CN101619300B

CN101619300B - 一株鞘氨醇单胞菌tp-5及其生产韦兰胶的方法和应用

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Publication number: CN101619300B
Application number: CN2009100699602A
Authority: CN
Inventors: 马挺; 李国强; 李丹萍; 梁凤来; 刘如林
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2009-07-31
Filing date: 2009-07-31
Publication date: 2011-08-31
Anticipated expiration: 2029-07-31
Also published as: CN101619300A

Abstract

一株鞘氨醇单胞菌TP-5及韦兰胶的制备方法和应用。本发明菌株是从糖蜜厂含糖废水中分离驯化得到，其分类命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.，其保藏号为CGMCCNo.3097。该菌可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在含糖的无机盐培养基中生长。本发明提供的TP-5菌株在28～37℃温度条件下，能够在糖、无机盐和水的无菌培养基中发酵，发酵液经提取即得韦兰胶。韦兰胶的耐温极限值为150℃，在加入不同浓度的氯化钾后，韦兰胶溶液的粘度显著增大，对温度的稳定性增强，其粘度几乎不随温度的改变而改变，表现出更强的温度耐受性，这一特征使其可应用于海水钻井泥浆和高盐油藏稠化水驱体系中。

Description

一株鞘氨醇单胞菌TP-5及其生产韦兰胶的方法和应用

【技术领域】本发明属于生物技术和生物材料技术领域，具体地说，它涉及一株鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株，及其产生的韦兰胶类生物聚合物的应用。

【背景技术】许多微生物在生长代谢过程中，在不同的外部条件下都能产生一定量的各种多糖聚合物。这类多糖聚合物安全无毒，具有独特的理化性质，且与植物和动物多糖聚合物相比，微生物多糖聚合物的生产受地理环境、气候、自然灾害等因素的影响较小，产量及质量都很稳定。韦兰胶易溶于水，水溶液具有独特的流变学特性和良好的增粘、耐酸碱性。其水溶液对温度的耐受性可高达150℃，高于同类多糖聚合物黄原胶的耐受温度120℃。

由于韦兰胶的剪切稀化作用及其优良的流变性能，它主要作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂、成膜剂和黏合剂应用于工农业的各个方面。特别是在食品、混凝土、石油、油墨等工业中有广泛的应用前景。在食品工业方面，韦兰胶在烘焙制品、乳制品、果汁、牛奶饮料、糖衣、糖霜、果酱、肉制品和各种甜点的加工中有潜在的应用价值。在石油工业中，韦兰胶可用于调配钻井泥浆，以保持水基钻井液的黏度和控制其流变性能。韦兰胶还是一种新型的驱油剂，用于油井的三次采油，将韦兰胶调配成适合浓度的水溶液注入井内，压进油层驱油，可大大提高采油率。韦兰胶也可广泛应用于水泥和混凝土中，它能够增强泥浆的保水性，当它作为保水剂时不需要像其它的添加剂那样使用分散剂。与其它添加剂相比，较低浓度的韦兰胶就可以取得很好的效果。因此，近年来它们已作为乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、胶凝剂、成膜剂和润滑剂等广泛应用于食品、制药、石油、化工等多个领域。

目前Kelco公司已成为韦兰胶在全球唯一的生产、供应商，而国内先后有南京工业大学、南昌大学和河北鑫合生物化工有限公司从事这方面的研究，但所用菌种、发酵生产工艺和后提取方法均不相同，此外还未见有关韦兰胶生产的相关报道。

