CN113151050B - 一株鞘氨醇单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株鞘氨醇单胞菌及其应用。所述菌株的发酵液或生产的胞外多糖组合物可作为生物絮凝剂,其功能组分为一种新型胞外多糖,是一种主要由葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖和古罗糖醛酸组成的杂多糖。该胞外多糖絮凝剂有效工作浓度可低至4mg/L,利用鞘氨醇单胞菌HL‑1的发酵液具有同等作用效果。本发明的微生物絮凝剂具有用量少、无毒、无二次污染、絮凝效果好、使用环境pH范围较宽、热稳定性好等优点,使用时稀释至絮凝体系中多糖含量4mg/L即可达到98%的絮凝率,具有显著的技术经济性。
Description
技术领域
本发明属于微生物絮凝剂技术领域,涉及一种胞外多糖絮凝剂的制备方法及其在废水中的应用,具体涉及鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1菌株在制备微生物絮凝剂上的应用。
背景技术
水是生命之源,是人们赖以生存的重要条件。但我国水资源人均占有量低,还面临着分布不协调、污染严重和浪费等问题,尤其是工业废水对水资源的危害极大,因此我们需要对废水进行有效且科学的处理。
目前我国处理工业废水的主要技术包括化学氧化法、萃取法、吸附法、电渗析法和絮凝法。其中絮凝法由于成本低廉且处理方便而被广泛应用。而絮凝法中所用的絮凝剂又分为无机絮凝剂、有机合成高分子絮凝剂和天然生物絮凝剂。
微生物絮凝剂是指由微生物本身,或微生物发酵产生的一类有絮凝性能的有机物,主要通过微生物及其代谢产物与水中的颗粒相互作用从而达到絮凝的效果。与传统絮凝剂相比,微生物絮凝剂具有绿色无毒、不造成二次污染、易降解、可持续再生、絮凝效率高等优点。
微生物絮凝剂主要分为四类:微生物细胞絮凝剂、微生物细胞壁成分絮凝剂、微生物细胞代谢产物絮凝剂和通过基因工程技术获得的絮凝剂。其中微生物细胞分泌到细胞外的代谢产物主要是细菌的荚膜和粘液质,其主要成分为多糖及少量的多肽、蛋白质、脂类及其复合物,其中胞外多糖组分通常是生物絮凝剂的功能组分。目前报道的微生物絮凝剂的有效絮凝浓度范围为0.1-90mg/L,大部分微生物絮凝剂的性能研究还处于实验室研究阶段,没有大批量投入到实际生产中。寻找产高活性絮凝剂的菌株并降低絮凝剂用量是十分重要且有意义的。
通过提取生物絮凝剂活性成分可以制备生物絮凝剂成品,但以多糖为主体的絮凝剂提取步骤比较复杂,消耗大量溶剂(乙醇)并产生较多废水,导致了生物絮凝剂的成本较高。将微生物发酵液直接用做生物絮凝剂有助于降低应用成本,而发酵液自身的絮凝效果、耐稀释能力等使用性能将直接决定应用成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可制备生物絮凝剂的鞘氨醇单胞菌。
为实现上述技术目的,本发明采用如下技术方案:
一株鞘氨醇单胞菌,其分类命名为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)HL-1,保藏号为CCTCC NO:M 2021162。
本发明的另一目的在于提供上述菌株在制备生物絮凝剂中的应用。
所述生物絮凝剂可以为菌株发酵液或菌株所产胞外多糖的溶液。
本发明的生物絮凝剂,其用于絮凝时,絮凝体系中包含三价金属阳离子。
进一步的,絮凝体系的温度范围为20-40℃;絮凝体系的pH范围为3-10;絮凝体系中多糖含量≥1mg/L;优选1~20mg/L。
本发明的又一目的在于提供上述菌株生产的胞外多糖组合物。
所述胞外多糖组合物不含鼠李糖,其主要结构成分为葡萄糖、半乳糖醛酸、古罗糖醛酸及甘露糖;所述主要结构成分总质量占组合物质量的90%以上。
进一步的,所述胞外多糖组合物的制备方式为:将所述菌株的发酵液离心除菌体后,上清液加入有机溶剂离心收集沉淀经精制后获取。
本发明的菌株,其发酵液或生产的胞外多糖可作为生物絮凝剂使用,发酵液作为生物絮凝剂具有较好的热稳定性,菌株所产胞外多糖是一种新型的生物多糖组合物。所述絮凝剂耐稀释、用量少、无毒、无二次污染、絮凝效果好、使用环境pH范围较宽、热稳定性,稀释至絮凝体系中多糖含量4mg/L即可达到98%的絮凝率,具有显著的技术经济性。
