CN107699594A - 一种利用地衣芽孢杆菌生产γ‑聚谷氨酸的方法 - Google Patents

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CN107699594A CN201711170540.4A CN201711170540A CN107699594A CN 107699594 A CN107699594 A CN 107699594A CN 201711170540 A CN201711170540 A CN 201711170540A CN 107699594 A CN107699594 A CN 107699594A
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乔长晟
范袆立
李雪
张卫
郝利民
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Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种利用地衣芽孢杆菌生产γ‑聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上培养活化；种子液的制备；将活化后的斜面种子接种于种子培养基中，得产γ‑聚谷氨酸的种子液；将种子液接种于发酵培养基中发酵；发酵结束后离心去菌体，醇沉析出聚谷氨酸，干燥，制备出干粉状γ‑聚谷氨酸。本发明利用F42和F55两种类型的果葡糖浆对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以提高γ‑聚谷氨酸的产量还能简化生产工艺，降低生产成本。

Description

一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法
技术领域
本发明属于农业微生物技术领域，涉及一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸是一种生物高分子载体材料，最早是由lvanovics等人在炭疽芽孢杆菌的夹膜中发现的，是芽孢杆菌属如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌等在生命活动过程中产生的次级代谢产物，当前可以在实验室通过生物发酵的方法制备。随着科技的进步与工业的发展，随之而来的环境污染问题也日益增多，因此各领域更倾向于发展和应用环境友好型材料。而γ-聚谷氨酸作为一种可生物降解的‘绿色’高分子材料，也越来越受人们的关注。因其具有良好的吸水特性，并且无论在人体内部，还是在外界环境中其最终的分解代谢产物均为谷氨酸，对人体无毒副作用，对环境无污染，因此在许多领域都展现出其优越性。目前已知，在化妆品行业，食品行业，医疗保健行业，农业方面均有广泛的应用。
葡萄糖(Glucose)是自然界分布最广且最为重要的一种单糖，它是一种多羟基醛。葡萄糖在生物学领域具有重要地位，是活细胞的能量来源和新陈代谢中间产物，即生物的主要供能物质。植物可通过光合作用产生葡萄糖。在生物发酵行业被当作最主要的C源有着极其广泛的应用。在当前生产γ-聚谷氨酸的生物发酵培养基中就仍采用单纯的葡萄糖作为C源，但生产成本大，为了降低生产成本，提高效益，需要利用价格低廉的C源对葡萄糖进行替换吗，但目前还未找到替换葡萄糖的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法。本发明利用F42和F55两种类型的果葡糖浆对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以提高γ-聚谷氨酸的产量还能简化生产工艺，降低生产成本。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃-37℃培养16-18小时，如此活化2-3次，制备成熟的活化后的斜面种子；
本发明所用菌种来源:天津北洋百川生物技术有限公司申请专利名称为一种高效生产γ-聚谷氨酸的方法，申请号CN201310749908.8。所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37-38℃，罐压0.02-0.05MPa；通风量0.5-1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0，培养72小时；
所述发酵培养基组分为：玉米浆25g/L，氯化钠15g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，无水氯化钙1.5g/L，NH4Cl 5.52g/L，F55型果葡糖浆104-109g/L或F42型果葡糖浆113-123g/L中的一种，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
果葡糖浆是葡萄糖和果糖的混合物，而微生物在生长过程中利用的糖类物质都需要分解成单糖进行利用。同时在聚谷氨酸的发酵生产过程中，葡萄糖做C源时浓度过高则会较多的合成多糖而合成聚谷氨酸的量则会减少。基于这些特点，果葡糖浆是葡萄糖最好的替代品。1.它能够保证C源总量不变的情况下降低葡萄糖的组分所占比例，减弱多糖的合成。2.相对于以二塘或者多糖做C源，它节省了水解成单糖的时间。这两点原因是它能够提高产量的支撑。
我们在实验中发现：在聚谷氨酸的发酵生产过程中，以葡萄糖做C源时如果浓度过高则会较多的合成多糖而合成聚谷氨酸的量则会减少，同时葡萄糖浓度过低又不利于菌体的生长。于是我们尝试了以果葡糖浆做C源，在葡萄糖浓度降低的情况下保证总的糖浓度不变进行实验，实验证明果葡糖浆的确有很好的利用价值。
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出干粉状γ-聚谷氨酸。
作为优选的技术方案：
优选的，通过高效液相检测样品中γ-聚谷氨酸的产量。
优选的，所述斜面培养基组成为胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉20g/L。
优选的，所述种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的种子培养基。
优选的，所述发酵培养基的pH是使用1～4mol/L硫酸、盐酸、氢氧化钠或氢氧化钾水溶液调节的。
优选的，所述干燥指的是利用喷雾干燥方法，制备出干粉状γ-聚谷氨酸。
优选的，所述γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
果葡糖浆果葡糖浆是由植物淀粉水解和异构化制成的淀粉糖晶，是一种重要的甜味剂。生产果葡糖浆不受地区和季节限制，设备比较简单，投资费用较低。它的组成主要是果糖和葡萄糖；它为无色黏稠状液体，常温下流动性好，无臭。果葡糖浆主要由葡糖糖和果糖组成。按果糖含量，果葡糖浆分为三个国家标准:果葡糖浆(F42型)含果糖42％；果葡糖浆(F55型)含果糖55％；果葡糖浆(F90型)含果糖90％。果葡糖浆极易被菌体利用，但相较与葡萄糖其制造设备简单，投资费用低，其成本也低，是一种及其理想的葡萄糖替代品。
本发明使用的果葡糖浆相关参数
F42型果葡糖浆和F55型果葡糖浆的国标要求
有益效果
本发明利用F42和F55两种类型的果葡糖浆对原有配方中的葡萄糖实施了替换。不仅可以提高γ-聚谷氨酸的产量还能简化生产工艺，降低生产成本。同时也证实了地衣芽孢杆菌对果糖也有很好的利用效率，对于后续一些利用葡萄糖效果不好的菌种，果葡糖浆可以作为一种很好的替代品。其次，通过对菌体的镜检，发现以果葡糖浆做C源下罐时的菌体细胞更圆润，初步确定果葡糖浆对菌体有一定的保护作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌CGMCC NO.3336原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养18小时，制备成熟的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
(2)所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备：将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可
所述种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌35min。
(3)发酵罐发酵：将步骤(2)中的种子液1.5L接种于发酵罐，以5％的接种量，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，初始发酵温度38℃，罐压0.03MPa，通风量1vvm；初始发酵液pH值调至7，培养72小时。发酵培养基的pH是使用1mol/L硫酸、氢氧化钠水溶液调节的。发酵培养基组分为：玉米浆25g/L，氯化钠15g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，无水氯化钙1.5g/L，NH4Cl5.52g/L，F42型果葡糖浆116g/L中的一种，余量为水；在温度125℃下灭菌40min，得到的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，且定容于25mL后经过水解处理得样品，通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为19g/L.转化率30％左右。替代葡萄糖每吨节省成本14.7％左右，利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
实施例2
