CN109988731A - 一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌tja 3-1及其生产韦兰胶的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3‑1，名称为TJA 3‑1，分类名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为：CGMCC No.15057，保藏日期：2017年12月13日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本菌株能利用低成本的糖蜜为原料进行发酵生产，发酵液粘度达到10500mPa.s，韦兰胶的产量达到21g/L，在160℃温度下仍具有良好的耐温性能，提供了韦兰胶生产的新途径。

Description

一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1及其生产韦兰胶 的方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1及其生产韦兰胶的方法和应用。
背景技术
自然界中的许多微生物都能够合成胞外多糖，它们粘附在细胞表面或以不定形粘液状分泌到培养液中，对微生物起到保护作用，一些微生物合成的多糖已经成为重要的生物技术产品，被称为微生物胶，在化工、食品等行业被广泛应用。鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是能合成微生物胶的重要微生物菌种资源，该属的某些菌株能够合成主链结构相似的多糖，被统称为鞘氨醇胶(sphingans)。包括Sphingomonas elodea ATCC 31461合成的结冷胶(Gellan)、Sphingomonas sp.ATCC 31555合成的韦兰胶(Welan)、Sphingomonas sp.ATCC 31961合成的鼠李胶(Rhamsan)、Sphingomonas sp.ATCC 53159合成的定优胶(Diutan)、Sphingomonas sp.ATCC 31554合成的鞘氨醇胶S-88、Sphingomonassp.ATCC 31853合成的鞘氨醇胶S-198，以及Sphingomonas yanoikuyae ATCC 21423合成的鞘氨醇胶S-7等。这些鞘氨醇胶的多糖主链结构类似，都由葡萄糖，葡萄糖醛酸，鼠李糖和(或)甘露糖组成，但侧链基团的种类和位置多样，使每一种鞘氨醇胶都具有独特的物理性质，广泛应用于食品、化工和医学组织工程等领域。
韦兰胶是鞘氨醇胶类多糖的一种，又称为鞘氨醇胶S-130，具有优良的流变性能，且粘度对温度、酸碱度、金属盐离子相对较稳定，特别是具有良好的抗高温性能，在25～100℃范围内，韦兰胶溶液的粘度变化很小。作为增稠剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、润滑剂，韦兰胶广泛应用于食品、混凝土、石油、化工等领域。
在筛选鞘氨醇胶合成菌的研究中，人们发现鞘氨醇单胞菌属的不同菌株能够合成同一种鞘氨醇胶。例如，Kerisha等人筛选到2株能够合成结冷胶的菌Sphingomonaspseudosanguinis和Sphingomonas yabuuchiae(Raghunandan K,Kumar A,Kumar S,Permaul K,Singh S.Production of gellan gum,an exopolysaccharide,frombiodiesel-derived waste glycerol by Sphingomonas spp.3 Biotech.2018；8(1):71.doi:10.1007/s13205-018-1096-3)，与Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461利用葡萄糖、蔗糖、淀粉为碳源发酵合成结冷胶不同，这2株菌能够利用生物柴油的副产物粗甘油发酵合成结冷胶，从而降低了生产成本。
韦兰胶是美国CPkelco公司最早研发的产品，国内河北鑫合生物化工等公司也从事韦兰胶的生产和研发，但目前已有的韦兰胶发酵菌种单一，大都为Sphingomonassp.ATCC 31555及其变种，存在发酵原料成本偏高，发酵产量低，发酵液中胶含量少等问题。
通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
1、用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂及其应用(CN103468762A)，用于增加韦兰胶发酵产量的携氧剂及其应用。韦兰胶是由鞘氨醇单胞菌合成并分泌到胞外的一类高分子微生物多糖。因其具备优良的假塑流变性、悬浮与乳化性、兼容性、稳定性而日益受到关注。在鞘氨醇单胞菌TP-5(保藏号CGMCCNo.3097)发酵初期，在发酵培养基中分别添加0.05％(m/v)的TritonX-100、0.2％(m/v)的Tween-20、0.2％(m/v)的Tween-40或0.3％(m/v)的Tween-80，能使韦兰胶的产量分别提高21.80％、22.73％、36.62％和28.12％。表面活性剂类携氧剂可望应用于韦兰胶等高粘度多糖的发酵工业中。
