CN112094877A - 一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法,包含以下操作:取已培养为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液,置于发酵培养基中,接种量按照体积比为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液:发酵培养基=1:20,于30℃培养48h,然后向培养基中添加8mmol/L氯化钠继续培养至72h,即得。本发明采用氯化钠胁迫激发鞘氨醇单胞菌自身保护机制从而提高威兰胶产量,直接将蔗糖作为发酵底物,无需任何前处理,把低价值糖转化为高价值多糖,提高糖转化率、简化操作、降低生产成本、提高产值。

Description

一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高生产威兰胶产量的方法,特别涉及一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法。
背景技术
细菌的生长、繁殖和代谢需要适宜的环境,包括营养因子、酸碱度、温度、溶氧量和渗透压等,当外界环境发生改变时,细胞会感知到这种变化,并采取一定的措施。鞘氨醇单胞菌所产生的威兰胶实际上也是一种保护机制,当鞘氨醇单胞菌感知到外界环境对自身产生威胁的时候,大量威兰胶会合成并释放于细胞外,在溶液中呈现粘性的威兰胶会包裹在细胞周围,形成生物膜,最大程度地保护菌体细胞。环境胁迫剂的加入,会引起细菌生存环境的改变,为了防御而大量分泌的胞外多糖则可使得威兰胶产量增加。
目前,提高威兰胶产量的方式大多集中在对发酵菌株的选育改造以及优化发酵培养基和发酵条件方面,现有技术中对于发酵菌株的选育的专利有:CN105505816A、CN104845896A;对于发酵菌株改造的专利有:CN102618468A、CN110144318A;对于优化发酵培养基和发酵条件的有:CN106906163A、CN101275154、CN103614432A。上述现有技术中大多以给菌体提供适宜环境来达到提产目的,存在糖转化率低、操作复杂,并且均以葡萄糖或其它低价值多糖水解物为底物,产生威兰胶的生产成本高、产值低。因此,目前亟需一种能够提高威兰胶糖转化率、简化操作、降低生产成本、提高产值的方法。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明针对上述技术问题,提供一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法,旨在得到一种能够有效提高威兰胶产量、简化操作、降低生产成本的方法。
为实现上述目的,本发明提供的技术方案如下:
一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法,包含以下操作:取已培养为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液,置于发酵培养基中,接种量按照体积比为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液:发酵培养基=1:20,于摇床中培养48h,然后向发酵培养基中添加8mmol/L氯化钠继续培养至72h,即得。
一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法,更为详细的操作步骤为,取5mL已培养为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液,置于装有100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中,接种量按照体积比为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液:发酵培养基=1:20,于30℃摇床中200rmp培养48h,然后向培养基中添加8mmol/L氯化钠继续培养至72h,即得。
优选地,所述的发酵培养基为每1L培养基中蔗糖60.0g、牛肉膏3.0g、K2HPO4 6.0g、KH2PO4 2.0g、硫酸镁0.1g,pH值7.0,由高压灭菌锅于115℃下灭菌20min所得。
优选地,所述的含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液为将鞘氨醇单胞菌接种于含有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中,于30℃摇床中200rpm培养16-18h至对数生长期,作为种子液。
优选地,所述的种子培养基为每1L培养基中含蔗糖40.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g,pH值7.0(添加3.0g/L琼脂的固体培养基),由高压灭菌锅于115℃下灭菌20min所得。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明方法采用氯化钠胁迫激发鞘氨醇单胞菌自身保护机制从而提高威兰胶产量,直接将蔗糖作为发酵底物,无需任何前处理,把低价值糖转化为高价值多糖,提高糖转化率、简化操作、降低生产成本、提高产值。
附图说明
图1是本发明鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp.生长曲线。
