CN116064309B - 一株假单胞菌属细菌新菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株假单胞菌属细菌新菌株及其应用，涉及微生物技术与水处理技术领域；该菌株在2022年07月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25238。本发明筛选获得了一株假单胞菌属新种菌株，即假单胞菌(Pseudomonassp.)GXUN74702，该菌株具有生物絮凝的特性，用其发酵液处理高岭土溶液，絮凝率最高可达90.2％，因此，本发明的假单胞菌属新种菌株在水处理方面具有良好的应用前景。

Description

一株假单胞菌属细菌新菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术与水处理技术领域，特别是涉及一株假单胞菌属细菌新菌株及其应用。

背景技术

目前水资源耗量增长日益加快，为了缓解水危机，实现水资源的可持续利用，必须在保护有限水资源的同时，加强对水污染排放的控制以及对污水的有效治理。在水处理特别是给水处理中，絮凝沉淀法是一种成本较低、应用普遍的方法。其中微生物絮凝剂具有生物可降解性，是一种高效、安全、无二次污染的絮凝剂，可以克服无机和有机高分子絮凝剂所固有的缺陷，最终实现处理后水的无污染排放，因而微生物絮凝剂的研究已成为当今世界絮凝剂研究的新发展方向。目前来看，絮凝剂的研究主要集中在高分子絮凝剂方面，但伴随着微生物絮凝剂的深入研究，微生物絮凝剂取代部分传统的无机高分子絮凝剂和合成有机高分子絮凝剂将成为一种趋势。

发明内容

本发明的目的是提供一株假单胞菌属细菌新菌株及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的假单胞菌具有生物絮凝的特性，用其发酵液处理高岭土溶液，絮凝率最高可达90.2％。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)GXUN74702，在2022年07月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25238。

本发明还提供上述的菌株或其发酵产物在废水絮凝处理中的应用。

本发明还提供上述的菌株或其发酵产物在制备生物絮凝剂中的应用。

本发明还提供一种生物絮凝剂，包含上述的菌株或其发酵产物。

本发明还提供一种废水絮凝处理的方法，包括将上述的菌株接种入废水中进行絮凝的步骤。

进一步地，将上述的菌株接种入废水中的具体操作包括：将上述菌株发酵培养，得到发酵液，再将所述发酵液接种于所述废水中。

进一步地，所述发酵培养的培养基配方为：葡萄糖10g，酵母膏0.5g，尿素0.5g，K₂HPO₄5g，KH₂PO₄2g，NaCl0.1g，MgSO₄·7H₂O2g，去离子水1L，pH7.0。

进一步地，所述发酵培养的培养条件为：30℃，180r/min。

本发明公开了以下技术效果：

本发明筛选获得了一株假单胞菌属新种菌株，即假单胞菌(Pseudomonas sp.)GXUN74702，该菌株具有生物絮凝的特性，用其发酵液处理高岭土溶液，絮凝率最高可达90.2％，因此，本发明的假单胞菌属新种菌株在水处理方面具有良好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为菌株GXUN74702在显微镜下的形态图；

图2为菌株GXUN74702在培养基上的菌落形态图；

图3为16SrDNA琼脂糖凝胶电泳，M：DL5000 DNA Marker；负：负对照；1：GXUN74702PCR产物；

图4为GXUN74702的系统发育树；

图5为高岭土溶液处理前的效果图；

图6为高岭土溶液处理后的效果图；

图7为实验例1絮凝率的测定结果；

图8为湖水处理前的效果图；

图9为湖水处理后的效果图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

以下实施例或实验例中所用的培养基配方：

(1)固体LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，琼脂10-15g，去离子水1L。

(2)液体LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，去离子水1L。

(3)发酵培养基：葡萄糖10g，酵母膏0.5g，尿素0.5g，K₂HPO₄5g，KH₂PO₄2g，NaCl0.1g，MgSO₄·7H₂O2g，去离子水1L，pH7.0。

实施例1

1.菌株分离筛选

采样地点：广西民族大学西校区思源湖淤泥

(1)菌株分离纯化：取1g样品置于装有10mL无菌水的离心管中，180r/min振荡30min，将样品菌悬液稀释到10^-2，10^-3和10^-4，分别取200μL涂布在LB平板上，30℃培养1-2d，挑取单菌落划线纯化菌株，获得纯菌落4℃保存。

(2)初筛：将分离纯化后的菌株接种至液体LB培养基中，培养至OD₆₀₀＝1.0时，按1％的接菌量转接至发酵培养基中，30℃、180r/min条件下发酵培养。测定发酵液的絮凝率，选出絮凝率大于70％的菌株。

(3)复筛：选取初筛中絮凝率大于70％的菌株，将菌株接种至装有30mL LB培养基的三角瓶中，30℃，180r/min的条件下培养至OD₆₀₀＝1.0作为种子液，按1％的接菌量转接至发酵培养基中，30℃、180r/min条件下发酵培养。测定不同培养时间发酵液的絮凝率，选出絮凝率最高的菌株，即GXUN74702。