2、一株鞘氨醇单胞菌TP-5及其生产韦兰胶的方法和应用(CN101619300B)，本发明菌株是从糖蜜厂含糖废水中分离驯化得到，其分类命名为鞘氨醇单胞菌Sphingomonassp.，其保藏号为CGMCCNo.3097。该菌可在普通牛肉汁、LB、营养琼脂营养培养基中生长，也可在含糖的无机盐培养基中生长。本发明提供的TP-5菌株在28～37℃温度条件下，能够在糖、无机盐和水的无菌培养基中发酵，发酵液经提取即得韦兰胶。韦兰胶的耐温极限值为150℃，在加入不同浓度的氯化钾后，韦兰胶溶液的粘度显著增大，对温度的稳定性增强，其粘度几乎不随温度的改变而改变，表现出更强的温度耐受性，这一特征使其可应用于海水钻井泥浆和高盐油藏稠化水驱体系中。
通过对比，本发明存在以下差别：
1、菌株不同，具体说16S序列不同，氧化酶，明胶水解这2个指标也不同；
2、发酵工艺差别，特别是本发明采用变温发酵提高产量；
3、本发明合成的温轮胶可耐受160℃高温。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1及其生产韦兰胶的方法和应用，该菌株能利用低成本的糖蜜为原料进行发酵生产，发酵液粘度达到10500mPa.s，韦兰胶的产量达到21g/L，在160℃温度下仍具有良好的耐温性能，提供了韦兰胶生产的新途径。
本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：
一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1，名称为TJA 3-1，分类名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为：CGMCC No.15057，保藏日期：2017年12月13日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1是从内蒙古翁牛特沙漠的沙化土壤中分离得到的。
而且，所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1的分类鉴定的特征为：革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.6-1.0um×1.2-2.5um，在活化培养基平板上形成黄色、质地黏稠的菌落，最适生长温度为28℃，最适生长pH为6.0，NaCl耐受性范围0-0.3％，氧化酶、接触酶、硝酸盐还原和七叶苷水解为阳性，甲基红和V-P试验、淀粉水解、明胶水解和吲哚产生为阴性；
所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1。
利用如上所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1生产韦兰胶的方法，步骤如下：
⑴菌种活化：菌种活化固体平板培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，pH 6.5；将保藏菌种鞘氨醇单胞菌TJA 3-1划线接种在此培养基的试管斜面上，30℃培养36-48h；
⑵种子制备：种子培养基(g/L)：蔗糖8-15，麦芽浸粉0.5-3，磷酸二氢铵0.5-1.5，硫酸镁0.1-1.0，pH 6-7.5；取活化好的试管斜面菌种，每支试管斜面中加入5mL无菌水，混合制成菌液，按3-5％的接种量接入摇瓶种子培养基中，27-33℃摇床振荡培养30-52h；
按3-5％的接种量接入种子培养基中，30℃培养48h，使菌量达到108CFU/mL以上；逐级放大，进行一级种子罐和/或二级种子罐扩大培养，种子罐接种龄为30-48h，接种量为2-5％，通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，温度27-33℃；
⑶发酵生产：将种子液以3-5％的接种量接入发酵罐中，发酵培养基(g/L)：糖蜜20-30，蔗糖10-20，硝酸钠3-6，豆饼粉0.5-1，磷酸二氢钾0.5-2，硫酸镁0.1-1.0，pH 6-7.5；通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，进行变温发酵，即：0-36h时发酵温度为29℃，36-68h时发酵温度为32℃；
⑷发酵产物的提取：发酵液升温至60-75℃维持10-15min，降至室温后，向发酵液中加入等体积的体积浓度为70-90％的乙醇，压滤后50-55℃烘干，粉碎后得韦兰胶产物。
如上所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1在生产韦兰胶方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果是：
1、本发明提供的鞘氨醇单胞菌TJA 3-1是从内蒙古翁牛特沙漠的沙化土壤中分离得到的，能够合成韦兰胶，分类鉴定数据表明与目前的韦兰胶生产菌Sphingomonassp.ATCC 31555或其变种不同，增加了韦兰胶生产菌株的来源。该菌株能利用低成本的糖蜜为原料进行发酵生产，发酵液粘度达到10500mPa.s，韦兰胶的产量达到21g/L，在160℃温度下仍具有良好的耐温性能，提供了韦兰胶生产的新途径。
2、本发明应用Sphingomonas sp.ATCC 31555及其变种之外的菌种合成韦兰胶的发明，利用低成本的糖蜜为碳源进行韦兰胶的发酵生产，合成的韦兰胶在160℃温度下仍具有良好的耐温性能。
附图说明
图1为本发明中菌株TJA 3-1的菌落特征图；
图2为本发明中菌株TJA 3-1的16S rDNA序列系统进化树；
图3为本发明中菌株TJA 3-1与Sphingomonas sp.ATCC 31555的16S rDNA序列比对图；
图4为本发明中菌株TJA 3-1与鞘氨醇单胞菌TP-5的16S rDNA序列比对图；