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃培养16小时，制备活化后的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可；得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌35min，得到的种子培养基。
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，控制初始发酵温度37℃，罐压0.02MPa；通风量0.5vvm；初始发酵液pH值调至7，培养72h；所述发酵培养基的pH是使用4mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液调节的。
所述发酵培养基组分为：玉米浆25g/L，氯化钠15g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，无水氯化钙1.5g/L，NH4Cl 5.52g/L，F55型果葡糖浆106g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌40min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，再纯净水复溶且定容于25mL后经过水解处理得样品。通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为聚谷产量25g/L，转化率35％左右，替代葡萄糖每吨节省成本17.6％左右；利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
对比例1
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于35℃培养17小时，制备活化后的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌35min，得到所述的种子培养基。
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，控制初始发酵温度38℃，罐压0.05MPa；通风量1vvm；初始发酵液pH值调至7，培养72h；所述发酵培养基的pH是使用2mol/L盐酸或氢氧化钠水溶液调节的。
所述发酵培养基组分为：葡萄糖：90g/L，玉米浆：25g/L，氯化钠：15g/L，MgSO4·7H2O：2g/L，无水氯化钙：1.5g/L，NH4Cl：5.52g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌40min，得到发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，再纯净水复溶且定容于25mL后经过水解处理得样品。通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为聚谷产量为20g/L.转化率为30﹪左右。利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
从实施例1、实施例2与对比例1的对比中，可以发现利用果葡糖浆为C源替代葡萄糖生产聚谷氨酸方法可行，其聚谷产量不但能够与以葡萄糖为C源产量相当而且还有部分产量高于葡萄糖，其中以F55型效果尤为明显。
实施例3
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于37℃培养16-小时，制备活化后的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌38min，得到所述的种子培养基。
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，控制初始发酵温度38℃，罐压0.02MPa；通风量0.5vvm；初始发酵液pH值调至7，培养72h；发酵培养基的pH是使用3mol/L盐酸或氢氧化钾水溶液调节的。
所述发酵培养基组分为：玉米浆25g/L，氯化钠15g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，无水氯化钙1.5g/L，NH4Cl 5.52g/L，F55型果葡糖浆109g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌35min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，再纯净水复溶且定容于25mL后经过水解处理得样品。通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为26g/L；利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
实施例4
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃培养16小时，制备活化后的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌38min，得到所述的种子培养基。
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，控制初始发酵温度37℃，罐压0.05MPa；通风量1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0
所述发酵培养基组分为：玉米浆20g/L，氯化钠10g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，无水氯化钙2g/L，NH4Cl 5.52g/L，F55型果葡糖浆104g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌35min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，再纯净水复溶且定容于25mL后经过水解处理得样品。通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为24g/L；利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
实施例5
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃培养16小时，制备活化后的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌38min，得到所述的种子培养基。
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，控制初始发酵温度37℃，罐压0.03MPa；通风量1vvm；初始发酵液pH值调至7.0
所述发酵培养基组分为：玉米浆23g/L，氯化钠12g/L，MgSO4·7H2O1.2g/L，无水氯化钙1.8g/L，NH4Cl 5.52g/L，F42型果葡糖浆113g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌35min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，再纯净水复溶且定容于25mL后经过水解处理得样品。通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为18g/L；利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
实施例6
一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃培养16小时，制备活化后的斜面种子；斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂粉20g/L。
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.3336；
(2)种子液的制备；将步骤(1)中将活化后的斜面种子接种于装有50mL液体培养基的500mL三角瓶中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，参考以OD660值长在0.3则可，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
种子培养基组成为：葡萄糖45g/L，玉米浆10g/L，胰蛋白胨15g/L，氯化钾0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌38min，得到所述的种子培养基。
(3)发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤(2)中的种子液接种于发酵培养基中，20L发酵罐发酵培养基装量为10L，控制初始发酵温度37℃，罐压0.03MPa；通风量1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0
所述发酵培养基组分为：玉米浆22g/L，氯化钠14g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，无水氯化钙1.8g/L，NH4Cl 5.52g/L，F42型果葡糖浆123g/L，余量为水；在温度125℃下灭菌35min，得到所述的发酵培养基；
(4)提取：发酵结束后离心去菌体，然后用5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，再纯净水复溶且定容于25mL后经过水解处理得样品。通过高效液相检测得其γ-聚谷氨酸产量为20g/L；利用喷雾干燥方法制备出干粉状γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。

