CN113980861B - 一种寡养单胞菌snd01及其应用 - Google Patents

一种寡养单胞菌snd01及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种寡养单胞菌SND01及其应用，寡养单胞菌SND01的保藏编号为CGMCC No.21718。本发明的寡养单胞菌SND01来源于人唾液，培养简单，烟碱降解率较高，可用于调整烟叶烟碱含量或降解烟草废弃物烟碱。

Description

一种寡养单胞菌SND01及其应用
技术领域
本发明涉及烟碱降解微生物领域，更具体地，涉及一种寡养单胞菌SND01及其应用。
背景技术
烟碱(nicotine)，俗称尼古丁，是存在于茄科植物(茄属)的一种生物碱，是烟草的重要成分，占烟草生物碱的95％以上。烟叶作为烟草制品的原料，对烟碱含量有严格的要求。烟碱含量过高，烟叶刺激性强、吃味变差、品质下降。受到烟草品种、栽培及气候等因素的影响，烟叶中的烟碱含量存在一定差异。此外，烟草制品生产加工过程中会产生固体和液体等废弃物，这些废弃物含有烟碱。
降解烟碱的方法有很多，微生物降解烟碱因具有安全环保、成本低廉等优势受到较多关注。公开报道的降解烟碱的微生物主要有节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、土壤杆菌属(Agrobacterium)等。
目前，应用烟碱降解的微生物绝大多数分离自烟叶、植烟土壤、烟草废弃物。具有烟碱降解能力的人唾液来源微生物未见报道。
因此，如何提供一种来源于人唾液且具有烟碱降解能力的微生物成为本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种来源于人唾液且具有烟碱降解能力的寡养单胞菌SND01的新技术方案。
根据本发明的第一方面，提供了一种寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)SND01，保藏编号为CGMCC No.21718。
根据本发明的第二方面，提供了一种微生物制剂，包括本发明所述的寡养单胞菌SND01。
根据本发明的第三方面，提供了一种本发明所述的寡养单胞菌SND01或本发明所述的微生物制剂在烟碱降解中的应用。
根据本发明的第四方面，提供了一种寡养单胞菌SND01在烟碱降解中的应用，先将保藏编号为CGMCC NO.21718的寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)SND01水浴融化后接入含有烟碱的液体培养基中，震荡培养获得菌株活化液，再将菌株活化液接入待降解物中。
可选的，包括如下步骤：
步骤(1)：将超低温保存的寡养单胞菌SND01菌株水浴融化后，接入含有烟碱的液体培养基中，25-37℃、160-180rpm震荡培养18-48h，获得菌株活化液；
步骤(2)：取菌株活化液接入待降解物中。
可选的，还包括以下步骤：
收集菌株活化液中的菌株细胞，并用无菌水将菌株细胞制成菌悬液，将菌悬液接入待降解物中。
可选的，菌悬液的OD600为0.6-0.7。
本发明的寡养单胞菌SND01来源于人唾液，培养简单，烟碱降解率较高，可用于调整烟叶烟碱含量或降解烟草废弃物烟碱。
附图说明
被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
图1为pH值对烟碱降解率的影响图。
图2为温度对烟碱降解率的影响图。
图3为烟碱浓度对烟碱降解率的影响图。
图4为氮源对烟碱降解率的影响图。
具体实施方式
现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。
对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为说明书的一部分。
在这里示出和讨论的所有例子中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它例子可以具有不同的值。
本发明提供了一种寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)SND01，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21718，菌种名称为寡养单胞菌，菌株编号为SND01，分类命名为Stenotrophomonas pavanii，保藏时间为2021年01月15日。
本发明还提供了一种微生物制剂，包括本发明的寡养单胞菌SND01。
本发明还提供了寡养单胞菌SND01或微生物制剂在烟碱降解中的应用。
本发明还提供了一种寡养单胞菌SND01在烟碱降解中的应用，该应用先将保藏编号为CGMCC NO.21718的寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)SND01水浴融化后接入含有烟碱的液体培养基中，震荡培养获得菌株活化液，再将菌株活化液接入待降解物中。上述待降解物可例如为烟叶或烟草制品生产加工过程中产出的废弃物。
上述应用可包括如下步骤：
步骤(1)：将超低温保存的寡养单胞菌SND01菌株水浴融化后，接入含有烟碱的液体培养基中，25-37℃、160-180rpm震荡培养18-48h，获得菌株活化液。
