CN109337944A - 一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及絮凝剂制备技术领域，解决了现有微生物存在多糖产量低和多糖絮凝活性低的问题，公开了一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法。该絮凝剂制备方法为先将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，加入无菌水制成菌种液；然后将菌种液接种量接种到液体培养基中进行发酵培养得到发酵液；最后加入絮凝载体继续发酵制得原料液，经过离心分离、干燥得到活性多糖絮凝剂。本发明采用海洋芽孢杆菌菌株生产的活性多糖产量较高且具有较高的絮凝活性。
Description
技术领域
本发明涉及絮凝剂技术领域，尤其是涉及一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法。
背景技术
絮凝剂是水处理技术中常用的药剂之一。近年来，应用最广泛的传统高分子聚合物类絮凝剂不断被发现存在威胁人类健康和破坏生态环境的潜在问题，研究环保无公害的新型絮凝剂便成为了水处理研究的热点问题，其中报道最多的当属微生物絮凝剂。生物絮凝剂是一类具有生物降解功能的聚合物，由具有这类特殊功能的微生物所分泌的包含多糖、脂类及蛋白质等。由于其对环境的安全及无污染性，因此受到国内外众多科研工作者的重视。目前已经从土壤、活性污泥、生活污水、各种工业废水等环境中筛选得到多种微生物絮凝剂产生菌，其中报道较多的有Nakamura等发现的产生微生物絮凝剂AJ7002的酱油曲霉AJ7002、Takagi 等发现的产生PF101的拟青霉和Kurane等产生NOC-1的红平红球菌等，这些微生物絮凝剂相对于传统高分子化学絮凝剂来说具有环境友好、无二次污染的优点，但是这些微生物存在多糖产量低和多糖絮凝活性低的问题。
发明内容
本发明是为解决上述问题，提供一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，该方法制备的活性多糖产量和絮凝活性高，另外该方法在分离后期采用载体离心分离的方法将活性多糖絮凝剂与发酵液分离，大大简化分离步骤，多糖与发酵液分离较为彻底，生产成本较低。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明所采用的海洋芽孢杆菌菌株Bacillllus sp.GHS8-1是从菲律宾蛤仔黏附淤泥中分离获得，经实验发现该海洋芽孢杆菌菌株Bacillllus sp.GHS8-1的代谢产物为具有较高絮凝活性的胞外多糖。
上述海洋芽孢杆菌菌株Bacillllus sp.GHS8-1已于2018年10月12日向中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏编号CGMCC No.16578，建议类命名为Bacillus；上述海洋芽孢杆菌菌株Bacillllus sp.GHS8-1的16S rDNA全序列(1282bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank 基因序列数据库提交，登录号为KX702261，全序列如下：
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1)将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，然后加入无菌水制成菌种液；
2)将菌种液接种到液体培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
3)将絮凝载体加入发酵液中，调节pH至7-7.5，并继续发酵制得原料液，经过离心分离、干燥得到活性多糖絮凝剂。
海洋芽孢杆菌能够代谢产生活性较高且产率较高的胞外多糖絮凝剂，本发明首先对海洋芽孢杆菌菌株进行固体培养基培养得到菌种，然后接种到液体培养基中进行发酵，发酵过程中海洋芽孢杆菌代谢产生具有活性的多糖絮凝剂，然后在发酵后期加入絮凝载体，细菌在絮凝载体上生长繁殖，经过离心后，载体沉降到发酵液底部，从而使细菌胞外多糖发生沉降，然后经过干燥得到活性多糖絮凝剂；本发明使用载体沉降胞外多糖，相比传统方法使用乙醇沉降胞外多糖不仅能够节省大量的乙醇，降低生产成本，还能够简化分离步骤，提高多糖与发酵液的分离效果。
作为优选，所述步骤1)中菌体的培养温度为22-30℃，培养时间为50-60h。
作为优选，所述步骤1)中无菌水的体积为固体培养基体积的1.5-3倍。
作为优选，所述步骤1)中固体培养基为向液体培养基中添加液体培养基重量1-2％琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
作为优选，所述步骤2)中菌种液的接种量为12-18％。
作为优选，所述步骤2)中液体培养基包括以下组分：葡萄糖10-15g/L，蔗糖5-10g/L，蛋白胨1-2g/L，醋酸钠0.5-1g/L，酵母膏0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，余量为陈化海水。
作为优选，所述步骤2)中发酵培养温度为23-25℃，发酵培养时间为3-6天。
作为优选，所述步骤3)中絮凝载体的添加量为0.2-0.5g/ml，发酵时间为2-3天。
