CN110343626A

CN110343626A - 一株耐热嗜盐单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN110343626A
Application number: CN201810280980.3A
Authority: CN
Inventors: 田永强; 甘龙站; 李晓广
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2018-04-02
Filing date: 2018-04-02
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明公开了一种耐热中度嗜盐菌Halomonas sp.LCB169，其保藏号为KCTC 52618。采用多相分类鉴定手段确定该菌株为嗜盐单胞菌属的一个新物种。本发明的嗜盐单胞菌具有氧化酶、过氧化氢酶、酯酶、类脂酯酶、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶和碱性磷酸酶等酶活性，可被广泛应用于各类生物工程酶制剂的相关生产领域。而且，该菌种可在高达17%NaCl浓度和52 ^oC高温下正常生长，表明其对环境的抗逆能力较强。同时，其能够在高达10%NaCl盐浓度下大量地分泌胞外多糖和积累聚羟基丁酸，故可进一步开发应用于适应极端高盐环境的生物医药和环境友好型生物塑料相关行业。

Description

一株耐热嗜盐单胞菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物菌种及其应用领域，具体地说，本发明涉及一种耐热嗜盐单胞菌及其应用的技术领域。

背景技术

嗜极微生物因其特殊的生存环境和生理机制而成为科学研究的热点。嗜盐菌是一类只有处在较高浓度的盐环境下才能获得最适生长状态的特殊微生物。然而高盐环境对于普通微生物的毒害作用明显，主要原因是高渗透压的胁迫下细胞膜和酶遭到破坏，进而抑制微生物的生理活动。嗜盐菌以其特殊的生理结构组成和代谢调控机制，能在高盐的极端环境中栖息繁殖。

嗜盐菌在其物种的长期进化过程中，为适应生存环境，经过不断演化，逐渐形成了独特的生物活性物质合成或代谢途径、新的调控机制以及与特异的生理生化相关的新的基因，进而能够产生普通生物没有的生物活性物质，是许多新抗生素和结构新颖的活性化合物的来源。此外，由于现阶段嗜盐菌的研究程度比较低，有大量新类型还没有被发行和认识，因而理论研究和应用实践上均具有很大的潜力。

在理论研究方面，有关嗜盐菌的嗜盐机理的研究，包括细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面，为人类认识生命起源及本质提供了得天独厚的研究材料；而在应用实践方面，嗜盐微生物能在高盐浓度环境生长，且易于培养、对无菌操作条件要求低等特点，还能产生或积累新颖的结构物质、嗜盐酶和积累相容性溶质，使其在工业、医药、环境、食品及材料等领域均具有广阔的应用前景。近十年来，随着多种微生物纯培养方法以及分子生物学技术的日新月异，越来越多的嗜盐菌新种属被国内外学者研究和报道，其表现出来的特殊生理生化特性引起了研究学者的广泛兴趣，目前相关文献报道主要集中在以下三个方面：

（1）典型嗜盐菌株分离纯化及多相分类学研究；

（2）耐高盐的分子及生化机制研究；

（3）嗜盐菌株潜在的工业生产应用研究。

随着社会生产力的不断发展和人们生活水平的提高，塑料的用量大大增加，但就目前使用的塑料而言,都是不可降解的，而且许多都是一次性的，对环境造成严重的破坏和污染。因此，研究人员着手研究降解性塑料，即光降解塑料和生物降解塑料，后者又分为淀粉填充型和利用生物技术由微生物合成型。其中。聚羟基丁酸酯(PHB)是微生物合成型之一。

聚羟基丁酸酯(PHB)是微生物在不平衡生长条件下形成的一种功能性生物聚酯，它是聚羟基脂肪酸酯（PHA）家族的一种聚合物。由于 PHB 具有生物可降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性以及由官能团引起的其他特殊性能，因此它是一种优良的生物可降解塑料，具有广泛的应用前景，受到国际上的普遍关注。利用微生物发酵生产聚酯类可降解塑料是目前生产生物可降解塑料的主要途径之一。自然界中许多属、种的细菌在细胞内都能积累PHB作为能量和碳源的储备，如产碱杆菌、甲基营养菌及鞘细菌等。嗜盐菌是一类常见的嗜极微生物，能够适应较高的渗透压。而且在较高的盐质量浓度下，其它微生物难以生长，因此可以利用嗜盐菌的嗜盐特性抑制其他微生物生长。采用嗜盐菌作为聚羟基脂肪酸酯的生产平台能够省去灭菌环节，进而大幅降低生产成本。