步骤(2)：取菌株活化液接入待降解物中。
为了达到更好的降解效果，本发明的应用还可包括以下步骤：
收集菌株活化液中的菌株细胞，并用无菌水将菌株细胞制成菌悬液，将菌悬液接入待降解物中。
菌悬液的OD600可为0.6-0.7。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，实验中使用的设备如无特殊说明，均为本领域技术人员熟知的设备。
一、寡养单胞菌SND01的筛选和分离。
1、培养基
(1)改良烟碱培养基
改良烟碱固体培养基：K2HPO4·3H20，13.3g；KH2PO4，4g；MgSO4·7H2O，0.2g；微量元素溶液，0.5mL；琼脂，1.5％；水，1000mL；调节pH 7.0；121℃灭菌15min；烟碱用0.22μm无菌一次性滤膜过滤后按1g/L加入。
改良烟碱液体培养基：与改良烟碱固体培养基的配方及配制方法相同，不加琼脂。
(2)微量元素溶液
FeSO4·7H2O，0.2g；MnSO4·H2O，0.65g；CaCl2·6H2O，0.13g；使用0.1mol/L HCl溶液定容到100mL。
2、菌株筛选和分离
(1)富集培养：从志愿者唾液样品5份中分别取1mL唾液加入40mL改良烟碱液体培养基中，30℃、150rpm摇床培养48h，获得初次富集培养液；取2mL富集培养液转接于新鲜改良烟碱液体培养基中，继续培养48h，获得二次富集培养液。
(2)稀释涂布：用无菌生理盐水(0.9％NaCl溶液)，将富集培养液10倍梯度稀释后，将富集培养液原液及稀释液分别涂布于改良烟碱固体培养基上，每个稀释度涂布3皿，分别置于需氧、厌氧条件下30℃恒温培养，每天早晚观察一次。
(3)分离纯化：在改良烟碱固体培养基上，挑选单菌落，划线于新鲜改良烟碱固体培养基上，置于需氧或厌氧条件下30℃培养；根据菌落情况再次划线分离，直至获得纯的菌株。
(4)菌株保存：挑取培养基上的单菌落，置于无菌甘油管(甘油15％，v/v)中充分混匀，置于程序降温盒中-80℃保存。
3、烟碱降解能力的测定
(1)烟碱标准曲线的绘制：采用紫外分光光度计测定烟碱含量。取烟碱0.1g用0.05mol/L HCl稀释为0.1mg/mL，吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于10mL容量瓶中，再用0.05mol/L HCl定容摇匀，以0.05mol/LHCl溶液作为空白，测定不同浓度下259nm的吸光值，绘制标准曲线。
(2)烟碱含量的测定：将超低温保存菌株37℃水浴快速融化后，取50μL保存液接入含5mL改良烟碱液体培养基中，30℃、150rpm震荡培养24～48h，获得菌株活化液；取0.5mL菌株活化液，接入含50mL改良烟碱液体培养基中，每个菌株接种2个平行，30℃、150rpm震荡培养1～6d，以加烟碱、未加菌液的液体培养基作为空白对照，测定培养液中烟碱含量。
4、降烟碱菌株的获得
从唾液样品中分离获得具有烟碱降解能力的菌株，命名为SND01。
二、菌株SND01的鉴定。
1、形态和生理生化鉴定
在改良烟碱固体平板上，菌落呈圆形、表面光滑、边缘整齐、颜色为淡黄色。菌株形态：革兰氏染色阴性，短杆状。生理生化特征：葡萄糖发酵阴性、精氨酸二水解酶阴性、尿素阴性、明胶水解阳性、β-半乳糖苷酶阳性、葡萄糖和阿拉伯糖同化阴性、甘露糖和麦芽糖同化阳性、苹果酸和枸橼酸钠同化阳性、己二酸和苯乙酸同化阴性。
2、分子生物学鉴定
利用细菌基因组提取试剂盒提取SND01基因组DNA，用16S rRNA基因序列的扩增引物20F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1500R(5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′)扩增16SrRNA基因，PCR扩增条件为：94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，32个循环；72℃5min。PCR产物进行测序后，在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行在线比对分析。结果显示，PCR产物长度为1448bp，与NCBI数据库中的寡养单胞菌(Stenotrophomonaspavanii)具有很高的同源性(99％)。基于以上结果，将SND01鉴定为寡养单胞菌。寡养单胞菌SND01 16S rDNA的序列表为SEQ ID NO:1。
三、寡养单胞菌SND01在降低烟碱中的应用。
(1)培养基初始pH对烟碱降解率的影响。
将超低温冻存的菌株取出后，在40℃水浴中迅速融化后，以1％(v/v)接种于改良烟碱液体培养基(烟碱含量1g/L)内，置于30℃、180rpm摇床培养18-24h，获得活化的SND01菌液。
将改良烟碱液体培养基初始pH依次调整为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；再将活化的SND01菌液(OD600在0.6-0.7之间)按1％(v/v)接种于不同pH改良烟碱液体培养基(烟碱含量1g/L)内；置于30℃、180rpm摇床培养48h，测定烟碱降解率。如图1所示，菌株SND01在pH 6～8之间均能降解烟碱并生长良好，降解烟碱的pH值范围较宽；随着pH从5.0升至7.0，烟碱降解率从9.99％增至27.90％，随着pH从7.0升至9.0，烟碱降解率随之降至17.28％。因此，培养基初始pH7.0时，该菌株的烟碱降解率最高。
