CN108841879A - 一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法 - Google Patents

一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法 Download PDF

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乔长晟
陈畅
郭鹏
赵廷彬
高翠
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Abstract

本发明涉及一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：种子培养：将出芽短梗霉抱子悬液接入种子培养基中培养，制得种子液；发酵培养：将种子液接入发酵培养基中，发酵生产聚苹果酸；发酵培养基中含有大豆糖蜜。本发明利用大豆糖蜜对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以有效提高聚苹果酸的产量，还能简化生产工艺，降低生产成本。

Description

一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法。
背景技术
出芽短梗霉为半知菌类短梗霉属，又名“茁霉”、“芽生侧茁霉”、“出芽短梗霉”及“短梗霉”，是一种和酵母有密切联系的、具有酵母型和菌丝型形态的多形真菌。利用出芽短梗霉进行发酵能够得到聚苹果酸、抗菌素、酶、胞外多聚糖及单细胞蛋白等产物。聚苹果酸是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物，特殊的立体结构使其具有生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性等优良性质。其次，它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、可化学衍生性。聚苹果酸的这些独特的性质，使其在医药、化妆品、环境治理以及香精香料等许多方面有着广阔的应用前景。生物法合成聚苹果酸和化学合成法相比，具有成本低、反应条件温和、分子量相对较高等优点，因此生物法合成聚苹果酸越来越吸引人们的注意。
葡萄糖（GLucose）是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。植物可通过光合作用产生葡萄糖。在生物发酵行业被当作最主要的C源有着极其广泛的应用。在当前生产的聚苹果酸生物发酵培养基中就仍采用单纯的葡萄糖作为C源，但生产成本大，为了降低生产成本，提高效益，需要利用价格低廉的C源对葡萄糖进行替换，但目前还未找到替换葡萄糖的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法。本发明利用大豆糖蜜对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以有效提高聚苹果酸的产量，还能简化生产工艺，降低生产成本。
为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
（1）种子培养：将出芽短梗霉抱子悬液接入种子培养基中培养，制得种子液；
（2）发酵培养：将种子液接入发酵培养基中，发酵生产聚苹果酸；所述发酵培养基中含有大豆糖蜜。
进一步地，步骤（1）中，将出芽短梗霉菌株活化2—3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液。
进一步地，步骤（1）中，按照5%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
进一步地，步骤（2）中，接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养。
进一步地，步骤（2）中，发酵培养条件为初始转速300r/min，通风比1：1—1：3，罐压在0.02—0.08MPa，0-40h设定培养温度为25-35℃，以后调节温度为20-30℃，pH控制在5.9-6.1，发酵周期为144h。
进一步地，步骤（2）中，所述发酵培养基为蛋白胨30—45g/L、KH2PO4 0.1—0.5g/L、NaNO3 1—3g/L、MgSO4.7H2O 0.1—0.5g/L、KCl 0.3—0.6g/L、MnSO4 0.03—0.06g/L、CaCO310—20g/L，大豆糖蜜200-333g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
进一步地，步骤（1）中，制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。
进一步地，步骤（1）中，所述种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
进一步地，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
进一步地，利用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定。
大豆糖蜜是生产大豆浓缩蛋白过程中，醇溶部分物质，经过浓缩处理后的产品，因颜色和流动性类似蜂蜜，所以命名为大豆糖蜜，它含有丰富的葡萄糖和蔗糖以及少量的蛋白，而微生物在生长过程中需要糖类物质和蛋白去合成自身所需的物质。
同时在现有的聚苹果酸的发酵生产过程中，葡萄糖做C源时浓度过高则会较多的合成多糖而合成聚苹果酸的量则会减少，浓度过低又不利于菌体的生长。
我们在实验中发现：利用大豆糖蜜对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以提高聚苹果酸的产量还能简化生产工艺，降低生产成本。同时也证实了出芽短梗霉对含复合糖类的残渣物也有很好的利用效率，对于后续一些利用葡萄糖效果不好或成本过高的菌种，大豆糖蜜可以作为一种很好的替代品。其次，通过对菌体的镜检，发现以大豆糖蜜做C源下罐时的菌体细胞更圆润，初步确定大豆糖蜜中含有对菌体有一定的保护作用的物质。基于这些特点，可以证明大豆糖蜜是葡萄糖最好的替代品之一。1.它能够保证C源总量不变的情况下降低葡萄糖的组分所占比例，减弱多糖的合成。2.相对于葡萄糖单一的能量供给，它含有更丰富的能量物质。这两点原因是它能够提高产量的支撑。
有益效果
本发明利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，利用大豆糖蜜对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以提高聚苹果酸的产量还能简化生产工艺，降低生产成本。
本发明同时也证实了出芽短梗霉对含复合糖类的残渣物也有很好的利用效率，对于后续一些利用葡萄糖效果不好或成本过高的菌种，大豆糖蜜可以作为一种很好的替代品。
本发明通过对菌体的镜检，发现以大豆糖蜜做C源下罐时的菌体细胞更圆润，初步确定大豆糖蜜中含有对菌体有一定的保护作用的物质。
本发明利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，在发酵培养中，不用调节发酵培养基的pH，使聚苹果酸的生产过程更加方便和简单。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，于25℃培养4天，如此活化3次，制备成熟的活化后的斜面种子，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化2h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：1.5，罐压在0.02MPa，0-40h设定培养温度为30℃，以后调节温度为25℃，pH控制在5.9，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨35g/L、KH2PO4 0.1g/L、NaNO3 2g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、KCl0.5g/L、MnSO4 0.05g/L、CaCO3 20g/L，大豆糖蜜200g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为38g/L，节约成本约12.1%。