附图说明
图1是鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1所产胞外多糖的离子色谱图。
图2是热处理温度对鞘氨醇单胞菌HL-1发酵液絮凝效果的影响。
图3是稀释倍数对鞘氨醇单胞菌HL-1发酵液絮凝效果的影响。
图4是金属离子对鞘氨醇单胞菌HL-1发酵液絮凝效果的影响。
图5是铁离子浓度对鞘氨醇单胞菌HL-1发酵液絮凝效果的影响。
图6是环境pH对鞘氨醇单胞菌HL-1发酵液絮凝效果的影响。
图7是环境温度对鞘氨醇单胞菌HL-1发酵液絮凝效果的影响。
本发明所述的生物材料,其分类命名为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassanxanigenens)HL-1,已于2021年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC NO:M 2021162,保藏地址:中国武汉。
具体实施方式
实施例1
本实施例用于说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1的鉴定方法及结果,其步骤包括:
(1)细菌基因组总DNA的提取:从菌种保藏管中取200μL HL-1菌液至LB培养基中,放入30℃、200rpm摇床培养24h,用基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。
(2)PCR扩增细菌的16S rDNA:采用细菌通用引物27F和1492R,用1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,并送至测序公司进行测序鉴定。
反应体系:ddH2O:20μL
高保真DNA聚合酶及混合底物:25μL
引物1:2μL
引物2:2μL
模板:1μL
反应条件:95℃预变性3min,95℃变性15s,56℃退火15s,72℃延伸30s/1kb,30个循环后72℃延伸5min。
16SrDNA部分序列的测序结果如下所示。采用NCBI BLAST分析软件比对后,显示本菌株与鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sanxanigenens)菌株的16S rDNA基因序列的同源性在96%以上。因此,对HL-1菌株的鉴定结果为鞘氨醇单胞菌Sphingomonassanxanigenens,命名为Sphingomonas sanxanigenens HL-1。
实施例2
本实施例用于说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1产生物絮凝剂的培养方法,其步骤包括:
(1)从菌种保藏管中取200μL Sphingomonas sanxanigenens HL-1菌液至装有菌种活化培养基的三角瓶中,放入30℃、200rpm摇床培养24h,用接种环蘸取少量菌液在菌种活化平板上划线,于30℃培养箱培养48h。
(2)用接种环挑取活化平板上的生长良好的单菌落一环接种于装有50mL种子培养基的250mL三角瓶中,放入30℃、200rpm摇床培养24h。
(3)将培养好的种子液以6%(v/v)的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中,放入30℃、200rpm摇床培养72h。
菌种活化培养基:蛋白胨5g,牛肉膏3g,NaCl 5g,琼脂15g,水1L,121℃灭菌20min。
种子培养基:蔗糖20g,酵母膏1g,蛋白胨4g,K2HPO4 2g,MgSO4 0.1g,水1L,pH 7.0-7.2,121℃灭菌20min。
发酵培养基:蔗糖40g,酵母膏1g,蛋白胨4g,K2HPO4 2g,MgSO4 0.1g,水1L,pH 7.0-7.2,121℃灭菌20min。
实施例3
本实施例用于说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1产胞外多糖的提取方法,其步骤包括:
