JPH07308188A - Ｌ−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法 - Google Patents

Ｌ−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法

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JPH07308188A
JPH07308188A JP6102708A JP10270894A JPH07308188A JP H07308188 A JPH07308188 A JP H07308188A JP 6102708 A JP6102708 A JP 6102708A JP 10270894 A JP10270894 A JP 10270894A JP H07308188 A JPH07308188 A JP H07308188A
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Toshiaki Nakajima
敏明 中島
Tadaatsu Nakahara
忠篤 中原
Koichi Uchida
康一 内田
Hideaki Yugawa
英明 湯川
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 オウレオバセディウム属に属するＬ−リンゴ
酸重合物産生微生物を培養するにあたり、適当量の有機
窒素源及びマグネシウムイオンを添加した培地で培養す
ることを特徴とするＬ−リンゴ酸重合物産生微生物の培
養法。 【効果】 従来の培養法に比べ高生産性のＬ−リンゴ酸
産生菌体を得ることができ、高収量でＬ−リンゴ酸重合
物が得られる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、休止菌体法によりＬ−
リンゴ酸重合物（poly-L-Malic acid 、以下「ＰＭＬ
Ａ」と略称することがある。）を高収率に製造するため
のＬ−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法に関する。こ
こでいう休止菌体法とは、培養により得られた菌体を回
収し、菌体が増殖し得ない組成の水溶液に作用させるこ
とにより、休止状態の菌体をそのまま酵素触媒として用
いる方法をいう。
【０００２】ＰＭＬＡは、生体内分解吸収性高分子化合
物として、生体吸収性縫合糸、骨接合用材料、人工腱、
人工血管及びドラッグデリバリーの高分子キャリアー等
として、医薬及び医療の分野での用途が多いに期待され
ている。
【０００３】
【従来の技術】ＰＭＬＡは、リンゴ酸モノベンジル又は
モノメチルエステルを原料とする化学合成法〔レポート
・オブ・ファクルティー・エンジニアリング（Reports
of theFaculty Engineering、Tottori University）、
８、 124 (1977) 〕、ベンジルマロラクトネートを開環
重合させる化学合成法〔米国特許第４２６５２４７号明
細書〕、直接熱縮合法〔高分子論文集、44、701 (198
7)〕等の化学合成法による製造法が報告されている。
【０００４】また、微生物を用いたＰＭＬＡの製造で
は、ペニシリウム・サイクロピウム（Penicillium cycl
opium ）を用いた固体培養による製造例〔アグリカルチ
ュアル・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural
Biological Chemistry ）、33、 459 (1969）〕、オウ
レオバセディウム（Aureobasidium ）属菌を用いた発酵
法（特開平４−２１１３８５）及び酵素法（特開平４−
３４１１８９）による製造例等が知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、化学合成法による製造では原料が高価
であるばかりか、多数の工程を必要とするため収率が低
いという欠点を有している。一方、前記したペニシリウ
ム・サイクロピウムを用いた固体培養法による製造では
収率が低く、また精製に多工程を要するため、実際的な
方法とは言い難い。
【０００６】また、オウレオバセディウム属菌を用いた
発酵法及び酵素法による製造では、工業的製造を行う上
ではいまだ収量が十分ではなく、より高収量で安価に製
造する方法の開発が望まれていた。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
について鋭意検討し、オウレオバセディウム属に属する
ＰＭＬＡ産生菌の培養培地にマグネシウムイオン及びペ
プトン、コーンスティープリカー等の有機窒素源を添加
することにより、ＰＭＬＡを高収量に産生しうる微生物
菌体を得る方法を見出し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、オウレオバセディウ
