BA2及其菌剂和应用。

背景技术

鸡白痢在世界各地均有发生，其中是发展中国家最重要的畜禽养殖病害之一，也是危害我国畜禽业最严重的疾病之一，该病由肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)下鸡白痢沙门氏菌(Salmonella Pullorum)血清型感染引起的一种急性全身性传染病，其生命力极其顽强，低温环境下对其致病力也无影响，既可通过感染卵进行垂直传播(生殖系统感染种蛋)，造成鸡白痢沙门氏菌在鸡群中代代相传扩大危害，也可通过接触以及媒介(如污染的粪便、饮水、饲料)迅速水平传播。鸡白痢对任何年龄段任何品种的鸡都可能感染并使其发病，其中导致14日龄至21日龄以内的雏鸡高发病率和高死亡率，成年鸡感染鸡白痢沙门氏菌往往以无症状隐性带菌为主，较为严重时表现为生殖器慢性炎症、贫血和下痢，进而导致生长缓慢，母鸡还表现出产蛋量下降，公鸡则是产精率下降，给养禽业带来了巨大的经济损失。据报告近年来青年鸡发病亦呈上升趋势，并且鸡白痢沙门氏菌感染具有宿主特异性只感染禽类。

目前对于鸡白痢的防治主要为两个手段：第一，从种鸡入手全群实施全血平板凝集实验检测鸡白痴沙门菌抗体，对种鸡场进行鸡白痢综合防治及种鸡逐只检疫净化并及时淘汰带菌鸡；但需花费大量的财力物力人力，并且需要进行世代净化，才能达到净化目标，即使这样也无法彻底控制鸡白痢的发生。对于大多数商品鸡舍鸡白痢仍然达不到净化标准；第二，使用传统抗生素类药物治疗。虽然在经济上对养殖业有利，但长期以来在商业家禽养殖中使用抗生素进行预防和促生长，增加了耐药微生物的发展，很大程度上导致了抗生素治疗的失败，造成养殖业的生产损失以及致病菌随动物性食物通过食物链传递给人类，提升了人畜共患感染的风险。其次抗生素在家禽体内积累等因素已造成了对家禽健康的危害，而且过量的抗生素排泄到环境中引起环境的污染，进而对人类健康也会引起一系列的影响。因此，迫切需要找到能够有效控制病原体和保留类似于抗生素的生长促进特性的替代策略。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)厚壁菌门的一员属于需氧兼厌氧的G+芽孢杆菌，广泛分布于自然界及动植物中，易分离易培养，对人和动物没有毒害作用，不会对环境造成污染，其发酵过程中能分泌一系列能够抑菌的活性代谢物(如各种水解酶类、表面活性素、伊枯草菌素等抗菌类物质)抑制有害病原菌的生长并增强机体抵抗致病菌的能力；还能分泌一系列可以帮助机体消化吸收营养物质的的代谢物(如蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶)，使机体增加体重更好的分解饲料。是一种可代谢多种抑菌活性物质且对宿主有益的微生物。在潜在的工农业开发方面具有一定优势，不同菌株在不同领域的益处得到了广泛的研究。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的一在于提供一株解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，目的二在于提供一种生物防治微生物态制剂，目的三在于提供上述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2的应用。所述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，耐热耐酸耐胆盐特性较好，在体外对鸡白痢沙门氏菌以及肠炎沙门氏菌有着较高的抑制效果，适用于畜禽业对鸡白痢沙门氏菌病害的防治。

为实现上述目的，本发明采用的具体方案为：

一株解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，所述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62746，保藏日期为2022年08月27日。