图5为本发明中菌株TJA 3-1合成多糖的凝胶渗透色谱检测图；
图6为本发明中菌种TJA 3-1发酵合成产物的单糖组成分析图；
图7为本发明中温度对菌株TJA 3-1合成韦兰胶的粘度影响图。
具体实施方式
下面结合通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1，名称为TJA 3-1，分类名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为：CGMCC No.15057，保藏日期：2017年12月13日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
其中，所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1是从内蒙古翁牛特沙漠的沙化土壤中分离得到的。
其中，所述株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1的分类鉴定的特征为：革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.6-1.0um×1.2-2.5um，在活化培养基平板上形成黄色、质地黏稠的菌落(图1)，最适生长温度为28℃，最适生长pH为6.0，NaCl耐受性范围0-0.3％，氧化酶、接触酶、硝酸盐还原和七叶苷水解为阳性，甲基红和V-P试验、淀粉水解、明胶水解和吲哚产生为阴性。
取菌株TJA 3-1的发酵液5mL，用北京天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA为模板，用引物27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR条件为：95℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃60s，30个循环；72℃10min。扩增得到的16S rDNA基因片段，送北京奥科公司测序。得到的16S rDNA基因片段长度为1383bp，将菌株TJA 3-1的16S rDNA测序结果与GenBank中核酸数据进行BLAST比对，得到与菌株TJA 3-1序列同源性最高的序列，与其同源性最高的有Sphingomonas azotifigens H1，相似性为98.7％；Sphingomonas pituitosa NBRC102491，相似性为98.12％；Sphingomonas trueperi Je44-11，相似性为98.48％。使用软件ClustalX1.8对所得到的核苷酸序列进行分析，得到序列间的相似值；利用软件MEGA 6.0计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树(如图2所示)。可以看出菌株TJA 3-1与Sphingomonas azotifigens H1分在同一个簇，与韦兰胶的合成菌Sphingomonassp.ATCC 31555处在不同的进化树分支。用软件DNAMAN 8.0进行序列比对，序列比对结果如图3所示，菌株TJA 3-1与Sphingomonas sp.ATCC 31555的16S rDNA序列有明显差别，相似性为96.61％。结合生理生化等鉴定指标，判断菌株TJA 3-1为鞘氨醇单胞菌，即Sphingomonas sp.TJA 3-1，但不是Sphingomonas sp.ATCC 31555或其变种。菌株TJA 3-1的16S rDNA序列与专利公开文献CN101619300B中公开的韦兰胶合成菌鞘氨醇单胞菌TP-5的16S rDNA序列也有明显差别(如图4所示)，相似性仅为93.88％。
利用如上所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1生产韦兰胶的方法，步骤如下：
⑴菌种活化：菌种活化固体平板培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，pH 6.5；将保藏菌种鞘氨醇单胞菌TJA 3-1划线接种在此培养基的试管斜面上，30℃培养36-48h；
⑵种子制备：种子培养基(g/L)：蔗糖8-15，麦芽浸粉0.5-3，磷酸二氢铵0.5-1.5，硫酸镁0.1-1.0，pH 6-7.5；取活化好的试管斜面菌种，每支试管斜面中加入5mL无菌水，混合制成菌液，按3-5％的接种量接入摇瓶种子培养基中，27-33℃摇床振荡培养30-52h；
优化的种子培养基(g/L)：蔗糖10，麦芽浸粉2，磷酸二氢铵1，硫酸镁0.6，pH 6.5；按5％的接种量接入种子培养基中，30℃培养48h，使菌量达到108CFU/mL以上；逐级放大，进行一级种子罐和/或二级种子罐扩大培养，种子罐接种龄为30-48h，接种量为2-5％，通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，温度27-33℃；优化的接种龄为42h，接种量为3％，通气量0.3vvm，200r/min，罐压0.3kg/cm2，温度29℃；
⑶发酵生产：发酵培养基(g/L)：糖蜜20-30，蔗糖10-20，硝酸钠3-6，豆饼粉0.5-1，磷酸二氢钾0.5-2，硫酸镁0.1-1.0，pH 6-7.5；通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，温度27-33℃，发酵周期60-72h；优化的发酵培养基(g/L)：糖蜜20，蔗糖20，硝酸钠3.5，豆饼粉0.5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.2，pH 6.5。通气量1.0vvm，搅拌转速200r/min，罐压0.3kg/cm2，发酵0-36h温度29℃，36-68h温度32℃。
