CN114456980A - 一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用 - Google Patents

一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种γ‑聚谷氨酸高产菌株，其生物保藏号为CGMCC NO.23967；命名为BCSW‑11052，属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。本发明还提供了利用所述γ‑聚谷氨酸高产菌株，作为发酵γ‑聚谷氨酸菌株的应用，及利用所述γ‑聚谷氨酸高产菌株进行发酵γ‑聚谷氨酸的方法。本发明的有益效果是：利用本发明所述高产菌株BCSW‑11052，使用价格低廉的甘蔗糖蜜作为碳源，额外添加少量酵母膏与硫酸亚铁大大提高了γ‑聚谷氨酸的产量，降低了生产成本。本发明γ‑聚谷氨酸的产量可以达到80g/L以上，相比于现有技术有较大突破。

Description

一种γ-聚谷氨酸高产菌株及应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一株高产γ-聚谷氨酸的菌株与利用其发酵γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
聚谷氨酸由D-谷氨酸和L-谷氨酸通过酰胺键聚合而成，通过γ-酰胺键聚合的谷氨酸单体称为γ-聚谷氨酸。γ-聚谷氨酸作为一种新型的多功能生物制品，具有无毒无害、可食用、易降解和保水性等特征，在农业生产、医药和食品等多个领域中有较强的应用前景。在农业中多作为保湿剂和肥料增效剂等，帮助植物有足够的水分生长，促进植物更好的吸收肥料。在医药行业中主要作为药物载体与组织工程支架；在食品方面，γ-聚谷氨酸可减少食物中可冻结水量，避免食物结构被冰晶破坏，从而增加冷冻面食的储藏性，一般作为食品添加剂添加到食物中。
生产γ-聚谷氨酸的方法有化学合成法、提取法、酶转化法与微生物发酵法，微生物发酵法由于方法条件温和、工艺简单，容易进行大规模生产，因此受到工业生产中大多使用微生物发酵法生产，是目前研究的热点。发酵过程中主要使用的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)等芽孢杆菌属。有多篇专利报道其使用了枯草芽孢杆菌作为发酵菌株生产γ-聚谷氨酸，不过大多使用葡萄糖、蔗糖作为碳源，生产升本高，不利于工业化生产。
目前，使用农业工业废弃物发酵γ-聚谷氨酸可降低成本，例如牛粪堆肥、味精和食醋生产的残留废物都已被研究应用制备γ-聚谷氨酸，以实现副产物再利用并降低了成本。有文献报道采用糖蜜发酵γ-聚谷氨酸产量达到32.7g/L，既获得了目标产物，又提高了资源利用率，但是未见在生产中实际应用的案例。据文献报道，大规模生产(1000L)实验中，γ-聚谷氨酸的产量为52g/L，使成本降低了11％。中国专利 CN201710363365.4报道了一种糖蜜作为碳源发酵γ-聚谷氨酸的方法，其利用糖蜜发酵γ-聚谷氨酸的产量为45.5g/L。提高γ-聚谷氨酸的生产浓度、降低发酵成本是每一个γ-聚谷氨酸生产厂家一直研究的问题。
发明内容
针对上述技术存在的不足，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，命名为： BCSW-11052，为γ-聚谷氨酸菌株；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC NO.23967。本发明还提供了利用所述菌株BCSW-11052通过液体发酵生产γ聚谷氨酸的方法，利用所述方法生产的γ-聚谷氨酸为胞外代谢产物。本发明所述菌株BCSW-11052及所述方法可应用于生产γ-聚谷氨酸，发酵所得γ-聚谷氨酸含量可达86.3g/L以上。
本发明提供了一种菌株，所述菌株为γ-聚谷氨酸高产菌株，其生物保藏号为CGMCC NO.23967；命名为BCSW-11052，属于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
本发明还提供了利用上述γ-聚谷氨酸高产菌株，作为发酵γ-聚谷氨酸菌株的应用。
本发明还提供了利用上述γ-聚谷氨酸高产菌株进行发酵γ-聚谷氨酸的方法，包括以下步骤：
步骤1：菌种活化：将地衣芽孢杆菌BCSW-11052转至斜面培养基，于37℃恒温培养8-16h；
步骤2：种子培养：将步骤1得到的活化菌种接入种子培养基中，进行种子培养，制得种子液；
步骤3：发酵培养：将步骤2得到的种子液以8％-14％(V/V)接种量接种至发酵培养基中，进行发酵培养。
优选的是，步骤1中，斜面培养基包括以下成分：1％氯化钠，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸粉，2％琼脂粉。
上述任一项优选的是，步骤1中，菌种活化的培养条件为：37℃恒温培养8-16h。
上述任一项优选的是，步骤2中，所述种子培养基包括以下成分：葡萄糖20～30g/L，酵母膏5～7g/L，胰蛋白胨8～15g/L，硫酸镁0.4～0.7g/L，磷酸氢二钾0.4～0.7g/L。
上述任一项优选的是，步骤2中，种子培养的条件为：37℃，220r/min下培养12-16h。
上述任一项优选的是，步骤3中，所述发酵培养基以甘蔗糖蜜作为碳源。所述甘蔗糖蜜优选为可溶性固形物。甘蔗糖蜜溶性固形物能更好、更准确的配制糖蜜培养基(可溶性固形物是指液体或流体食品中所有溶解于水的化合物的总称。包括糖、酸、维生素、矿物质等。)
上述任一项优选的是，步骤3中，所述发酵培养基含有0.5～1g/L的硫酸亚铁。在本发明的优选实施方式中，采用甘蔗糖蜜作为碳源，同时添加0.1g/L的硫酸亚铁，虽然γ-聚谷氨酸产量得到提升，但制备过程中发酵培养后粘度较大(发酵液粘度可达500mPa·s)。在本发明又一优选实施方式中，硫酸亚铁的含量优选为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0g/L，发酵过程中菌液粘度降低(降低至100mPa·s)，使得发酵液体系中溶氧量更大、更均匀，γ-聚谷氨酸分子量降低并且产量进一步大大提升。