图2是在不同发酵时期添加不同浓度氯化钠胁迫对威兰胶产量及菌体浓度的影响。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、实际若无特殊说明,皆为市售所得。实施例中采用的鞘氨醇单胞菌为市售所得。
实施例中采用的种子培养基(g/L):蔗糖40.0、牛肉膏3.0、氯化钠5.0,pH值7.0(添加3.0g/L琼脂的固体培养基);
发酵培养基(g/L):蔗糖60.0、牛肉膏3.0、K2HPO4 6.0、KH2PO4 2.0、硫酸镁0.1,pH值7.0;
培养基均由高压灭菌锅于115℃下灭菌20min。
实施例1
菌种活化
将市购所得鞘氨醇单胞菌菌株接种于含有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中,于30℃摇床中200rpm培养16-18h至对数生长期,作为种子液,备用。
实施例2
摇瓶培养
取5mL实施例1备用的对数生长期的种子液,置于装有100mL发酵培养基的500mL锥形瓶中(接种量1:20v/v,即按照体积比为对数生长期的种子液:发酵培养基=1:20),于30℃摇床中200rmp培养72h。
培养期间,在接种后培养的72h的时间段内每隔4-8h测定菌体浓度,测定方法为分别取于30℃摇床中200rmp培养相应时间的发酵液l ml,加入24mL去离子水,充分震荡摇匀,使稀释至25倍,于600nm处测定紫外吸光度,测定结果如图1所示,即为鞘氨醇单胞菌生长曲线。
实施例3
氯化钠的添加以及添加后威兰胶的产量:
氯化钠的添加
准确称取氯化钠5.85g于烧杯中,加入少许无菌去离子水充分搅拌溶解,将溶液移入100ml容量瓶中用无菌去离子水定容至100ml,充分混匀后备用。使用针管吸取上述备用的稀释后的氯化钠溶液0.2mL、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分别向实施例2摇瓶培养16h、32h、48h、64h不同发酵时期的发酵培养基中加入,充分震荡混匀,氯化钠终浓度为2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8mmol/L、10mmol/L,分别继续培养至72h,再分别测定威兰胶的产量。也即向实施例2摇瓶培养16h的发酵培养基中加入0.2mL稀释后的氯化钠溶液,氯化钠终浓度为2mmol/L,继续培养至72h,然后测定威兰胶的产量;另一个摇瓶培养16h的发酵培养基中加入0.4mL稀释后的氯化钠溶液,充分震荡混匀氯化钠终浓度为4mmol/L,继续培养至72h,然后测定威兰胶的产量;其余以此类推。
威兰胶产量测定
取10mL上述添加氯化钠后培养至72h所得发酵液于50mL离心管中,置于沸水浴灭活30min后取出,加入三倍体积95%乙醇溶液进行醇沉,8h后6500rmp 4℃离心10min,弃去上清液,加入适量95%乙醇溶液洗涤沉淀,再次离心,重复洗涤两到三次,沉淀于70℃烘箱烘干至恒重,测定各发酵条件下所得威兰胶产量,结果如图2所示。
图1t0-t1为菌体生长迟缓期,t1-t2为细菌的对数生长期,t2-t3为菌体生长稳定期,图2中(a)、(b)、(c)、(d)的添加时间分别为对数生长期、产胶初期、产胶中期和产胶后期。
图2中(a)为接种后16h加入氯化钠对威兰胶终产量及菌体浓度的影响;(b)为接种后32h加入氯化钠对威兰胶终产量及菌体浓度的影响;(c)为接种后48h加入氯化钠对威兰胶终产量及菌体浓度的影响;(d)为接种后64h加入氯化钠对威兰胶终产量及菌体浓度的影响;从图2可以看出威兰胶产量与菌体浓度之间没有确定关系,在接种48h时添加8mmol/L氯化钠使得威兰胶产量达到最高,为28.12±0.25g/L。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式,并且很显然,根据上述教导,可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用,从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (4)

1.一种提高鞘氨醇单胞菌生产威兰胶产量的方法,其特征在于,包含以下操作:取已培养为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液,置于发酵培养基中,接种量按照体积比为含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液:发酵培养基=1:20,于摇床中培养48h,然后向发酵培养基中添加8mmol/L氯化钠继续培养至72h,即得。
2.根据权利要求1所述方法,其特征在于:所述的发酵培养基为每1L培养基中蔗糖60.0g、牛肉膏3.0g、K2HPO4 6.0g、KH2PO4 2.0g、硫酸镁0.1g,pH值7.0,由高压灭菌锅于115℃下灭菌20min所得。
3.根据权利要求1所述方法,其特征在于:所述的含鞘氨醇单胞菌对数生长期的种子液为将鞘氨醇单胞菌接种于含有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中,于30℃摇床中200rpm培养至对数生长期,作为种子液。
4.根据权利要求1所述方法,其特征在于:所述的种子培养基为每1L培养基中含蔗糖40.0g、牛肉膏3.0g、氯化钠5.0g,pH值7.0(添加3.0g/L琼脂的固体培养基),由高压灭菌锅于115℃下灭菌20min所得。
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