CN107641610A - 一株海洋盐单胞菌及用其制备絮凝剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一株海洋盐单胞菌及用其制备絮凝剂的方法，将该海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离纯化得到，将该菌株的菌种扩大培养后制成菌种液，再经发酵培养分泌胞外多糖，在发酵后期向发酵菌液中加入絮凝载体，提供菌体的粘附场所，使菌体粘结成团沉降，并经乙醇进一步作用使胞外多糖沉降较为完全。本发明筛选的海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11分泌的胞外多糖具有较强的絮凝效果，在絮凝剂的制备过程中添加载体，加快胞外多糖的沉降，而且减少了乙醇的使用，所得絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

Description

一株海洋盐单胞菌及用其制备絮凝剂的方法

技术领域

本发明涉及水处理技术领域，具体涉及一株海洋盐单胞菌及用其制备絮凝剂的方法。

背景技术

我国近十年的城市化发展迅速，但由于污水处理设施投入滞后、污水处理效率低，大量的工业废水、生活污水排放造成严重的水环境恶化，使水体中重金属、色素及悬浮颗粒含量超标，蓝藻等藻类爆发，水资源现已成为制约社会城市化和工业化发展的重要因素。提升污水处理技术、强化城市污水治理能力已经成为当务之急。其中在污水中引入适当粒径的絮状颗粒物，利用其巨大的表面积对重金属、色素和悬浮颗粒进行絮凝吸附形成絮状体，通过沉降或离心方式从水体中分离出已经成为治理污水的重要方法。

絮凝法的关键在于选择合适的絮凝剂，常用的絮凝剂有无机絮凝剂、有机絮凝剂、生物絮凝剂等，其中生物絮凝剂因处理效果好，且与环境的相容性高而受到重视。生物絮凝剂主要有微生物絮凝体及微生物产生的胞外聚合物，微生物絮凝体在水体中的生存条件要求较为苛刻，而微生物产生的胞外聚合物使用较为方便。胞外聚合物主要是部分胞外多糖，可以使重金属离子、色素及悬浮颗粒等凝集沉降，安全高效。目前从环境中分离出的可以分泌具有絮凝效果的胞外多糖的微生物主要有酱油曲霉、红平红球菌与类芽孢杆菌等，但是利用这些微生物制备胞外多糖絮凝剂还主要处于研究阶段，存在产量低、絮凝活性低等问题。

发明内容

针对现阶段微生物制备胞外多糖絮凝剂存在絮凝活性低的问题，本发明的目的在于提供一株可以分泌具有絮凝作用的胞外多糖的海洋盐单胞菌，同时提供用该海洋盐单胞菌菌株制备絮凝剂的方法，由该海洋盐单胞菌菌株分泌的胞外多糖制备的絮凝剂的絮凝活性高，絮凝能力强，性能稳定。

本发明提供如下的技术方案：

一株海洋盐单胞菌Halomonas sp.GHF11，所述海洋盐单胞菌菌株GHF11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14510，建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonas taeanensis。本发明的海洋盐单胞菌菌株Halomonassp.GHF11从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离得到，经实验发现，该海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11的分泌物，主要是胞外多糖具有制备絮凝剂的作用。

上述海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11的16S rDNA全序列(1281bp)已向美国国家生物技术信息中心(NCBI)的GenBank基因序列数据库提交，登陆号为KX702265，全序列如下：

cataggaatc tgcccggtag tgggggataa cgtggggaaa ctcacgctaa taccgcatacgccccaaggg ggaaagcagg ggatcttcgg accttgcgct atcggatgag cctatgtcgg attagcttgttggtgaggta atggctcacc aaggcagcga tccgtagctg gtctgagagg atgatcagcc acactgggactgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggggaa accctgatccagccatgccg cgtgtgtgaa gaaggctttc gggttgtaaa gcactttcag cgaggaagaa ggcctgatgattaatactcg ccaggaagga catcactcgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggtaatacggaggg tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg ataagccggttgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccggaa ctgtcaggct agagtgcagg agaggaaggtagaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga ggaataccag tggcgaaggc ggccttctggactgacactg acactgaggt gcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccgtaaactatgt cgactagccg ttgggagcct tgagttctta gtggcgcagc taacgcaata agtcgaccgcctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgtggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatcgtgc gaactttcca gagatggattggtgccttcg ggagcgcaca gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggttaagtcccgtaa cgagcgcaac ccctatcctt atttgccagc gagtaatgtc gggaactcta aggagactgccggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca tcatggccct tacgagtagg gctacacacgtgctacaatg gcaggtacaa agggtcgcaa gacggcgacg tggagctaat cccagaaagc ctgcctcagtccggatcgga gtctgcaact cgactccgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacggtgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg c。