上述任一项优选的是，步骤3中，所述发酵培养基包括以下成分：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L。
上述任一项优选的是，步骤3中，发酵培养的条件为：37℃，220r/m下震荡培养72h。
本发明提供的具体技术方案是：
首先获得了一株新的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株，该菌株代码为BCSW-11052，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO.23967。所述菌株BCSW-11052的16S rDNA序列如Seq ID NO：1所示。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株形态主要为：芽孢杆菌形态，细胞呈杆状，大小均匀；菌落形态特征为：圆形，突起，边缘不规则，淡黄色，表面光滑、粘稠，能拉丝。培养特征：37℃， 200-220r/m下振荡3-4天，发酵液颜色呈深色；可利用碳源有：葡萄糖、蔗糖、果糖其中之一；可以利用的氮源有：硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母膏及酵母粉中的一种或几种。
在本发明一项优选的实施方式中还提供了一种提高γ-聚谷氨酸产量的方法，包括如下步骤：
(1)菌种活化：将保藏编号为CGMCC NO.23967地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)菌株转接至斜面培养基中活化；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子使用接种环刮取一环接入种子培养基中；
(3)发酵培养：将种子培养液接种到含有的发酵培养基中发酵培养；
(4)γ-聚谷氨酸测定：将步骤(3)所得的发酵液离心后取上清液，使用流动相稀释100倍，经HPLC 法检测。
作为本发明的优选，所述步骤(1)中，菌种活化条件为：在37℃下培养8-16h；所述斜面培养基为 LB培养基，121℃灭菌20min。
作为本发明的优选，所述步骤(2)中，将地衣芽孢杆菌接种到种子培养基中，在温度34-40℃(进一步优选为37℃)、转速为180-220rpm(进一步优选为220rpm)的条件下培养12-16小时；所述种子培养基中各组分及含量如下：葡萄糖20～30g/L，酵母膏5～7g/L，胰蛋白胨8～15g/L，硫酸镁0.4～0.7g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
作为本发明的进一步优选，所述步骤(3)中，将种子培养液以7％-12％(V/V)(进一步优选为 8％-14％(V/V))的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养；所述发酵培养基组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
作为本发明的优选，所述步骤(3)的发酵培养为摇瓶发酵培养或发酵罐培养60～96h；摇瓶发酵培养时，发酵培养条件为:在温度34～40℃、转速200～240rpm的条件下培养72～96h；发酵罐发酵培养时，发酵培养条件为：在温度34～40℃、转速350～650rpm条件下，通气比1：0.9～1:1.8条件下培养60～120h；
作为本发明的进一步优选，发酵罐发酵培养时，发酵温度在37℃、转速为450rpm、通气比1：1.2条件下培养72小时。
作为本发明的优选，所述步骤(4)中，收集步骤(3)的发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心 20min后取上清1ml，使用流动相定容至100mL，使用HPLC法检测γ-聚谷氨酸产量，流动相为：0.05mol/L 硫酸钠溶液。
本发明的有益效果是：利用本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株。使用价格低廉的甘蔗糖蜜额外添加少量酵母膏与硫酸亚铁的情况下仍能保证γ-聚谷氨酸的产量，大大降低了生产成本，相较于使用葡萄糖作为碳源，甘蔗糖蜜作为碳源的γ-聚谷氨酸的产量可以达到80g/L以上，相比于现有技术有较大突破。本发明具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于工业化生产；在发酵培养基中使用甘蔗糖蜜作为碳源，加入硫酸亚铁既提供了碳氮源，又满足了菌体生长所使用的金属离子。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进行更加清晰、完整的描述，但所描述的实例仅是本发明一部分实施例，并非全部。所述实施例为帮助理解本发明，不应依此来局限本发明的保护范围。
本发明提供了一种高产γ-聚谷氨酸的菌株，该菌株的分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间：2021年11月24日，保藏编号为： CGMCC NO.23967。
本发明的高产γ-聚谷氨酸的菌株是由诱变而来，出发菌株为百川生物公司保藏菌株，先采用紫外照射后再He-Ne激光诱变，在确定致死率后结合SG、AHV、AEC抗性平板，在摇床上初筛得到的90株菌株，发酵3天，测定发酵液中的γ-聚谷氨酸产量，得到9株产量较高的菌株，其中3株菌谷氨酸利用率较高，因此对这三株菌进行遗传稳定性实验，发现其中1株菌在传代10次后仍有较高的γ-聚谷氨酸产量，最终获得了适合工业化生产、易于培养、具有稳定遗传能力的γ-聚谷氨酸高产菌株BCSW-11052。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052的特征为：