(1)提取胞外多糖粗品:将实施例2中的发酵液置于80℃水浴20min,用蒸馏水等体积稀释,8000r/min离心30min除菌体,收集上清液,浓缩后加入3倍体积的95%乙醇,混匀,放于4℃冰箱静置过夜,8000r/min离心30min去上清,重复多次,收集沉淀,置于80℃烘箱烘干至恒重,得胞外多糖粗品。
(2)去除蛋白质:取适量粗品溶于100mL蒸馏水中,加热搅拌至其溶解,加入氯仿:正丁醇=4:1的溶液20mL,振荡30min,8000r/min离心30min收集上清,重复多次,直至有机相中无油状物出现为止。
(3)冷冻干燥:将脱去蛋白后的粗品置于截流分子量为10000Da的透析袋中,聚乙二醇浓缩,透析3天,将透析后的溶液进行冷冻干燥,得胞外多糖纯品。
将实施例1中的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1发酵液进行多糖提取后,可以得到其胞外多糖产量达20g/L。
实施例4
本实施例用于说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1发酵液中的多糖提取物与发酵液的絮凝效果比较,其步骤包括
(1)絮凝剂样品的准备:将实施例3中提取的HL-1多糖纯品用去离子水彻底溶解,调整浓度至0.2g/L。将实施例2中的HL-1发酵液用去自来水稀释100×至其中的多糖含量为0.2g/L。
(2)高岭土悬浊液的制备:将高岭土溶于去自来水中,制备浓度为4g/L高岭土悬浊液,取48mL高岭土悬浊液,添加1ml FeCl3溶液使体系中铁离子终浓度为3mM。
(3)絮凝体系的操作方法:49ml高岭土悬浊液中分别加入1mLHL-1多糖纯品或1mL发酵液稀释液,先用250rpm快速搅拌1min,再用100rpm慢速搅拌4min,最后静置5min,在550nm处测定絮凝作用前后的吸光度。
实验中涉及的絮凝率的计算公式如下所示:
絮凝率(μ)=(A-B)/A×100%
其中,A表示空白对照高岭土悬浊液在550nm处的吸光度,B表示絮凝样品体系在550nm处的吸光度。
结果如表1所示。鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1所产的胞外多糖具有优异的絮凝效能,HL-1多糖纯品的有效使用浓度可以低至4mg/L,对高岭土悬浊液的絮凝效率达99.43%;将发酵液直接用于絮凝时,用量为1/5000(v/v)时,体系中的多糖浓度为4mg/L,对高岭土悬浊液的絮凝效率达99.59%。直接使用稀释后的发酵液作为絮凝剂可以达到同等效果,且发酵液的稀释度可以达到1/5000,具有良好的性价比。
表1 HL-1菌株的提取絮凝剂纯品与发酵液的絮凝作用效果
絮凝剂 | 用量 | 絮凝率μ |
HL-1胞外多糖纯品 | 4mg/L | 99.43% |
HL-1发酵液 | 1/5000(v/v) | 99.59% |
实施例5
本实施例用于说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1产胞外多糖的结构鉴定结果
将实施例3中提取的HL-1多糖纯品取10mg置于安瓿瓶中,加入3M TFA 10mL,120℃水解3h。准确吸取酸水解溶液转移至管中氮吹吹干,加入5mL水涡旋混匀,吸取100μL加入900μL去离子水,12000rpm离心5min。取上清进行离子色谱分析。
图1所示为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1产胞外多糖水解体系的离子色谱图,HL-1多糖组分的主要产物峰分别是:阿拉伯糖(12.425min)、盐酸氨基葡萄糖(13.825min)、半乳糖(15.7min)、葡萄糖(17.817min)、甘露糖(22.034min)、半乳糖醛酸(45.325min)和古罗糖醛酸(45.917min),上述组分的占比约为0.2%、0.4%、0.2%、89.3%、1.9%、5.5%和2.5%。