一种生物防治微生物态制剂，包含上述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，或/和其发酵物。

优选地，所述生物防治微生物态制剂包含解淀粉芽孢杆菌YN-BA2的菌粉、发酵液、浓缩发酵液、稀释发酵液、菌悬液、发酵产物或发酵离心上清液中的至少一种。

更优选地，所述发酵液是将解淀粉芽孢杆菌YN-BA2菌株活化后，接种于LB肉汤培养基中，180r/min摇床培养12h-16h所得。

上述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2或生物防治微生物态制剂在如下任意一种中的应用：

A、用于体外抑制鸡白痢沙门氏菌或/和肠炎沙门氏菌；

B、用于制备体外抑制鸡白痢沙门氏菌或/和肠炎沙门氏菌的制品；

C、用于制备防治鸡白痢沙门氏菌病害的制品。

有益效果：本发明解淀粉芽孢杆菌YN-BA2在体外对肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌有较好的抑制效果，在“禁抗、限抗”的大环境下，微生态饲料添加剂的推广与应用,对推动我国饲料业的绿色进程，解决药物残留问题，实现动物源性食品绿色化，提高畜产品的国际市场竞争能力，保障人民身体健康，必将发挥重要作用。在畜禽业作为代替抗生素的新型微生态制剂菌源具有广阔的前景和潜力。

菌种保藏信息：本发明提供一株解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62746，保藏日期为2022年08月27日。

附图说明

图1是分离菌株基因进化树；

图2是解淀粉芽孢杆菌YN-BA2对各实验组中的IL-10的影响对比图；

图3是解淀粉芽孢杆菌YN-BA2对各实验组中的TNF-α的影响对比图；

图4是解淀粉芽孢杆菌YN-BA2对各实验组空肠中ALP的影响对比图；

图5是解淀粉芽孢杆菌YN-BA2对各实验组空肠中MPO的影响对比图。

具体实施方式

本发明提供的一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)YN-BA2，该菌株YN-BA2是从云南省昆明市云南农业大学东校区后山实验鸡场环境土壤中分离所得，该菌株经16S rDNA基因测序鉴定为解淀粉芽孢杆菌；解淀粉芽孢杆菌YN-BA2的形态特征：菌株YN-BA2为革兰氏阳性菌，具有运动性，形状为杆状，两端钝圆；在LB琼脂培养基平板上生长出的菌落呈现为表面粗糙，有隆起，边缘不规则、乳白色不透明。

一种所述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2在防治鸡白痢中的应用。

一种生物防治微生态制剂，生物防治微生态制剂含上述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2。

所述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2包含该菌株的菌粉、发酵液、浓缩发酵液、稀释发酵液、菌悬液、发酵产物或发酵离心上清液。

所述菌剂中解淀粉芽孢杆菌YN-BA2活菌数高于1×10⁶cfu/mL。

所述发酵液为该菌株活化后，接种于LB肉汤培养基中，180r/min摇床培养12h-16h，即可得到所述发酵液。

培养本发明菌株的需求条件简易，一般培养温度为37℃，培养液调控在pH7.0-8.0期间，震荡180r/min，15mL装5mL LB肉汤培养基，培养12h-16h(优选12h)，最终发酵液菌体浓度高于1×10⁸cfu/mL。

所述生物防治微生态制剂的应用，所述生物防治微生态制剂通过口服给以鸡群，用于防治鸡白痢疾病。

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：菌株的分离鉴定及筛选。

解淀粉芽孢杆菌YN-BA2分离于云南省昆明市云南农业大学东校区后山实验鸡场环境土壤样品中。样本采集于云南农业大学东校区后山实验鸡场环境土壤，距地面10cm的土壤100g，共10份，样品放入自封袋中带回实验室-20℃保存。

分离方法：取1g土壤样品放入50mL离心管中并加入25mL蒸馏水混匀，置于80℃水浴锅中处理10min，冷却后吸取上层液体100μL涂布于LB琼脂(胰蛋白胨10.g、酵母浸粉5.0g、氯化钠10.0g、琼脂15.0g蒸馏水1000mL)平板，置于37℃恒温培养箱中培养24h后，根据形态、大小、色泽等特点挑取单菌落5株继续反复划线纯化，获得纯系菌株。