一种用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将菌种接种到固体培养基上培养，然后加入无菌水制成菌种液；

(2)将菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体并继续发酵培养得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物，经干燥后制成絮凝剂。

首先将菌种扩大培养后制成菌种液，将菌种液经发酵培养后制成发酵菌液，发酵菌液中含有丰富的胞外多糖，在发酵后期向发酵菌液中加入絮凝载体，絮凝载体可以提供菌体的粘附场所，使菌体粘结成团沉降，加快胞外多糖的沉降，在加入的乙醇的作用下发酵菌液中游离的胞外多糖也迅速沉降，粘附在絮凝载体的菌体结团上，沉降较为完全。

作为本发明方法的一种改进，1kg液体培养基的组份如下：马铃薯汁50～80g、蛤肉汤10～30g、磷酸氢二钾0.6～1.8g和葡萄糖20～30g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15～20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。可以满足菌种扩大培养及发酵培养的要求，提高胞外多糖的产率。

作为本发明方法的一种改进，步骤(1)中培养温度25～30℃、时间36～48小时，无菌水与固体培养基体积比为1.0～1.5:1。提供合适的培养温度和时间提高菌种的培养效果，经适量的无菌水混合得到合适的菌种液浓度。

作为本发明方法的一种改进，步骤(2)中菌种液接种浓度为0.6～1.0mL菌种液/100mL液体培养基，发酵培养温度为25～30℃、时间3～5天，摇床转速为80～150r/min。菌种在液体培养基中充分发酵培养分泌胞外多糖，胞外多糖的产率高。

作为本发明方法的一种改进，步骤(3)中絮凝载体的加入量为5～10g/100mL，继续培养1～3天。在发酵过程的后期中加入絮凝载体既避免对菌种前期发酵过程的影响，絮凝载体直接凝聚发酵菌液中的菌体及胞外多糖，并在停止摇床转动后沉降，促进胞外多糖的沉降，减少沉降剂乙醇的使用，而且便于离心分离。

作为本发明方法的一种改进，所述絮凝载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中的一种或几种，所述絮凝载体经200～300目筛网过筛后灭菌使用。通过加入絮凝载体加快胞外多糖的沉降，减少了乙醇的使用。选用的絮凝载体有丰富的表面积或孔隙结构，对菌体及胞外多糖的凝聚效果好，且絮凝载体本身具有一定的吸附絮凝能力，提高絮凝剂的絮凝性能。

作为本发明方法的一种改进，步骤(4)中乙醇与原料液的体积比为2～4:1，在1～5℃静置6～10小时，离心速率3000～5000r/min，干燥温度为90～105℃，干燥时间1～2小时。通过加入乙醇与絮凝载体共同作用使胞外多糖尽可能充分沉降，提高胞外多糖收率。

本发明的有益效果如下：

本发明筛选的海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11分泌的胞外多糖具有较强的絮凝效果，在发酵后期添加絮凝载体，使菌体在絮凝载体上凝聚成团，促进胞外多糖的沉降，而且减少乙醇的使用，所得絮凝剂的絮凝能力强，性能稳定。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

陈化海水为取新鲜海水在23℃静置沉降7天后所得的海水的上清液。

蛤肉汤为250g蛤仔洗净后置于2kg蒸馏水中在高压锅内蒸煮2小时后过滤的汁液。

一株海洋盐单胞菌Halomonas sp.GHF11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No.：14510，建议的分类命名为大安盐单胞菌，拉丁文学名为Halomonastaeanensis。该海洋盐单胞菌菌株GHF11从菲律宾蛤仔吐出的污泥液中分离得到，经实验发现，该海洋盐单胞菌菌株GHF11的分泌物，主要是胞外多糖有絮凝作用。