实施例2
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，于25℃培养4天，如此活化3次，制备成熟的活化后的斜面种子，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：1.5，罐压在0.02MPa，0-40h设定培养温度为30℃，以后调节温度为25℃，pH控制在5.9，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨35g/L、KH2PO4 0.1g/L、NaNO3 2g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、KCl0.5g/L、MnSO4 0.05g/L、CaCO3 20g/L，大豆糖蜜286g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为46g/L，节约成本约17.3%。
实施例3
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，于25℃培养4天，如此活化3次，制备成熟的活化后的斜面种子，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化2—3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：1.5，罐压在0.02MPa，0-40h设定培养温度为30℃，以后调节温度为25℃，pH控制在5.9，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨35g/L、KH2PO4 0.1g/L、NaNO3 2g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、KCl0.5g/L、MnSO4 0.05g/L、CaCO3 20g/L，大豆糖蜜333g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为41g/L，节约成本约18.1%。
对比例1
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化2h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：1.5，罐压在0.02MPa，0-40h设定培养温度为30℃，以后调节温度为25℃，pH控制在5.9，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨35g/L、KH2PO4 0.1g/L、NaNO3 2g/L、MgSO4.7H2O 0.3g/L、KCl0.5g/L、MnSO4 0.05g/L、CaCO3 20g/L，葡萄糖100g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为32g/L。
从实施例1、实施例2、实施例3与对比例1的对比中，可以发现利用大豆糖蜜为C源替代葡萄糖生产聚苹果酸方法可行，其聚苹果酸不但能够与以葡萄糖为C源产量相当而且还有部分产量高于葡萄糖，其中以286g/L效果尤为明显，节约成本约为17.3%。根据上述的对比，可以发现虽然本申请中大豆糖蜜加入量均大于对比例1中的葡萄糖的加入量，但是加多少是大豆糖蜜按葡萄糖和蔗糖的含量来折算的，为了保证与对比例1中葡萄糖和蔗糖大致的情况下，本申请中的大豆糖蜜加的比较多，但是在如此大的加入量的情况下，本申请的生产成本依旧很低，提高了企业的经济效益。
根据上述的对比，可以发现虽然本申请中大豆糖蜜加入量均大于对比例1中的葡萄糖的加入量，但是加多少是大豆糖蜜按葡萄糖和蔗糖的含量来折算的，为了保证与对比例1中葡萄糖和蔗糖大致的情况下，本申请中的大豆糖蜜加的比较多，但是在如此大的加入量的情况下，本申请的生产成本依旧很低，提高了企业的经济效益。
实施例4
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，于25℃培养4天，如此活化3次，制备成熟的活化后的斜面种子，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：1，罐压在0.08MPa，0-40h设定培养温度为25℃，以后调节温度为20℃，pH控制在5.9，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨30g/L、KH2PO4 0.5g/L、NaNO31g/L、MgSO4.7H2O 0.5g/L、KCl0.6g/L、MnSO4 0.06g/L、CaCO3 10g/L，大豆糖蜜300g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为38g/L。
实施例5
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，于25℃培养4天，如此活化3次，制备成熟的活化后的斜面种子，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：3，罐压在0.06MPa，0-40h设定培养温度为35℃，以后调节温度为25℃，pH控制在6.1，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨45g/L、KH2PO4 0.1g/L、NaNO33g/L、MgSO4.7H2O 0.1g/L、KCl0.3g/L、MnSO4 0.03g/L、CaCO3 20g/L，大豆糖蜜290g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为39g/L
实施例6
一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，包括以下步骤：
菌种活化：将出芽短梗霉的原始菌株接种在斜面培养基上，于25℃培养4天，如此活化3次，制备成熟的活化后的斜面种子，出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan），该菌株现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
（1）种子培养：
将出芽短梗霉菌株活化3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液，按照10%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L；
种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
（2）发酵罐发酵：
接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，初始转速300r/min，通风比1：3，罐压在0.06MPa，0-40h设定培养温度为35℃，以后调节温度为25℃，pH控制在6.1，发酵周期为144h。发酵液无需调节pH。
发酵培养基为蛋白胨40g/L、KH2PO4 0.3g/L、NaNO32g/L、MgSO4.7H2O 0.4g/L、KCl0.5g/L、MnSO4 0.05g/L、CaCO3 15g/L，大豆糖蜜310g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min；
聚苹果酸产量测定：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的甲醇，醇沉析出聚苹果酸，然后再复溶于蒸馏水且定容于10mL后，加等体积的2M的硫酸水解处理得样品，通过高效液相检测得其聚苹果酸产量为40g/L。