作为优选，所述步骤3)中絮凝载体的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖溶于质量浓度为0.5-1％醋酸中配制成质量浓度为1-5％壳聚糖溶液，备用；将乳化剂仲醇基硫酸钠按仲醇基硫酸钠与壳聚糖的质量比1:10-20加入壳聚糖溶液中，然后加入多巴胺，多巴胺与壳聚糖的质量比为1:3-6，搅拌混合均匀，静置脱泡；将脱泡后的溶液滴加到凝结液中，凝结液为氢氧化钠和甲醇的混合水溶液，其中氢氧化钠的质量浓度百分比为10-20％，甲醇的质量浓度百分比为25-30％，得到絮凝载体前驱体；将絮凝载体前驱体加入质量浓度为 0.5-5％的六偏磷酸钠交联剂水溶液中进行交联1-2h，经过分离，洗涤，干燥，即得。
本发明利用壳聚糖和多巴胺之间通过交联剂发生交联反应，生成稳定性较高的絮凝载体，避免在后续离心分离过程中壳聚糖载体在外力的条件下发生破坏，使胞外多糖脱离絮凝载体；在酸性条件下，絮凝载体上的氨基发生质子化作用，使絮凝载体带正电，带正电的絮凝载体与带负电的细菌和胞外多糖具有引力作用，从而提高絮凝载体对细菌和胞外多糖的吸附效果，氨基发生质子化还会使絮凝载体大分子上氨基形成的氢键受到破坏，絮凝载体发生溶胀作用，提高絮凝载体的表面积，进一步增加絮凝载体对细菌和胞外多糖的吸附效果。另一方面，选用壳聚糖与多巴胺交联相比选用壳聚糖自身发生交联能增加絮凝载体上的氨基，这是因为壳聚糖分子体积较大，多巴胺分子体积较小，多巴胺与壳聚糖交联相比壳聚糖自身交联，相同体积的絮凝载体，多巴胺与壳聚糖交联形成的絮凝载体具有更多的氨基，从而提高絮凝载体与细菌和胞外多糖之间的静电作用。
因此，本发明具有如下有益效果：(1)利用洋芽孢杆菌菌株Bacillllus sp.GHS8-1能够代谢产生活性较高且产率较高的胞外多糖絮凝剂；(2)发酵液中的胞外多糖能够得到充分的分离，从而得到更多的胞外多糖絮凝剂；(3)降低生产成本。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的，实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
液体培养基包括以下组分：葡萄糖13g/L，蔗糖8g/L，蛋白胨1.5g/L，醋酸钠0.8g/L，酵母膏 0.7g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，余量为陈化海水。
固体培养基：向液体培养基中添加液体培养基重量1.5％琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1)将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，在27℃下培养55h，然后加入固体培养基2倍体积的无菌水制成菌种液；
2)将菌种液按接种量15％接种到液体培养基中在24℃进行发酵培养4天，得到发酵液；
3)将絮凝载体按质量体积比0.45g/ml加入发酵液中，调节pH至7.3，并继续发酵2天，制得原料液，经过离心分离、干燥得到絮凝剂。
絮凝载体的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖溶于质量浓度为0.8％醋酸中配制成质量浓度为3％壳聚糖溶液，备用；将乳化剂仲醇基硫酸钠按仲醇基硫酸钠与壳聚糖的质量比1:15加入壳聚糖溶液中，然后加入多巴胺，多巴胺与壳聚糖的质量比为1:5，搅拌混合均匀，静置脱泡；将脱泡后的溶液滴加到凝结液中，凝结液为氢氧化钠和甲醇的混合水溶液，其中氢氧化钠的质量浓度百分比为15％，甲醇的质量浓度百分比为28％，得到絮凝载体前驱体；将絮凝载体前驱体加入质量浓度为3％的六偏磷酸钠交联剂水溶液中进行交联1.5h，经过分离，洗涤，干燥，即得。
经测定本实施例制备的胞外多糖絮凝剂对高岭土的FR值达到88％，对六价铬离子去除率达到86％；对高浓度水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝的脱色率达87％，对墨水蓝的脱色率达90％，对孔雀石绿脱色率达92％，对结晶紫的脱色率达94％。
实施例2
液体培养基包括以下组分：葡萄糖11g/L，蔗糖6g/L，蛋白胨1.5g/L，醋酸钠0.6g/L，酵母膏 0.7g/L，磷酸二氢钾0.6g/L，余量为陈化海水。
固体培养基：向液体培养基中添加液体培养基重量1.5％琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1)将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，在23℃下培养52h，然后加入固体培养基1.8倍体积的无菌水制成菌种液；
2)将菌种液按接种量13％接种到液体培养基中在24℃进行发酵培养4天，得到发酵液；
3)将絮凝载体按质量体积比0.3g/ml加入发酵液中，调节pH至7.2，并继续发酵3天，制得原料液，经过离心分离、干燥得到絮凝剂。
絮凝载体的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖溶于质量浓度为0.6％醋酸中配制成质量浓度为1.5％壳聚糖溶液，备用；将乳化剂仲醇基硫酸钠按仲醇基硫酸钠与壳聚糖的质量比1:12加入壳聚糖溶液中，然后加入多巴胺，多巴胺与壳聚糖的质量比为1:3.5，搅拌混合均匀，静置脱泡；将脱泡后的溶液滴加到凝结液中，凝结液为氢氧化钠和甲醇的混合水溶液，其中氢氧化钠的质量浓度百分比为12％，甲醇的质量浓度百分比为25％，得到絮凝载体前驱体；将絮凝载体前驱体加入质量浓度为1％的六偏磷酸钠交联剂水溶液中进行交联1.5h，经过分离，洗涤，干燥，即得。