实施例1

一种用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将菌种接种到固体培养基上在25℃培养36小时，然后加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基体积比为1:1；

(2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为0.6mL菌种液/100mL液体培养基，在30℃发酵培养3天，摇床转速为80r/min，制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量为5g/100mL发酵菌液，絮凝载体为沙土，优选为养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，絮凝载体经200目筛网过筛后灭菌使用，继续发酵培养1天得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇静置沉降，乙醇与原料液的体积比为2:1，然后在1℃静置沉降6小时，在3000r/min转速下离心分离固体，然后90℃干燥2小时得到絮凝剂。

其中1kg液体培养基的组份如下：马铃薯汁50g、蛤肉汤10g、磷酸氢二钾0.6g和葡萄糖20g、余量为陈化海水，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入15g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

实施例2

一种用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将菌种接种到固体培养基上在28℃培养42小时，然后加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基体积比为1.25:1；

(2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为0.8mL菌种液/100mL液体培养基，在28℃发酵培养4天，摇床转速为120r/min，制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量为7.5g/100mL发酵菌液，絮凝载体为沙土，优选为养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，絮凝载体经250目筛网过筛后灭菌使用，继续发酵培养2天得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇静置沉降，乙醇与原料液的体积比为3:1，然后在4℃静置沉降8小时，在4000r/min转速下离心分离固体，然后100℃干燥1.5小时得到絮凝剂。

其中，1kg液体培养基的组份如下：马铃薯汁65g、蛤肉汤20g、磷酸氢二钾1.2g和葡萄糖25g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入17g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

实施例3

一种用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

(1)将菌种接种到固体培养基上在30℃培养48小时，然后加入无菌水制成菌种液，无菌水与固体培养基体积比为1.5:1；

(2)将菌种液接种到液体培养基中，接种浓度为1.0mL菌种液/100mL液体培养基，在30℃发酵培养5天，摇床转速为150r/min，制成发酵菌液；

(3)向发酵菌液中加入絮凝载体，加入量为10g/100mL发酵菌液，絮凝载体为沙土，优选为养殖菲律宾蛤仔的天然沙土，絮凝载体经200目筛网过筛后灭菌使用，继续发酵培养3天得到原料液；

(4)向原料液中加入乙醇静置沉降，乙醇与原料液的体积比为4:1，然后在5℃静置沉降10小时，在5000r/min转速下离心分离固体，然后105℃干燥1小时得到絮凝剂。

其中，1kg液体培养基的组份如下：马铃薯汁80g、蛤肉汤30g、磷酸氢二钾1.8g和葡萄糖30g，余量为陈化海水，固体培养基为向1kg的液体培养基中加入20g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

需要说明的是，将絮凝载体沙土替换为泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中的一种，或者泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中任意两种或多种的混合也可以起到相近的沉降效果，絮凝剂的絮凝能力相近。

絮凝剂性能测定

分别用蒸馏水配制4g/L的高岭土悬浊液与10g/L的氯化钙溶液，取100mL高岭土悬浊液与5mL氯化钙溶液混匀得到混合液，用3支10mL的比色管各盛取5mL的混合液，依次标记为管1、管2、管3，然后分别取实施例1、实施例2、实施例3中制备的絮凝剂0.3g各自对应加入管1、管2、管3中，300r/min下搅拌10分钟，再50r/min下搅拌2分钟，然后静置10分钟，在波长550nm处测量吸光度，对照样为配制混合液所用蒸馏水，根据吸光度计算絮凝率。其中絮凝率为测试样的吸光度值排除对照样的吸光度值后相对测试样的吸光度值的百分比，结果如表1所示。

表1絮凝率

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				絮凝率/％	92	89	90

絮凝剂的应用

取对数期生长的小球藻的藻液100mL，加入由海洋盐单胞菌菌株Halomonas sp.GHF11制备的絮凝剂0.3g，在23℃下快速搅拌2～3分钟，搅拌速率150r/min，然后静置30分钟，小球藻的沉降率达到70％～77％，具体结果如表2所示。

表2小球藻絮凝率

实施例	实施例1	实施例2	实施例3
				絮凝率/％	70.6％	74.7％	77.2％

序列表

<110> 浙江海洋大学

<120> 一株海洋盐单胞菌及用其制备絮凝剂的方法

<130> JWE173054

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1281

<212> DNA

<213> 大安盐单胞菌的16S rDNA基因全序列(Halomonas taeanensis 16S ribosomalDNA gene)

