JPH04341190A - 酵素法によるｌ−リンゴ酸重合物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素法によるＬ−リン
ゴ酸重合物（ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｍａｌｉｃ　ａｃｉｄ，　
　以下ＰＭＬＡと称する）の製造法に関する。

【０００２】ＰＭＬＡは、生体内分解吸収性高分子化合
物として、生体吸収性縫合系、骨接合用材料、人工腱、
人工血管及びドラッグデリバリーの高分子キャリアー等
として、医薬及び医療の分野での用途が大いに期待され
ている。

【０００３】

【従来の技術】ＰＭＬＡは、リンゴ酸モノベンジル又は
モノメチルエステルを原料とする化学合成法［Ｒｅｐｏ
ｒｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆａｃｕｌｔｙ　Ｅｎｇｉｎｅ
ｅｒｉｎｇ，　Ｔｏｔｔｏｒｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，　８，　１２４　（１９７７）　］、ベンジルマロラ
クトネートを開環重合させる化学合成法［米国特許第４
，２６５，２４７号明細書］、直接熱縮合法［高分子論
文集、４４、　７０１　（１９８７）］等の化学合成法
による製造法が報告されている。

【０００４】また、微生物を用いた発酵法によるＰＭＬ
Ａの製造では、ペニシリウム・サイクロピウム　（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｙｃｌｏｐｉｕｍ）を用いた固
体培養による製造例［Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３３　（４）
，　４５９　（１９６９）］が報告されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、化学合
成法による製造では原料が高価であるばかりか、多数の
工程を必要とするため収率が低いという欠点を有してい
る。

【０００６】一方、前記したペニシリウム・サイクロピ
ウムを用いた固体培養法による製造では、収率が低く、
また精製に多工程を要するため実際的な方法とは言い難
い。

【０００７】また、オウレオバセディウム（Ａｕｒｅｏ
ｂａｓｉｄｉｕｍ）　属菌を用いた発酵法による製造で
は、プルラン等の副成物の除去が問題となっていた。従
って、より安価な原料から高収量で安価に製造する方法
の開発が望まれていた。

【０００８】そこで本発明者らは、ＰＭＬＡを効率良く
産生し、プルラン等の副成物の生成が少ない方法を鋭意
検討し、オウレオバセディウム属に属するＬ−リンゴ酸
重合物産生菌をＬ−，Ｄ−もしくはＤＬ−リンゴ酸、又
はフマル酸を含有する水溶液に作用させて、酵素反応さ
せることにより、副成物の生成を抑制し、ＰＭＬＡを高
効率に生成させる方法を見出し、本発明を完成するに到
った。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、オウレオバセ
ディウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）　属に属する
Ｌ−リンゴ酸重合物産生菌体又はその固定化物を、Ｌ−
，Ｄ−もしくはＤＬ−リンゴ酸、又はフマル酸を含有す
る水溶液に作用させて、酵素法によりＰＭＬＡを高収率
で製造する方法である。

【００１０】オウレオバセディウム属に属する微生物に
は、従来プルラリア（Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ）属に分類
され、後にオウレオバセディウム属に再分類された微生
物も含まれ、総括的に黒色酵母（ｂｌａｃｋ　ｙｅａｓ
ｔ）　とも言われている［Ｍｙｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉ
ａ　ｅｔ　ＭｙｃｏｌｏｇｉａＡｐｐｌｉｃａｔａ，　
１２，　１　（１９５９），　　同　１７，　１　（１
９６２）　］。従って、ＰＭＬＡを産生し得る黒色酵母
であれば、これらをも本発明の範囲に含むものである。 そのような微生物の具体例としては、例えば以下のもの
が挙げられる。