目前已报道的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.能大量合成的胞外多糖被统称为鞘氨醇胶(Sphingans),包括威兰胶、结冷胶、三赞胶、定优胶等产物,这些鞘氨醇胶具有共同的结构单体组分D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、L-甘露糖和L-鼠李糖。图1中所示的鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1所产多糖结构主要由D-葡萄糖、L-甘露糖、半乳糖醛酸以及古罗糖醛酸构成,HL-1多糖结构中不含L-鼠李糖,与黄原胶(由D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖组成)和已报道的鞘氨醇胶具有显著差异。因此鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1所产多糖组分是一种新型结构的生物多糖,该生物多糖作为生物絮凝剂的应用尚未被公开发表。
实施例6
本实施例用于说明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sanxanigenens HL-1发酵液作为生物絮凝剂应用的性能特征
(1)HL-1发酵液作为生物絮凝剂的热稳定性
将实施例2中获得的HL-1发酵液置于不同温度(20℃、40℃、60℃、80℃、100℃)的水浴锅中水浴60min,将各处理温度下的发酵液用自来水稀释100×至多糖浓度为0.2g/L,按实施例4所述方法测定絮凝率,结果如图2所示:HL-1发酵液作为生物絮凝剂具有较好的热稳定性,在20-100℃的处理范围内,絮凝率皆可达到95%以上。
(2)HL-1发酵液作为生物絮凝剂的用量范围
将实施例2中获得的HL-1发酵液在80℃水浴中水浴60min后取出,冷却至室温,分别稀释10×、50×、100×、150×和200×,对应的絮凝剂多糖浓度约为2g/L、0.4g/L、0.2g/L、0.133g/L和0.1g/L。按实施例4所述方法测定絮凝率,结果如图3所示:发酵液用自来水稀释10-150×时其絮凝率皆在95%以上,但稀释200×时絮凝率有所下降。综合考虑成本及效率问题,稀释100×的发酵液为最适体系,即对于高岭土悬浊液的最适絮凝用量为1/5000(v/v)。
(3)金属离子作为助凝剂的作用效果
将高岭土溶于去离子水中,制备浓度为4g/L高岭土悬浊液,取48mL高岭土悬浊液,分别添加去离子水(对照组)、NaCl、CaCl2、FeCl3或AlCl3溶液各1mL,使体系中钠离子、钙离子、铁离子、铝离子的终浓度均为3mM。将实施例2中获得的HL-1发酵液用自来水稀释100×,取1mL稀释后的HL-1发酵液添加到49mL配置好的高岭土悬浊液中,按实施例4所述测定方法测定絮凝率,结果如图4所示:HL-1发酵液作为生物絮凝剂使用时,强烈依赖三价阳离子(铁离子、铝离子),不添加离子或仅添加钠离子、钙离子的环境下,HL-1发酵液几乎没有发生絮凝,但是可以被三价阳离子(铁离子、铝离子)明显激活絮凝功能。
(4)铁离子浓度对高岭土悬浊液的絮凝效果
配制高岭土悬液(4g/L),分别加入FeCl3溶液,使其铁离子的终浓度分别为0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM和3.0mM。将实施例2中获得的HL-1发酵液用自来水稀释100×,取1mL稀释后的HL-1发酵液添加到49mL配置好的高岭土悬浊液中,按实施例4所述测定方法测定絮凝率,结果如图5所示:铁离子的添加量对HL-1絮凝剂的絮凝效果影响不大,高岭土悬浊液中铁离子的添加量在0.5-3mM范围内,其絮凝率皆在99%以上,说明HL-1絮凝剂对铁离子浓度没有很大的依赖性。
(5)HL-1发酵液作为生物絮凝剂的适用环境pH
配制4g/L的高岭土悬液,调节其pH为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,加入终浓度为3mM的FeCl3。将实施例2中获得的HL-1发酵液用自来水稀释100×,取1mL稀释后的HL-1发酵液添加到49mL配置好的高岭土悬浊液中,按实施例4所述测定方法测定絮凝率,结果如图6所示:HL-1生物絮凝剂可有效作用的环境pH为3-10,该范围内絮凝效果较为良好;当pH升至11-12时,其絮凝效果大大降低。说明HL-1生物絮凝剂的环境pH较为宽泛,但不耐受极端碱性环境,具有应用于酸性、中性和偏碱性污水中的潜力。