发明内容

针对国内外有关嗜盐单胞菌的研究现状，本发明提供一种新的耐热嗜盐单胞菌。所述的嗜盐单胞菌能大量积累聚羟基丁酸酯(Polyhydroxybutyrate; PHB）颗粒和分泌胞外多糖(Exopolysaccharide; EPS)，其最高生长温度可达52 ^oC，且在此温度下仍能生长良好并可获得较高的生物量；并与所有已有效发表的盐单胞菌属（Halomonas）模式菌种的16S rRNA基因序列最高相似度分布在95.28 %至98.00 % (EzBioCloud server; https://www.ezbiocloud.net/)之间，这可明显区别于所有已公开报道的其它有效菌种。

本发明提供一株嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169。

本发明以含高盐浓度的选择培养基为富集条件，从甘肃省阿克塞县的盐碱土中分离纯化培养获得多株嗜盐耐盐菌株，经多级筛选确定了一株嗜盐单胞菌Halomonas sp.LCB169。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：韩国典型培养物保藏中心(KCTC)，保藏时间为2016年11月7日，保藏号是KCTC 52618，KCTC地址为韩国大田市儒城区韩国生物科学和生物技术研究所，邮编是305-806。

参考《放线菌系统学》和《常见细菌系统鉴定手册》的标准方法对嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169进行形态学特征、生长特性、生理生化特征、极性脂组成、呼吸醌醌型、脂肪酸成分以及DNA(G+C)含量等分类鉴定指标分析。

本发明通过提取基因组DNA，PCR扩增16S rRNA基因后送样测序，再将其16S rRNA基因序列上传至EzBioCloud的EzTaxon 进行在线 BLAST比对分析。根据分析结果，将16SrRNA 基因序列和与其同源性关系较近的相关模式菌株的16S rRNA基因序列从EzTaxon的数据库调出，再利用Clustal W进行多序列比对，并通过软件MEGA5.2以邻近连接法（Neighbor-Joining method, N-J）和最大似然法（Maximum Likelihood method, ML）其构建系统发育树以进一步确定其分类地位。

采用Sanger法测定Halomonas sp. LCB169的16S rRNA基因序列，测序结果表明其序列全长约为1471bp（GenBank登录号：KX008964）。基于16S rRNA基因构建的系统发育树分析显示Halomonas sp. LCB169与Halomonas属同源关系较近的模式菌种聚集在一起呈单独一枝，且Halomonas sp. LCB169隶属于盐单胞菌属但又与同属内的已知种之间存在相对较为适中的进化距离，表明其为盐单胞属的一株潜在新种。结合化学、表型、生理生化和基因型等数据进一步比较分析，结果表明Halomonas sp. LCB169为盐单胞属的一个新种。

通过实施本发明的具体技术指标，可达到以下预期效果。

本发明的嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169为好氧的革兰氏阴性菌，具有运动性，细胞大小为2.3-4.5 × 0.6-1.2 μm，附有周生鞭毛。NaCl浓度的生长范围为0-17 %（最佳NaCl浓度生长范围为10-15 %），生长温度范围为10~52 ℃（最佳生长温度为30 ℃），pH生长范围为6.0~10.0（最佳生长pH为8.0）。该菌株能在含有10 % (w/v) NaCl 培养基中发酵产生积累大量的聚羟基丁酸酯和胞外多糖，同时具有氧化酶、过氧化氢酶、碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类酯酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶和缬氨酸芳胺酶等酶活性，可广泛地应用于生物可降解塑料、疫苗、多糖类食品、化妆品以及各类生物工程酶制剂等的相关生产领域。

附图说明：图1是本发明的嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169于扫描电子显微镜下观察所记录的形态特征。