ム属に属するＬ−リンゴ酸重合物産生微生物を培養する
にあたり、０．１〜２重量％の有機窒素源及び０．２〜
３０ｍＭのマグネシウムイオンを添加した培地で培養す
ることを特徴とするＬ−リンゴ酸重合物産生微生物の培
養法を提供するものである。以下に、本発明のＬ−リン
ゴ酸重合物産生微生物の培養法について更に詳細に述べ
る。
【０００９】オウレオバセディウム属に属する微生物に
は、従来プルラリア（Pullularia）属に分類され、後に
オウレオバセディウム属に再分類された微生物も含ま
れ、総括的に黒色酵母（black yeast ）とも言われてい
る〔マイコパソロジア・マイコロジア・アプリカータ
（Mycopathologia et Mycologia Applicata ）、12、1
(1959)、同17、1 (1962)〕。従って、ＰＭＬＡを産生し
得る黒色酵母であれば、これらをも本発明の範囲に含む
ものである。そのような微生物としては、例えば、以下
のものが挙げられる。
【００１０】オウレオバセディウム・プルランス（Aure
obasidium pullulans ）ＩＦＯ ４４６４、同ＩＦＯ
４４６５、同ＩＦＯ ４８７５、同ＩＦＯ ７７５７、
同ＡＴＣＣ ７３０５、オウレオバセディウム・マンソ
ニー（Aureobasidium mansonii）ＩＦＯ ６４２１、同
ＩＦＯ ８１９４、同ＩＦＯ ９２３３、同ＡＴＣＣ１
４２４９、オウレオバセディウム・ミクロステイクタム
（Aureobasidium microstictum）ＩＦＯ ３２０６６、
同ＩＦＯ ３２０６７、同ＩＦＯ ３２０６８、同ＩＦ
Ｏ ３２０６９、オウレオバセディウムｓｐ．Ａ−９１
株、及びこれらの変異株。
【００１１】上記菌株の中で、オウレオバセディウムｓ
ｐ．Ａ−９１株は、工業技術院生命工学工業技術研究所
に微生物受託番号 微工研菌寄第１１９６６号（ＦＥＲ
ＭＰ−１１９６６）として寄託されている。上記のオウ
レオバセディウム属菌を培養するには、炭素源、窒素
源、無機塩等に加えて適当量の有機窒素源及びマグネシ
ウムイオンの栄養分を含む培地を用いて行うことができ
る。
【００１２】培地の炭素源としては、例えば、グルコー
ス、フルクトース、シュークロース等の糖質原料、それ
らの中で特にグルコースが好適に用いられ、その添加濃
度は１〜３０重量％、好ましくは１〜２０重量％が適当
である。窒素源としては、微生物の培養に際して通常使
用される無機物質、例えば、アンモニア、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、コハク酸
アンモニウムなどの有機酸アンモニウム塩、尿素等を単
独もしくは混合して用いることができる。
【００１３】また、無機塩としては、例えば、リン酸一
水素カリウム、リン酸二水素カリウム等を用いることが
でき、その添加濃度は、０．００１〜５重量％、好まし
くは０．０１〜１重量％が適当である。有機窒素源とし
ては、例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、
ペプトン、肉エキス、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粕
又はトリプトン等、好ましくは、コーンスティープリカ
ー又はペプトン等を用いることができ、その添加濃度
は、０．１〜２重量％、好ましくは０．１〜１重量％が
適当である。
【００１４】マグネシウムイオンはマグネシウム塩とし
て添加することができ、例えば、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム又はシュウ酸マ
グネシウム等、好ましくは、塩化マグネシウムまたは硫
酸マグネシウム等を挙げることができ、その添加濃度
は、マグネシウムイオンの濃度が０．２〜３０ｍＭ、好
ましくは０．２〜５ｍＭとなるように添加するのが適当
である。
【００１５】この他に菌の生育に必要であれば、各種ビ
タミン等の栄養素を培地に添加し用いることができる。
培養は振とう、通気撹拌等の好気的条件下で行われ、培
養温度は一般に２０〜４０℃、好ましくは２２〜３５℃
が好適である。培養ｐＨは、通常２〜１０、好ましくは
３〜９、更に好ましくは３〜７が適当である。
【００１６】本発明の培養方法により得られた菌体を用
いＰＭＬＡを製造する場合、上記のように培養して得ら
れた培養物から菌体を集め、水や適当な緩衝液で洗浄し
たのち、そのまま使用することができる。あるいは該菌
体をそれ自体既知の方法で固定化し、固定化物として使
用することができる。微生物菌体の固定化法としては、
例えば、アクリルアミド等の重合体モノマーを用いる方
法、アルギン酸塩やカラギーナン等の適当な担体を用い
て不溶化させる方法等が挙げられる。
【００１７】かくして得られる菌体又はその固定化物