【００１１】オウレオバセディウム・プルランス（Ａｕ
ｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）　ＩＦ
Ｏ　　４４６４、同ＩＦＯ　　４４６５、同ＩＦＯ　　
４８７５、同ＩＦＯ　　７７５７、同ＡＴＣＣ　　７３
０５、オウレオバセディウム・マンソニー（Ａｕｒｅｏ
ｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍａｎｓｏｎｉｉ）ＩＦＯ　　６４
２１、同ＩＦＯ　　８１９４、同ＩＦＯ　　９２３３、
同ＡＴＣＣ　　１４２４９、オウレオバセディウム・ミ
クロスティクタム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍｉ
ｃｒｏｓｔｉｃｔｕｍ）ＩＦＯ　　３２０６６、同ＩＦ
Ｏ　　３２０６７、同ＩＦＯ　　３２０６８、同ＩＦＯ
　　３２０６９、オウレオバセディウム（Ａｕｒｅｏｂ
ａｓｉｄｉｕｍ）　　　ｓｐ．Ａ−９１株、及びこれら
の変異株を含むものである。

【００１２】上記菌株の中でオウレオバセディウム　　
ｓｐ．Ａ−９１株は、本発明者によって土壌中から新た
に分離された菌株であり、その菌学的性状は次のとおり
である。 Ａ．培地上の生育状況 ａ）顕微鏡的所見（ＹＭ寒天培地で２５℃、５日間培養
後） 栄養細胞の大きさ：３〜６×３〜２０μｍ栄養細胞の形
状　　：菌糸及び酵母様の単胞、卵形等の形状を示す ｂ）寒天斜面（ポテトグルコース寒天培地）生育：良好 光沢：無し 色調：３日以上培養すると白色クリーム状から暗色、黒
色のコロニーとなる ｃ）液体培養 ＹＭ液体培地：生育良好 Ｂ．子のう胞子の形成 ポテトグルコース寒天培地：形成せず コーンミール寒天培地　　　　：形成せずＹＭ寒天培地
　　　　　　　　　　　　：形成せずＶ８　寒天培地　
　　　　　　　　　　　：形成せずＣ．生理学的性質 酸素要求性：好気的 生育温度　　：５〜３５℃ 生育ｐＨ　　：２〜９ ＫＮＯ３　の利用性（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ　合成培地）
：有り（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　の利用性（Ｗｉｃｋｅ
ｒｈａｍ　合成培地）：有り 尿素の分解：有り ゼラチンの液化：無し 有機酸の生成：有り ビタミンの要求性（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ　合成培地）：
無しＤ．資化可能な炭素源（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ　合成
培地）グルコース、シュークロース、マルトース、アラ
ビノース、キシロース、マンノース、フラクトース、ト
レハロース、グリセロール、マンニトール、デンプン、
エタノール、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、ＤＬ
−リンゴ酸、フマル酸

【００１３】上記の菌学的性質を有する本菌株の分類学
上の位置を“Ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　Ｆｕｎｇｉ
Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｎｇ　ｉｎ　ｐｕｒｅ　ｃｕｌｔｕ
ｒｅ　”（第３版）Ｊ．Ａ．　Ｖｏｎ　Ａｒｘ編　Ｌｕ
ｂｒｅｃｈｔ　＆　ｃｒａｍｅｒ社刊（１９８１）によ
り検討した結果、オウレオバセディウム属に属する新菌
株であることが判明し、これをオウレオバセディウム　
　ｓｐ．Ａ−９１株と命名した。

【００１４】本菌株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に「微生物受託番号　　微工研菌寄第Ｐ−１１９６６
号」として寄託されている。

【００１５】以下に、本発明のＰＭＬＡ製造方法につい
て述べる。

【００１６】上記のオウレオバセディウム属菌を培養す
るには、通常の方法に従い、炭素源、窒素源、無機塩等
の栄養分を含む培地を用いて行うことができる。

【００１７】培地の炭素源としては、例えば糖質原料と
くにグルコースが好適に用いられ、その添加濃度は１〜
３０重量％、好ましくは１〜２０重量％が適当である。 窒素源としては、微生物の培養に際して通常使用される
窒素含有の有機又は無機物質、例えば、アンモニア、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム
、コハク酸アンモニウムなどの有機酸アンモニウム塩、
尿素等を単独もしくは混合して用いることができ、また
、無機塩としては、例えば、リン酸一水素カリウム、リ
ン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等を用いること
ができる。この他に菌の生育に必要であれば、酵母エキ
ス、コーンスティープリカー、ペプトン、肉エキス、カ
ザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添加し用い
ることができる。