经测定本实施例制备的胞外多糖絮凝剂对高岭土的FR值达到83％，对六价铬离子去除率达到84％；对高浓度水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝的脱色率达84％，对墨水蓝的脱色率达86％，对孔雀石绿脱色率达90％，对结晶紫的脱色率达92％。
实施例3
液体培养基包括以下组分：葡萄糖14g/L，蔗糖8g/L，蛋白胨1.5g/L，醋酸钠0.8g/L，酵母膏 0.9g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，余量为陈化海水。
固体培养基：向液体培养基中添加液体培养基重量1.5％琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1)将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，在28℃下培养58h，然后加入固体培养基2.5倍体积的无菌水制成菌种液；
2)将菌种液按接种量16％接种到液体培养基中在24℃进行发酵培养5天，得到发酵液；
3)将絮凝载体按质量体积比0.4g/ml加入发酵液中，调节pH至7.3，并继续发酵3天，制得原料液，经过离心分离、干燥得到絮凝剂。
絮凝载体的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖溶于质量浓度为0.8％醋酸中配制成质量浓度为4.5％壳聚糖溶液，备用；将乳化剂仲醇基硫酸钠按仲醇基硫酸钠与壳聚糖的质量比1:18加入壳聚糖溶液中，然后加入多巴胺，多巴胺与壳聚糖的质量比为1:5，搅拌混合均匀，静置脱泡；将脱泡后的溶液滴加到凝结液中，凝结液为氢氧化钠和甲醇的混合水溶液，其中氢氧化钠的质量浓度百分比为18％，甲醇的质量浓度百分比为28％，得到絮凝载体前驱体；将絮凝载体前驱体加入质量浓度为4％的六偏磷酸钠交联剂水溶液中进行交联1.5h，经过分离，洗涤，干燥，即得。
经测定本实施例制备的胞外多糖絮凝剂对高岭土的FR值达到84％，对六价铬离子去除率达到85％；对高浓度水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝的脱色率达87％，对墨水蓝的脱色率达87％，对孔雀石绿脱色率达89％，对结晶紫的脱色率达91％。
实施例4
液体培养基包括以下组分：葡萄糖15g/L，蔗糖10g/L，蛋白胨2g/L，醋酸钠1g/L，酵母膏1g/L，磷酸二氢钾1g/L，余量为陈化海水。
固体培养基：向液体培养基中添加液体培养基重量2％琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1)将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，在30℃下培养60h，然后加入固体培养基3倍体积的无菌水制成菌种液；
2)将菌种液按接种量18％接种到液体培养基中在25℃进行发酵培养6天，得到发酵液；
3)将絮凝载体按质量体积比0.5g/ml加入发酵液中，调节pH至7.5，并继续发酵3天，制得原料液，经过离心分离、干燥得到絮凝剂。
絮凝载体的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖溶于质量浓度为1％醋酸中配制成质量浓度为5％壳聚糖溶液，备用；将乳化剂仲醇基硫酸钠按仲醇基硫酸钠与壳聚糖的质量比1:20加入壳聚糖溶液中，然后加入多巴胺，多巴胺与壳聚糖的质量比为1:6，搅拌混合均匀，静置脱泡；将脱泡后的溶液滴加到凝结液中，凝结液为氢氧化钠和甲醇的混合水溶液，其中氢氧化钠的质量浓度百分比为20％，甲醇的质量浓度百分比为30％，得到絮凝载体前驱体；将絮凝载体前驱体加入质量浓度为5％的六偏磷酸钠交联剂水溶液中进行交联2h，经过分离，洗涤，干燥，即得。
经测定本实施例制备的胞外多糖絮凝剂对高岭土的FR值达到83％，对六价铬离子去除率达到82％；对高浓度水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝的脱色率达85％，对墨水蓝的脱色率达88％，对孔雀石绿脱色率达90％，对结晶紫的脱色率达92％。
实施例5
液体培养基包括以下组分：葡萄糖10g/L，蔗糖5g/L，蛋白胨1g/L，醋酸钠0.5g/L，酵母膏 0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，余量为陈化海水。
固体培养基：向液体培养基中添加液体培养基重量1％琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：
1)将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，在22℃下培养50h，然后加入固体培养基1.5倍体积的无菌水制成菌种液；
2)将菌种液按接种量12％接种到液体培养基中在23℃进行发酵培养3天，得到发酵液；