鉴定方法：对纯化后的5株菌株进行形态学观察、生理生化试验、16S rDNA基因测序鉴定。5株菌株均是革兰氏阳性好氧菌，具有运动性，形状为杆状，两端钝圆；在LB琼脂培养基平板上生长出的菌落均呈现为表面粗糙，有隆起，边缘不规则、乳白色不透明。扩增5株菌株的16S rDNA基因，测出其16S rDNA基因序列，登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov网站，在GenBank中进行核苷酸比对，结果显示分离所得菌均与Bacillus amyloliquefaciens的亲缘关系最近。用DNA Star软件与9株同源性较高菌株核苷酸序列比对并绘制基因进化树。结果显示分离所得5株菌株均与MW361269.1解淀粉芽孢杆菌MW672320.1解淀粉芽孢杆菌在同一分支上(图1)，综合以上结果分析确定分离所得菌株均属于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

筛选方法：采用琼脂打孔法测定菌株的抑菌效果，将肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌接种于30℃的LB琼脂培养基中迅速混匀倒板，待琼脂冷却凝固后，使用6mm孔径打孔器在LB琼脂上进行打孔，各孔间隔25mm，将分离菌株的发酵上清液接种于孔内，37℃培养24h后测量分离菌株对致病菌的抑菌直径，根据琼脂打孔法抑菌实验说明，判断各分离株对致病菌的敏感度并筛选抑菌直径长的菌株。

试验结果：临床分离菌株YN-BA1、YN-BA2、YN-BA3、YN-BA4、YN-BA5对实验室所保存的鸡白痢沙门氏菌YN-SP10肠炎沙门氏菌YN-S1均有抑菌作用(表1)。

表1：分离菌株对致病菌的抑菌敏感度。

注：“+++”代表高敏；“++”代表中敏；“+”代表钝敏；“－”代表无抑菌作用。

同时，采用体外耐酸耐胆盐实验测定分离菌株的存活率，使用稀释5倍的盐酸将LB肉汤PH值依次调整为2、3、4，然后使用滤膜(0.22μm)过滤。取1mL过夜培养XX菌液6000r/min离心10min，收集菌体沉淀并使用上述调整过PH值的LB肉汤重悬；另取一份普通LB肉汤培养基重悬菌泥作为对照，37℃摇床培养2h。进行菌落计数并计算存活率：菌株存活率＝不同处理2h后活菌数/普通培养基处理2h后活菌数×100％。

试验结果：对分离得到的菌株进行耐酸试验，结果显示(见表2)在PH＝2的环境中YN-BA2活菌率42.10％高于另外4个菌株，PH＝3的环境中YN-BA2活菌率51.50％高于其他4个菌株，PH＝4的环境中YN-BA2活菌率74.67％高于另外四个菌株。

表2：分离菌株耐酸试验结果。

称取猪胆盐2.5g溶于50mL去离子水中，配制成5％的胆盐溶液，并用滤膜(0.22μm)过滤。然后将600μL 5％胆盐溶液加入至10mL LB肉汤中配置成0.3％胆盐的LB肉汤培养基。

取耐受LB肉汤PH＝2解淀粉芽孢杆菌菌液，1％比例分别接种于含/不含0.3％胆盐的LB肉汤中，37℃，180r/min培养5h后进行菌落计数。计算存活率：同耐酸实验。

试验结果：对分离得到的菌株进行耐胆盐试验，结果显示(见表3)在0.3％胆盐浓度下处理5h后，YN-BA2存活率为51％，相比高于另外四株菌。结合耐酸试验结果，故认为YN-BA2耐酸耐胆盐特性相对于另外四株较好，在消化道生存潜力最大。

表3：耐胆盐试验结果。

综合上述实验分析，得到一株抑菌能力强，耐酸耐胆盐较好的菌株，并将其命名为YN-BA2，并进行了保藏，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCC No：62746，保藏日期为2022年08月27日。

YN-BA2菌株的16S rDNA序列为：

CCGCCGTGCTATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGGCTTGGCATCCTCTGGCAATCCTAAA。

实施例2：动物体感染模型上解淀粉芽孢杆菌YN-BA2对鸡白痢沙门氏菌的预防及治疗效果。

1.动物体试验设计。

试验采用随机试验设计，120羽7日龄茶花雏鸡随机分为4组，分别命名为A组、B组、C组和D组，每组3个重复，每个重复10羽(详情如表4)。所有分组分别在隔离环境下笼养，参照云岭广大茶花仔鸡营养需要量标准配制的饲粮进行饲喂。试验全期正常免疫，温湿度以及灯光照明状态严格按照云岭广大茶花仔鸡饲养流程进行，定期对鸡舍进行消毒、清理和通风等工作，饲养期间严格保持鸡群自由采食和饮水，其他管理措施与常规饲养管理相同。