⑷发酵产物的提取：发酵液升温至60-75℃维持10-15min，降至室温后，向发酵液中加入等体积的体积浓度为70-90％的乙醇，压滤后50-55℃烘干，粉碎后得韦兰胶产物。
如上所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1能够应用在生产韦兰胶方面中。
实施例2
一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1，名称为TJA 3-1，分类名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为：CGMCC No.15057，保藏日期：2017年12月13日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
其中，所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1是从内蒙古翁牛特沙漠的沙化土壤中分离得到的。
相关步骤如下：
1)菌株的分离纯化：
从内蒙古翁牛特沙漠采集沙化土壤样品，取10g土样，加入灭菌后的生理盐水涡旋震荡，静置后取上清，用无菌生理盐水倍比稀释，取100uL样液涂布于筛选培养基(g/L：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，pH 6.5)表面。30℃培养3d，挑取产粘菌落，结合拉丝法初筛，得到多糖合成菌，平板划线纯化得到单菌落，保藏备用。
2)菌株的形态学和生理生化特征：
按照《常见细菌系统鉴定手册》的方法进行形态学和生理生化特征检测，菌株TJA3-1为革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.6-1.0um×1.2-2.5um，在活化培养基平板上形成黄色、质地黏稠的菌落，生长温度20-38℃，最适生长温度28℃，生长pH范围4.5-12，最适pH为6.0，NaCl耐受性范围0-0.3％，氧化酶、接触酶、硝酸盐还原和七叶苷水解为阳性，甲基红和V-P试验、淀粉水解、明胶水解和吲哚产生为阴性。
3)菌株16S rDNA的PCR扩增和系统进化分析：
取菌株TJA 3-1的发酵液5mL，用北京天根公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA为模板，用引物27F(5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR条件为：95℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃60s，30个循环；72℃10min。扩增得到的16S rDNA基因片段，送北京奥科公司测序。得到的16S rDNA基因片段长度为1383bp，将菌株TJA 3-1的16S rDNA测序结果与GenBank中核酸数据进行BLAST比对，得到与菌株TJA 3-1序列同源性最高的序列，与其同源性最高的3个菌种为Sphingomonas azotifigens H1，相似性为98.7％；Sphingomonas pituitosa NBRC102491，相似性为98.12％；Sphingomonas trueperi Je44-11，相似性为98.48％。与Sphingomonas sp.ATCC 31555的相似性为96.61％，与专利公开文献CN101619300B中公开的韦兰胶合成菌鞘氨醇单胞菌TP-5的相似性为93.88％。使用软件ClustalX1.8对所得到的核苷酸序列进行分析，得到序列间的相似值；利用软件MEGA 6.0计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树。
4)菌株合成多糖产物的分离纯化和结构检测：
菌株TJA 3-1的发酵液中加入5倍体积的去离子水，摇床振荡至完全混匀，于90℃加热20min，14000r/min离心30min除菌体，收集上清液，重复离心直至镜检无菌体，合并上清液，Sevag法除蛋白后，加入等3倍体积乙醇沉淀多糖。10000r/min离心10min，收集沉淀的多糖，放入截留分子量6000-8000透析袋中，流水透析过夜，去离子水透析24h，真空冷冻干燥，得多糖纯品。进行双缩脲反应和斐林试剂反应检测，均为阴性，说明样品的表面结构中无游离的半缩醛羟基和多肽的-CO-NH-结构。
取冻干的多糖纯品，超纯水溶解后，进行Sephacryl S-400过柱纯化，示差折光检测器示踪，收集主峰样液，用岛津LC-20A凝胶渗透色谱仪分析多糖样品的纯度和分子量，色谱柱为Agilent PL aquagel-OH MIXED 8um column，视差折光检测器；流动相使用ddH2O，流速1.0mL/min，柱温36℃，进样体积20uL。检测结果表明：样品在6.201min形成一个两侧对称的单峰(结果如图5所示)，根据窄分布葡聚糖分子量标准品的标准曲线，计算出多糖产物的重均分子量为5.3×106KDa，数均分子量为4.5×106KDa，聚合物分散指数PDI为1.18。