(6)HL-1发酵液作为生物絮凝剂的适用环境温度
配制4g/L的高岭土悬液,添加终浓度为3mM FeCl3,将49mL高岭土悬液分别置于20℃、40℃、60℃、80℃和100℃水浴保温。将实施例2中获得的HL-1发酵液用自来水稀释100×,取1mL稀释后的HL-1发酵液添加到保温状态下的49mL高岭土悬浊液中,按实施例4所述方法测定絮凝率。结果如图7所示:环境温度为20-40℃时絮凝率较好,维持在97%以上;但环境温度较高(60℃及以上)时絮凝率会大大降低,说明HL-1生物絮凝剂适用于常温状况下处理污水。
实施例7
本实施例用于比较HL-1微生物絮凝剂和其他种类絮凝剂对高岭土溶液的絮凝效果。
配置浓度为0.1%的聚丙烯酰胺(PAM)和聚合氯化铝(PAC),置于37℃、200rpm摇床中24h使其充分溶解;将实施例2中获得的HL-1发酵液用自来水稀释100×。按照实施例4所述方法,测定各种絮凝剂对高岭土悬浊液的絮凝效果。结果如表2所示:PAM和PAC在高岭土溶液中几乎没有絮凝效果,因此本微生物絮凝剂具有较好的絮凝效果和应用前景。
表2不同絮凝剂种类对高岭土悬浊液的絮凝效果
絮凝剂种类 | 用量(v/v) | 絮凝率 |
HL-1发酵液 | 1/5000 | 99.59% |
PAC | 0.1% | 0 |
PAM | 0.1% | 2.22% |
实施例8
本实施例用于比较HL-1微生物絮凝剂和其他种类絮凝剂对泥浆溶液的絮凝效果
人造泥浆溶液的制备:将土壤放置于70℃烘箱中烘干至恒重,用研钵研细并用筛子过滤。称取10g土壤溶于1L自来水中,并用超声波清洗机超声30min,得到人造泥浆水。
配置浓度为0.1%的聚丙烯酰胺(PAM)和聚合氯化铝(PAC),置于37℃、200rpm摇床中24h使其充分溶解,将实施例2中获得的HL-1发酵液用自来水稀释100×。按照实施例4所述方法,测定各种絮凝剂对泥浆溶液的絮凝效果。结果如表3所示:HL-1生物絮凝剂在泥浆水中的絮凝效果与PAM和PAC相当,皆在99%以上,由此可以看出HL-1生物絮凝剂在泥浆水中也有较好的应用前景。
表3不同絮凝剂种类对泥浆水的絮凝效果
絮凝剂种类 | 用量(v/v) | 絮凝率 |
HL-1发酵液 | 1/5000 | 99.18% |
PAC | 0.1% | 99.51% |
PAM | 0.1% | 99.62% |
Claims (8)
1.一株鞘氨醇单胞菌,其特征在于,分类命名为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)HL-1,保藏号为CCTCC NO:M 2021162。
2.权利要求1所述鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)HL-1在制备生物絮凝剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述生物絮凝剂为菌株发酵液或菌株所产胞外多糖的溶液。
4.一种生物絮凝剂的使用方法,其特征在于,生物絮凝剂是权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sanxanigenens)HL-1的菌株发酵液,絮凝体系的温度范围为20-40℃。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,絮凝体系中多糖含量≥2 mg/L。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,絮凝体系中多糖含量为2~40 mg/L。
7.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,絮凝体系的pH范围为3-10。
8.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,絮凝体系中包含三价金属阳离子作为助凝剂。
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