3)将絮凝载体按质量体积比0.2g/ml加入发酵液中，调节pH至7，并继续发酵2天，制得原料液，经过离心分离、干燥得到絮凝剂。
絮凝载体的制备方法包括以下步骤：
将壳聚糖溶于质量浓度为0.5％醋酸中配制成质量浓度为1％壳聚糖溶液，备用；将乳化剂仲醇基硫酸钠按仲醇基硫酸钠与壳聚糖的质量比1:10加入壳聚糖溶液中，然后加入多巴胺，多巴胺与壳聚糖的质量比为1:3，搅拌混合均匀，静置脱泡；将脱泡后的溶液滴加到凝结液中，凝结液为氢氧化钠和甲醇的混合水溶液，其中氢氧化钠的质量浓度百分比为10％，甲醇的质量浓度百分比为25％，得到絮凝载体前驱体；将絮凝载体前驱体加入质量浓度为0.5％的六偏磷酸钠交联剂水溶液中进行交联1h，经过分离，洗涤，干燥，即得。
经测定本实施例制备的胞外多糖絮凝剂对高岭土的FR值达到85％，对六价铬离子去除率达到86％；对高浓度水脱色具有较高活性，对亚甲基蓝的脱色率达84％，对墨水蓝的脱色率达90％，对孔雀石绿脱色率达91％，对结晶紫的脱色率达93％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
序列表
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1282
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌(Bacillus sp. strain GHS8-1)
<400> 1
cacgtgggca acctgcctgt aagactggga taacttcggg aaaccgaagc taataccgga 60
taggatcttc tccttcatgg gagatgattg aaagatggtt tcggctatca cttacagatg 120
ggcccgcggt gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcatagc 180
cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 240
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ccagcattta gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1080
tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta 1140
caaagggctg caagaccgcg aggtcaagcc aatcccataa aaccattctc agttcggatt 1200
gtaggctgca actcgcctac atgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1260
cggtgaatac gttcccgggc ct 1282
Claims (8)
1.一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将海洋芽孢杆菌菌株接种到固体培养基，然后加入无菌水制成菌种液；
2）将菌种液接种到液体培养基中进行发酵培养，得到发酵液；
3）将絮凝载体加入发酵液中，调节pH至7-7.5，并继续发酵制得原料液，经过离心分离、干燥得到活性多糖絮凝剂。
2.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤1）中菌体的培养温度为22-30℃，培养时间为50-60h。
3.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤1）中无菌水的体积为固体培养基体积的1.5-3倍。
4.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤1）中固体培养基为向液体培养基中添加液体培养基重量1-2%琼脂并凝固后制得的斜面培养基。
5.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤2）中菌种液的接种量为12-18%。
6.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤2）中液体培养基包括以下组分：葡萄糖10-15g/L，蔗糖5-10g/L，蛋白胨1-2g/L，醋酸钠0.5-1g/L，酵母膏0.5-1g/L，磷酸二氢钾0.5-1g/L，余量为陈化海水。
7.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤2）中发酵培养温度为23-25℃，发酵培养时间为3-6天。
8.根据权利要求1所述的一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述步骤3）中絮凝载体的添加量为0.2-0.5g/ml，发酵时间为2-3天。
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| CN201811279525.8A CN109337944A (zh) | 2018-10-30 | 2018-10-30 | 一种利用海洋芽孢杆菌制备絮凝剂的方法 |
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