(1)菌体形态主要为：杆状，大小均匀，有芽孢；
(2)菌落形态特征；圆形，突起，边缘不规则，淡黄色，表面光滑、粘稠，能拉丝；
(3)培养特征为：37℃，200-220r/m下振荡3-4天，发酵液颜色呈深色；
(4)可利用碳源有：葡萄糖、蔗糖、果糖其中之一；
(5)可以利用的氮源有：硫酸铵、氯化铵、蛋白胨、酵母膏及酵母粉中的一种或几种。
(6)对所述菌株BCSW-11052进行16S rDNA测序，其序列为Seq ID NO：1所示的核苷酸序列。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052培养方法为：
(1)菌种活化；将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052转至斜面培养基，于37℃恒温培养8-16h；
(2)种子培养：选取生长良好的斜面种子使用接种环刮取一环接入种子培养基中，于37℃， 220r/min下培养12-16h，制得种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)中的种子培养液以8％-14％(V/V)接种量接种至发酵培养基中，于 37℃，220r/m下震荡培养72h。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052培养过程中用的培养基及其配制方法为：
斜面培养基：各组分及含量如下：1％氯化钠，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸粉，2％琼脂粉，121℃灭菌20min。
种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖20～30g/L，酵母膏5～7g/L，胰蛋白胨8～15g/L，硫酸镁 0.4～0.7g/L，磷酸氢二钾0.4～0.7g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min。
发酵培养基各组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～ 1g/L，味精60～100g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
本发明中检测发酵液中γ-聚谷氨酸的含量的方法：收集发酵液，将发酵液在15000rpm条件下离心 20min后去上清1mL，使用流动相稀释100倍的分析样品。分析样品进行HPLC分析，HPLC流动相为0.05mol/L 的无水硫酸钠，检测波长210nm，流速0.5mL/min，同时用γ-聚谷氨酸标准溶液，通过HPLC检测后绘制标准曲线，然后根据标准曲线计算γ-聚谷氨酸的含量。
实施例1
本实施例中利用地衣芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的具体过程为：取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052转接至斜面培养基中于37℃下恒温培养8h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在37℃，转速220rpm条件下培养12h，然后取培养液按接种量10％接种于摇瓶中，，摇瓶含有50mL发酵培养基，然后在温度37℃、转速220rpm条件下培养72h，检测培养液中γ-聚谷氨酸的含量。结果显示，本实例中γ-聚谷氨酸产量为33.5g/L。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖20g，酵母膏5g，胰蛋白胨8g，硫酸镁0.4g，磷酸氢二钾0.4g，溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70g/L，酵母膏2g/L，硫酸亚铁0.1g/L，味精60g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
实施例2
本实施例中利用地衣芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的具体过程为：取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052转接至斜面培养基中于37℃下恒温培养8h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在37℃，转速220rpm条件下培养12h，然后取培养液按接种量10％接种于摇瓶中，摇瓶含有50mL发酵培养基，然后在温度37℃、转速220rpm条件下培养72h，检测培养液中γ-聚谷氨酸的含量。结果显示，本实例中γ-聚谷氨酸产量为62.9g/L。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖30g，酵母膏7g，胰蛋白胨10g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.5g，溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
实施例3