【００１８】培養は振盪、通気撹拌等の好気的条件下で
行われ、培養温度は一般に２０〜４０℃、好ましくは２
２〜３５℃が好適である。培養ｐＨは２〜１０、好まし
くは、３〜９、さらに好ましくは、３〜７である。

【００１９】本発明の方法を実施する場合、上記のよう
に培養して得られた培養物から菌体を集め、水や適当な
緩衝液で洗浄した後そのまま使用することができる。あ
るいは該菌体をそれ自体既知の方法で固定化し固定化物
として使用することができる。微生物菌体の固定化法と
しては、例えば、アクリルアミド等の重合性モノマーを
用いる方法、アルギン酸塩やカラギーナン等の適当な単
体を用いて不溶化させる方法等が挙げられる。

【００２０】該水性反応液は、Ｌ−，Ｄ−もしくはＤＬ
−リンゴ酸、又はフマル酸を含有する水あるいはリン酸
又はトリス塩酸等の緩衝液であることもできる。

【００２１】Ｌ−，Ｄ−もしくはＤＬ−リンゴ酸、又は
フマル酸の添加濃度は、特に制限はないが、一般には０
．１〜３０重量％、好ましくは０．２〜１５重量％の範
囲内が適当である。

【００２２】一方、水性反応液中の微生物菌体又はその
処理物の濃度もまた特に制限されるものではないが、一
般には１〜５０重量％、好ましくは２〜２０重量％の範
囲内が好都合である。

【００２３】本発明による酵素反応は、一般に約２０〜
約５０℃、好ましくは約２５〜約４０℃の温度で、通常
約１０〜約１２０時間行う。また、反応液のｐＨは２〜
１０、好ましくは３〜９、さらに好ましくは３〜７であ
る。

【００２４】以上に述べた酵素法により反応液中に生成
したＰＭＬＡを反応液から分離・精製するには、それ自
体既知の方法に従い、例えば、イオン交換樹脂処理法、
沈殿法、例えばアセトン、メタノール、エタノール、ｎ
−プロパノール、メチルエチルケトン等の有機溶媒沈殿
法等を適宜組合わせて行うことができる。

【００２５】以上に述べた方法で製造されるＰＭＬＡの
物理化学的性質は、以下のとおりである。 （１）ＧＰＣ法により測定した分子量は、約２，０００
〜５０，０００の範囲内である。 （２）１Ｎ硫酸溶液による加水分解処理により、Ｌ−リ
ンゴ酸のみが生成する。

【００２６】

【発明の効果】本発明によれば、副成物の生成を抑制し
、高収量でＰＭＬＡを得ることができる。

【００２７】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に
説明する。しかしながら、下記の実施例は本発明につい
て具体的な認識を得る一助としてのみ挙げたものであり
、これによって本発明は何ら限定されるものではない。

【００２８】参考例 培地（グルコース１２％、ＫＨ２　ＰＯ４　０．０５％
、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ０．０５％、酵母エキス０
．０２％）５０ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注
し、滅菌（１２１℃、１５分間）した後、別に滅菌した
６％硝酸アンモニウム溶液１ｍｌを添加した。培養は、
該調製培地に炭酸カルシウム１ｇ　を添加後、第１表に
示した微生物を植菌し、２５℃にて３日間振盪培養を行
い、これを前培養物とした。本培養は上記培地２，００
０ｍｌを５，０００ｍｌ容三角フラスコに分注、滅菌（
１２１℃、１５分間）した後、別に滅菌した６％硝酸ア
ンモニウムの４０ｍｌと乾熱滅菌した炭酸カルシウム６
０ｇ　を添加後、前培養物の２（ｖ／ｖ）　％を添加し
て２５℃にて３日間振盪培養を行った。