【发明内容】本发明的目的在于提供一种高产韦兰胶的鞘氨醇单胞菌；同时提供一种利用鞘氨醇单胞菌的廉价高产韦兰胶工艺，以及从发酵终产物中提取韦兰胶的方法。

本发明方法以淀粉水解糖、硝酸钠、玉米浆、磷酸氢二钠、硫酸镁和碳酸钙组成发酵培养基进行发酵生产韦兰胶，并采用预处理、超滤、醇沉和干燥技术从发酵终产物中提取韦兰胶。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株，于2009年6月12日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”(北京市朝阳区大屯路3号，中国科学院微生物研究所)，其保藏号为CGMCC No.3097，分类命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株，该菌可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在含糖的无机盐培养基中生长。菌株在28～37℃之间的任一温度下好氧生长。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株，是以无机盐培养基从糖蜜生产废水中分离，接着以糖为唯一碳源在30℃反复驯化培养而获得。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌落特征：在LB平板上30℃培养两天即可长出淡黄色、圆形菌落，菌落大小直径1～2mm，边缘整齐，表面光滑。继续培养菌落会变大变厚。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株的形态特征：革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢，好氧，在LB培养基培养2天后细胞平均大小0.5-0.6μm(宽)×1.2-1.6μm(长)。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株生理生化特征：生长温度28-37℃，生长pH范围5-12，NaCl耐受性3％。氧化酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，反硝化，淀粉水解，M.R.，V-P，吲哚产生实验均为阴性；接触酶，分解七叶苷，硝酸盐还原，明胶水解实验为阳性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为酸凝型。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株的16S rRNA基因序列特征：将TP-5菌株接种于LB培养基，30℃摇床培养(180rpm)24小时，离心收集菌体，重新悬浮，加溶菌酶和SDS破壁，由酚-氯仿法提取基因组DNA，并采用上游引物(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和下游引物(5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)，用这对引物对其16S rDNA基因进行PCR扩增，将扩增引物送大连宝生物公司进行测序。PCR条件为：94℃，5min；94℃，45s，56.2℃，45s，72℃90s，30个循环；72℃9min，4℃保存。16S rDNA基因序列长度为1610p，与Sphingomonas asaccharolytica的16S rDNA(GenBank accession No.AY509241.1)序列相似性为98％。其16S rDNA的序列如序列表所示。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株，可在以淀粉水解糖、硝酸钠、玉米浆、磷酸氢二钠、硫酸镁和碳酸钙组成发酵培养基中进行发酵以生产韦兰胶，并采用预处理、超滤、醇沉、脱色和干燥技术从发酵终产物中提取制得韦兰胶。

具体工艺步骤是：

1、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入含普通LB培养基的摇瓶中，培养制成种子液；

2、将种子液以4～6％的接种量接入发酵培养基(蒸馏水中按质量体积比计包括8％的淀粉水解糖、0.4％的硝酸钠、0.1％的玉米浆、0.358％的磷酸氢二钠、0.02％的硫酸镁和0.15％的碳酸钙)中进行一级发酵，制成一级发酵液；

3、将一级发酵液以8～10％的接种量接入发酵培养基(蒸馏水中按质量体积比计包括8％的淀粉水解糖、0.4％的硝酸钠、0.1％的玉米浆、0.358％的磷酸氢二钠、0.02％的硫酸镁、0.15％的碳酸钙、0.0005％的硫酸亚铁和0.005％的消泡剂)中进行二级发酵，制成二级发酵液(即发酵终产物)。若进行大规模生产可进行三级发酵，发酵放大方法同二级发酵；

4、将发酵终产物进行后提取处理工艺得到韦兰胶，包括如下步骤：

(1)、预处理。用絮凝技术结合工业滤布除去大部分菌体碎片和发酵液中的不溶性杂质；

(2)、超滤。利用超滤膜截留分子量为10⁶～10⁷道尔顿的较大的物质；

(3)、醇沉。边加入酒精边搅拌，使韦兰胶呈纤维状析出；

(4)、脱色。利用酸洗、碱洗和醇洗步骤洗脱色素和杂质；

(5)、干燥。将沉淀用真空干燥或喷雾干燥的方式干燥，即制得韦兰胶粉末。

本发明的优点和积极效果：

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株所发酵生产的韦兰胶，具有良好的稳定性和独特的剪切稀释性。其水溶液对热稳定，在温度提升至150℃时粘度基本不变；对酸、碱稳定，pH2～13范围内粘度基本不受影响；对盐的稳定性高(氯化物浓度＜100g/L)，且与大多数盐都有配伍性。在温度继续升高后溶液的粘度下降，在温度降低后又可完全恢复。当施加一定的剪切力时，粘度迅速下降，一旦失去剪切力粘度仍能恢复。这一点在石油钻井海水泥浆中发挥突出的作用。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株所发酵生产的韦兰胶，具有理想的增稠性和强韧的成胶特性。低浓度的韦兰胶水溶液即有很高的粘度，25℃时1％的韦兰胶水溶液粘度可达4300mPa·s，因此用韦兰胶作为稠化剂可用于生物聚合物驱油试验中。此外，韦兰胶在0.1％的NaOH溶液加热可形成凝胶，与结冷胶复配后在Ge²⁺盐存在下亦可形成凝胶，且凝胶强度大，可用于油藏深部调剖堵水试验中。