上述步骤(2)、(3)中，测定絮凝率的方法如下：

S1：将菌株在LB培养基上培养活化，大概10h后，测其OD₆₀₀值，OD₆₀₀＝1.0时，再将其转接至发酵培养基中，培养24h；活化和发酵培养的条件为：30℃、180r/min。

S2：配置高岭土混悬液：高岭土0.25g，ddH₂O50mL，1wt％CaCl₂5mL，pH 7.0(图5)。

S3：向步骤S2中的高岭土混悬液中加入1.5mLS1中菌株的发酵液，充分搅拌2min，常温静置10min，得到如图6所示的处理后的高岭土混悬液；并小心吸取液面下约1cm处的液体，用紫外分光光度计测定550nm处的吸光度(OD₅₅₀)，以蒸馏水作空白对照，重复3次，计算絮凝率。

2.鉴定

(1)形态学鉴定

菌株GXUN74702在显微镜下观察呈短杆状(图1)，培养基上菌落呈圆形、淡黄色，表面光滑湿润、边缘整齐(图2)。

(2)生理生化鉴定

对菌株GXUN74702进行生理生化鉴定，结果见表1。结果显示，菌株GXUN74702可以产生多糖类物质，无蛋白物质生成，革兰氏阴性，菌株有运动性，可以产生氧化酶、过氧化氢酶、蛋白酶和油脂酶，不产生纤维素酶，不具有降解无机磷和有机磷的能力。

表1菌株GXUN74702生理生化鉴定结果

注：“+”表示有，“-”表示无，“G^-”表示革兰氏阴性。

(3)分子生物学鉴定

提取菌株GXUN74702的基因组DNA，利用PCR技术扩增其16SrDNA，扩增后的PCR产物经电泳检测后，在1500bp处有一条明显的条带(图3)，与16SrDNA的大小一致，将此PCR产物送到上海生工测序。测序结果在Ezbiocloud网站进行16S-based ID比对，发现其与多株假单胞菌(Pseudomonas)的同源性在97％以上，采用邻位相连法(N-J法)对该序列构建系统进化树(图4)，结果表明GXUN74702与假单胞菌属的亲缘关系最近，由此可初步判断GXUN74702的分类地位属于Pseudomonassp.。菌株GXUN74702的16SrDNA基因序列测定结果如下所示：

SEQ ID NO:1:

CAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGGGTCCTTCGGGATGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTTCGGAAACGGACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGTACTTACCTAATACGTGAGTATTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGTTCCTTGAGAACTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCAGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGACGGTTACCACGGAGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCT。

3.保藏

在2022年07月06日将菌株GXUN74702保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.25238。

实验例1

优化絮凝剂的絮凝条件：分别将发酵培养温度调整为25℃、30℃、35℃和40℃；发酵培养的时间调整为12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h；将发酵培养基的pH值分别调整为4、5、6、7、8、9和10；助凝剂1％CaCl₂的投加量分别调整为0mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL和10mL；絮凝剂的投加量分别调整为1mL、2mL、3mL、4mL和5mL。分别测定菌株GXUN74702发酵液的絮凝率(絮凝率的测定方法同实施例1)，不同助凝剂1％CaCl₂的投加量结果见图7。结果显示，当菌株GXUN74702在30℃发酵培养24h，发酵培养基pH值为7，助凝剂添加量为10mL，发酵液投加量为2mL时，絮凝效果最好，絮凝率最高达90.2％。

实施例2

S1：将菌株GXUN74702在LB培养基上培养活化，大概10h后，测其OD₆₀₀值，OD₆₀₀＝1.0时，再将其转接至发酵培养基中，培养24h；活化和发酵培养的条件为：30℃、180r/min。

S2：广西民族大学思源湖湖水(图8)300mL中加入6mL S1中菌株的发酵液，48mL助凝剂1％CaCl₂，充分搅拌2min，常温静置5min，得到如图9所示的处理后的湖水。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (8)

1.一株假单胞菌(Pseudomonas sp.)GXUN74702，其特征在于，在2022年07月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.25238。

2.一株如权利要求1所述的假单胞菌GXUN74702在废水絮凝处理中的应用。

3.一株如权利要求1所述的假单胞菌GXUN74702在制备生物絮凝剂中的应用。

4.一种生物絮凝剂，其特征在于，包含权利要求1所述的假单胞菌GXUN74702。

5.一种絮凝废水的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的假单胞菌GXUN74702接种入废水中进行絮凝的步骤。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将权利要求1所述的假单胞菌GXUN74702接种入废水中的具体操作包括：将权利要求1所述的假单胞菌GXUN74702发酵培养，得到发酵液，再将所述发酵液接种于所述废水中。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基配方为：葡萄糖10g，酵母膏0.5g，尿素0.5g，K₂HPO₄ 5g，KH₂PO₄ 2g，NaCl 0.1g，MgSO₄·7H₂O 2g，去离子水1L，pH7.0。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养条件为：30℃，180r/min。

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