【００２９】培養終了後、培養物を２００ｍｌずつ遠心
分離（８，０００ｒｐｍ　、１５分間、室温）し、菌体
を集めた。得られた菌体を、１００ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．０）の４０ｍｌにて１度洗浄した。

【００３０】実施例１ 反応液（Ｌ−リンゴ酸１％、１００ｍＭリン酸緩衝液、
ｐＨ７．０）の１００ｍｌに参考例で得られた菌体を懸
濁し、炭酸カルシウム３ｇとともに３００ｍｌ容三角フ
ラスコに分注して、２５℃にて３日間反応させた。反応
終了後、該反応物から遠心分離（８，０００ｒｐｍ　、
１５分間、室温）により除菌した上清液８０ｍｌに、メ
タノール１６０ｍｌを徐々に添加すると生成物が析出沈
殿した。該沈殿物を遠心分離（８，０００ｒｐｍ　、１
０分間、４℃）にて分離後、減圧下デシケーター中で乾
燥させた後、秤量した。結果は表１に示した。

【００３１】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表１　　　　　　────────
───────────────────────　　
　　　　　　　　　　　　　　菌株名　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＰＭＬＡ粗生成量＊
（ｍｇ）　　　　　　　──────────────
─────────────────　　　　　　　　
　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　　　ｐｕｌ
ｌｕｌａｎｓ　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　
　　　　　　　　　４４６４　　　　　　　　　　　　
　　　　　　６０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　７７５７　　　　　　　　　　　
　　　　　７００　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　４８７５　　　　　　　　　　　
　　　　　１７０　　　　　　───────────
────────────────────　　　　　
　　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　　　
ｍａｎｓｏｎｉｉ　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　６４２１　　　　　　　　　　　
　　　　　１５０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　９２３３　　　　　　　　　　　
　　　　　４８０　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ　　　　　　１４２４９　　　　　　　　　　　　　
　　　　　５０　　　　　　────────────
───────────────────　　　　　　
　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍｉｃｒｏ
ｓｔｉｃｔｕｍ　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　
　　　　　　　３２０６６　　　　　　　　　　　　　
　　　２００　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　
　　　　　　３２０６８　　　　　　　　　　　　　　
　　１００　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　
　　　　　３２０６９　　　　　　　　　　　　　　　
　３５０　　　　　　───────────────
────────────────　　　　　　　　　
　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　ｓｐ．Ａ−９
１　　　　　　　　　　１２００　　　　　　────
─────────────────────────
──＊　　生成物はカルシウム塩として秤量

【００３２
】実施例２ 実施例１と同様にして、フマル酸ナトリウム１％を含有
する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて、
酵素反応を行った。結果は表２に示した。

【００３３】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表２　　　　　　────────
───────────────────────　　
　　　　　　　　　　　　　　菌株名　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　ＰＭＬＡ粗生成量＊
（ｍｇ）　　　　　　　──────────────
─────────────────　　　　　　　　
　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　　　ｐｕｌ
ｌｕｌａｎｓ　　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　
　　　　　　　　　４４６４　　　　　　　　　　　　
　　　　　　８０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　７７５７　　　　　　　　　　　
　　　　　７６０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　４８７５　　　　　　　　　　　
　　　　　２００　　　　　　───────────
────────────────────　　　　　
　　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　　　
ｍａｎｓｏｎｉｉ　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　６４２１　　　　　　　　　　　
　　　　　１８０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ
　　　　　　　　　　９２３３　　　　　　　　　　　
　　　　　５００　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ
Ｃ　　　　　　１４２４９　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８０　　　　　　────────────
───────────────────　　　　　　
　　　　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｍｉｃｒｏ
ｓｔｉｃｔｕｍ　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　
　　　　　　　３２０６６　　　　　　　　　　　　　
　　　２３０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　
　　　　　　３２０６８　　　　　　　　　　　　　　
　　１５０　　　　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　
　　　　　３２０６９　　　　　　　　　　　　　　　
　４００　　　　　　───────────────
────────────────　　　　　　　　　
　　　Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　　　ｓｐ．Ａ−９
１　　　　　　　　　　１０００　　　　　　────
─────────────────────────
──＊　　生成物はカルシウム塩として秤量