<400> 1

cataggaatc tgcccggtag tgggggataa cgtggggaaa ctcacgctaa taccgcatac 60

gccccaaggg ggaaagcagg ggatcttcgg accttgcgct atcggatgag cctatgtcgg 120

attagcttgt tggtgaggta atggctcacc aaggcagcga tccgtagctg gtctgagagg 180

atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtgggg 240

aatattggac aatgggggaa accctgatcc agccatgccg cgtgtgtgaa gaaggctttc 300

gggttgtaaa gcactttcag cgaggaagaa ggcctgatga ttaatactcg ccaggaagga 360

catcactcgc agaagaagca ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg 420

tgcaagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgcgcgt aggtggcttg ataagccggt 480

tgtgaaagcc ccgggctcaa cctgggaact gcatccggaa ctgtcaggct agagtgcagg 540

agaggaaggt agaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta gagatcggga ggaataccag 600

tggcgaaggc ggccttctgg actgacactg acactgaggt gcgaaagcgt gggtagcaaa 660

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaactatgt cgactagccg ttgggagcct 720

tgagttctta gtggcgcagc taacgcaata agtcgaccgc ctggggagta cggccgcaag 780

gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc 840

gatgcaacgc gaagaacctt acctactctt gacatcgtgc gaactttcca gagatggatt 900

ggtgccttcg ggagcgcaca gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgttgtgaaa 960

tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccctatcctt atttgccagc gagtaatgtc 1020

gggaactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtca 1080

tcatggccct tacgagtagg gctacacacg tgctacaatg gcaggtacaa agggtcgcaa 1140

gacggcgacg tggagctaat cccagaaagc ctgcctcagt ccggatcgga gtctgcaact 1200

cgactccgtg aagtcggaat cgctagtaat cgtgaatcag aatgtcacgg tgaatacgtt 1260

cccgggcctt gtacacaccg c 1281

Claims (8)

1.一株海洋盐单胞菌Halomonas sp. GHF11，所述海洋盐单胞菌菌株GHF11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2017年8月9日，保藏编号CGMCC No. ：14510。

2.一种用如权利要求1所述海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，包括以下步骤：

（1）将菌种接种到固体培养基上培养，然后加入无菌水制成菌种液；

（2）将菌种液接种到液体培养基中发酵培养制成发酵菌液；

（3）向发酵菌液中加入絮凝载体并继续发酵培养得到原料液；

（4）向原料液中加入乙醇静置沉降，然后离心分离沉降物，经干燥后制成絮凝剂。

3.根据权利要求2所述的用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，其特征在于，1kg液体培养基的组份如下：马铃薯汁50～80 g、蛤肉汤10～30 g、磷酸氢二钾0.6～1.8 g和葡萄糖20～30 g，余量为陈化海水，固体培养基为向1 kg的液体培养基中加入15～20 g的琼脂凝固制成的斜面培养基。

4.根据权利要求2所述的用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（1）中培养温度25～30 ℃、时间36～48小时，无菌水与固体培养基体积比为1.0～1.5:1。

5.根据权利要求2所述的用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（2）中菌种液接种浓度为0.6～1.0 mL菌种液/100 mL液体培养基，发酵培养温度为25～30 ℃、时间3～5天，摇床转速为80～150 r/min。

6.根据权利要求2所述的用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，其特征在于，步骤（3）中絮凝载体的加入量为5～10 g/100 mL发酵菌液，继续培养1～3天。

7.根据权利要求2或6所述的用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，其特征在于，所述絮凝载体为沙土、泥沙、海沙、硅藻土、膨润土、活性炭、生物炭、壳聚糖和贝壳粉中的一种或几种，所述絮凝载体经200～300目筛网过筛后灭菌使用。

8.根据权利要求2所述的用海洋盐单胞菌菌株GHF11制备絮凝剂的方法，步骤（4）中乙醇与原料液的体积比为2～4:1，在1～5 ℃静置6～10小时，离心速率3000～5000 r/min，干燥温度为90～105 ℃，干燥时间1～2小时。