(2)培养温度对烟碱降解率的影响。
将活化的SND01菌液(OD600在0.6-0.7之间)按1％(v/v)接种于改良烟碱液体培养基(烟碱含量1g/L)内，分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃6个温度下培养，置于180rpm摇床培养48h，测定烟碱降解率。如图2所示，菌株SND01对温度较为敏感，烟碱降解率随温度变化较大；在25℃～37℃之间均能生长并能降解烟碱，低于25℃或高于40℃菌株不能生长；在25℃～30℃之间，烟碱降解率随温度的增加而升高，烟碱降解率从13.21％升至28.63％，在30℃～37℃之间烟碱降解率随温度的升高而降低，烟碱降解率从28.63％降至15.40％。因此，该菌株在培养温度30℃时，烟碱降解能力最佳。
(3)烟碱浓度对烟碱降解率的影响。
将活化的SND01菌液(OD600在0.6-0.7之间)按(v/v)接种于不同烟碱含量的改良烟碱液体培养基内，烟碱含量分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5g/L，置于30℃、180rpm摇床培养48h，测定烟碱降解率。如图3所示，烟碱浓度在1.0～2.5g/L时，该菌株能降解烟碱；烟碱浓度为1.0～1.5g/L时，烟碱降解率较高且均在28.0％以上；烟碱浓度为1.5～3.0g/L时，烟碱降解率随烟碱浓度的增加而降低。
(4)不同氮源对烟碱降解率的影响。
分别考察蛋白胨、牛肉粉、酵母提取物3种氮源对烟碱降解率的影响。在改良烟碱液体培养基配方中，分别加入以上3种氮源，含量均为1g/L。将活化的菌液(OD600在0.6-0.7之间)按1％(v/v)接种于不同氮源的改良烟碱液体培养基中，置于30℃、180rpm摇床培养48h，测定烟碱降解率。如图4所示，在不同的氮源下，菌株SND01的烟碱降解率不同；以蛋白胨和牛肉粉为氮源，该菌株的降解烟碱能力有较好的协同作用，以加入蛋白胨效果最好，烟碱降解率达到31.23％，加入酵母提取物的协同作用不大。
(5)菌株的烟碱降解优化条件。
在以上单因素实验获得的最佳条件下，将活化的菌液(OD600在0.6-0.7之间)按1％(v/v)接种于含1.5g/L烟碱和1g/L蛋白胨的改良烟碱液体培养基(pH 7.0)内，置于30℃、180rpm摇床培养48h，测定烟碱降解率。结果显示，菌株SND01的烟碱降解率为30.79％。
四、寡养单胞菌SND01在降低烟叶或废弃物烟碱中的应用。
将寡养单胞菌SND01制备成菌悬液，应用于烟叶或废弃物中烟碱的降解。SND01菌悬液的制备方法具体是：(1)按照寡养单胞菌SND01的烟碱降解优化条件，进行SND01菌株的培养，获得培养液；(2)再通过0.22μm的无菌滤膜收集培养液中的菌株细胞，用无菌蒸馏水将菌株细胞制备成菌悬液，菌悬液OD600在0.6-0.7之间；(3)以上菌悬液可用于烟叶或废弃物处理。
虽然已经通过例子对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上例子仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员应该理解，可在不脱离本发明的范围和精神的情况下，对以上实施例进行修改。本发明的范围由所附权利要求来限定。

Claims (7)

1.一种寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)SND01，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.21718。
2.一种微生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述的寡养单胞菌SND01。
3.权利要求1所述的寡养单胞菌SND01或权利要求2所述的微生物制剂在烟碱降解中的应用。
4.一种寡养单胞菌SND01在烟碱降解中的应用，其特征在于，先将保藏编号为CGMCCNO.21718的寡养单胞菌(Stenotrophomonas pavanii)SND01水浴融化后接入含有烟碱的液体培养基中，震荡培养获得菌株活化液，再将菌株活化液接入待降解物中。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)：将超低温保存的寡养单胞菌SND01菌株水浴融化后，接入含有烟碱的液体培养基中，25-37℃、160-180rpm震荡培养18-48h，获得菌株活化液；
步骤(2)：取菌株活化液接入待降解物中。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，还包括以下步骤：
收集菌株活化液中的菌株细胞，并用无菌水将菌株细胞制成菌悬液，将菌悬液接入待降解物中。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，菌悬液的OD600为0.6-0.7。
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