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株相比其它生产工艺，利用了廉价的碳源和无机氮源，在28～37℃最适温度条件下利用淀粉水解糖、硝酸钠、玉米浆、磷酸氢二钠、硫酸镁和碳酸钙组成的培养基发酵生产韦兰胶，对糖的转化率可达56％以上，保持高产的同时比利用有机氮源(如蛋白胨)拥有较大的粘度。利用预处理、超滤、醇析、脱色和干燥组合工艺进行产物后提取，得到的韦兰胶质量较高。较现有技术而言更易实现工业化生产，且生产的韦兰胶产品质量较好。

【附图说明】：

图1是LB培养基上30℃培养2天后的TP-5菌落照片；

图2是剪切速率对1％的韦兰胶水溶液表观粘度的影响；

图3是温度对1％的韦兰胶盐溶液表观粘度的影响；

图4是韦兰胶浓度对表观粘度的影响。

【具体实施方式】

实施例1

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株的筛选和育种。

从天津津南区某糖蜜厂采集废水样，取10mL于90mL葡萄糖无机盐培养基中(培养基组成：KH₂PO₄3.48，Na₂HPO₄·12H₂O 1.5，NH₄SO₄2，MgSO₄·7H₂O 0.70，酵母提取物0.05；葡萄糖5％；蒸馏水，1000ml；pH7.2；105℃灭菌30min)，置于200r/min低温摇床30℃富集培养5天，划线筛选直径较大且明显粘稠的菌落；进一步挑选该菌落至新鲜的100mL葡萄糖无机盐培养基中进行传代驯化，培养条件同上；经过5～7个周期富集后最终得到TP-5；在LB固体平板上反复划线，挑取单菌落划斜面保存；将TP-5菌落分别取一环接入装有5mL LB培养液的试管内，30℃震荡培养48h，作为种子液；分别取1mL种子液接入装有100mL葡萄糖无机盐培养基的250mL三角瓶中，30℃震荡培养3d，检测多糖聚合物的产量和种类。

实施例2

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株的形态特征和生理生化特征。

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》(Vol.VIII)的实验方法进行，检测其革兰氏染色，菌体大小和形态，有无鞭毛和芽孢，生长温度，生长pH范围，NaCl耐受性。接触酶，氧化酶，M.R.实验，V-P实验，吲哚产生，硝酸盐还原，淀粉水解，产氨实验，脲酶，硫化氢产生，明胶水解，葡萄糖发酵，石蕊牛奶试验，分解七叶苷实验。

鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)在LB平板上30℃培养两天即可长出淡黄色、圆形菌落，菌落大小直径1～2mm，边缘整齐，表面光滑(见图1)。继续培养菌落会变大变厚。革兰氏染色阴性，菌体呈短杆状，有鞭毛，无芽孢，好氧，在LB培养基培养2天后细胞平均大小0.5-0.6μm(宽)×1.2-1.6μm(长)。生长温度28-37℃，生长pH范围5-12，NaCl耐受性3％。氧化酶，亚硝酸盐还原，脲酶，硫化氢产生，反硝化，淀粉水解，M.R.，V-P，吲哚产生实验均为阴性；接触酶，分解七叶苷，硝酸盐还原，明胶水解实验为阳性；葡萄糖发酵为氧化型；石蕊牛奶试验为酸凝型。

实施例3

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株的的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定。

实施例4

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株的多糖聚合物种类检测。

菌株产生的聚合物溶于水，不溶于醇、酮等有机溶剂。

聚合物的双缩脲反应、斐林试剂反应均为阴性，说明样品中不含游离的氨基酸和单糖类物质。采用不同的特异性显色方法对聚合物样品和酸水解后的样品进行薄层定性分析。酸水解前后的聚合物样品用硫酸-蒽酮显色后都呈明显的蓝绿色斑点，说明样品中含有糖类成分；聚合物样品的丁酮抽提物用铝酸铵-高氯酸显色无明显斑点，说明聚合物中不含有脂类物质；用茚三酮显色水解聚合物样品无明显斑点，说明聚合物样品中不含有多肽组分。

用硫酸-咔唑法对糖醛酸进行定量测定，结果表明葡萄糖醛酸占糖组分的10.4％。聚合物样品经过三氟乙酸水解后，气相色谱法测定单糖组成，相对保留时间为16.032的峰为内标肌醇六乙酸酯，保留时间12.389、14.238和14.542的组分依次为鼠李糖、甘露糖和葡萄糖，根据各组分峰面积，由内标法计算可知样品中葡萄糖、鼠李糖、甘露糖的比例为2∶2∶1。进一步采用高碘酸氧化法，测得鼠李糖末端连接的和1，4连接的比例为1∶2，葡萄糖基本上为1，3连接。这种典型结构证实该多糖类生物聚合物是韦兰胶类鞘氨醇胶。