Claims (6)

1.一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征是，包括以下步骤：
菌种活化：将地衣芽孢杆菌的原始菌株接种在斜面培养基上，于30℃-37℃培养16-18小时，制备活化后的斜面种子；
所述地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）TKPG091，该菌株已于2009年10月14日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为 CGMCC No.3336；
（2）种子液的制备；将步骤（1）中活化后的斜面种子接种于种子培养基中，37℃，摇床转速220rpm培养16小时至对数生长期，得到产γ-聚谷氨酸的种子液；
（3）发酵罐发酵：按照以发酵培养基体积计，5％接种量，将步骤（2）中的种子液接种于发酵培养基中，控制初始发酵温度37-38℃，罐压0.02-0.05MPa；通风量0.5-1.5vvm；初始发酵液pH值调至7.0，培养72小时；
所述发酵培养基组分为：玉米浆20g-25g/L，氯化钠10g-15g/L，MgSO4·7H2O 1g-2g/L，无水氯化钙 1.5g-2g/L，NH4Cl 5.52g/L，F55型果葡糖浆104-109g/L或F42型果葡糖浆113-123g/L中的一种，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的发酵培养基；
（4）提取：发酵结束后离心去菌体，然后用4-5倍上清液体积的乙醇，醇沉析出聚谷氨酸，然后再复溶于上清液体积的蒸馏水后，干燥；制备出干粉状γ-聚谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，通过高效液相检测样品中γ-聚谷氨酸的产量。
3.根据权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述斜面培养基组成为:胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，Nacl10g/L，琼脂粉20g/L。
4.根据权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：葡萄糖45 g/L，玉米浆 10g/L，胰蛋白胨15 g/L，氯化钾 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH 7.2，余量为水；在温度125℃下灭菌30-40min，得到所述的种子培养基。
5.根据权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述干燥指的是利用喷雾干燥方法，制备出干粉状γ-聚谷氨酸。
6.根据权利要求1所述的一种利用地衣芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸的分子量为20万到200万道尔顿。
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