称取5mg多糖样品，加入2mol/L三氟乙酸1.5mL，120℃水解4h，水解后的样品置于旋转蒸发仪中干燥，完全蒸干后加入3mL甲醇40℃旋蒸干燥，重复三次。加入1mL超纯水溶解，进行PMP柱前衍生后，进行HPLC分析，具体条件为色谱柱Unitary C18(250mm×4.6mm×5um)，流动相为乙腈和0.05mol/L pH 6.8的磷酸缓冲液(V:V＝18:82)，流速1.0mL/min，柱温40℃，紫外检测波长为250nm，进样量为20uL。HPLC检测到15.171、20.152、24.826和35.243(图6)，与单糖标准品比对后，确定样品的单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖，根据单糖的标准曲线计算可知这四种单糖的比例为1:3:2:4。进行高碘酸氧化和Smith降解，结果表明葡萄糖和鼠李糖通过1-3糖苷键连接，鼠李糖和甘露糖位于多糖侧链，结果表明菌株TJA 3-1合成的多糖为韦兰胶。
5)菌株TJA 3-1合成韦兰胶的发酵和提取工艺：
将保藏菌种划线接种在试管斜面上，30℃培养48h。取活化好的试管斜面菌种，试管斜面中加入5mL无菌水，混合制成菌液，按3-5％的接种量接入装有100mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃摇床振荡培养42h。
按3-5％的接种量接入种子培养基中，30℃培养48h，使菌量达到108CFU/mL以上；逐级放大，进行一级种子罐和/或二级种子罐扩大培养，种子罐接种龄为30-48h，接种量为2-5％，通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，温度27-33℃.。
将种子液以3％的接种量接入发酵罐中，发酵培养基为(g/L)：糖蜜20，蔗糖20，硝酸钠3.5，豆饼粉0.5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.2，pH 6.5，发酵条件为通气量1.0vvm，搅拌转速200r/min，罐压0.3kg/cm2，0-36h的发酵温度为29℃，36-68h的发酵温度为32℃。发酵液利用Brookfield R/S Plus旋转流变仪检测，6r/min的剪切速率下，粘度达到10500mPa.s。发酵结束后，将发酵液升温至70℃维持10min，降至室温后，向发酵液中加入等体积的体积浓度为90％的乙醇，压滤后50℃烘干，粉碎后得韦兰胶产物，称重后韦兰胶的发酵产量为21g/L。
6)菌株TJA 3-1合成韦兰胶的发酵液耐温性能：
利用BrookfieldR/S Plus旋转流变仪检测菌株TJA 3-1合成韦兰胶的耐温性能，以二甲基硅油为介质，测定20-160℃温度范围内，剪切速率6r/min下的样品粘度，结果如图7所示，可以看出菌株TJA 3-1合成的韦兰胶的粘度几乎不随温度升高的影响，在160℃的温度条件下有良好的抗温性能。
菌株TJA 3-1的16S rDNA序列：
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津农学院
<120> 一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1及其生产韦兰胶的方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1383
<212> DNA/RNA
<213> 鞘氨醇单胞菌TJA 3-1的16S rDNA序列(Unknown)
<400> 1
gcggcgtgct accatgcagt cgaacgagat cttcggatct agtggcgcac gggtgcgtaa 60
cgcgtgggaa tctgccttgg ggttcggaat aactccccga aaggggtgct aataccggat 120
gatgtcgaaa gaccaaagat ttatcgccct gagatgagcc cgcgtaggat tagctagttg 180
gtgtggtaaa ggcgcaccaa ggcgacgatc cttagctggt ctgagaggat gatcagccac 240
actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattggacaa 300
tgggcgaaag cctgatccag caatgccgcg tgagtgatga aggccttagg gttgtaaagc 360
tcttttaccc gggaagataa tgactgtacc gggagaataa gccccggcta actccgtgcc 420
agcagccgcg gtaatacgga gggggctagc gttgttcgga attactgggc gtaaagcgca 480
cgtaggcggc tttgtaagtc agaggtgaaa gcctggagct caactccaga actgcctttg 540
agactgcatc gcttgaatcc aggagaggtg agtggaattc cgagtgtaga ggtgaaattc 600
gtagatattc ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctcac tggactggta ttgacgctga 660
ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga 720
tgataactag ctgtccgggc acttggtgct tgggtggcgc agctaacgca ttaagttatc 780
cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cctgcacaag 840