实施例5

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株制备韦兰胶的方法。

将生产菌种在以淀粉水解糖、硝酸钠、玉米浆、磷酸氢二钠、硫酸镁和碳酸钙组成发酵培养基进行发酵，发酵过程是在33℃，pH6.8的条件下进行好氧发酵，对发酵终产物采用预处理、超滤、醇沉和干燥技术提取制得韦兰胶。具体工艺步骤是：

1、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入20倍体积的普通LB培养基中，好氧发酵24～36h制成种子液；

2、将种子液以4～6％的接种量接入发酵培养基(蒸馏水中按质量体积比计包括8％的淀粉水解糖、0.4％的硝酸钠、0.1％的玉米浆、0.358％的磷酸氢二钠、0.02％的硫酸镁和0.15％的碳酸钙)中，28～37℃好氧发酵28h，制成一级发酵液；

3、将一级发酵液以8～10％的接种量接入发酵培养基(蒸馏水中按质量体积比计包括8％的淀粉水解糖、0.4％的硝酸钠、0.1％的玉米浆、0.358％的磷酸氢二钠、0.02％的硫酸镁、0.15％的碳酸钙、0.0005％的硫酸亚铁和0.005％的消泡剂)中，好氧条件发酵24h，制成二级发酵液(终产物)；

4、将发酵终产物进行后提取处理得到韦兰胶，包括如下步骤：

(1)、预处理。用5％的氯化铝絮凝1h，继而以2500rpm离心10分钟除去部分菌体碎片和发酵液中的不溶性杂质；

(2)、超滤。利用超滤膜截留分子量为10⁶～10⁷道尔顿，操作压力为0.4MPa，室温流速为3m/s；

(3)、醇沉。边加入等体积的95％酒精边搅拌，使韦兰胶呈纤维状析出；

(4)、脱色。利用1/10体积的0.1％(v/v)的盐酸、0.1％的氢氧化钠和95％的酒精各洗涤沉淀1次；

(5)、干燥。将沉淀用真空干燥或喷雾干燥的方式干燥，即制得韦兰胶粉末。经称重计算韦兰胶得率为29g/L，糖转化率为56.3％。

实施例6

本发明提供的鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)菌株制备的韦兰胶特性。

配制1.0％的韦兰胶水溶液，室温下通过选择不同的转速调节剪切速率，用DVLV-II型旋转粘度计测定韦兰胶水溶液的表观粘度，二者关系曲线见图2，25℃时1％的韦兰胶水溶液粘度可达4300mPa·s，韦兰胶水溶液的粘度随着剪切速率的增大而降低，当转速降低时粘度又可回升，呈现典型的假塑流体特征，证明具有良好的剪切稀释性。

配制1.0％的韦兰胶水溶液，加入不同量的氯化钾，使氯化钾的最终浓度分别为0.1％、0.3％、0.5％，在20～150℃范围内、恒定转速30r/min条件下用DVLV-II型旋转粘度计测定溶液的表观粘度(图3)。在加入不同浓度的氯化钾后，韦兰胶溶液的粘度显著增大。对温度的稳定性增强，其粘度几乎不随温度的改变而改变，并表现出更强的温度耐受性，说明其具有良好的耐温性和耐盐性。

配制0.2％、0.4％、0.6％、0.8％浓度的韦兰胶水溶液，在室温下选择不同的转速，用DVLV-II型旋转粘度计测定溶液的表观粘度(图4)。在相同的剪切速率下，表观粘度与溶液浓度正相关，表现出良好的增稠效果。且剪切速率越小，这种趋势越显著。说明低浓度韦兰胶也具有较高的粘度。

配制1％的韦兰胶0.1％NaOH溶液，或在1％的韦兰胶水溶液中添加0.1％的Ge²⁺离子，60～120℃加热1min并冷却后可形成凝胶；此外将韦兰胶与结冷胶按1∶3(m/m)比例复配后可形成凝胶，形成凝胶所需的最低溶液浓度有较大差异，在不加金属离子的条件下，形成凝胶所需复配胶浓度≥1％，结冷胶为1.2％；加入金属离子，0.04％的结冷胶即可形成凝胶，而复配胶只需要0.03％，且形成的凝胶透明，强度大，可用于油藏深部调剖堵水试验中。