を、少なくとも糖質原料及び鉄イオンを含有し菌体増殖
必須成分の少なくとも一つの成分を含有しない水溶液
（以下これを「水性反応液」と略称することがある）に
作用させることにより、該水溶液中にＬ−リンゴ酸重合
物を生成蓄積せしめることができる。該水性反応液は、
糖質原料及び鉄イオンを含有し、菌体増殖必須成分であ
る窒素源、リン酸、ビタミン等のうち少なくとも一つの
成分が欠如し、実質的に菌体が増殖し得ない水溶液であ
れば特に制限はなく、通常、糖質原料及び鉄イオンを含
有する水又はリン酸若しくはトリス塩酸等の緩衝液であ
ることができる。
【００１８】水性反応液中に添加される糖質原料として
は、本発明に使用する微生物が資化するものであれば特
に制限されるものではなく、例えば、グルコース、フル
クトース、シュークロース、マルトース等を挙げること
ができ、それらの中でもグルコースが好適に用いられ
る。その添加濃度は、特に制限はないが、一般には０．
１〜３０重量％、好ましくは０．２〜１５重量％の範囲
内が適当である。
【００１９】水性反応液中に添加される鉄イオンとして
は、通常使用される無機あるいは有機塩、例えば、硫酸
鉄、塩化鉄、硝酸鉄、クエン酸鉄、シュウ酸鉄、フマル
酸鉄等を用いることができる。その添加濃度は、特に制
限はないが、一般には０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは
０．１〜３ｍＭの範囲内が適当である。上記した休止菌
体反応は、一般的に約２０〜５０℃、好ましくは約２５
〜４０℃の温度で、通常約１０〜１７０時間行う。ま
た、反応液のｐＨは、通常２〜１０、好ましくは３〜
９、更に好ましくは３〜７が適当である。
【００２０】以上に述べた休止菌体法により反応液中に
生成蓄積されたＰＭＬＡの反応液からの採取は、それ自
体既知の通常用いられる分離・精製法に従い、例えば、
アセトン、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール
またはメチルエチルケトン等の有機溶媒沈澱法、イオン
交換樹脂処理法、沈澱法等を適宜組み合わせて行うこと
ができる。
【００２１】以上に述べた方法で製造されるＰＭＬＡの
物理学的性質は、以下の通りである。 （１）ＧＰＣ法により測定した分子量は、約２，０００
〜５０，０００の範囲内である。 （２）１Ｎ硫酸溶液による加水分解処理により、Ｌ−リ
ンゴ酸のみが生成する。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、従来の培養法に比べ高
生産性のＰＭＬＡ産生菌体を得ることができ、高収量で
ＰＭＬＡを得ることができる。
【００２３】
【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に具体的に
説明する。しかしながら、下記の実施例は、本発明につ
いて具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであ
り、これによって本発明はなんら限定されるものではな
い。
【００２４】実施例１ 第１表に示す各濃度のマグネシウムイオンを添加（Ｍｇ
ＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ添加）した培地（グルコース ８％、
ＮＨ4 Ｃｌ ０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、Ｚ
ｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５ｐｐｍ、Ｋ2 ＣＯ3 ０．０４
％及び酵母エキス ０．０２％を含む水溶液）５０ｍｌ
を５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、滅菌（１２１
℃、１５分間）した。培養は、該培地に乾熱滅菌した炭
酸カルシウム１ｇを添加後、オウレオバセディウムｓ
ｐ．Ａ−９１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６６）を植菌し、
２５℃にて３日間振とう培養を行い、これを前培養物と
した。本培養は、上記培地２００ｍｌを１０００ｍｌ容
三角フラスコに分注、滅菌（１２１℃、１５分間）した
後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム６ｇを添加後、前培養
物の５ｍｌを添加して２５℃にて３日間振とう培養を行
った。培養終了後、培養物の580nm における吸光度を測
定し菌体量とした。その結果を第１表に示す。
【００２５】
【表１】 第１表 マグネシウムイオン濃度 菌体量 （ｍＭ） （580nm における吸光度) ０．１ ３ ５ ２５ １５ ２４ ３０ ２４
【００２６】上記培養物を遠心分離（８, ０００rpm 、