Claims (10)

1.一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）种子培养：将出芽短梗霉抱子悬液接入种子培养基中培养，制得种子液；
（2）发酵培养：将种子液接入发酵培养基中，发酵生产聚苹果酸；所述发酵培养基中含有大豆糖蜜。
2.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，将出芽短梗霉菌株活化2—3h，用无菌生理盐水洗下斜面菌株的抱子，制备抱子悬液。
3.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，按照5%的接种量将抱子悬液转接到含有100mL种子培养基的500mL挡板瓶中进行培养，培养温度25℃，摇床转速为200r/min，培养时间为40h。
4.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，接种口在火焰保护下，将所得种子液以10%v/v的量接于装有3L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养。
5.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，发酵培养条件为初始转速300r/min，通风比1：1—1：3，罐压在0.02—0.08MPa，0-40h设定培养温度为25-35℃，以后调节温度为20-30℃，pH控制在5.9-6.1，发酵周期为144h。
6.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述发酵培养基为蛋白胨30—45g/L、KH2PO4 0.1—0.5g/L、NaNO3 1—3g/L、MgSO4.7H2O 0.1—0.5g/L、KCl 0.3—0.6g/L、MnSO4 0.03—0.06g/L、CaCO3 10—20g/L，大豆糖蜜200-333g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
7.根据权利要求2所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，制备抱子悬液时，斜面培养基组成为土豆200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L。
8.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述种子培养基组成为：葡萄糖60 g/L，丁二酸2g/L，硫酸铵1 g/L，碳酸钾 0.4g/L，KH2PO4 0.1g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，酵母膏3g/L，玉米浆1mL，CaCO3 20g/L，余量为水；在温度121℃下灭菌20-30min。
9.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征是：出芽短梗霉(Aureobasidium Pullulan）现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No.3337。
10.根据权利要求1所述的一种利用出芽短梗霉生产聚苹果酸的方法，其特征是：利用高效液相色谱法进行聚苹果酸的含量测定。
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