下面举实施例说明本发明，但本发明并不限于下述实施例。

具体实施方法

实施例一：嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169的筛选和分离

样品采自采自甘肃省敦煌玉门关的盐碱土。将1 g土样加入装有9 mL无菌水的试管中，涡旋振荡，然后用移液枪移取1 mL悬液至装有9 mL无菌水的试管，依次配制成10^-1~10^-6倍数的土壤稀释悬液，分别移取100 μL涂布于筛选培养基平板上，倒置于37 ℃下培养72 h后，观察菌落的生长状况及形态特点，用无菌竹签挑取单菌落转移至新鲜的LB+10 % (w/v)NaCl (pH=8.0)固体培养基进行划线纯化，于相同条件下培养，挑选出单菌落再次纯化，重复多次，最后挑取单菌落转接至纯化培养基斜面，置于4 ℃短期保藏，同时取新鲜培养物加入灭菌的20 % (w/v)甘油，置于-80 ℃作长期保藏。将纯化后编号为LCB169的单菌落进行多相分类鉴定。所用培养基配方如下：

富集及筛选培养基：分别称取7.5 g酪蛋白胨、10 g酵母粉、100 g NaCl 和1.5 mLMS混合液[浓度为0.05g/L相容性物质(甜菜碱，脯氨酸，甘氨酸，D-山梨醇，谷氨酸盐)混合液]，加入1000 mL蒸馏水，调节pH至8.0，再加入20 g 琼脂粉搅拌加热溶解后，分装，置于121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

纯化及基础培养基：分别称取10 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、100 g NaCl，加入1000mL蒸馏水搅拌至溶解，调节pH至8.0，再加入20 g 琼脂粉搅拌加热溶解后，分装，置于121℃下高压蒸汽灭菌20 min。

菌种描述：细胞好氧，革兰氏阴性，运行性，呈短杆状，大小范围为1.0-1.6 ×0.3-0.5 μm，附有周生鞭毛，单菌落呈粉白色，表面光滑且略有凸起，边缘光滑，直径约1~2mm。可产生H₂S和吲哚，能水解吐温20、吐温40、明胶和七叶苷，不能水解吐温60、吐温80、DNA、酪蛋白和淀粉，但MR实验、V-P实验及硝酸盐还原实验均为阴性。细胞膜主要的呼吸醌为Q-9，全细胞的极性脂由双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、一种未知结构的磷脂(PL)和一种未知结构的磷脂(PL)组成，其主要脂肪酸为C_{18 : 1} ω7c、 C_{16 : 0}、 C_{16 : 1} ω7c 和 C_{12 : 0} 3-OH。基因组DNA (G+C)含量为66.1 mol%。

实施例二：嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169生长特性

分别配制NaCl浓度为0 %、3 %、5 %、7 %、10 %、12 %、15 %、17 %和20 % (w/v)的LB液体培养基(pH=8.0)，每个梯度设置三个平行，将新鲜种子液定量接种于每支试管中，置于30℃、180 rpm下摇床培养48 h，取出测定其OD₆₀₀值，从而确定其NaCl浓度的耐受范围及最佳生长浓度；同理，分别用缓冲体系（pH 4.0–5.0: 0.1 M citric acid/0.1 M sodiumcitrate; pH 6.0–8.0: 0.1 M KH₂PO₄ /0.1 M NaOH; pH 9.0–10.0: 0.1 M NaHCO₃/0.1 MNa₂CO₃; pH 11.0: 0.05 M Na₂HPO₄ /0.1 M NaOH）配制成pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的LB+10 % (w/v) NaCl的液体培养基，接种培养后分析其pH耐受范围及最佳生长pH；结合本实验现有条件以及综合考虑测定结果的可靠性及准确性，在测定实验菌株温度生长范围过程中，配制LB+10 %（w/v）NaCl液体培养基及固体培养基（pH=8.0），将新鲜种子液定量接种于每支试管中，分别置于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、52℃和60℃下，以180rpm摇床培养48h后，取出测定其OD₆₀₀值；同时将固体平板划线接种后置于4℃和10℃培养两周，观察其生长状况；最后确定实验菌株的生长温度范围及最佳生长温度。结果表明，该嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169的NaCl耐受范围为0~17 %（最佳盐浓度为10~15 %），生长温度范围为10-52 ℃（最佳生长温度为30 ℃），pH生长范围为6.0~10.0（最佳生长pH为8.0）。

实施例三：嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169酶学特性分析

氧化酶实验：将1 % (w/v)四甲基对苯二胺盐酸盐新鲜试剂直接滴加至处于指数生长期的单菌落上，若其在10 s内显紫色，则为氧化酶阳性；反之，若60 s以上变色或不变色则为氧化酶阴性。