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgcagaac cttaccagcg tttgacatgg 900
taggacgact ggcagagatg cctttcttcc cttcggggac ctacacacag gtgctgcatg 960
gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg 1020
actttagtta ccatcattaa gttgggtact ttaaagtaac cgccggtgat aagccggagg 1080
aaggtgggga tgacgtcaag tcctcatggc ccttacgcgc tgggctacac acgtgctaca 1140
atgggcaagt acagtgggca gcattccccg cgagggtgag ctaatctcca aaacttgtct 1200
cagttcggat tgttctctgc aactcgagag catgaaggcg gaatcgctag taatcgcgga 1260
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccagg ccttgtacac accgcccgtc acaccatggg 1320
agttgggttc acccgaaggc gttgcgctaa ctcgtaagag aggcaggcga ccacgtgcag 1380
cgc 1383
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 引物27F(Unknown)
<400> 2
gagagtttga tcctggctca g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 引物1492R(Unknown)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (5)

1.一株韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1，其特征在于：名称为TJA 3-1，分类名称为Sphingomonas sp.，保藏编号为：CGMCC No.15057，保藏日期：2017年12月13日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1，其特征在于：所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1是从内蒙古翁牛特沙漠的沙化土壤中分离得到的。
3.根据权利要求1所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1，其特征在于：所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1的分类鉴定的特征为：革兰氏阴性杆菌，细胞大小为0.6-1.0um×1.2-2.5um，在活化培养基平板上形成黄色、质地黏稠的菌落，最适生长温度为28℃，最适生长pH为6.0，NaCl耐受性范围0-0.3％，氧化酶、接触酶、硝酸盐还原和七叶苷水解为阳性，甲基红和V-P试验、淀粉水解、明胶水解和吲哚产生为阴性；
所述鞘氨醇单胞菌TJA 3-1的16S rDNA序列为SEQ ID NO.1。
4.利用如权利要求1至3任一项所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1生产韦兰胶的方法，其特征在于：步骤如下：
⑴菌种活化：菌种活化固体平板培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨3，氯化钠0.5，牛肉膏1，酵母膏1，pH 6.5；将保藏菌种鞘氨醇单胞菌TJA 3-1划线接种在此培养基的试管斜面上，30℃培养36-48h；
⑵种子制备：种子培养基(g/L)：蔗糖8-15，麦芽浸粉0.5-3，磷酸二氢铵0.5-1.5，硫酸镁0.1-1.0，pH 6-7.5；取活化好的试管斜面菌种，每支试管斜面中加入5mL无菌水，混合制成菌液，按3-5％的接种量接入摇瓶种子培养基中，27-33℃摇床振荡培养30-52h；
按3-5％的接种量接入种子培养基中，30℃培养48h，使菌量达到108CFU/mL以上；逐级放大，进行一级种子罐和/或二级种子罐扩大培养，种子罐接种龄为30-48h，接种量为2-5％，通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，温度27-33℃；
⑶发酵生产：将种子液以3-5％的接种量接入发酵罐中，发酵培养基(g/L)：糖蜜20-30，蔗糖10-20，硝酸钠3-6，豆饼粉0.5-1，磷酸二氢钾0.5-2，硫酸镁0.1-1.0，pH 6-7.5；通气量0.2-1.0vvm，搅拌转速100-200r/min，罐压0.2-1.0kg/cm2，进行变温发酵，即：0-36h时发酵温度为29℃，36-68h时发酵温度为32℃；
⑷发酵产物的提取：发酵液升温至60-75℃维持10-15min，降至室温后，向发酵液中加入等体积的体积浓度为70-90％的乙醇，压滤后50-55℃烘干，粉碎后得韦兰胶产物。
5.如权利要求1至3任一项所述的韦兰胶高产菌株鞘氨醇单胞菌TJA 3-1在生产韦兰胶方面中的应用。
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