常见的一价离子如K⁺、Na⁺，二价离子除Cu²⁺、Fe²⁺外，Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺(浓度均为0.01mol/L)均可使0.02％的复配胶溶液形成凝胶；三价离子如Fe³⁺和Al³⁺，可使复配胶形成团块状沉淀。

表1不同离子对复配胶形成凝胶的影响

序列表

<110>南开大学

<120>一株鞘氨醇单胞菌TP-5及其生产韦兰胶的方法和应用

<160>1

<170>Patentin Version 3.3

<210>1

<211>1610

<212>DNA

<213>鞘氨醇单胞菌TP-5(Sphingomonas sp.TP-5)

<400>1

ttgggcccga cgtcgcatgc tcccggccgc catggcggcc gcgggaattc gattgagagt 60

ttgatcctgg ctcagaatga acgctggcgg catgcctaac acatgcaagt cgaacgagac 120

cttcgggtct agtggcgcac gggtgcgtaa cgcgtgggaa tctgcccttg ggttcggaat 180

aacagtgaga aattactgct aataccgaat gatgacgtag agtccaaaga tttatcgccc 240

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ccttagctgg gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 360

tacgggaggc agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg 420

cgtgagtgat gaaggcctta gggttgtaaa gctcttttac ccgggatgat aatgacagta 480

ccgggagaat aagctccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggagcta 540

gcgttattcg gaattactgg gcgtaaagcg cacgtaggcg gctttgtaag ttagaggtga 600

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gtgagtggaa ttccgagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttcggaagaa caccagtggc 720

gaaggcggct cactggactg gtattgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 780

attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgataac tagctgtccg ggcacttagt 840

gcttgggtgg cgcagctaac gcattaagtt atccgcgggg agtacggccg caaggttaaa 900

actcaaatga attgacgggg gcctgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960

acgcgcagaa ccttaccagc gtttgacatg tccggacgat ttccagagat ggatctcttc 1020

ccttcgggga ctggaacaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080

gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gcctttagtt accatcattt ggttgggtac 1140

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cgcaaggagg cagctgacca cggtgggatc agcgactggg gtgaagtcgt aacaaggtag 1500

ccgtagggga acctgcggct ggatcacctc cttaatcact agtgaattcg cggccgcctg 1560

caggtcgacc atatgggaga gctcccaacg cgttggatgc atagcttgag 1610

Claims

1.一种鞘氨醇单胞菌TP-5菌株，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，分类命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.，其保藏号为CGMCC No.3097。

2.一种使用权利要求1所述菌株制备韦兰胶的方法，该方法在以淀粉水解糖、硝酸钠、玉米浆、磷酸氢二钠、硫酸镁和碳酸钙组成的发酵培养基中进行发酵生产，并采用预处理、超滤、醇沉、脱色和干燥技术，从发酵终产物中提取制得韦兰胶，具体工艺步骤是：

第一、以无菌水将原始菌种从一个或多个斜面上洗下，直接接入普通LB培养基中，好氧发酵培养制成种子液；

第二、将上步培养的种子液以4～6％的接种量接入发酵培养基中进行一级发酵，制成一级发酵液；其中发酵培养基的组成按质量体积比计包括：8％的淀粉水解糖、0.4％的硝酸钠、0.1％的玉米浆、0.358％的磷酸氢二钠、0.02％的硫酸镁和0.15％的碳酸钙，以蒸馏水配制；

第三、将第二步制成的一级发酵液以8～10％的接种量接入发酵培养基中进行二级发酵，制成二级发酵液；其中发酵培养基的组成按质量体积比计包括：8％的淀粉水解糖、0.4％的硝酸钠、0.1％的玉米浆、0.358％的磷酸氢二钠、0.02％的硫酸镁、0.15％的碳酸钙、0.0005％的硫酸亚铁和0.005％的消泡剂，以蒸馏水配制；

第四、将第三步制成的二级发酵液作为发酵终产物，依次经过预处理→超滤→醇沉→脱色→干燥的后提取处理工艺得到韦兰胶；

其中，第四步所述的后提取处理工艺的具体步骤是：

预处理：用絮凝技术结合工业滤布除去大部分菌体碎片和发酵液中的不溶性杂质；

超滤：利用超滤膜截留分子量为10⁶～10⁷道尔顿的较大物质；

醇沉：边加入酒精边搅拌，使韦兰胶呈纤维状析出；

脱色：利用酸洗、碱洗和醇洗步骤洗脱色素和杂质；

干燥：将沉淀用真空干燥或喷雾干燥的方式干燥，即制得韦兰胶粉末。