过氧化氢酶实验：将实验菌株在LB+10 % (w/v) NaCl的固体培养基培养至指数生长期，挑取少许菌体涂于培养皿，滴加5 %的过氧化氢溶液，观察有无气泡产生，如30 s内有大量气泡产生的为过氧化氢酶阳性；反之，不产气泡则为过氧化氢酶阴性。

脲酶实验：将实验菌株在LB+10 % (w/v) NaCl的培养基平板上培养第3天和第7天进行脲酶测定，具体方法为：用接种铲刮取第3或7天的菌体配制成浓菌悬液，加入一滴苯酚红指示剂，调节pH至7.0，即是菌悬液恰好转黄呈橙红色时，然后将其一份为二，其中一份不加尿素作为空白对照，另外一份则加入少量结晶的尿素反应，如实验组在几分钟内变碱性呈红色，则为脲酶阳性；反之，不变色者为阴性。

纤维素酶实验：配制纤维素水解培养基(0.5 g/L MgSO4, 0.5 g/L K2HPO4, 1 g/L KNO3, 30 g/L NaCl, 1000mL H2O, pH 7.2)分装试管后灭菌，将无菌的滤纸条一端浸入液体培养基中，接种于液面以上的滤纸条上，于30 ℃培养30天后，观察滤纸条是否被降解。

淀粉酶实验：配制LB+10 % (w/v) NaCl+1 % (w/v)可溶性淀粉固体培养基，于121℃下灭菌20 min，将实验菌株划线接种于淀粉水解平板，倒置于30 ℃培养3天后，在生长良好的菌落周围滴加适量的碘液，观察菌落周围是否产生无色透明圈，若有透明圈，则说明淀粉被水解，淀粉酶为阳性；反之，无透明圈，则为阴性。

嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169的其它酶学特性则采用API ZYM系统按照规定的用户使用手册完成检测。测试结果表明，Halomonas sp. LCB169具有以下酶活性：氧化酶、过氧化氢酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶和碱性磷酸酶。

实施例四：嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169的应用

配制含有10 % NaCl的产胞外多糖发酵培养基，接种后置于30 ℃、180 rpm下摇床培养72 h后，取一定量的发酵液加入终浓度为4 %三氯乙酸后，于35 ℃下振荡30 min以灭活并沉淀胞外多糖水解酶，然后以10000 r/min离心20 min，取上清，加入3倍体积的预冷无水乙醇沉淀多糖，4℃放置过夜，若产生絮状沉淀，即可确定该菌株能够产胞外多糖。筛查结果表明，该嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169具备有大量产生并分泌胞外多糖的能力，因此有望被广泛应用于微生物胞外多糖及相关生产领域。

实施例五：嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169的应用

类脂粒染色观察具体操作方法如下：①按常规制成涂片；②用0.3 %苏丹黑染色10min；③用水冲去染剂，并以滤纸将水吸干；④用二甲苯冲洗涂片至无色素洗脱为止；⑤用0.5 %番红水溶液复染1~2 min; ⑥水洗，吸干后镜检。类脂粒染色显微镜观察显示，染色细胞观察到大量蓝黑色的小点，说明嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169具有大量积累聚羟基丁酸的能力，有望将其开发应用于生产能够自然降解的环境友好型生物塑料高分子化合物。

Claims

1.一株耐热中度嗜盐菌Halomonas sp. LCB169，其保藏号为KCTC 52618。

2.如权利1所述的嗜盐单胞菌Halomonas sp. LCB169，其主要特征为好氧，革兰氏阴性细菌，运行性，呈短杆状，大小范围为1.0-1.6 × 0.3-0.5 μm，附有周生鞭毛，单菌落呈粉白色，表面光滑且略有凸起，边缘光滑，直径约1~2 mm；可产生H₂S和吲哚，能水解吐温20、吐温40、明胶和七叶苷，不能水解吐温60、吐温80、DNA、酪蛋白和淀粉，但MR实验、V-P实验及硝酸盐还原实验均为阴性；细胞膜主要的呼吸醌为Q-9，全细胞的极性脂由双磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、一种未知结构的磷脂(PL)和一种未知结构的磷脂(PL)组成，其主要脂肪酸为C_{18 : 1} ω7c、 C_{16 : 0}、 C_{16 : 1} ω7c 和 C_{12 : 0}3-OH，基因组DNA (G+C)含量为66.1 mol%。