１５分間、室温）し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にて１度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液（グルコース ８％、硫酸
第一鉄 ０．５ｍＭ、１００ｍＭリン酸緩衝液）に懸濁
後、菌体濃度を調整（580nm における吸光度＝３０）
し、その懸濁液１０ｍｌを、炭酸カルシウム０．３ｇと
ともに５０ｍｌ容三角フラスコに分注して、３０℃にて
２４時間反応させた。
【００２７】反応終了後、該反応物から遠心分離（８,
０００rpm 、１５分間、室温）により除菌した上清１ｍ
ｌに２Ｎ Ｈ2 ＳＯ4 を１ｍｌを添加し、該液を１００
℃で５時間加水分解処理を行った。ＰＭＬＡの生成量
は、該処理物を高速液体クロマトグラフィー（島津製Ｌ
Ｃ−５Ａ型）により有機酸の分析を行い〔カラム：ＨＰ
Ｘ−８７Ｈ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）、カラム温度：６０℃、
移動相：０．０１Ｍ Ｈ 2 ＳＯ4 、流速：０．７ｍｌ／
分、検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）〕リンゴ酸量として定
量を行った。
【００２８】その結果を第２表に示した。尚、加水分解
処理前の反応液上清中の遊離のリンゴ酸を同様に高速液
体クロマトグラフィーにより分析した結果、リンゴ酸に
相当するピークは検出されなかった。これより加水分解
により生成するリンゴ酸はすべてＰＭＬＡ由来であるこ
とが確認された。
【００２９】
【表２】 第２表 マグネシウムイオン濃度 ＰＭＬＡ量 （ｍＭ） （ｍｇ／ｍｌ） ０．１ ４．８ ５ ８．３ １５ ８．２ ３０ ８．３
【００３０】実施例２ 第３表に示す各有機窒素源１％を添加した培地（グルコ
ース ８％、ＮＨ4 Ｃｌ ０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4
０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１％、ＺｎＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５ｐｐｍ及びＫ2 ＣＯ3 ０．０４％
を含む水溶液）５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、滅菌（１２１℃、１５分間）した。培養は、該
培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウム１ｇを添加後、オウ
レオバセディウムｓｐ．Ａ−９１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１
９６６）を植菌し、２５℃にて３日間振とう培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は、上記培地１００
ｍｌを１０００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌（１２
１℃、１５分間）した後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム
３ｇを添加後、前培養物の２０ｍｌを添加して２５℃に
て３日間振とう培養を行った。培養終了後、培養物の58
0nm における吸光度を測定し菌体量とした。その結果を
第３表に示す。
【００３１】
【表３】 第３表 有機窒素源 菌体量 （各１％） （580nm における吸光度) 酵母エキス ２０ カザミノ酸 ８ コーンスティープリカー ２３ ペプトン ２８
【００３２】上記培養物を遠心分離（８, ０００rpm 、
１５分間、室温）し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にて１度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液（グルコース ８％、硫酸
第一鉄 ０．５ｍＭ、１００ｍＭリン酸緩衝液）に懸濁
後、菌体濃度を調整（580nm における吸光度＝３０）
し、その懸濁液５０ｍｌを、炭酸カルシウム１．５ｇと
ともに３００ｍｌ容三角フラスコに分注して、３０℃に
て３日間反応させた。反応終了後、該反応物を実施例１
と同様に加水分解処理を行い、生成ＰＭＬＡ量をリンゴ
酸量として定量を行った。結果は第４表に示した。
【００３３】
【表４】 第４表 有機窒素源 ＰＭＬＡ量 （各１％） （ｍｇ／ｍｌ） 酵母エキス １４ カザミノ酸 ８ コーンスティープリカー ２８ ペプトン ３２
【００３４】実施例３ 第５表に示す各濃度のペプトンを添加した培地（グルコ
ース ８％、ＮＨ4 Ｃｌ ０．２％、ＫＨ2 ＰＯ4
０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．１％、ＺｎＳ