表4动物体试验分组及处理。

样品的采集：14日龄与21日龄时，各实验组随机挑选6羽，心脏采血2mL,室温放置10-20min后3000/20min收集血清，ELISA法检测血清中IL-10与TNF-α含量；无菌条件下采集空肠，加入一定量的PBS(PH＝7.4)，均浆器将样品充分均浆，3000r/20min收集上清。比色法检测空肠中ALP、MPO含量。

如图2所示，在实验14d和21d时，与空白组相比，SP组IL-10表达量显著增加了33.83％、17.57％(P＜0.05)；与SP组相比，预防组IL-10表达量增加了4.40％、5.10％(P>0.05)，攻毒7d时治疗组IL-10表达量增加了9.16％，21d时治疗组IL-10表达量显著增加了14.01％(P＜0.05)。由上述说明，正常茶花鸡灌喂YN-BA2能够增加血清中IL-10的表达量，且茶花鸡感染SP后，相比于SP组，连续3d灌胃YN-BA2进行预防和治疗能够提升茶花鸡血清中抗炎因子IL-10表达量。如图3所示，在实验14d和21d时，与空白对照组相比，SP组TNF-α表达量显著增加了28.57％、33.55％(P＜0.05)；与SP感染组相比，预防组TNF-α表达量显著降低了24.68％、24.96％(P＜0.05)，治疗组TNF-α表达量显著降低了18.80％、20.57％(P＜0.05)。由上述说明，茶花鸡感染SP后，相比于SP组，连续3d灌胃YN-BA2进行预防和治疗能够降低茶花鸡血清中促炎因子TNF-α的表达量。

如图4可知，在实验14d和21d时，与空白对照组相比，SP组ALP含量显著降低(P＜0.05)；与SP组相比，预防组ALP含量显著上升(P＜0.05)，治疗组虽然也有所上升但差异不显著(P>0.05)；

如图5可知，在实验14d时，与空白组相比，SP组MPO含量显著上升(P＜0.05)；与SP组相比，预防组MPO含量显著降低(P＜0.05)，治疗组虽然也有所降低但差异不显著(P>0.05)；21d时，与空白对照组相比，SP组MPO含量虽有所上升但差异不显著(P>0.05)；与SP组相比，预防组和治疗组MPO含量均显著降低(P＜0.05)。

综合上述说明，茶花鸡感染SP后，相比于SP组，单纯灌喂与连续3d灌胃YN-BA2进行预防和治疗能够提高ALP活性并降低MPO活性。

需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一株解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，所述解淀粉芽孢杆菌YN-BA2的分类命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，保藏编号为GDMCCNo：62746，保藏日期为2022年08月27日。

2.一种生物防治微生物态制剂，其特征在于：包含权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌YN-BA2，或/和其发酵物。

3.根据权利要求2所述的一种生物防治微生物态制剂，其特征在于：所述生物防治微生物态制剂包含解淀粉芽孢杆菌YN-BA2的菌粉、发酵液、浓缩发酵液、稀释发酵液、菌悬液、发酵产物或发酵离心上清液中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的一种生物防治微生物态制剂，其特征在于：所述发酵液是将解淀粉芽孢杆菌YN-BA2菌株活化后，接种于LB肉汤培养基中，180r/min摇床培养12h-16h所得。

5.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌YN-BA2或权利要求2-4任意一种所述的生物防治微生物态制剂在如下任意一种中的应用：

A、用于体外抑制鸡白痢沙门氏菌或/和肠炎沙门氏菌；

B、用于制备体外抑制鸡白痢沙门氏菌或/和肠炎沙门氏菌的制品；

C、用于制备防治鸡白痢沙门氏菌病害的制品。

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