本实施例中利用地衣芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的具体过程为：取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052转接至斜面培养基中于37℃下恒温培养8h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在37℃，转速220rpm条件下培养12h，然后取培养液按接种量10％接种于摇瓶中，，摇瓶含有50mL发酵培养基，然后在温度37℃、转速220rpm条件下培养72h，检测培养液中γ-聚谷氨酸的含量。结果显示，本实例中γ-聚谷氨酸产量为67.5g/L。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖30g，酵母膏7g，胰蛋白胨10g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.5g，溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
实施例4
本实施例中利用地衣芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的具体过程为：取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052转接至斜面培养基中于37℃下恒温培养8h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在37℃，转速220rpm条件下培养12h，然后取培养液按接种量10％接种于5L 发酵罐中，发酵罐装液量3L发酵培养基，然后在温度37℃、转速400r/min，通风比为1：1.2条件下培养72h，检测培养液中γ-聚谷氨酸的含量。结果显示，本实例中γ-聚谷氨酸产量为70.6g/L。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖30g，酵母膏7g，胰蛋白胨10g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.5g，溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
实施例5
本实施例中利用地衣芽孢杆菌发酵γ-聚谷氨酸的具体过程为：取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BCSW-11052转接至斜面培养基中于37℃下恒温培养8h，选取生长良好的斜面种子使用接种环接种至种子培养基中，在37℃，转速220rpm条件下培养12h，然后取培养液按接种量10％接种于5L 发酵罐中，发酵罐装液量3L发酵培养基，然后在温度37℃、转速400r/min，通风比为1：1.2条件下培养84h，检测培养液中γ-聚谷氨酸的含量。结果显示，本实例中γ-聚谷氨酸产量为86.3g/L。
所用种子培养基各组分及含量如下：葡萄糖30g，酵母膏7g，胰蛋白胨10g，硫酸镁0.5g，磷酸氢二钾0.5g，溶剂为水，121℃灭菌20min。所用发酵培养基各组分及含量为：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L，溶剂为水，121℃灭菌20min，其中可溶性固形物使用手持糖度计测定。
本发明与专利CN201710363365.4相比聚谷氨酸产量更高，提升了190％，检测方法更准确，工业化生产更加便捷，不需要后续流加培养基，降低了发酵染菌风险的同时也是低成本。

Claims (10)

1.一种菌株，其生物保藏号为CGMCC NO.23967；命名为BCSW-11052，属于地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。
2.权利要求1所述的菌株，作为发酵γ-聚谷氨酸菌株的应用。
3.利用权利要求1所述的菌株进行发酵γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：菌种活化：将地衣芽孢杆菌BCSW-11052转至斜面培养基，进行培养；
步骤2：种子培养：将步骤1得到的活化菌种接入种子培养基中，进行种子培养，制得种子液；
步骤3：发酵培养：将步骤2得到的种子液以7％-12％(V/V)接种量接种至发酵培养基中，进行发酵培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1中，斜面培养基包括以下成分：1％氯化钠，1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸粉，2％琼脂粉。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤1中，菌种活化的培养条件为：37℃恒温培养8-16h。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2中，所述种子培养基包括以下成分：葡萄糖20～30g/L，酵母膏5～7g/L，胰蛋白胨8～15g/L，硫酸镁0.4～0.7g/L，磷酸氢二钾0.4～0.7g/L。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2中，种子培养的条件为：34-40℃，180-220r/min下培养12-16h。
8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述发酵培养基以甘蔗糖蜜作为碳源。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述发酵培养基包括以下成分：甘蔗糖蜜可溶性固形物70～100g/L，酵母膏2～7g/L，硫酸亚铁0.5～1g/L，味精60～100g/L。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤3中，发酵培养的条件为：34～40℃，200-650r/m下震荡培养60-120h。
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