Ｏ4 ・７Ｈ2 Ｏ ５ｐｐｍ及びＫ2 ＣＯ3 ０．０４％
を含む水溶液）５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに
分注し、滅菌（１２１℃、１５分間）した。培養は、該
培地に乾熱滅菌した炭酸カルシウム１ｇを添加後、オウ
レオバセディウムｓｐ．Ａ−９１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１
９６６）を植菌し、２５℃にて３日間振とう培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は、上記培地１００
ｍｌを１０００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌（１２
１℃、１５分間）した後、乾熱滅菌した炭酸カルシウム
３ｇを添加後、前培養物の２０ｍｌを添加して２５℃に
て３日間振とう培養を行った。培養終了後、培養物の58
0nm における吸光度を測定し菌体量とした。その結果を
第３表に示す。
【００３５】
【表５】 第５表 ペプトン濃度 菌体量 （％） （580nm における吸光度) ０．１ １０ ０．５ １８ １．０ ３２ ２．０ ３５ ５．０ ３７
【００３６】上記培養物を遠心分離（８, ０００rpm 、
１５分間、室温）し菌体を集め、得られた菌体を、洗浄
液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）にて１度洗
浄した。洗浄菌体を、反応液（グルコース ８％、硫酸
第一鉄 ０．５ｍＭ、１００ｍＭリン酸緩衝液）に懸濁
し、菌体濃度を調整（580nm における吸光度＝３０）後
５０ｍｌとし、炭酸カルシウム１．５ｇとともに３００
ｍｌ容三角フラスコに分注して、３０℃にて２４時間反
応させた。反応終了後、該反応物を実施例１と同様に加
水分解処理を行い、生成ＰＭＬＡ量をリンゴ酸量として
定量を行った。その結果を第６表に示す。
【００３７】
【表６】 第６表 ペプトン濃度 ＰＭＬＡ量 （％） （ｍｇ／ｍｌ） ０．２ １０ ０．５ １１ １．０ １１ ２．０ ８ ５．０ １
【００３８】実施例４ 培地（グルコース ８％、ＮＨ4 Ｃｌ ０．２％、ペプ
トン １％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０５％、ＭｇＳＯ4 ・
７Ｈ2 Ｏ ０．１％、ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ５ｐｐｍ及
びＫ2 ＣＯ3 ０．０４％を含む水溶液）５０ｍｌを５
００ｍｌ容三角フラスコに分注し、滅菌（１２１℃、１
５分間）した。培養は、該培地に乾熱滅菌した炭酸カル
シウム１ｇを添加後、オウレオバセディウムｓｐ．Ａ−
９１（ＦＥＲＭ Ｐ−１１９６６）を植菌し、２５℃に
て３日間振とう培養を行い、これを前培養物とした。本
培養は、上記培地１００ｍｌを１０００ｍｌ容三角フラ
スコに分注、滅菌（１２１℃、１５分間）した後、乾熱
滅菌した炭酸カルシウム３ｇを添加後、前培養物の２０
ｍｌを添加して２５℃にて３日間振とう培養を行った。
【００３９】培養終了後、培養物を遠心分離（８, ００
０rpm 、１５分間、室温）し、菌体を集めた。得られた
菌体を、洗浄液（１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．
０）にて１度洗浄した。上記洗浄菌体を、反応液（グル
コース １５％、硫酸第一鉄 ０．３ｍＭ、１００ｍＭ
リン酸緩衝液）に懸濁後、菌体濃度を調整（580nm にお
ける吸光度＝３０）し、その懸濁液５０ｍｌを、炭酸カ
ルシウム１．５ｇとともに３００ｍｌ容三角フラスコに
分注して、３０℃にて７日間及び１２日間反応させた。
尚、反応５日目にグルコース濃度が１５％となるよう
に、更にグルコースを追加した。反応終了後、該反応物
を実施例１と同様に加水分解処理を行い、生成ＰＭＬＡ
量をリンゴ酸量として定量を行った。その結果を第７表
に示す。
【００４０】
【表７】 第７表 反応時間 ＰＭＬＡ量 （日） （ｍｇ／ｍｌ） ７ ６８ １２ ８６

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 オウレオバセディウム属に属するＬ−リ
    ンゴ酸重合物産生微生物を培養するにあたり、０．１〜
    ２重量％の有機窒素源及び０．２〜３０ｍＭのマグネシ
    ウムイオンを添加した培地で培養することを特徴とする
    Ｌ−リンゴ酸重合物産生微生物の培養法。
  2. 【請求項２】 オウレオバセディウム属に属するＬ−リ
    ンゴ酸重合物産生微生物が、オウレオバセディウムｓ
    ｐ. Ａ−９１株である請求項１記載の方法。
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