【００３４
】実施例３ オウレオバセディウム・プルランス（Ａｕｒｅｏｂａｓ
ｉｄｉｕｍ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）　ＩＦＯ　　７７５
７及びオウレオバセディウム　　ｓｐ．Ａ−９１株につ
いて、発酵法及び本発明の酵素法によりプルランの副成
量を比較した。発酵法は、参考例の方法により８日間本
培養を行った。酵素法は実施例１の方法で行った。プル
ラン副成量は、反応液中の全糖質濃度をアンスロン−硫
酸法により分析後、同一反応液中の残存原料グルコース
濃度を差し引くことにより求めた。グルコース濃度は、
グルコースアナライザー（東亜電波工業、ＧＬＶ−１）
を用い分析した。結果は表３に示した。

【００３５】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　表３　　────────────
──────────────────────　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　プルラン副成量＊　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　─
────────────────────　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
発酵法　　　　　　　　　　　　　　　　　　酵素法　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　──────　　──────────────　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
（グルコース）　　（Ｌ−リンゴ酸）（フマル酸）　　
─────────────────────────
─────────　　オウレオバセディウム・　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　プルラ
ンスＩＦＯ７７５７　　　　１００　　　　　　　　　
　　　３　　　　　　　　　　　　　　２　　オウレオ
バセディウム 　　ｓｐ．Ａ−９１　　　　　　　　　　　　　　１０
０　　　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　
　　　２　　───────────────────
───────────────　　＊　発酵法におけ
るプルラン副成量を１００として示した。

【００３６】実施例４ 実施例１で回収した生成物について、分子量の測定をＧ
ＰＣ法（カラム：ＴＳＫ　ｇｅｌ　　Ｇ３０００　ＰＷ
ＸＬ　、移動相：０．０５Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）、２５℃、検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）及び　ＲＩ
　）により分析した結果、反応に用いた菌株の生育相及
び反応条件により分子量は異なり、２，０００〜５０，
０００であった。

【００３７】生成物の５０ｍｇを１Ｎ　　Ｈ２　ＳＯ４
　溶液１０ｍｌに溶解後、該液を１００℃沸騰水中で３
時間加水分解処理を行った。該処理液をペーパークロマ
トグラフィー（酢酸エチル：酢酸：水＝５０：１２：１
０）により分析した結果、リンゴ酸のＲｆ　値に相当す
る単一スポットが認められた。更に高速液体クロマトグ
ラフィー（島津製ＬＣ−５Ａ型）により有機酸の分析を
行った結果、リンゴ酸のリテンションタイムを示す単一
ピークが得られた。また、培養物から回収した生成物に
ついて酸加水分解物の高速液体クロマトグラフィー［カ
ラム：ＨＰＸ−８７Ｈ（ＢＩＯ−ＲＡＤ），カラム温度
：６０℃、溶媒：０．０１Ｍ　Ｈ２　ＳＯ４　、流速：
０．７ｍｌ／分、検出器：ＵＶ（２１０ｎｍ）］分析の
結果、標準物質のＬ−リンゴ酸と同一のリテンションタ
イムを示した。

【００３８】得られた加水分解物をＬ−リンゴ酸測定キ
ット（ベーリンガー・マンハイム製）により分析した結
果Ｌ体であることが判明した。

【００３９】以上の結果から、本生成物はＬ−リンゴ酸
が重合したものであることが判明した。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　オウレオバセディウム属に属するＬ−
   リンゴ酸重合物産生菌体又はその固定化物を、Ｌ−，Ｄ
   −もしくはＤＬ−リンゴ酸、又はフマル酸を含有する水
   溶液に作用させ、酵素法によりＬ−リンゴ酸重合物を製
   造する方法。
2. 【請求項２】　　オウレオバセディウム属に属するＬ−
   リンゴ酸重合物産生菌が、オウレオバセディウム　　ｓ
   ｐ．Ａ−９１株である請求項１記載の方法。